1459/30.12.2016 Hotărîre cu privire la aprobarea Metodologiei de analiză şi evaluare calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Anexa nr.1

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

LISTA

metodelor de referinţă

Partea I

- vanilină

SM ISO 8851-2:2015 (SNF)

15 g/100 kg de unt concentrat

Anexa nr.7

- etil esterul acidului butiric

- anexa nr.8 (stigmasterol)

- etil esterul acidului butiric

- anexa nr.5 (trigliceride ale acidului enantic)

SM EN ISO 4833-2:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

SM SR ISO 5545:2012

SM EN ISO 4833-2:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

SM EN ISO 8968-3:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

(¹) Fără a se aduce atingere cerinţelor prezentei Metodologii.

Partea II

Metodele de referinţă enumerate în partea II pot fi folosite

pentru analiza laptelui şi a produselor lactate

SM EN ISO 8968-3:2014

SM SR EN ISO 1736:2012

SM EN ISO 2450:2014

SM EN ISO 7208:2014

SM SR ISO 8262-3:2012

SM EN ISO 8968-3:2014

SM EN ISO 2450:2014

SM EN ISO 7208:2014

SM EN ISO 8968-3:2014

Observaţii la lista metodelor de referinţă:

Nota 1: Izolarea grăsimii din lapte conform SM ISO 1740:2015 (la adăpost de lumină).

Nota 2: Nu s-a stabilit nici o metodă de referinţă.

Nota 3: Proba este preparată conform SM SR EN ISO 6887-5:2014.

Nota 4: Incubate timp de 48 de ore la temperatura de 55⁰C, acordîndu-se atenţie prevenirii uscării mediului de cultură.

Nota 5: % m/m SNF = % m/m solide - % m/m grăsime.

Abrevieri:

Min. = minimum

Max. = maximum

SNF = substanţe solide negrase

PV = valoarea peroxidului

A = aspect

F = miros

C = consistenţă

TBC = număr total de bacterii

Therm = număr de bacterii termofile

SMP = furaje combinate şi lapte praf degresat

SCM = lapte condensat îndulcit

EMC = lapte sau smîntînă evaporate

ISO = Organizaţia Internaţională de Standardizare

Anexa nr.2

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Evaluarea conformităţii unui lot cu limita legală

1. În cazurile în care este stabilită o normă de reglementare care prevede proceduri detaliate de prelevare a probelor, aceste proceduri trebuie utilizate. În toate celelalte cazuri, se utilizează o probă din cel puţin 3 unităţi de probă luate la întîmplare din lotul supus controlului. Se poate prepara o probă compozită. Rezultatul obţinut este comparat cu limitele legale prin calcularea intervalului de încredere de 95% pe baza a 2 x deviaţia standard, unde deviaţia standard relevantă depinde:

1) de validarea metodei în cadrul colaborării internaţionale cu valorile pentru σ_r şi σ_R; sau

2) în cazul validării interne, de calcularea reproductibilităţii interne. Acest interval de încredere este apoi comparat cu incertitudinea de măsurare a rezultatului.

2. În cazul în care metoda este validată în cadrul colaborării internaţionale, iar deviaţia standard a repetabilităţii σ_r şi deviaţia standard a reproductibilităţii σ_R au fost stabilite, laboratorul poate demonstra conformitatea cu caracteristicile de performanţă ale metodei validate.

A se calcula media aritmetică x din n măsurători repetate.

A se calcula incertitudinea extinsă (k = 2) din x pe baza

.

În cazul în care rezultatul final x al măsurătorii se calculează utilizînd o formulă de forma x = y₁+y₂,x=y₁–y₂,x=y₁·y₂ sau x=y₁/y₂, se respectă procedurile obişnuite de combinare a deviaţiilor standard în astfel de cazuri.

Se apreciază că lotul nu respectă limita legală superioară UL în cazul în care:

      _

x – U > UL;

în caz contrar, se apreciază că lotul respectă UL.

Se apreciază că lotul nu respectă limita legală inferioară LL în cazul în care:

_

x + U < LL;

în caz contrar, se apreciază că lotul respectă LL.

3. În cazurile în care se folosesc metode care nu sînt specificate în prezenta Metodologie şi nu sînt stabilite măsuri de precizie, se realizează o validare internă. Se utilizează deviaţia standard a repetabilităţii interne s_ir şi deviaţia standard a reproductibilităţii interne s_iR în locul σ_r şi σ_R , respectiv, în formulele de calcul al incertitudinii extinse U.

Regulile de luare a unei decizii sînt aceleaşi ca la punctul 1 din prezenta anexă. Cu toate acestea, în cazul în care se consideră că lotul nu respectă limita legală, măsurătorile se repetă folosind metoda specificată în prezenta Metodologie, decizia urmînd să fie luată în conformitate cu punctul 1 din prezenta anexă.

Anexa nr.3

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Evaluarea senzorială a untului

1. Scopul procedurii de evaluare senzorială a untului este de a furniza o metodă uniformă aplicabilă pe teritoriul republicii.

2. În scopul aplicării prezentei anexe, termenii folosiţi se definesc după cum urmează:

1) evaluare senzorială – examinare a caracteristicilor unui produs cu ajutorul organelor de simţ;

2) panel – grup de evaluatori selectaţi de către conducătorul laboratorului acreditat, care, pe perioada evaluării, lucrează independent, fără a comunica între ei şi fără a se influenţa reciproc;

3) evaluator – persoana aleasă pentru capacitatea sa de a efectua un test senzorial. Acest tip de evaluator poate avea experienţă limitată;

4) evaluator expert – persoana cu un grad înalt de sensibilitate senzorială şi cu experienţă în metodologia senzorială, care este capabilă să efectueze evaluări coerente şi sigure ale unor produse variate. Acest tip de evaluator dispune pe termen lung de o bună memorie senzorială;

5) punctare – evaluare senzorială realizată de un panel, folosindu-se o scală numerică. Trebuie să se folosească un nomenclator al defectelor;

6) clasificare – clasificare calitativă realizată pe baza punctării;

7) documente de control – documente folosite pentru înregistrarea punctajelor individuale pentru fiecare caracteristică şi a clasificării finale a produsului (acest document poate fi folosit şi pentru înregistrarea compoziţiei chimice).

3. Condiţiile privind camera de testare sînt:

1) Evaluatorii din camera de testare nu trebuie să fie influenţaţi de factori externi.

2) În camera de testare nu trebuie să existe mirosuri străine şi trebuie să fie uşor de curăţat. Pereţii trebuie să aibă o culoare deschisă şi nereflectantă.

3) Camera de testare şi iluminarea acesteia trebuie să fie de aşa natură încît să nu afecteze proprietăţile produsului care urmează să fie punctat.

4) Camera trebuie dotată cu un sistem adecvat de control al temperaturii care să permită păstrarea unei temperaturi constante a untului. Untul trebuie să aibă o temperatură de 12 °C (±2 °C) în momentul clasificării.

4. Un evaluator trebuie să fie familiarizat cu produsele din unt şi să aibă competenţa necesară pentru a realiza o gradare a sensibilităţii senzoriale. Competenţa evaluatorului este controlată de către conducătorul panelului în mod regulat (cel puţin o dată pe an).

Cerinţele generale şi testele de selecţie care trebuie aplicate înaintea utilizării oficiale a unui nou evaluator sînt specificate în SM ISO 22935-1.

Formarea profesională trebuie să fie continuă, iar conducătorul panelului trebuie să organizeze şedinţe generale cel puţin o dată pe trimestru. Formarea profesională a panelului se efectuează conform SM EN ISO 8586.

Formarea iniţială trebuie să acopere următoarele:

1) teoria generală şi importanţa practică a evaluării senzoriale;

2) metodele, scalele şi descrierea percepţiilor senzoriale;

3) detectarea şi recunoaşterea caracteristicilor senzoriale şi termenilor senzoriali specifici;

4) pregătirea de bază în fabricarea untului;

5) referinţele şi probele valide care să îl ajute pe evaluator în identificarea aromelor specifice şi a intensităţii aromei produsului.

5. Numărul evaluatorilor din panel trebuie să fie impar, numărul minim fiind de trei. Majoritatea acestora trebuie să fie angajaţi ai unui laborator acreditat, dar să nu fie angajaţi în industria de prelucrare a laptelui.

Înainte de evaluare trebuie avuţi în vedere mai mulţi factori pentru obţinerea unor performanţe optime ale subiecţilor:

1) nu trebuie să sufere de boli care le-ar putea afecta performanţa. Într-un asemenea caz, evaluatorul în cauză trebuie înlocuit în panel cu un alt evaluator;

2) trebuie să se prezinte în mod punctual la evaluare şi să dispună de suficient timp pentru realizarea evaluării;

3) nu trebuie să folosească substanţe cu miros puternic cum ar fi parfum, loţiune după ras, deodorant etc. şi trebuie să evite consumul de alimente cu arome puternice (de exemplu, foarte condimentate) etc.;

4) nu au voie să fumeze, să mănînce şi să bea altceva decît apă cu o jumătate de oră înainte de evaluare.

6. Toţi evaluatorii trebuie să participe în mod regulat la panelele de evaluare senzorială pentru a-şi păstra competenţele. Frecvenţa acestora depinde de volumul şi capacitatea de producţie a untului şi, în măsura în care acest lucru este posibil, trebuie să se organizeze cel puţin un panel pe lună.

7. Este esenţial ca identitatea probelor să fie ascunsă în timpul evaluării, astfel încît să se evite orice posibilitate de favorizare. Probele trebuie să fie codate.

Această etapă are loc înaintea evaluării propriu-zise. Se stabileşte temperatura untului în timpul transportului către camera de testare (6 °C ± 2 °C).

Cînd evaluarea senzorială se realizează într-un antrepozit frigorific, proba este prelevată cu ajutorul unui prelevator de unt. În cazul în care evaluarea senzorială se realizează în alt loc decît în antrepozitul frigorific, se prelevează o probă de cel puţin 500 g. Pe parcursul evaluării, untul trebuie să aibă o temperatură de 12 °C (±2 °C). Deviaţiile mari trebuie evitate.

8. Evaluarea senzorială se realizează pentru următoarele trei caracteristici: aspect, consistenţă şi aromă.

Aspectul implică următoarele caracteristici: culoare, puritate vizibilă, absenţa contaminării fizice, absenţa fungilor şi uniformitatea de dispersie a apei.

Consistenţa implică următoarele caracteristici: corp, textură şi fermitate. Tartinabilitatea poate fi monitorizată prin utilizarea mijloacelor fizice, în cazul în care agentul economic doreşte acest lucru în vederea satisfacerii cerinţelor clientului.

Corpul reprezintă termenul care se referă la coeziunea produsului în timp ce este consumat. În mod normal este asociat cu fermitatea şi tartinabilitatea şi trebuie să fie uniform în întregul produs. Se află în strînsă legătură cu textura şi reprezintă abilitatea produsului de a-şi menţine poziţia iniţială. Este indicat de rezistenţă la tăiere, putînd fi măsurat mecanic şi prin evaluare bucotactilă şi tactilă.

Aroma reprezintă caracteristica percepută în cavitatea bucală, în principal prin intermediul papilelor gustative de la nivelul limbii.

Mirosul reprezintă caracteristica percepută prin intermediul nasului şi al simţului olfactiv.

O deviaţie semnificativă faţă de temperatura recomandată împiedică evaluarea sigură a consistenţei şi a aromei. Temperatura este extrem de importantă.

Clasificarea untului trebuie amînată în cazul în care temperatura se află în afara intervalului recomandat.

Fiecare caracteristică trebuie să facă obiectul unei evaluări senzoriale separate. Punctarea se realizează în conformitate cu tabelul 1.

Tabelul 1

Punctajul pentru unt

tipul ideal cea mai bună calitate (substanţă uscată egală)

tipul ideal cea mai bună calitate (bine tartinabil)

tipul ideal cea mai bună calitate (cea mai fină aromă absolut pură)

nu există defecte evidente

nu există defecte evidente

nelegat (necompact), umed

neuniform, în două culori,

pestriţ, marmorat,

aromă de copt, aromă de ars,

aspru, amar,

nelegat (necompact),

umed,

păstos, de consistenţa aluatului, gras,

pestriţ, marmorat,

miros oxidat, miros metalic,

aspru, amar,

mucegăit, putred,

nelegat (necompact),

umed,

păstos, de consistenţa aluatului, gras,

brînzos, miros de brînză lactică,

pestriţ, marmorat,

uleios, cu gust de peşte,

miros oxidat, miros metalic,

mucegăit, putred,

miros de substanţe

chimice

______________________________

(1) Punctul 10.

(2) Defectele menţionate la “bun” reprezintă numai deviaţii foarte mici de la tipul ideal.

Pentru a se obţine uniformitate, uneori este de dorit ca, înainte de începerea evaluării, evaluatorii să puncteze împreună una sau mai multe probe de referinţă, în privinţa aspectului, a consistenţei şi a aromei.

Punctajul de acceptare este următorul:

În cazurile în care nu se obţine punctajul necesar, trebuie să se prezinte o descriere a defectului.

Punctajul acordat de fiecare evaluator pentru fiecare caracteristică trebuie înregistrat în documentul de control.

Produsul este acceptat sau respins pe baza deciziei majorităţii evaluatorilor.

Nu trebuie să se înregistreze în mod frecvent cazuri în care diferenţele dintre punctajele individuale acordate pentru fiecare caracteristică să fie mai mari de un punct (nu mai frecvent de un caz la 20 de probe). În caz contrar, competenţa panelului trebuie verificată de conducătorul panelului.

9. Conducătorul panelului, care trebuie să fie angajat al laboratorului acreditat şi care poate fi membru al panelului, trebuie să răspundă în general pentru întreaga procedură de evaluare. Acesta trebuie să înregistreze, în documentul de control punctajele, individuale pentru fiecare caracteristică şi să confirme dacă produsul este acceptat sau respins.

10. Defectele untului sînt redate în tabelul 2.

Tabelul 2

Defectele untului

I. Aspect:

______________________________

(¹) Această desemnare trebuie folosită cît mai rar posibil şi numai atunci cînd defectul nu poate fi descris mai exact.

Anexa nr.4

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Determinarea conţinutului de trigliceride

 ale acidului enantic în unt, ulei de unt şi smîntînă prin analiza

 cromatografică în fază gazoasă a trigliceridelor

1. Prezenta metodă stabileşte o metodă pentru determinarea conţinutului de trigliceride ale acidului enantic în unt, ulei de unt şi smîntînă.

2. Conţinutul de acid enantic reprezintă conţinutul de trigliceride ale acidului enantic determinat prin procedura specificată în prezenta anexă.

Conţinutul de acid enantic este exprimat în kg/tonă din produs pentru uleiul de unt şi unt, iar pentru smîntînă este exprimat în kg/tonă din grăsimea din lapte.

3. Grăsimea din lapte este extrasă din diferite produse în conformitate cu SM ISO 14156. Determinarea cantitativă a conţinutului de trigliceride ale acidului enantic în grăsimea extrasă este realizată prin cromatografie în fază gazoasă în coloană capilară (GC). Rezultatul obţinut pentru probă este evaluat prin aplicarea standardului privind trigliceridele acidului caproic.

4. Se folosesc reactivi de calitate analitică recunoscută:

1) n-Hexan;

2) trigliceride etalon ale acidului caproic, cel puţin 99% puritate;

3) trigliceride etalon ale acidului enantic, cel puţin 99% puritate;

4) sulfat de sodiu, anhidru (Na₂SO₄).

5. Aparatura obişnuită de laborator:

1) balanţă analitică echilibrată la 1 mg;

2) baloane cotate cu capacitate de 10 ml şi 20 ml;

3) tuburi de centrifugă cu capacitate de 30 ml;

4) evaporator rotativ;

5) cuptor care să poată fi menţinut la o temperatură de 50 °C ± 5 °C;

6) hîrtie de filtru de porozitate medie cu diametrul de aproximativ 15 cm;

7) aparatură de cromatografie în fază gazoasă;

a) cromatograf în fază gazoasă dotat cu un injector cu sau fără divizare sau “în coloană” şi cu un detector cu ionizare în flacără;

b) coloană de cromatografie în fază gazoasă cu fază staţionară care a fost folosită cu succes în operaţiunea de separare a trigliceridelor (100% dimetilpolisiloxan sau 5% fenil-95% metilpolisiloxan). Se selectează faza staţionară, se ajustează lungimea coloanei (între 4 m şi 15 m), diametrul intern (între 0,22 mm şi 0,50 mm) şi grosimea stratului (0,12 μm sau mai mult), ţinînd cont de experienţa laboratorului şi de sistemul de injectare aplicat. În orice caz, coloana selectată produce în acelaşi timp o separare completă între vîrful solventului şi trigliceridele acidului caproic şi o rezoluţie a liniei de bază între vîrfurile trigliceridelor acidului caproic şi ale acidului enantic;

8) seringă pentru injectare, cu capacitate de 5 μl.

6. Proba primită în laborator trebuie să fie reprezentativă şi care să nu fi fost deteriorată sau modificată în timpul transportului sau pe durata depozitării.

Metoda recomandată de prelevare a probelor este prezentată în SM SR EN ISO 707:2012 Lapte şi produse lactate. Ghid pentru eşantionare.

7. Prepararea probei pentru analiză şi a cantităţii analizate se realizează în conformitate cu SM ISO 14156.

1) Ulei de unt, unt

a) Se topeşte între 50 g şi 100 g din proba pentru analiză în cuptor.

b) Se pun între 0,5 g şi 1 g de sulfat de sodiu anhidru într-o hîrtie de filtru pliată.

c) Se filtrează grăsimea prin hîrtia de filtru care conţine sulfat de sodiu anhidru, colectînd filtratul într-un pahar de laborator care se păstrează în cuptor. În timpul decantării, se acordă multă atenţie untului topit în hîrtia de filtru, pentru a nu se transfera serul.

2) Smîntînă

a) Proba analizată se aduce la o temperatură de 20 °C ± 2 °C.

b) Proba se amestecă sau se agită bine.

c) Se diluează o cantitate adecvată din proba analizată pentru a se obţine 100 ml de cantitate analizată cu o fracţiune de masă a grăsimii de aproximativ 4%.

d) Se procedează ca şi în cazul laptelui crud şi al laptelui omogenizat (SM ISO 14156) pentru a extrage grăsimea din smîntînă.

e) Se cîntăreşte, cu o precizie de 1 mg, 1 g din grăsimea extrasă, într-un balon cotat de 10 ml. Se adaugă 1 ml din soluţia indicată la punctul 8 subpunctul 1). Se completează pînă la 10 ml cu n-hexan şi se omogenizează.

f) Se introduce 1 ml din soluţia indicată la subpunctul 1 litera b) din prezentul punct, într-un balon cotat de 10 ml şi se diluează pînă la 10 ml cu n-hexan.

8. Prepararea etaloanelor de calibrare se efectuează în felul următor:

1) Se dizolvă 100 mg de trigliceride ale acidului enantic în 10 ml de n-hexan.

2) Se dizolvă 100 mg de trigliceride ale acidului caproic în 10 ml de n-hexan.

3) Se introduce 1 ml din soluţia indicată la subpunctul 2) din prezentul punct, într-un balon cotat de 10 ml. Se completează pînă la 10 ml cu n-hexan.

4) Se introduce 1 ml din soluţia indicată la subpunctul 1) din prezentul punct şi 1 ml din soluţia indicată la subpunctul 2) din prezentul punct punctul 2, într-un balon cotat de 10 ml. Se completează pînă la 10 ml cu n-hexan.

5) Se introduce 1 ml din soluţia indicată la subpunctul 4) din prezentul punct într-un balon cotat de 10 ml şi se completează pînă la 10 ml cu n-hexan.

9. Determinarea cromatografică se efectuează în felul următor.

1) Se injectează de două ori 1 μl din soluţia etalon indicată la punctul 8 subpunctul 5).

2) Se injectează 1 μl din fiecare soluţie de probă.

În cazul în care se adoptă sistemul de injectare în coloană, se aplică o diluare mai mare atît soluţiei etalon, cît şi soluţiei de probă.

3) Operaţia indicată la subpunctul 1) din prezentul punct se repetă la fiecare 3 probe, în vederea încadrării probelor între injectările etalon martor. Rezultatele se bazează pe media coeficienţilor de răspuns din cromatogramele etalon.

10. Pentru fiecare cromatogramă, se integrează suprafaţa vîrfurilor asociate cu trigliceridele acidului enantic şi ale acidului caproic.

Se urmează aceste instrucţiuni pentru fiecare ciclu delimitat, respectiv pentru un set de probe delimitate, etalonul injectat de două ori imediat după acestea este STD₁, iar etalonul injectat de două ori imediat după acestea este STD₂.

1) Calibrare

a) Se calculează coeficientul de răspuns pentru fiecare duplicat al STD₁, Rf₁(a) şi Rf₁(b), unde:

Rf₁ (a) sau (b) = (Suprafaţa vîrfului pentru trigliceridele acidului caproic/

Suprafaţa vîrfului pentru trigliceridele acidului enantic) × 100.

Se calculează media coeficientului de răspuns, Rf₁, unde:

Rf₁ = [Rf₁(a) + Rf₁(b)] / 2

b) În mod similar, se calculează media coeficientului de răspuns STD₂, Rf₂.

c) Se calculează media coeficientului de răspuns, Rf:

Rf = (Rf₁ + Rf₂) /2.

2) Probele analizate

Pentru fiecare cromatogramă a probei obţinută între STD₁ şi STD₂, se calculează conţinutul de acid enantic, C (kg/ton):

C = (Suprafaţa vîrfului pentru trigliceridele acidului enantic × Rf × 100)/

(Suprafaţa vîrfului pentru trigliceridele acidului caproic × Wt × 1 000),

unde:

Wt = greutatea grăsimii prelevate (g);

100 = volumul de diluare pentru probă;

1000 = coeficientul de transformare (pentru μg/g în kg/t).

Pentru probele de unt, se ţine cont de conţinutul de grăsime al untului şi se calculează o valoare a concentraţiei corectată, C_unt (kg/t de unt):

C_unt = C_grăsime × F,

unde F este conţinutul de grăsime al untului.

11. Valorile pentru limita de repetabilitate şi reproductibilitate sînt exprimate pentru nivelul de probabilitate de 95%, fiind posibil ca acestea să nu fie aplicabile în cazul altor intervale şi matrice de concentraţie decît cele prezentate.

1) Repetabilitate

Diferenţele absolute dintre două rezultate individuale ale unui singur test, obţinute prin aceeaşi metodă aplicată asupra unor materiale de testare identice, în acelaşi laborator, de către acelaşi operator, utilizîndu-se acelaşi echipament, la un interval scurt de timp nu vor fi mai mari de 0,35 kg/t, în nu mai mult de 5% din cazuri.

2) Reproductibilitate

Diferenţele absolute dintre două rezultate individuale ale unui singur test, obţinute prin aceeaşi metodă aplicată asupra unor materiale de testare identice, în laboratoare diferite, de către operatori diferiţi, utilizîndu-se echipamente diferite nu vor fi mai mari de 0,66 kg/t, în nu mai mult de 5% din cazuri.

12. Limitele de toleranţă: limite inferioare (în cazul cantităţilor insuficiente).

1) Pentru a verifica marcarea corectă a produsului, trebuie prelevate trei probe din produsul studiat.

2) Unt şi unt concentrat.

a) Rata de încorporare este de 11 kg din trigliceridele acidului enantic cu o puritate de cel puţin 95%, respectiv 10,45 kg/t.

b) Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei şi a omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

- 9,51 kg/t (rată de încorporare minimă de 95% pentru trigliceridele acidului enantic cu o puritate de 95%, determinare separată);

- 6,89 kg/t (rată de încorporare minimă de 70% pentru trigliceridele acidului enantic cu o puritate de 95%, determinare separată);

- concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare, respectiv între 9,51 kg/t şi 6,89 kg/t.

3) Smîntînă

a) Rata de încorporare este de 10 kg de trigliceride ale acidului enantic, cu o puritate de cel puţin 95%, pe tona de grăsimi din lapte, respectiv 9,5 kg/t grăsimi din lapte marcate.

b) Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

- 8,60 kg/t (rată de încorporare minimă de 95% pentru trigliceridele acidului enantic cu o puritate de 95%, determinare separată);

- 6,23 kg/t (rată de încorporare minimă de 70% pentru trigliceridele acidului enantic cu o puritate de 95%, determinare separată);

- concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare, respectiv între 8,60 kg/t şi 6,23 kg/t.

13. Limitele de toleranţă: limitele superioare (în cazul depăşirii cantităţii cu peste 20 %)

1) Pentru a verifica marcarea corectă a produsului, trebuie prelevate trei probe din produsul studiat.

2) Unt şi unt concentrat

Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei şi omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar media acestor rezultate se compară cu limita superioară de 12, 96 kg/t.

3) Smîntînă

Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei şi omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar media acestor rezultate se compară cu limita superioară de 11,82 kg/t.

Anexa nr.5

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Determinarea conţinutului de vanilină

 în untul concentrat, unt şi smîntînă prin

cromatografie lichidă de înaltă performanţă

1. Metoda implică o procedură de determinare cantitativă a vanilinei din untul concentrat, unt şi smîntînă.

2. Extragerea unei cantităţi cunoscute de probă cu ajutorul unui amestec de izopropanol/etanol/acetonitril (1:1:2). Precipitarea majorităţii grăsimii prin răcire între –15 °C şi –20 °C, urmată de centrifugare şi decantare.

Soluţia decantată este diluată cu apă şi filtrată. Filtratul este gata pentru determinarea conţinutului de vanilină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC).

3. Aparatură de laborator:

1) Refrigerator cu funcţionare în intervalul de temperatură –15 °C la –20 °C

2) Seringi de unică folosinţă cu capacitate de 2 ml.

3) Membrană filtrantă cu pori de 0,45 μm, rezistentă la o soluţie conţinînd 5% soluţie de extragere

4) Sistem de cromatografie lichidă conţinînd o pompă (cu debit de 1,0 ml/min), un injector (injectare automată sau manuală a 20 μl), un detector UV (acţionat la 306 nm, 0,01 Å scală completă), un înregistrator sau integrator şi o coloană termostat care funcţionează la 25C

5) Coloană analitică (aproximativ 250 mm × 4,6 mm diametru interior) umplută cu LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) sau o coloană echivalentă

6) Coloană de control (aproximativ 20 mm × 3 mm diametru interior) umplută cu LiChrospher RP 18 (5-10 μm) sau o coloană echivalentă

7) Centrifugă care operează la 2 000 rpm.

4. Reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută.

1) Izopropanol

2) Etanol 96% (v/v)

3) Acetonitril

4) Soluţie de extragere

Se amestecă izopropanol, etanol şi acetonitril în proporţie de 1:1:2 (v/v).

5) Vanilină (4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidă) ≥ 98%

a) Soluţie “stock” de vanilină (= 500 μg/ml)

Se cîntăresc, cu o precizie de 0,1 mg, aproximativ 50 mg (CM mg) de vanilină într-un balon cotat de 100 ml, se adaugă 25 ml de soluţie de extragere şi se completează cu apă.

b) Soluţie etalon de vanilină (= 10 μg/ml)

Se pipetează 5 ml de soluţie “stock” de vanilină într-un balon cotat de 250 ml şi se completează cu apă.

c) Metanol, calitate HPLC

d) Acid acetic, glacial

e) Apă, calitate HPLC

f) Faza mobilă HPLC

Se amestecă 300 ml de metanol cu aproximativ 500 ml apă şi 20 ml de acid acetic într-un balon cotat de 1 000 ml şi se completează cu apă. Se filtrează printr-un filtru de 0,45 μm.

5. Procedura de determinare cantitativă a vanilinei din untul concentrat, unt şi smîntînă are loc în felul următor:

1) Prepararea probei pentru analiză

a) Unt

Se încălzeşte proba pînă cînd începe să se topească. Se evită supraîncălzirea unor porţiuni din probă la peste 30 °C. În orice caz, există posibilitatea ca untul să nu se separe în două faze. Cînd proba devine suficient de maleabilă, se omogenizează prin scuturare. Untul se amestecă timp de 15 s înainte de prelevarea unei probe. Se cîntăresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 5 g (SM g) de unt într-un balon cotat de 100 ml.

b) Unt concentrat

Imediat după prelevarea probei, recipientul conţinînd un concentrat se introduce în cuptor la 40-50 °C pînă cînd se topeşte complet. Proba se amestecă prin turbionare sau agitare, evitîndu-se formarea de bule de aer din cauza amestecării prea puternice. Se cîntăresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 4 g (SM g) de unt concentrat într-un balon cotat de 100 ml.

c) Smîntînă

Proba se încălzeşte în baie de apă sau într-un incubator la o temperatură de 35-40 °C. Grăsimea se distribuie omogen prin turbionare şi, după caz, prin amestecare. Proba se răceşte rapid la 20 ± 2 °C. Proba trebuie să aibă un aspect omogen; în caz contrar, procedura trebuie repetată. Se cîntăresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 10 g (SM g)de smîntînă într-un balon cotat de 100 ml.

2) Prepararea soluţiei de analiză

Se adaugă aproximativ 75 ml de soluţie de extragere la proba prelevată (punctul 5 subpunctul 1 litera a), b) sau c)), se agită sau se scutură cu putere timp de aproximativ 15 minute şi se completează cu soluţie de extragere. Se transferă aproximativ 10 ml din acest extract într-o eprubetă prevăzută cu dop. Eprubeta se introduce în refrigerator timp de aproximativ 30 minute. Extractul rece se centrifughează timp de 5 minute la aproximativ 2 000 rpm şi se decantează imediat. Soluţia decantată se lasă să se răcească la temperatura camerei. Se pipetează 5 ml din soluţia decantată într-un balon cotat de 100 ml şi se completează cu apă. Se filtrează o parte alicotă printr-o membrană microfiltrantă cu ajutorul unei seringi. Filtratul este gata pentru determinarea HPLC.

3) Calibrare

Se pipetează 5 ml de soluţie etalon de vanilină într-un balon cotat de 100 ml. Se adaugă 5 ml de soluţie de extragere şi se completează cu apă pînă la marcaj. Această soluţie conţine 0,5 μg/ml de vanilină.

4) Determinarea prin HPLC

Se lasă sistemul cromatografic să se stabilizeze timp de aproximativ 30 minute. Se injectează soluţia etalon (subpunctul 3) din prezentul punct). Procedura se repetă pînă cînd diferenţa dintre suprafeţele vîrfurilor sau dintre înălţimile vîrfurilor a două injectări succesive este sub 2%. În condiţiile descrise, timpul de retenţie al vanilinei este de aproximativ 9 minute. Soluţia etalon (subpunctul 3) din prezentul punct) se analizează în duplicat prin injectarea a 20 μl. Se injectează 20 μl din soluţia de analiză (subpunctul 2) din prezentul punct). Se determină suprafaţa sau înălţimea vîrfului obţinut pentru vanilină. Se repetă injectarea soluţiei etalon (subpunctul 3) din prezentul punct) în duplicat, după 10 injectări ale probelor analizate (subpunctul 2) din prezentul punct).

6. Se calculează suprafaţa (sau înălţimea) medie a vîrfurilor (AC) pentru vîrfurile vanilinei asociate injectării duplicatelor la începutul şi la sfîrşitul fiecărui lot de soluţie de analiză (în total patru suprafeţe sau înălţimi).

Se calculează coeficientul de răspuns (R):

R=AC/CM

unde:

CM este masa vanilinei în mg.

Conţinutul (mg/kg) de vanilină (C) din probă se calculează cu ajutorul formulei:

C=[(AS × 20 × 0,96)/(SM × R)],

unde:

AS – suprafaţa vîrfului sau înălţimea pentru vîrful vanilinei din proba pentru analiză;

SM – masa probei pentru analiză exprimată în g (punctul 5 subpunctul 1 literele a), b) sau c));

La analiza vanilinei din smîntînă, concentraţia marcatorului se exprimă ca mg marcator/kg grăsime din lapte. Pentru aceasta se înmulţeşte C cu 100/f.;

f – este conţinutul de grăsime al smîntînii în procente (m/m);

20 – coeficientul de diluare a probei etalon şi a probei pentru analiză;

0,96 – factorul de corecţie pentru conţinutul de grăsime la prima diluare a probei pentru analiză.

În locul suprafeţei vîrfului se poate folosi înălţimea vîrfului (a se vedea punctul 8 subpunctul 3 din prezenta anexă).

7. Precizia metodei rezultă din valorile pentru repetabilitate şi reproductibilitate:

1) Repetabilitate, (r)

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeaşi aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 16 mg/kg.

2) Reproductibilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 27 mg/kg.

8. Trebuie să se preleveze trei probe din produsul urmărit pentru a se verifica omogenitatea

1) Marcator obţinut fie din vanilie, fie din vanilină sintetică:

a) Rata de încorporare pentru 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidă este de 250 g pe tonă de unt concentrat sau de unt. Pentru smîntîna marcată, rata de încorporare este de 250 g pe tonă de grăsime din lapte.

b) Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei şi a omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

- 220,8 mg/kg (95% din rata minimă de încorporare);

- 158,3 mg/kg (70% din rata minimă de încorporare).

Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 220,8 mg/kg şi 158,3 mg/kg.

2) Marcator obţinut numai din păstăi de vanilie sau extracte integrale ale acesteia:

a) Rata de încorporare pentru 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehidă este de 100 g pe tonă de unt concentrat sau de unt. Pentru smîntîna marcată, rata de încorporare este de 100 g pe tonă de grăsime din lapte.

b) Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei şi a omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

- 78,3 mg/kg (95% din rata minimă de încorporare);

- 53,3 mg/kg (70% din rata minimă de încorporare).

Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 78,3 mg/kg şi 53,3 mg/kg.

9. Recuperarea vanilinei adăugate la un nivel de 250 mg/kg ulei de unt variază de la 97,0 la 103,8. Conţinutul mediu identificat a fost de 99,9%, cu o deviaţie standard de 2,7%.

Soluţia etalon conţine 5% soluţie de extragere pentru a compensa creşterea suprafeţei vîrfului provocată de prezenţa a 5% soluţie de extragere în probă. Astfel, se poate opera o clasificare în funcţie de înălţimea vîrfului.

Analiza se bazează pe o curbă liniară de etalonare, cu intersecţie cu punctul zero.

Folosindu-se soluţii diluate adecvate de soluţie etalon, se verifică liniaritatea în momentul realizării primei analize, iar apoi la intervale regulate şi după modificări sau reparaţii la echipamentul HPLC. Vanilina poate fi degradată în acid vanilic, divanilină şi alţi compuşi prin acţiunea enzimelor intrinseci în smîntîna nepasteurizată sau produsele obţinute din aceasta.

Anexa nr.6

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Detectarea prin spectrometrie a etil esterului acidului

beta-apo-8′-carotenic în untul concentrat şi în unt

1. Această metodă descrie o procedură de determinare cantitativă a etil esterului acidului beta-apo-8′-carotenic (ester apo-carotenic) în untul concentrat şi în unt. Esterul apocarotenic este suma tuturor substanţelor prezente într-un extract din probe prelevate în condiţiile prevăzute pentru această metodă, care absorb lumină la 440 nm.

2. Grăsimea din unt se dizolvă în eter de petrol şi se măsoară absorbanţa la 440 nm. Conţinutul de ester apocarotenic se determină prin raportare la un standard extern.

3. Aparatură de laborator:

1) Pipete gradate, cu capacitate de 0,25, 0,50, 0,75 şi 1,0 ml

2) Spectrofotometru – adecvat utilizării la 440 nm (şi la 447-449 nm) şi prevăzut cu celule cu drum optic de 1 cm

3) Baloane cotate, de 20 ml şi de 100 ml

4) Balanţă analitică cu sensibilitate de 0,1 mg, cu o capacitate de cîntărire avînd o precizie de 1 mg, cu o capacitate de citire de 0,1 mg

5) Cuptor, 45 °C ± 1 °C

6) Filtre fără cenuşă cu filtrare rapidă

4. Toţi reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută.

1) Suspensie de acid apocarotenic (aproximativ 20%)

a) Conţinutul suspensiei se determină astfel:

Suspensia se încălzeşte între 45 °C şi 50 °C şi se omogenizează în recipientul original închis. Se cîntăresc aproximativ 400 mg într-un balon cotat (100 ml), se dizolvă în 20 ml cloroform şi se completează volumul cu ciclohexan. Se diluează 5,0 ml din această soluţie cu 100 ml de ciclohexan (soluţia A). Se diluează 5,0 ml de soluţie A cu ciclohexan pînă la 100 ml. Se măsoară absorbanţa la 447-449 nm (se măsoară valoarea maximă faţă de o probă de ciclohexan ca probă martor, folosindu-se celule cu drum optic de 1 cm).

Conţinutul de ester apocarotenic P (%) = (Abs_max × 40 000)/(M_susp × 2 550) sau se dezvoltă:

(Abs_max /2 550) × (100/5) × (100/5) × (100/M_susp):

Abs_max = absorbanţa soluţiei de măsurare la maximum;

M_susp = masa suspensiei (g);

2 550 = valoarea de referinţă Abs (1%, 1 cm);

P = puritatea (conţinutul) suspensiei (%).

Suspensia de ester apocarotenic este sensibilă la aer, căldură şi lumină. Se poate păstra la loc rece timp de aproximativ 12 luni, în recipientul original închis (sigilat sub azot). După deschiderea recipientului, conţinutul trebuie utilizat cît de repede posibil.

b) Soluţia etalon de ester apocarotenic, aproximativ 0,2 mg/ml.

Se cîntăresc, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 0,100 g de suspensie de ester apocarotenic (W), se dizolvă în ligroină, se transferă cantitativ într-un balon cotat cu capacitate de 100 ml şi se completează pînă la marcaj cu ligroină.

Această soluţie conţine (W × P)/10 mg/ml de ester apocarotenic.

Soluţia trebuie păstrată la rece şi la adăpost de lumină. Soluţia nefolosită se aruncă după o lună.

2) Ligroină (40-60 °C)

3) Sulfat de sodiu anhidru, granulat, deshidratat în prealabil la 102 °C timp de 2 ore

4) Cloroform

5) Ciclohexan

5. Procedura de determinare cantitativă a etil esterului acidului beta-apo-8′-carotenic (ester apo-carotenic) în untul concentrat şi în unt are loc în felul următor:

1) Prepararea probei pentru analiză

a) Unt concentrat

Proba se topeşte în cuptor la aproximativ 45 °C

b) Unt

Proba se topeşte în cuptor la aproximativ 45 °C şi se filtrează o parte reprezentativă printr-un filtru care conţine aproximativ 10 g de sulfat de sodiu anhidru într-un mediu protejat de lumina naturală sau artificială puternică şi se păstrează la 45 °C. Se colectează o cantitate adecvată de grăsime din unt.

2) Determinare

Se cîntăreşte, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 1 g de unt concentrat [sau grăsime extrasă din unt (subpunctul 1 litera b) din prezentul punct), (M). Se transferă cantitativ într-un balon cotat de 20 ml (V), folosindu-se ligroină, se completează pînă la marcaj şi se amestecă bine.

Se transferă o parte alicotă într-o celulă de 1 cm şi se măsoară absorbanţa la 440 nm, faţă de o probă martor de ligroină. Concentraţia de ester apocarotenic în soluţie se determină conform curbei de etalonare (C μg/ml).

3) Calibrare

Se pipetează 0, 0,25, 0,5, 0,75 şi 1,0 ml de soluţie etalon de ester apocarotenic în cinci baloane cotate de 100 ml. Se diluează la volum cu ligroină şi se amestecă.

Concentraţiile aproximative ale soluţiei variază între 0 şi 2 μg/ml şi se calculează cu precizie prin referire la concentraţia soluţiei etalon de ester apocarotenic (W × P)/10 mg/ml. Se măsoară absorbanţa la 440 nm faţă de o probă martor de ligroină.

Valorile absorbanţei se reprezintă pe axa y, iar pe axa x se reprezintă concentraţia esterului apocarotenic. Se calculează ecuaţia curbei de etalonare.

6. Conţinutul de ester apocarotenic, exprimat în mg/kg de produs, se calculează după cum urmează:

Unt concentrat: (C × V)/M

Unt: 0,82 (C × V)M,

unde:

C – conţinutul de ester apocarotenic, în μg/ml, citit de pe curba de etalonare (punctul 5 subpunctul 3);

V – volumul (ml) soluţiei de analiză (punctul 5 subpunctul 2);

M – masa (g) cantităţii analizate (punctul 5 subpunctul 2);

0,82 – factorul de corecţie pentru conţinutul de grăsime al untului.

7. Precizia metodei rezultă din valorile pentru repetabilitate şi reproductibilitate:

1) Repetabilitate

a) Analiza untului

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeaşi aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 1,4 mg/kg.

b) Analiza untului concentrat

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeaşi aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 1,6 mg/kg.

2) Reproductibilitate

a) Analiza untului

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 4,7 mg/kg.

b) Analiza untului concentrat

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 5,3 mg/kg.

8. Pentru a verifica marcarea corectă a produsului, trebuie prelevate trei probe din produsul studiat.

1) Unt

a) Rata de încorporare pentru unt, avînd în vedere absorbanţa de fond, este de 22 mg/kg

b) Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei şi a omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

- 17,7 mg/kg (95% din rata minimă de încorporare);

- 12,2 mg/kg (70% din rata minimă de încorporare).

Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 17,7 mg/kg şi 12,2 mg/kg.

2) Unt concentrat

a) Rata de încorporare pentru untul concentrat, avînd în vedere absorbanţa de fond, este de 24 mg/kg.

b) Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei şi a omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

- 19,2 mg/kg (95% din rata minimă de încorporare);

- 13,2 mg/kg (70% din rata minimă de încorporare).

Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 19,2 mg/kg şi 13,2 mg/kg.

Anexa nr.7

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Determinarea sitosterolului sau

a stigmasterolului în unt şi în untul concentrat prin

cromatografia în fază gazoasă cu coloană capilară

1. Metoda implică o procedură care permite determinarea cantitativă a sitosterolului şi a stigmasterolului din unt şi din untul concentrat. Conţinutul de sitosterol reprezintă suma cantităţilor de β-sitosterol şi de 22-dihidro-β-sitosterol, ceilalţi sitosteroli fiind consideraţi nesemnificativi.

2. Untul sau untul concentrat este saponificat cu hidroxid de potasiu într-o soluţie de etanol, iar substanţele nesaponificabile sînt extrase cu ajutorul dietil eterului.

Sterolii se transformă în trimetil-silil-eteri şi sînt analizaţi prin cromatografie în fază de gaz cu coloană capilară prin raportare la un etalon intern/betulina.

3. Aparatură de laborator:

1) Balon de saponificare de 150 ml, dotat cu un refrigerator cu reflux cu capete rodate

2) Conducte de decantare de 500 ml

3) Baloane de 250 ml

4) Conducte de egalizare a presiunii, de 250 ml sau cu o capacitate similară, pentru a colecta dietil eterul residual

5) Coloană de sticlă de 350 mm × 20 mm, prevăzută cu un racord cu frită

6) Baie de apă sau izotermă

7) Eprubete de reacţie de 2 ml

8) Cromatograf cu gaz care poate fi utilizat cu coloană capilară, prevăzut cu un dispozitiv de scindare format din următoarele:

a) etuvă cu termostat pentru coloane, care poate menţine temperatura dorită cu o precizie de ±1 °C;

b) injector termoreglabil;

c) detector cu ionizare în flacără şi convertor-amplificator;

d) integrator-înregistrator care poate fi utilizat împreună cu convertorul-amplificator.

9) Coloană capilară din sticlă de siliciu acoperită în întregime de BP1 sau de o substanţă echivalentă (sau orice altă coloană cu rezoluţie cel puţin egală) în strat uniform cu grosimea de 0,25 μm; coloana trebuie să poată reduce derivaţii trimetil-silil ai lanosterolului şi ai sitosterolului. Este recomandabil să se utilizeze o coloană cu lungimea de 12 m şi diametrul intern de 0,2 mm.

10) Microseringă cu ac din oţel inoxidabil de 1 μl pentru cromatografie cu gaz.

4. Toţi reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puţin echivalentă.

1) Etanol, cu o puritate de cel puţin 95%

2) Hidroxid de potasiu, soluţie 60%, prin dizolvarea a 600 g de hidroxid de potasiu (minimum 85%) în apă, la care se adaugă apă pînă la 1 l

3) Betulină cu o puritate de cel puţin 99%

a) Soluţii de betulină în eter dietilic

Concentraţia soluţiei de betulină utilizată pentru determinarea sitosterolului trebuie să fie de 1,0 mg/ml.

Concentraţia soluţiei de betulină utilizată pentru determinarea stigmasterolului trebuie să fie de 0,4 mg/ml.

4) Eter dietilic de puritate analitică (fără peroxizi sau reziduuri).

5) Sulfat de sodiu anhidru, granulat, deshidratat în prealabil la 102 °C timp de 2 ore.

6) Reactiv de sililare (TRI-SIL) sau un reactiv echivalent (Important: TRI-SIL este inflamabil şi toxic, coroziv şi are un posibil potenţial cancerigen. Personalul de laborator trebuie să cunoască normele de siguranţă aplicabile în cazul utilizării TRI-SIL şi trebuie să ia toate măsurile de precauţie care se impun).

7) Lanosterol.

8) Sitosterol, cu puritate cunoscută, mai mare sau egală cu 90% (P).

Soluţia etalon de sitosterol: se prepară o soluţie cu o precizie de 0,001 mg/ml, conţinînd aproximativ 0,5 mg/ml (W₁) de sitosterol în eter dietilic.

9) Stigmasterol, cu puritate cunoscută, mai mare sau egală cu 90% (P).

Soluţie etalon de stigmasterol: se prepară o soluţie cu o precizie de 0,001 mg/ml, conţinînd aproximativ 0,2 mg/ml (W₁) de stigmasterol în eter dietilic.

10) Amestec pentru testul de rezoluţie.

Se prepară o soluţie conţinînd 0,05 mg/ml de lanosterol şi 0,5 mg/ml de sitosterol în eter dietilic.

5. Prepararea soluţiilor etalon pentru cromatografie se efectuează în felul următor:

Se adaugă soluţia etalon intern la soluţia etalon de sterol adecvată şi, simultan, la proba saponificată (punctul 6 subpunctul 2).

1) Soluţia cromatografică etalon de sitosterol: se transferă 1 ml de soluţie etalon de sitosterol în fiecare dintre cele două eprubete de reacţie şi se elimină dietil eterul sub flux de azot. Se adaugă 1 ml de soluţie etalon intern şi se elimină dietil eterul sub flux de azot

2) Soluţia cromatografică etalon de stigmasterol: se transferă 1 ml de soluţie etalon de stigmasterol în fiecare dintre cele două eprubete de reacţie şi se elimină dietil eterul sub flux de azot. Se adaugă 1 ml de soluţie etalon intern şi se elimină dietil eterul sub flux de azot.

6. Prepararea substanţelor nesaponificabile se efectuează în felul următor:

1) Se topeşte proba de unt la o temperatură de maximum 35 °C; se amestecă cu grijă.

Se cîntăreşte, cu o precizie de 1 mg, aproximativ 1 g de unt (W₂) sau de unt concentrat (W₂) într-un balon de 150 ml. Se adaugă 50 ml de etanol şi 10 ml de soluţie de hidroxid de potasiu. Se adaptează refrigeratorul cu reflux şi se aduce la aproximativ 75 °C timp de 30 de minute. Se deconectează refrigeratorul şi se lasă balonul să se răcească la temperatura camerei.

2) Se adaugă 1,0 ml de soluţie etalon intern în balon în cazul în care se determină sitosterolul sau în cazul în care se determină stigmasterolul. Se amestecă bine. Se transferă cantitativ conţinutul balonului într-o conductă de decantare de 500 ml, se spală balonul cu 50 ml de apă, apoi cu 250 ml de eter dietilic. Se agită puternic conducta de decantare timp de 2 minute şi se lasă fazele să se separe. Se elimină faza apoasă inferioară şi se spală faza eterică agitîndu-se 4 părţi alicote succesive de 100 ml apă.

Pentru a evita formarea unei emulsii, este neapărat necesar ca primele două spălări cu apă să se efectueze uşor (10 rotaţii). Pentru a treia spălare, se poate agita mai puternic timp de 30 de secunde. În cazul în care se formează o emulsie, aceasta poate fi eliminată prin adăugarea a 5 pînă la 10 ml de etanol. În cazul în care se adaugă etanol, este absolut necesar să se efectueze încă două spălări puternice cu apă.

3) Se trece faza eterică limpede şi desaponificată pe o coloană de sticlă care conţine 30 g de sulfat de sodiu anhidru. Se colectează eterul într-un balon de 250 ml. Se adaugă bile antiproiecţie şi se evaporă pînă la uscare aproape completă într-o baie de apă sau într-o izotermă, colectîndu-se solvenţii care trebuie eliminaţi.

În cazul în care anumite părţi din probă se evaporă în uscat la o temperatură prea ridicată, este posibil să se piardă cantităţi de sterol.

7. Prepararea trimetil-silil-eterilor se efectuează în felul următor:

1) Se transferă soluţia de eter rămasă în balon într-o eprubetă de reacţie de 2 ml cu ajutorul a 2 ml de dietil eter şi se elimină eterul sub flux de azot. Se spală balonul cu două părţi alicote suplimentare de 2 ml de eter dietilic, transferîndu-se conţinutul în eprubetă şi eliminîndu-se eterul de fiecare dată sub flux de azot.

2) Se sililează proba prin adăugarea a 1 ml de TRI-SIL. Se astupă eprubeta şi se agită puternic pentru a produce dizolvarea. În cazul în care proba nu s-a dizolvat complet, se aduce la temperatura de 65-70 °C. Se lasă să stea cel puţin 5 minute înainte de a se injecta în cromatograful cu gaz. Se sililează etaloanele în acelaşi mod ca şi probele. Se sililează amestecul pentru testul de rezoluţie în acelaşi mod ca şi probele.

Sililarea trebuie efectuată într-un mediu anhidru. Sililarea incompletă a betulinei se recunoaşte prin obţinerea unui al doilea vîrf apropiat de cel al betulinei.

Prezenţa etanolului în timpul sililării va interfera cu procesul de sililare. Acest fapt poate fi consecinţa unei spălări insuficiente în momentul extragerii. În cazul în care această problemă persistă, în etapa de extragere se va include o a cincea spălare, cu agitare puternică timp de 30 de secunde.

8. Pentru analiza prin cromatografie cu gaz se instalează cromatograful cu gaz conform instrucţiunilor producătorului.

Condiţiile pentru procedură sînt:

1) temperatura coloanei: 265 °C;

2) temperatura injectorului: 265 °C;

3) temperatura detectorului: 300 °C;

4) debitul gazului vector: 0,6 ml/min;

5) presiunea hidrogenului: 84 kPa;

6) presiunea aerului: 155 kPa;

7) fracţionarea probei: de la 10:1 la 50:1; raportul de fracţionare trebuie optimizat în funcţie de instrucţiunile producătorului şi de liniaritatea răspunsului detectorului şi validat ulterior în funcţie de intervalele de concentraţii luate în considerare.

Camera de vaporizare trebuie curăţată după fiecare utilizare sau saptămînal, în cazul în care nu a fost folosită;

8) cantitatea de substanţă injectată: 1 μl de soluţie TMSE.

Se lasă sistemul să se echilibreze şi se obţine un răspuns stabil înainte de a se efectua vreo analiză.

Aceste condiţii pot fi modificate în funcţie de caracteristicile coloanei şi ale cromatografului cu gaz, pentru a se obţine cromatograme care să îndeplinească condiţiile următoare:

a) vîrful sitosterolului trebuie să prezinte o rezoluţie suficientă faţă de lanosterol

b) timpii relativi de retenţie ai sterolilor de mai jos trebuie să fie de aproximativ:

colesterol: 1,0;

stigmasterol: 1,3;

sitosterol: 1,5;

betulină: 2,5;

c) timpul de retenţie al betulinei trebuie să fie de aproximativ 24 de minute.

9. Injectarea soluţiei de probă se efectuează în felul următor:

Se injectează 1 μl de soluţie etalon sililată (stigmasterol sau sitosterol) şi se ajustează parametrii de calibrare ai integratorului.

Se injectează din nou 1 μl de soluţie etalon sililată pentru a se determina coeficientul de răspuns faţă de betulină.

Se injectează 1 μl de soluţie de probă sililată şi se măsoară suprafaţa vîrfurilor. Fiecare serie de probe trebuie precedată şi urmată de o injectare de soluţie etalon.

În general, injectarea soluţiei de probă se poate efectua după o serie de şase probe.

Integrarea vîrfului sitosterolului trebuie să înglobeze suprafaţa vîrfului 22- dihidro-β-sitosterolului (stigmastanol) care apare imediat după sitosterol în momentul evaluării sitosterolului total.

10. Calcularea rezultatelor se efectuează în felul următor:

Se determină suprafaţa vîrfurilor sterolului şi a vîrfurilor betulinei în cele două etaloane, la începutul şi la finalul fiecărei serii, şi se calculează R₁:

R₁ – (suprafaţa medie a vîrfului sterolului în etalon)/(suprafaţa medie a vîrfului betulinei în etalon)

Se determină suprafaţa vîrfului de sterol (stigmasterol sau sitosterol) şi a vîrfului betulinei în probă şi se calculează R₂:

R₂ – (suprafaţa vîrfului sterolului în probă)/(suprafaţa vîrfului betulinei în probă)

W₁ – conţinutul de sterol al etalonului (mg) din 1 ml de soluţie etalon;

W₂ – masa probei (g);

P – puritatea sterolului etalon.

Conţinutul de sterol din probă (mg/kg) = [(R ₂) / (R ₁)] × [(W ₁) / (W ₂)] × P × 10.

11. Precizia metodei rezultă din valorile pentru repetabilitate şi reproductibilitate:

1) Unt

a) Repetabilitate

Stigmasterol

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeaşi aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 19,3 mg/kg.

Sitosterol

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeaşi aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 23,0 mg/kg.

b) Reproductibilitate

Stigmasterol

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 31,9 mg/kg.

Sitosterol

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 8,7% din valoarea medie a acestor determinări.

2) Unt concentrat

a) Repetabilitate

Stigmasterol

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeaşi aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 10,2 mg/kg.

Sitosterol

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate în cel mai scurt interval de timp posibil de un operator care utilizează aceeaşi aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 3,6% din valoarea medie a acestor determinări.

b) Reproductibilitate

Stigmasterol

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 25,3 mg/kg.

Sitosterol

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate de operatori din laboratoare diferite care utilizează aparatură diferită pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 8,9% din valoarea medie a acestor determinări.

12. Pentru a verifica marcarea corectă a produsului, trebuie prelevate trei probe din produsul studiat.

1) Unt

a) Stigmasterol

Rata de încorporare pentru stigmasterol este de 150 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puţin 95%, pe o tonă de unt, respectiv 142,5 mg/kg, sau de 170 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puţin 85%, pe o tonă de unt, respectiv 144,5 mg/kg.

Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei şi a omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

- 115,8 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95% pentru stigmasterol cu o puritate de 95%);

- 117,7 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95% pentru stigmasterol cu o puritate de 85%);

- 80,1 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70% pentru stigmasterol cu o puritate de 95%);

- 81,5 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70% pentru stigmasterol cu o puritate de 85%).

Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 115,8 mg/kg şi 80,1 mg/kg sau între 117,7 mg/kg şi 81,5 mg/kg.

b) Sitosterol

Rata de încorporare pentru sitosterol este de 600 g de sitosterol, cu o puritate de cel puţin 90%, pe o tonă de unt, respectiv 540 mg/kg.

Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se folosesc pentru verificarea ratei şi omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

- 482,6 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95% pentru sitosterol cu o puritate de 90%);

- 347,6 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70% pentru sitosterol cu o puritate de 90%).

Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 482,6 mg/kg şi 347,6 mg/kg.

2) Unt concentrat

a) Stigmasterol

Rata de încorporare pentru stigmasterol este de 150 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puţin 95%, pe o tonă de unt concentrat, respectiv 142,5 mg/kg; sau de 170 g de stigmasterol, cu o puritate de cel puţin 85%, pe o tonă de unt concentrat, respectiv 144,5 mg/kg.

Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei şi a omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

- 118,5 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95% pentru stigmasterol cu o puritate de 95%);

- 120,4 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95% pentru stigmasterol cu o puritate de 85%);

- 82,9 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70% pentru stigmasterol cu o puritate de 95%);

- 84,3 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70% pentru stigmasterol cu o puritate de 85%).

Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 118,5 mg/kg şi 82,9 mg/kg sau între 120,4 mg/kg şi 84,3 mg/kg.

b) Sitosterol

Rata de încorporare pentru sitosterol este de 600 g de sitosterol, cu o puritate de cel puţin 90%, pe o tonă de unt concentrat, respectiv 540 mg/kg.

Rezultatele pentru cele trei probe obţinute în urma analizei produsului se utilizează la verificarea ratei şi a omogenităţii de încorporare a marcatorilor, iar cel mai slab rezultat se compară cu următoarele limite:

- 480,9 mg/kg (rată de încorporare minimă de 95% pentru sitosterol cu o puritate de 90%);

- 345,9 mg/kg (rată de încorporare minimă de 70% pentru sitosterol cu o puritate de 90%).

Concentraţia marcatorului din proba cu rezultatul cel mai slab este utilizată prin interpolare între 480,9 mg/kg şi 345,9 mg/kg.

Anexa nr.8

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Metoda de referinţă

pentru detectarea laptelui de vacă şi a cazeinatului în brînzeturile

 produse din lapte de oaie, lapte de capră sau lapte de bivoliţă

 sau din amestecuri de lapte de oaie, capră şi bivoliţă

1. Metoda implică o procedură de detectare a laptelui de vacă şi a cazeinei în brînzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capră, lapte de bivoliţă sau din amestecuri de lapte de oaie, capră şi bivoliţă prin focalizarea izoelectrică a γ-cazeinelor după plasminoliză.

2. Această metodă poate fi folosită pentru detectarea sensibilă şi specifică a laptelui de vacă natural şi tratat termic şi a cazeinatului în brînzeturile proaspete şi maturate produse din lapte de oaie, lapte de capră, lapte de bivoliţă sau din amestecuri de lapte de oaie, capră şi bivoliţă. Nu poate fi folosită pentru detectarea falsificării laptelui şi a brînzei cu concentrate de proteine de zer de bovine tratate termic.

3. Principiul metodei constă în:

1) izolarea cazeinei din brînză şi din probele de referinţă;

2) dizolvarea cazeinelor izolate şi tratarea acestora prin clivare plasminică;

3) focalizarea izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină în prezenţa ureii şi colorarea proteinelor;

4) evaluarea benzilor colorate de γ₂- şi γ₃-cazeină (dovezi ale prezenţei laptelui de vacă) prin compararea benzilor obţinute din probă cu benzile obţinute pe acelaşi gel din probele de referinţă conţinînd 0% şi 1% lapte de vacă.

4. În afara cazurilor în care se precizează altceva, produsele chimice utilizate trebuie să fie de puritate analitică. Apa folosită trebuie să fie dublu-distilată sau de o puritate echivalentă.

Următoarele detalii se aplică gelurilor de poliacrilamide cu conţinut de uree preparate în laborator, cu dimensiunile de 265 × 125 × 0,25 mm. În cazul în care se folosesc geluri de alte dimensiuni sau tipuri, poate fi necesară modificarea condiţiilor de separare.

Focalizarea izoelectrică

1) Reactivi pentru producerea gelurilor de poliacrilamide cu conţinut de uree

a) Soluţie “stock” de gel

Se dizolvă în apă:

4,85 g acrilamidă;

0,15 g N, N′-metilen-bis-acrilamidă (BIS);

48,05 g uree;

15,00 g glicerol (87% m/m);

şi se completează cu apă pînă la 100 ml, apoi se păstrează produsul obţinut în refrigerator, într-un recipient de sticlă de culoare maro.

În locul cantităţilor fixe de acrilamide neurotoxice menţionate mai sus se poate folosi o soluţie de acrilamidă/BIS prefabricată disponibilă în comerţ. În cazul în care o asemenea soluţie conţine 30% m/v acrilamidă şi 0,8% m/v BIS, cantităţile de acrilamidă şi BIS din preparatul de mai sus se înlocuiesc cu 16,2 ml de soluţie. Termenul de valabilitate a soluţiei “stock” este de maximum 10 zile; în cazul în care conductibilitatea acesteia este mai mare de 5 μS, se deionizează substanţa prin agitare cu 2 g Amberlite MB-3 timp de 30 de minute, ulterior se filtrează printr-o membrană de 0,45 μm.

b) Soluţia de gel

Se prepară o soluţie de gel amestecînd aditivii şi amfoliţii cu soluţia “stock” de gel:

9,0 ml soluţie “stock”;

24 mg β-alanină;

500 μl amfolit pH 3,5-9,5;

250 μl amfolit pH 5-7;

250 μl amfolit pH 6-8.

Se amestecă soluţia de gel şi se degazeifică timp de două sau trei minute într-o baie ultrasonică sau sub vid.

Soluţia de gel se prepară imediat înainte de a o turna (punctul 6 subpunctul 2)).

c) Soluţii catalizator

N, N, N′ N′ – tetrametiletilendiamină (Temed)

40% m/v persulfat de amoniu (PER):

Se dizolvă 800 mg PER în apă şi se completează cu apă pînă la 2 ml.

A se folosi întotdeauna soluţie PER proaspăt preparată.

2) Fluid de contact – kerosen sau parafină lichidă

3) Soluţie anodică

Se dizolvă în apă 5,77 g acid fosforic (85% m/m) şi se diluează pînă la 100 ml.

4) Soluţie catodică

Se dizolvă în apă 2,00 g hidroxid de sodiu şi se diluează pînă la 100 ml.

Prepararea probei

5) Reactivi pentru izolarea proteinelor

a) Se diluează acid acetic (25,0 ml acid acetic cristalizabil completat cu apă pînă la 100 ml)

b) Diclorometan

c) Acetonă

6) Soluţie tampon de dizolvare a proteinelor

Se dizolvă în apă:

5,75 g glicerol (87% m/m);

24,03 g uree;

250 mg ditiotreitol;

şi se completează cu apă pînă la 50 ml.

Se păstrează substanţa în refrigerator, termen de valabilitate: maximum o săptămînă.

7) Reactivi pentru clivarea plasminică a cazeinelor

a) Soluţie tampon de carbonat de amoniu

Se titrează pînă la pH 8 o soluţie de hidrogencarbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml apă) conţinînd acid etilendiaminotetraacetic 0,05 mol/l (EDTA, 1,46 g/100 ml) cu o soluţie de carbonat de amoniu 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml apă) conţinînd 0,05 mol/l EDTA.

b) Plasmină bovină, cu activitate de minimum 5 U/ml

c) Soluţie de acid ε-aminocaproic pentru inhibarea enzimelor

Se dizolvă 2,624 g acid ε-aminocaproic (acid 6-amino-n-hexanoic) în 100 ml de etanol 40% (v/v).

8) Standarde

a) Amestecuri de lapte închegat de oaie şi capră cu conţinutul de 0%, respectiv 1% lapte de vacă.

b) Prepararea probelor de referinţă provizorii de laborator din lapte de bivoliţă închegat conţinînd 0% şi 1% lapte de vacă.

Laptele degresat se prepară prin centrifugarea laptelui crud de bivoliţă sau de vacă în vrac la 37 °C (2 500 g, timp de 20 de minute). După răcirea rapidă a tubului şi a conţinutului la 6-8 °C, stratul superior de grăsime se îndepărtează în totalitate. Pentru prepararea probei etalon 1% se adaugă 5,00 ml de lapte de vacă degresat la 495 ml lapte de bivoliţă degresat într-un vas de 1 l, se ajustează pH-ul la 6,4 prin adăugarea de acid lactic diluat (10% m/v). Se ajustează temperatura la 35 °C şi se adaugă 100 μl de cheag de viţel, se amestecă timp de 1 minut, apoi se acoperă vasul cu o folie de aluminiu şi se lasă la 35 °C timp de 1 oră pentru a se putea forma coagulul. După formarea acestuia, laptele închegat este liofilizat în întregime fără omogenizare prealabilă şi fără a se extrage zerul. După liofilizare, produsul se zdrobeşte pînă se obţine o pulbere fină omogenă. Pentru prepararea probei etalon 0%, se urmează aceeaşi procedură folosind lapte degresat de bivoliţă veritabil. Probele trebuie păstrate la –20 °C.

Înaintea preparării probelor etalon, se recomandă verificarea purităţii laptelui de bivoliţă prin focalizarea izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină.

Reactivi pentru colorarea proteinelor

9) Fixativ

Se dizolvă în apă 150 g acid tricloroacetic şi se completează cu apă pînă la 1 000 ml.

10) Soluţie pentru decolorare

Se diluează în apă distilată pînă la 2 000 ml 500 ml metanol şi 200 ml acid acetic cristalizabil.

Se prepară zilnic o soluţie proaspătă de decolorare; soluţia poate fi preparată prin amestecarea de volume egale de soluţii “stock” metanol 50% (v/v) şi acid acetic cristalizabil 20% (v/v).

11) Soluţii pentru colorare

a) Soluţie pentru colorare (soluţie “stock” 1)

Se dizolvă 3,0 g Albastru Briliant de Coomassie G-250 în 1 000 ml metanol 90% (v/v) folosind un agitator magnetic (timp de aproximativ 45 minute), apoi se filtrează prin două filtre pliate de viteză medie.

b) Soluţie pentru colorare (soluţie “stock” 2)

Se dizolvă 5,0 g sulfat de cupru pentahidrat în 1 000 ml acid acetic 20% (v/v).

c) Soluţie pentru colorare (soluţie de lucru)

Se amestecă 125 ml din fiecare soluţie “stock” imediat înainte de colorare.

Se recomandă prepararea soluţiei de colorare în ziua folosirii acesteia.

5. Aparatură de laborator:

1) Plăci de sticlă (265 × 125 × 4 mm); rolă de cauciuc (lăţime 15 cm); masă reglabilă

2) Foaie susţinătoare de gel (265 × 125 mm)

3) Foaie de acoperire (280 × 125 mm). Se lipeşte o bucată de bandă adezivă (280 × 6 ×0,25 mm) pe fiecare latură lungă (figura 1).

Figura 1. Schiţa foii de acoperire

4) Cuvă de electrofocalizare cu placă de răcire cu unitate de alimentare electrică adecvată (≥ 2,5 kV) sau cu aparat automat de electroforeză

5) Criostat de circulaţie controlat termostatic la 12 ± 0,5 °C

6) Centrifugă ajustabilă la 3 000 g

7) Benzi de electrozi (lungime ≥ 265 mm)

8) Sticle picurătoare de plastic pentru soluţiile anodice şi catodice

9) Aplicatoare de probe (10 × 5 mm, vîscoză sau hîrtie de filtru cu absorbţie redusă a proteinelor)

10) Foarfeci, scalpele şi pensete din oţel inoxidabil

11) Cuve din oţel inoxidabil pentru colorare şi decolorare

12) Omogenizator ajustabil cu tijă (diametrul tijei 10 mm), viteză de rotaţie 8 000-20 000 rpm

13) Agitator magnetic

14) Baie ultrasonică

15) Aparat de sudură a foliilor

16) Micropipete de 25 μl

17) Concentrator sub vid sau liofilizator

18) Baie de apă cu agitator, controlată termostatic şi ajustabilă la 35 şi 40 ± 1 °C

19) Echipament de densitometrie cu citire la λ = 634 nm.

6. Procedura de detectare a laptelui de vacă şi a cazeinei în brînzeturile produse din lapte de oaie, lapte de capră, lapte de bivoliţă sau din amestecuri de lapte de oaie, capră şi bivoliţă are loc în felul următor:

1) Prepararea probei

a) Izolarea cazeinelor

Se cîntăreşte într-un tub de centrifugă de 100 ml echivalentul a 5 g materie uscată de brînză sau probă de referinţă, se adaugă 60 ml apă distilată şi se omogenizează cu un omogenizator cu tijă (8 000-10 000 rpm). Se ajustează la un pH de 4,6 cu o soluţie de acid acetic diluat şi se pune în centrifugă (5 minute, 3 000 g). Se decantează grăsimea şi zerul, se omogenizează reziduul la 20 000 rpm în 40 ml apă distilată ajustată la un pH de 4,5 cu soluţie de acid acetic diluat, se adaugă 20 ml diclorometan, se omogenizează din nou şi se pune în centrifugă (5 min., 3 000 g). Se îndepărtează cu o spatulă stratul de cazeină care se află între faza apoasă şi cea organică (figura 2) şi se elimină ambele faze. Se reomogenizează cazeina în 40 ml apă distilată şi în 20 ml diclorometan, apoi se pune în centrifugă. Se repetă procedura pînă cînd ambele faze extrase sînt incolore (de două sau trei ori). Se omogenizează reziduul de proteină cu 50 ml acetonă şi se filtrează printr-o hîrtie de filtru pliată de viteză medie. Se spală de fiecare dată reziduul de pe filtru cu cîte două porţii separate de 25 ml acetonă şi se lasă să se usuce în aer sau sub jet de azot, apoi se transformă în pulbere într-un mojar.

Figura 2. Strat de cazeină plutind după centrifugare

între faza apoasă şi faza organică

Cazeina izolată uscată trebuie păstrată la –20 °C.

b) Clivarea plasminică al ß-cazeinelor pentru intensificarea γ-cazeinelor

Se prepară o suspensie de 25 mg cazeine izolate (subpunctul 1) din prezentul punct) în 0,5 ml soluţie tampon de carbonat de amoniu şi se omogenizează timp de 20 minute folosind, de exemplu, tratamentul ultrasonic. Se încălzeşte la 40 °C şi se adaugă 10 μl plasmină, apoi se amestecă şi se incubează timp de o oră la 40 °C, agitînd continuu. Pentru a inhiba enzimele se adaugă 20 μl soluţie de acid ε-aminocaproic, apoi se adaugă 200 mg uree solidă şi 2 mg ditiotreitol.

Pentru a obţine o simetrie mai mare a benzilor cazeinice focalizate, se recomandă liofilizarea soluţiei după adăugarea acidului ε-aminocaproic şi dizolvarea reziduurilor în 0,5 ml soluţie tampon pentru dizolvarea proteinelor.

2) Prepararea gelurilor poliacrilamide care conţin uree

Cu ajutorul cîtorva picături de apă se întinde foaia susţinătoare de gel pe o placă de sticlă, îndepărtîndu-se surplusul de apă cu un şerveţel. Se întinde în mod similar foaia de acoperire cu spaţiatoare (0,25 mm) pe o altă placă de sticlă. Se aşează placa orizontal pe masa reglabilă.

Se adaugă 10 μl Temed la soluţia de gel degazeificată pregătită, se amestecă şi se adaugă 10 μl soluţie PER, se amestecă bine şi se toarnă imediat amestecul într-un strat egal pe centrul foii de acoperire. Se pune o margine a plăcii susţinătoare de gel (cu faţa foii îndreptată în jos) pe placa de acoperire şi se coboară încet, astfel încît între foi să se formeze un strat subţire de gel care să se întindă uniform şi fără bule (figura 3). Se coboară cu grijă pînă la capăt placa susţinătoare de gel, folosind o spatulă subţire, apoi se aşează încă trei plăci de sticlă deasupra, pentru a acţiona ca greutate. După încheierea polimerizării (aproximativ 60 minute), se transferă gelul polimerizat împreună cu foaia de acoperire pe foaia susţinătoare de gel, înclinînd plăcile de sticlă. Se curăţă cu grijă spatele foii susţinătoare de gel pentru a elimina reziduurile de gel şi de uree. Se sudează marginile “sandvişului” de gel, astfel încît să se obţină un tub şi se păstrează în refrigerator (timp de maximum şase săptămîni).

Figura 3. Tehnică de pliere pentru obţinerea straturilor foarte fine de geluri poliacrilamide

a – bandă adezivă pentru spaţiere (0,25 mm);

b – foaie de acoperire;

c, e – plăci de sticlă;

d – soluţie de gel;

f – foaie susţinătoare de gel

Foaia de acoperire şi spaţiatoarele pot fi refolosite. Gelul de poliacrilamidă poate fi tăiat la dimensiuni mai mici, acţiune care este recomandată în cazul în care există puţine probe sau în cazul în care se foloseşte un aparat automat de electroforeză (două geluri format 4,5 × 5 cm).

3) Focalizarea izoelectrică

Se reglează termostatul de răcire la 12 °C. Se şterge cu kerosen spatele foii susţinătoare de gel, apoi se picură cîteva picături de kerosen pe centrul blocului de răcire. Se rulează apoi pe el “sandvişul” de gel, cu partea susţinătoare de gel îndreptată în jos, avînd grijă să se evite formarea bulelor. Se şterge excesul de kerosen şi se îndepărtează foaia de acoperire. Se îmbibă benzile de electrozi în soluţiile electrolitice, se taie după lungimea gelului şi se plasează în poziţia prevăzută (distanţa dintre electrozi de 9,5 cm).

Condiţii pentru focalizarea izoelectrică:

Dimensiunile gelului 265 × 125 × 0,25 mm

_______________________________

(¹) Aplicarea probei: După prefocalizare (etapa 1) se picură 18 μl din proba şi din soluţiile standard pe aplicatorii probei (10 × 5 mm), se plasează aplicatorii pe gel la distanţă de 1 mm unul de celălalt şi la 5 mm longitudinal faţă de anod şi se apasă uşor. Procedura de focalizare se finalizează în condiţiile specificate mai sus, îndepărtînd cu grijă aplicatorii probei după 60 de minute de focalizare a probei.

În cazul în care se modifică grosimea sau lăţimea gelurilor, atunci intensitatea şi puterea curentului trebuie ajustate în consecinţă.

4) Colorarea proteinelor

a) Fixarea proteinelor

Se îndepărtează benzile de electrozi imediat după stingerea aparatului şi se plasează imediat gelul într-o cuvă de colorare/decolorare umplută cu 200 ml fixativ; se lasă acolo timp de 15 minute, agitînd încontinuu.

b) Spălarea şi colorarea plăcii de gel

Se scurge cu grijă fixativul şi se spală placa de gel de două ori, timp de cîte 30 de secunde, cu 100 ml soluţie decolorantă. Se decantează soluţia decolorantă şi se umple cuva cu 250 ml soluţie colorantă; se lasă 45 de minute să se coloreze, agitîndu-se uşor cuva.

c) Decolorarea plăcii de gel

Se decantează soluţia colorantă, se spală placa de gel de două ori, cu cîte 100 ml soluţie decolorantă, apoi se agită timp de 15 minute cu 200 ml soluţie decolorantă şi se repetă pasul de decolorare de cel puţin două-trei ori, pînă cînd fundul vasului este curăţat şi incolor. Se clăteşte apoi cu apă distilată placa de gel (2 × 2 minute) şi se usucă la aer (2-3 ore) sau cu un uscător de păr (10-15 minute).

Fixarea, spălarea, colorarea şi decolorarea se efectuează la 20 °C. A nu se folosi temperaturi ridicate.

În cazul în care se preferă colorarea mai sensibilă cu argint, probele de cazeină tratate cu plasmină trebuie diluate la 5 mg/ml.

7. Evaluarea este efectuată prin compararea benzilor de proteine ale probei necunoscute cu probele de referinţă efectuate pe acelaşi gel. Detectarea laptelui de vacă în brînzeturile din lapte de oaie, lapte de capră şi lapte de bivoliţă şi în amestecurile de lapte de oaie, capră şi bivoliţă se face prin intermediul γ₃- şi γ₂-cazeinelor, ale căror puncte izoelectrice se află în intervalul pH 6,5-pH 7,5 (figurile 4a, 4b şi 5). Limita de detecţie este mai mică de 0,5%.

Figura 4a. Focalizare izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină din brînză

din lapte de oaie şi de capră care conţine diferite cantităţi de lapte de vacă

% CM = procentaj lapte de vacă;

C = vacă;

E = oaie;

G = capră.

Este ilustrată jumătatea de sus a gelului IEF.

Figura 4b. Focalizare izoelectrică a cazeinelor tratate cu plasmină din brînză din amestec

de lapte de oaie, capră şi bivoliţă care conţine diferite cantităţi de lapte de vacă

% CM = procentaj lapte de vacă;

1 + = probă conţinînd 1% lapte de vacă şi dopat cu cazeină pură de lapte de vacă la mijlocul traiectului gelului.

C = vacă;

E = oaie;

G = capră;

B = bivoliţă.

Este ilustrată distanţa separatoare totală a gelului IEF.

Figura 5. Suprapunerea densitogramelor probelor etalon (STD) şi a probelor de brînză

preparate din amestec de lapte de oaie şi de capră după focalizarea izoelectrică

a, b – probe etalon conţinînd 0, respectiv 1% lapte de vacă;

c-g – probe de brînză conţinînd 0, 1, 2, 3 şi 7% lapte de vacă.

C – vacă;

E – oaie;

G – capră.

Jumătatea superioară a gelului IEF a fost scanată la λ = 634 nm.

1) Estimare vizuală

Pentru evaluarea vizuală a cantităţii de lapte de vacă se recomandă ajustarea concentraţiilor probelor şi a probelor etalon pentru a obţine acelaşi nivel de intensitate a γ₂- şi γ₃-cazeinelor din laptele de ovine, caprine şi/sau bivoliţe (a se vedea “γ₂ E, G, B” şi “γ₃ E, G, B” din figurile 4 a şi 4 b şi din figura 5). După aceasta, nivelul de lapte de vacă (mai mic decît, egal cu sau mai mare de 1%) din proba necunoscută poate fi estimat direct, prin compararea intensităţii γ₃- şi γ₂-cazeinelor din laptele de vacă (a se vedea “γ₃ C” şi “γ₂ C” din figurile 4 a, 4 b şi 5) cu cea a probelor de referinţă de 0% şi 1% (oaie, capră) sau cu standardele provizorii de laborator (bivoliţă).

2) Estimare densitometrică

În cazul în care este disponibilă, se aplică densitometria pentru determinarea raportului dintre suprafaţa vîrfurilor γ₂- şi γ₃-cazeinelor din laptele de vacă, respectiv din laptele de oaie, capră şi/sau bivoliţă (figura 5). Această valoare se compară cu raportul dintre suprafaţa vîrfurilor γ₂- şi γ₃-cazeinelor pentru proba de referinţă 1% (oaie, capră) sau pentru standardul provizoriu de laborator (bivoliţă), analizate pe acelaşi gel.

Metoda funcţionează corespunzător în cazul în care se obţine un semnal pozitiv clar pentru ambele cazeine bovine γ₂- şi γ₃- din proba de referinţă 1%, dar nu şi din proba de referinţă 0%. Dacă nu, procedura trebuie îmbunătăţită respectîndu-se cu exactitate detaliile metodei.

O probă este considerată pozitivă în cazul în care ambele cazeine bovine γ₂- şi γ₃- sau raportul suprafeţei vîrfurilor corespunzător sînt mai mari sau egale cu nivelul din proba de referinţă 1%.

Anexa nr.9

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Metoda de referinţă pentru detectarea bacteriilor coliforme

din unt, lapte praf degresat, cazeină şi cazeinaţi

1. Prepararea probelor se realizează în conformitate cu standardul SM SR EN ISO 6887-5.

2. Detectarea bacteriilor coliforme se efectuează în conformitate cu standardul SM ISO 4831.

Se inoculează probe de 1 g de unt sau de 0,1 g de lapte praf degresat sau cazeină/cazeinaţi în mediul de cultură.

Se inoculează trei tuburi pentru fiecare probă.

3. În cazul în care cele 3 tuburi produc 3 rezultate negative, rezultatul este “conform”.

În cazul în care cele 3 tuburi produc 2 sau 3 rezultate pozitive, rezultatul este “neconform”.

În cazul în care cele 3 tuburi produc 2 rezultate negative, analiza se repetă (cu două tuburi).

1) În cazul în care cele 2 rezultate sînt negative, rezultatul este “conform”.

2) În cazul în care cel puţin 1 rezultat este pozitiv, rezultatul este “neconform”.

Anexa nr.10

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Determinarea lactozei în furajele combinate

1. Metoda implică o procedură de determinare a lactozei în furajele combinate.

2. Conţinutul de lactoză se defineşte ca procent de masă determinat prin procedura descrisă.

Conţinutul de lactoză anhidră se exprimă în g per 100 g.

3. Furajul compus se reconstituie cu apă. Se adaugă soluţie “Biggs” la o parte alicotă cîntărită diluată pentru precipitarea grăsimii şi a fracţiunilor componente ale proteinei furajului combinat. Proba este filtrată (sau centrifugată) şi filtratul (sau supernatantul) este injectat printr-o coloană HPLC de schimb de cationi în forma de plumb folosind apă de calitate HPLC ca fază mobilă. Lactoza eluată este detectată cu un refractometru ⁱ diferenţial.

4. Se folosesc numai reactivi de calitate analitică recunoscută, cu excepţia cazurilor în care se precizează altceva, şi apă de calitate HPLC degazată.

1) Lactoză

Monohidratatul de D-Lactoză [(C₁₂H₂₂)O₁₁. H₂O] poate prelua umezeala suplimentară. Înainte de folosire, se măsoară cantitatea reală de apă cu titratorul Karl-Fisher sau se elimină umezeala suplimentară plasînd lactoza într-un cuptor la 105°C, timp de 8 ore.

2) Soluţie concentrată Biggs/Szijarto

Se dizolvă 9,10 g dihidrat de acetat de zinc [Zn(CH₃COO)₂.2H₂O] şi 5,46 g de acid fosfotungstic monohidrat (H₃[P(W₃O₁₀)₄.xH₂O]) în aproximativ 70 ml cu apă de calitate HPLC într-un balon cotat de 100 ml.

Se adaugă 5,81 ml acid acetic glacial (CH₃COOH). Se diluează pînă la nivelul de 100 ml cu apă de calitate HPLC şi se amestecă. Soluţia poate fi depozitată la temperatura camerei pentru o perioadă de 1 an.

3) Soluţie diluată Biggs/Szijarto

Se diluează 25 ml de soluţie concentrată Biggs/Szijarto cu apă pînă la nivelul de 500 ml folosind un balon cotat. Soluţia poate fi depozitată la temperatura camerei pentru o perioadă de 1 lună.

4) Prepararea apei de calitate HPLC

Se filtrează apă ultrapură folosind sistemul de filtrare cu vid. Pentru a îmbunătăţi performanţa pompei şi pentru a obţine o linie de bază stabilă, se degazifică zilnic faza mobilă optînd pentru una dintre tehnicile disponibile, cum ar fi spălarea cu heliu, dezintegrarea, sistemul de degazificare în vid sau în linie.

Pentru a prelungi viaţa coloanei este esenţial ca procentul de bioxid de carbon al eluantului să fie cît mai mic posibil şi să fie împiedicată o reabsorbţie.

5. Aparatură obişnuită de laborator şi, în special, următoarele:

1) Coloană de plastic pentru schimb ioni HPLC

Umplerea coloanei: copolimer polistiren-divinilbenzen cu legătură între catene 8%, funcţionalizat cu grupuri de schimb de cationi în formă de plumb.

Dimensiunile coloanei: lungimea 300 mm, diametrul interior aproximativ 8 mm.

Este posibilă şi utilizarea altor diametre, cu condiţia ca debitul să fie reglat în mod corespunzător.

2) Coloană de control

Coloana de control este o combinaţie între un schimbător de cationi separat (H⁺) şi un schimbător de anioni (CO₃-), fiecare introdus în coloane de aproximativ 30 mm × 4,6 mm (L × ID) şi conectat în serie sau sub forma unui strat combinat constînd din AG 50W-X4, – 400 ochiuri de sită (H⁺) şi AG3-X4A, 200-400 ochiuri de sită (OH-) în raportul de 35:65 (m/m) umplute manual într-o coloană de aproximativ 20 × 9 mm (L × ID).

3) Cuptorul de coloană

Cuptor capabil să menţină o temperatură constantă de 85 °C ± 1 °C.

4) Pompa de HPLC

Pompă capabilă să genereze un debit constant (fluctuaţii < 0,5%) la 0,2-1,0 m/min.

5) Dispozitiv de injectare a HPLC

Autosondă capabilă să injecteze 25 μL şi avînd o repetabilitate < 0,5%.

Ca soluţie alternativă poate fi folosit un dispozitiv manual.

6) Detector de HPLC

Detector de index refractant de mare sensibilitate avînd un zgomot < 5.10^-9 RI unităţi.

7) Integrator

Software sau un integrator dedicat pentru a realiza strîngerea datelor, procesarea şi generarea suprafeţei vîrfurilor şi a înălţimilor vîrfurilor, care pot fi transformate în concentraţii de lactoză.

8) Unitate de purificare a apei

Sistem capabil să furnizeze apă foarte pură avînd o rezistivitate >14 MΩ.cm.

9) Unitate de filtrare a solventului

Sistem care asigură filtrarea apei folosind un filtru cu membrană filtrantă cu diametrul porilor de 0,45 μm.

Multe unităţi de purificare a apei au o unitate de filtrare integrată de 0,45 sau de 0,2 μm. Se poate renunţa la o filtrare suplimentară dacă această apă este folosită direct.

10) Balanţă analitică

Balanţă avînd un afişaj de 0,1 mg.

11) Baie de apă

Baie de apă capabilă să menţină o temperatură de 40 °C (±0,5).

12) Centrifugă

Avînd o capacitate de generare de cel puţin 3 000 g pentru eprubete Eppendorf sau echivalente sau pentru tipuri mai mari de eprubete.

13) Balon cotat de 50 mL

Capacitate de 50 mL, clasa A.

Pot fi folosite şi baloane de altă capacitate ţinînd cont de factorul volum.

14) Balon cotat de 100 mL

Capacitate de 100 mL, clasa A.

15) Pipetă gradată

Pipetă gradată de 10 mL.

Ca soluţie alternativă se poate folosi un picurător manual cu o capacitate de 5 mL, adăugînd un volum dublu de 5 mL de reactiv (punctul 4 subpunctul 3).

6. Este important ca laboratorul să primească o probă prelevată conform SM SR EN 707 care să fie cu adevărat reprezentativă şi care să nu fi fost deteriorată în timpul transportului sau pe durata depozitării.

7. Soluţia etalon de lactoză se prepară în felul următor:

1) Etalon 1

Se dizolvă o cantitate cîntărită exact (cu indicaţii de 0,1 mg) de aproximativ 50 mg monohidrat de lactoză într-un balon cotat de 100 mL şi se completează cu apă pînă la marcaj.

2) Etalon 2

Se dizolvă o cantitate cîntărită exact (cu indicaţii de 0,1 mg) de aproximativ 100 mg monohidrat de lactoză într-un balon cotat de 100 mL şi se completează cu apă pînă la marcaj.

Soluţiile etalon pot fi depozitate pentru maximum 1 săptămînă, la aproximativ 5 °C.

8. Proba pentru analiză se prepară în felul următor:

1) Reconstituirea probei

Se cîntăresc aproximativ 5 g de lapte praf într-un balon de 50 mL şi se notează greutatea cu o precizie de 1 mg [W₁, (11)]. Se adaugă 50 mL de apă şi se notează creşterea de greutate [W₂, (11)] cu o precizie de 0,01 g. Se aşază balonul închis în baia de apă timp de 30 min. şi se răstoarnă de cîteva ori în această perioadă. Apoi se lasă să se răcească la temperatura camerei.

2) Tratarea probei

Se ia aproximativ 1 g din această soluţie şi se pune într-un balon cotat de 50 mL, se notează greutatea cu o precizie de 1 mg [W₃ (11)], se adaugă 20 mL de apă, după care se adaugă 10 mL de reactiv diluat Biggs/Szijarto, completaţi cu apă pînă la marcaj. Balonul se răstoarnă uşor de 5 ori în timpul primelor 30 de minute.

După 1 oră, se ia o parte alicotă şi se centrifughează la 3 000 g timp de 10 min. Se foloseşte o cotă alicotă de supernatant pentru analiza HPLC.

9. Determinarea HPLC se efectuează în felul următor:

1) Prepararea preliminară a HPLC

a) Instalarea coloanei şi a precoloanei

Se intalează precoloana (punctul 5 subpunctul 2) în afara cuptorului de coloană (punctul 5 subpunctul 3) şi coloana (punctul 5 subpunctul 1) în cuptor.

În cazul în care cuptorul nu conţine ţevi pentru preîncălzirea eluantului, este necesar ca eluantul să treacă prin aproximativ 15 cm de ţeavă de oţel inoxidabil în cuptor, înainte de a intra în coloană (este absolut necesar ca eluantul să se fi încălzit înainte de a intra în coloană, altfel va avea loc o creştere a suprafeţei vîrfului).

b) Detectorul şi fluxul iniţial

Pentru a obţine o linie de bază stabilă, detectorul de HPLC se pune în funcţiune cu cel puţin 24 de ore înainte de a începe analiza. Se stabileşte temperatura interioară a detectorului la 35 °C. Se stabileşte debitul la 0,2 ml/min. (punctul 5 subpunctul 4) pentru cel puţin 20 min., în timp ce cuptorul de coloană este reglat la temperatura camerei.

c) Cuptorul de coloană şi debitul final

Se reglează cuptorul de coloană la 85 °C. Cînd se atinge această temperatură, se creşte, după 30 de minute, treptat, debitul de la 0,2 ml/min. la 0,6 ml/min. (punctul 5 subpunctul 4). Se lasă sistemul să ajungă în echilibru cu acest debit şi la 85 °C, timp de 2 ore sau pînă se obţine o linie de bază stabilă.

d) Integrarea

Se aleg cu grijă parametrii de colectare a datelor şi integrare (punctul 5 subpunctul 7), cum ar fi estimarea datelor, sensibilitatea, constanta de timp, lăţimea vîrfului şi pragul.

Timpul de retenţie al lactozei este de aproximativ 11 minute.

Multe programe software de strîngere de date (punctul 5 subpunctul 7) permit o măsurare uşoară a numărului de placă teoretic. Se măsoară numărul de placă teoretic al etalonului 1 în mod normal şi se înlocuieşte coloana (punctul 5 subpunctul 1) cînd numărul de placă este cu 25% mai mic decît cel al valorii iniţiale a unei noi coloane.

e) Testarea coloanei de control

Se verifică regulat (cel puţin o dată la fiecare ciclu de analiză) capacitatea coloanei de control de a elimina sărurile din probă prin injectarea a 25 μL de soluţie 0,05% de clorură de sodiu. De fiecare dată cînd apar vîrfuri, coloana de control trebuie schimbată.

2) Prelucrarea etaloanelor

Se injectează, la începutul fiecărei serii de analize, 25 μL (punctul 5 subpunctul 5) din etalonul 1 şi apoi din etalonul 2. Această operaţiune se repetă la fiecare 10-20 de probe şi, de asemenea, la sfîrşitul ciclului.

3) Prelucrarea probelor

Se injectează 25 μL de supernatant (punctul 8 subpunctul 2) din probă.

10. Calcularea şi exprimarea rezultatelor are loc în felul următor:

1) Calibrare

În mod normal, înălţimile vîrfurilor sînt folosite pentru a calcula rezultatele, totuşi, dacă semnalul conţine prea mult zgomot, se poate folosi suprafaţa vîrfului (cuantificarea în cazul înălţimii vîrfului este mai puţin influenţată de vîrfurile componentelor în concentraţie mică şi care sînt separate în parte, dar nu suficient, de vîrful lactozei).

Cu ajutorul software-ului (punctul 5 subpunctul 7) trebuie să se calculeze o curbă liniară de etalonare ce trece forţat prin origine. Se verifică curba pentru a identifica posibila neliniaritate (neliniaritatea poate fi provocată de o greşeală în pregătirea etaloanelor 1 sau 2, de o integrare greşită şi, mai puţin probabil, de o funcţionare necorespunzătoare a injectorului).

Se folosesc ca date de introducere concentraţiile de lactoză calculate în mg/mL ale etaloanelor 1 şi 2 , cum ar fi lactoza fără apă.

Înclinarea (RF) a liniei de calibrare este definită de raportul suprafaţă/concentraţie în mg/mL.

2) Probe

Rezultatul analizei este obţinut în g/100 g şi este calculat folosind software-ul (punctul 6 subpunctul 7) sau folosind următoarea formulă:

unde:

C – concentraţia lactozei în g/100 g lapte praf;

H – înălţimea vîrfului de lactoză al probei;

RF – factorul de răspuns (sau înclinarea) curbei de calibrare în mV/mg/mL;

W₁ – greutatea probei de lapte praf în g (punctul 8 subpunctul 1);

W₂ – greutatea apei adăugat în g la proba de lapte praf (punctul 8 subpunctul 1);

W₃ – greutatea probei din soluţia reconstituită de lapte praf în g (punctul 8 subpunctul 2);

50 – volumul balonului cotat folosit în (punctul 8 subpunctul 2);

0,1 – conversia rezultatului în g/100 g.

11. Se poate ca valorile obţinute prin această probă interlaboratoare să nu fie aplicabile la valorile şi matricele de concentraţie altele decît cele date. Valorile pentru repetabilitate şi reproductibilitate vor fi derivate din rezultatul unei probe interlaboratoare realizate conform cu SM SR ISO 5725-1.

1) Repetabilitate

Diferenţa absolută dintre rezultatele a două probe individuale, obţinute prin folosirea aceleiaşi metode pe material de probă identic în acelaşi laborator, cu acelaşi operator, folosind aceeaşi aparatură, într-un interval scurt de timp, nu va depăşi, în peste 5% din cazuri, xxx (care va fi determinată printr-o probă realizată în comun).

2) Reproductibilitate

Diferenţa absolută între două rezultate de probe individuale, obţinute folosind aceeaşi metodă, pe material de probă identic, în laboratoare diferite, cu diferiţi operatori, folosind aparatură diferită, nu va depăşi, în peste 5% din cazuri, 0,5 g/100 g (care va fi determinată printr-o probă realizată în comun).

Anexa nr.11

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Detectarea zerului praf din laptele praf degresat destinat depozitării

publice prin determinarea cromatografiei lichide de înaltă

performanţăa cazeinomacropeptidelor (HPLC)

1. Această metodă permite detectarea zerului închegat din laptele praf degresat destinat depozitării publice prin determinarea cazeinomacropeptidelor.

2. Conţinutul de substanţe solide din zer închegat se defineşte ca procent de masă determinat de conţinutul de cazeinomacropeptide prin procedura descrisă.

3. Principiul metodei de detectare a zerului închegat din laptele praf degresat destinat depozitării publice prin determinarea cazeinomacropeptidelor constă în:

1) reconstituirea laptelui praf degresat, îndepărtarea grăsimilor şi proteinelor cu acid tricloroacetic, urmată de centrifugare sau filtrare;

2) determinarea cantităţii de cazeinomacropeptide (CMP) din supranatant prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC);

3) evaluarea rezultatelor obţinute pentru probe faţă de probe etalon formate din lapte praf degresat cu sau fără adăugarea unui procent cunoscut de zer praf.

4. Toţi reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puţin echivalentă.

1) Soluţie de acid tricloroacetic

Se dizolvă 240 g de acid tricloroacetic (CCl₃COOH) în apă şi se completează pînă la 1 000 ml. Soluţia trebuie să fie limpede şi incoloră.

2) Soluţie eluantă, pH 6,0

Se dizolvă 1,74 g de fosfat dipotasic (K₂HPO₄), 12,37 g de fosfat monopotasic (KH₂PO₄) şi 21,41 g de sulfat de sodiu (Na₂SO₄) în aproximativ 700 ml de apă. În cazul în care este necesar, se ajustează cu ajutorul unei soluţii de acid fosforic sau hidroxid de potasiu pînă la obţinerea unui pH de 6,0.

Se completează cu apă pînă la 1 000 ml şi se omogenizează.

Compoziţia eluantului poate fi actualizată pentru a respecta certificatul standardelor sau recomandările producătorului de pe ambalajul coloanei.

Soluţia eluantă se filtrează înainte de folosire printr-o membrană filtrantă cu diametrul porilor de aproximativ 0,45 μm.

3) Solvent de spălare

Se amestecă un volum de acetonitril (CH₃CN) cu nouă volume de apă. Amestecul se filtrează înainte de folosire printr-o membrană filtrantă cu pori cu diametrul de 0,45 μm.

Se poate folosi orice alt solvent de spălare cu efect bactericid care nu afectează eficienţa rezoluţiei coloanelor.

4) Probele etalon:

a) lapte praf degresat care îndeplineşte cerinţele prezentei rezoluţii (respectiv [0]);

b) acelaşi lapte praf degresat modificat cu 5% (m/m) zer închegat praf cu compoziţie standard (respectiv [5]).

5. Aparatură de laborator:

1) balanţă analitică;

2) centrifugă opţională cu o forţă de centrifugare de 2 200 g, prevăzută cu tuburi astupate sau acoperite pentru centrifugare cu o capacitate de aproximativ 50 ml;

3) agitator mecanic;

4) agitator magnetic;

5) coloane de sticlă cu diametrul de aproximativ 7 cm;

6) filtre de hîrtie cu filtrare medie cu diametrul de aproximativ 12,5 cm;

7) dispozitiv de sticlă pentru filtrare prevăzut cu membrană filtrantă cu diametrul porilor de aproximativ 0,45 μm;

8) pipete gradate de 10 ml sau un sistem prin care pot trece 10,0 ml în două minute;

9) sistem prin care pot trece 20,0 ml de apă la aproximativ 50°C;

10) baie termostat de apă, reglată la 25 ± 0,5°C;

11) echipament pentru HPLC format din:

a) pompă;

b) injector, manual sau automat, cu o capacitate de 15-30 μl;

c) două coloane TSK 2 000-SW în serie (lungime de 30 cm, diametru intern de 0,75 cm) sau coloane echivalente şi o precoloană (3 cm × 0,3 cm) umplute cu I 125 sau cu un material cu eficienţă echivalentă;

d) cuptor cu coloană termostat, reglat la 35 ± 1°C;

e) detector UV cu lungime de undă variabilă care permite realizarea de măsurători la 205 nm cu o sensibilitate de 0,008 A;

f) integrator cu ajutorul căruia se poate realiza integrarea la linia de bază.

Se poate lucra cu coloanele aflate la temperatura camerei, dar puterea lor de rezoluţie este puţin mai mică. În acest caz, temperatura nu trebuie să varieze cu mai mult de ± 5 °C în nici o serie de analize.

6. Probele se prelevează conform procedurii descrise de standardul SM SR EN ISO 707.

Probele se depozitează în condiţii în care nu poate surveni nici o deteriorare sau modificare a compoziţiei.

7. Procedura de detectare a zerului închegat din laptele praf degresat destinat depozitării publice prin determinarea cazeinomacropeptidelor are loc în felul următor:

1) Prepararea probei pentru analiză

Se transferă laptele praf într-un recipient cu o capacitate aproximativ triplă faţă de volumul laptelui praf, prevăzut cu un capac etanş la aer. Recipientul se închide imediat. Laptele praf se amestecă bine prin răsturnări repetate ale recipientului.

2) Cantitatea analizată

Se cîntăresc 2,000 ± 0,001 g din proba analizată într-un tub de centrifugare sau într-un balon astupat adecvat (50 ml).

3) Îndepărtarea grăsimii şi a proteinelor

a) Se adaugă 20,0 ml de apă caldă (50 °C) la cantitatea analizată. Se dizolvă laptele praf agitîndu-se cîteva minute cu ajutorul unui agitator mecanic. Tubul se introduce în baia de apă şi se lasă să se echilibreze la 25 °C.

b) Se adaugă 10,0 ml de soluţie de acid tricloroacetic la aproximativ 25 °C timp de două minute, amestecîndu-se puternic cu ajutorul unui agitator magnetic. Tubul se introduce într-o baie de apă şi se lasă timp de 60 de minute.

c) Se centrifughează timp de 10 minute la 2 200 g sau se filtrează printr-o hîrtie, eliminîndu-se primii 5 ml de filtrat.

4) Determinarea cromatografică

a) Se injectează 15-30 μl de supernatant sau filtrat măsurat cu precizie în aparatul HPLC funcţionînd la un debit de 1,0 ml de soluţie eluantă pe minut.

Se poate folosi un alt debit în funcţie de diametrul intern al coloanelor utilizate sau de instrucţiunile producătorului coloanei.

Soluţia eluantă se menţine la 85 °C pe parcursul întregii analize cromatografice pentru ca eluantul să se menţină degazat şi pentru a împiedica dezvoltarea bacteriilor. Se poate recurge la orice măsură de precauţie cu efect similar.

Coloanele se clătesc cu apă la fiecare întrerupere. Soluţia nu se lasă niciodată în coloane.

Înainte de orice întrerupere care durează mai mult de 24 de ore, coloanele se clătesc cu apă şi se spală cu soluţie timp de cel puţin trei ore la un debit de 0,2 ml pe minut.

b) Rezultatele analizei cromatografice a probei etalon [E] se obţin sub forma unei cromatograme în care fiecare vîrf se identifică după timpul de retenţie RT după cum urmează:

Alegerea coloanei (coloanelor) poate afecta timpii de retenţie ai fiecărui vîrf, în mod considerabil.

Integratorul calculează automat suprafaţa A a fiecărui vîrf.

Este esenţial să se examineze aspectul fiecărei cromatograme înainte de realizarea interpretării cantitative pentru a se detecta orice eventuale anomalii datorate fie funcţionării necorespunzătoare a aparatului sau a coloanelor, fie originii sau naturii probei analizate.

În cazul în care există dubii, analiza se repetă.

5) Calibrare

a) Probelor etalon li se aplică exact procedura descrisă în subpunctele 2)-4) din prezentul punct.

Se folosesc soluţii proaspăt preparate, întrucît CMP se degradează într-un mediu 8% tricloroacetic. Pierderea este estimată la 0,2% pe oră la 30 °C.

b) Înainte de determinarea cromatografică a probelor, coloanele trebuie condiţionate prin injectarea repetată a probei etalon în soluţie (litera a) din prezentul subpunct), pînă cînd suprafaţa vîrfului şi timpul de retenţie al acestuia pentru CMP sînt constante.

c) Se determină coeficientul de răspuns R prin injectarea aceluiaşi volum de filtraţi (litera a) din prezentul subpunct) folosit şi în probe.

8. Experimentarea rezultatelor se efectuează în felul următor:

1) Metoda de calcul şi formule

a) Calcularea factorilor de răspuns R:

unde:

R_II – coeficienţii de răspuns pentru vîrfurile II;

A_II [0] – suprafeţele vîrfurilor II pentru proba etalon [0] obţinute la punctul 7 subpunctul 5) litera c).

unde:

R_III – coeficientul de răspuns pentru vîrful III;

A_III [0] şi A_III [5] – suprafeţele vîrfului III pentru probele etalon [0] şi, respectiv, [5] obţinute la punctul 7 subpunctul 5) litera c);

W – cantitatea de zer din proba etalon [5], respectiv 5.

b) Calcularea suprafeţei relative a vîrfurilor probei [E]

S_II[E] = R_II × A_II[E]

S_III[E] = R_III × A_III[E]

S_IV[E] = R_IV × A_IV[E]

unde:

S_II [E], S_III [E], S_IV [E] – suprafeţele relative ale vîrfurilor II, III şi, respectiv, IV din proba [E];

A_II [E], A_III [E] – suprafeţele vîrfurilor II şi, respectiv, IV din proba [E] obţinute la punctul 7 subpunctul 4) litera b);

R_II, R_III – coeficienţii de răspuns calculaţi la litera a) din prezentul subpunct.

c) Calcularea timpului relativ de retenţie al vîrfului III pentru proba [E]: RRT_III[E] = (RT_III[E])/(RT_III[5]),

unde:

RRT_III [E] – timpul relativ de retenţie al vîrfului III pentru proba [E];

RT_III [E] – timpul relativ de retenţie al vîrfului III din proba [E] obţinut la punctul 7 subpunctul 4) litera b);

RT_III [5] – timpul relativ de retenţie al vîrfului III din proba de control [5] obţinut la punctul 7 subpunctul 5) litera c).

d) Există o relaţie liniară între timpul relativ de retenţie al vîrfului III, respectiv RRT_III [E] şi procentul de zer praf de pînă la 10% adăugat:

- RRT_III [E] este < 1,000 în cazul în care conţinutul de zer este > 5%;

- RRT_III [E] este ≥ 1,000 în cazul în care conţinutul de zer este ≤ 5%.

Nesiguranţa permisă pentru valorile RRT_III este de ± 0,002.

În mod normal, valoarea RRT_III [0] deviază puţin de la 1,034. În funcţie de starea coloanelor, valoarea se poate apropia de 1,000, dar este întotdeauna mai mare de această valoare.

2) Calcularea procentului de zer închegat praf din probă:

W = S_III[E] – [1, 3 + (S_III[0] – 0, 9)],

unde:

W – procentul m/m de zer închegat în proba [E];

S_III [E] – suprafaţa relativă a vîrfului III al probei analizate [E] obţinută ca la subpunctul 1) litera b) din prezentul punct;

1,3 – reprezintă suprafaţa medie relativă a vîrfului III exprimată în grame de zer închegat pe 100 g determinată pentru lapte praf degresat nemodificat cu diferite origini. Această valoare a fost obţinută experimental;

S_III [0] – reprezintă suprafaţa relativă a vîrfului III egală cu R_III × A_III [0]. Aceste valori au fost obţinute la subpunctul 1 litera a) din prezentul punct şi, respectiv, punctul 7 subpunctul 5) litera c);

(S_III [0] – 0,9) – reprezintă corecţia care trebui adusă suprafeţei relative 1,3 cînd S_III [0] nu are valoarea 0,9. În mod experimental, suprafaţa medie relativă a vîrfului III al probei martor [0] este de 0,9.

3) Precizia metodei

a) Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate simultan sau în cel mai scurt interval de timp posibil de acelaşi operator care utilizează aceeaşi aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 0,2% m/m.

b) Reproductibilitate

Diferenţa dintre două rezultate separate şi independente, obţinute de doi operatori care lucrează în laboratoare diferite cu material de analiză identic nu trebuie să depăşească 0,4% m/m.

9. Se presupune că zerul este absent în cazul în care suprafaţa relativă a vîrfului III, S_III[E] exprimată în grame de zer închegat pe o sută de grame de produs este ≤ 2,0 + (S_III[0] – 0,9), unde:

2,0 – valoarea maximă permisă a suprafeţei relative a vîrfului III avîndu-se în vedere suprafaţa relativă a vîrfului III, respectiv 1,3, nesiguranţa datorată variaţiilor compoziţiei laptelui praf degresat şi reproductibilitatea metodei (punctul 8 subpunctul 3) litera b));

(S_III [0] –0,9) – corecţia care trebuie adusă cînd suprafaţa S_III [0] nu este 0,9 (punctul 8 subpunctul 2).

În cazul în care suprafaţa relativă a vîrfului III, S_III[E] este > 2,0 + (S_III[0] – 0,9) şi suprafaţa relativă a vîrfului II, S_II[E] ≤ 160, se determină conţinutul de zer închegat conform indicaţiilor de la punctul 8 subpunctul 2).

În cazul în care suprafaţa relativă a vîrfului III, S_III[E] este > 2,0 + (S_III[0] – 0,9) şi suprafaţa relativă a vîrfului II, S_II[E] ≤ 160, se determină conţinutul total de proteine (P%); apoi se examinează graficele 1 şi 2.

1) Linia continuă reprezintă regresia liniară, ai cărei coeficienţi se calculează prin metoda pătratului celui mai mic.

Linia dreaptă punctată marchează limita superioară a suprafeţei relative a vîrfului III, cu probabilitatea ca aceasta să nu fie depăşită în 90% din cazuri.

Ecuaţiile liniilor drepte punctate de pe graficele 1 şi 2 sînt:

S_III = 0,376 P % – 10,7 (graficul 1);

S_III = 0,0123 S_II [E] + 0,93 (graficul 2);

şi, respectiv, unde:

S_III – suprafaţa relativă a vîrfului III calculată fie pe baza conţinutului total de proteine, fie pe baza suprafeţei relative a vîrfului S_II[E];

P% – conţinutul total de proteine exprimat ca procent de masă;

S_II [E] – suprafaţa relativă pentru probă calculată la punctul 8 subpunctul 1) litera b).

Diferenţa (T₁ şi T₂) dintre suprafaţa relativă S_III[E] determinată şi suprafaţa relativă S_III se calculează după cum urmează:

 T₁ = S_III[E] – [(0,376 P % – 10,7) + (S_III[0] – 0,9)]

T₂ = S_III[E] – [(0,0123 S_II[E] + 0,93) + (S_III[0] – 0,9)].

2) În cazul în care T₁ şi/sau T₂ au valoarea zero sau mai mică, nu se poate determina prezenţa zerului închegat.

În cazul în care T₁ şi T₂ au o valoare mai mare de zero, zerul închegat este prezent.

Conţinutul de zer închegat se calculează cu ajutorul formulei: W = T₂+0,91,

unde 0,91 este distanţa pe axa verticală între linia dreaptă continuă şi linia dreaptă punctată.

Anexa nr.12

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Determinarea substanţelor solide

din zer închegat în laptele praf degresat şi în amestecurile ce conţin lapte

 praf degresat şi, după caz, grăsime, vitamine, săruri minerale, zaharoză,

agenţi anticoagulanţi şi/sau agenţi fluidizanţi şi alţi agenţi fluidizanţi,

 în special antioxidanţi şi emulsificatori

1. Conţinutul de substanţe solide din zer închegat reprezintă procentul de masă determinat de conţinutul de cazeinomacropeptide prin procedura descrisă.

2. Conţinutul de cazeinomacropeptide se determină conform anexei nr.11. Probele pentru care se obţin rezultate pozitive se analizează pentru detectarea cazeinomacropeptidelor A prin procedura de cromatografie lichidă de înaltă performanţă în fază inversată (procedura HPLC). Ca soluţie alternativă, probele sînt analizate direct prin procedura HPLC în fază inversă. Evaluarea rezultatelor se face prin referire la probe etalon formate din lapte praf degresat care conţin sau nu conţin un procent cunoscut de zer praf. Rezultatele mai mari de 1% (m/m) indică prezenţa substanţelor solide din zer închegat.

3. Toţi reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puţin echivalentă. Acetonitrilul trebuie să fie de calitate spectroscopică sau de calitate HPLC.

Reactivii necesari pentru această procedură sînt descrişi în anexa nr.11 la prezenta Metodologie.

Reactivi pentru HPLC în fază inversată.

1) Soluţie de acid tricloroacetic

Se dizolvă 240 g de acid tricloroacetic (CCl₃COOH) în apă şi se completează pînă la 1 000 ml. Soluţia trebuie să fie limpede şi incoloră.

2) Eluanţii A şi B

Eluantul A: Se introduc într-un balon cotat de 1 000 ml 150 ml acetonitril (CH₃CN), 20 ml izopropanol (CH₃CHOHCH₃) şi 1,00 ml de acid trifloroacetic (TFA, CF₃COOH). Se completează cu apă pînă la 1 000 ml.

Eluantul B: Se introduc într-un balon cotat de 1 000 ml 550 ml acetonitril, 20 ml izopropanol şi 1,00 ml TFA. Se completează cu apă pînă la 1 000 ml. Soluţia eluantă se filtrează înainte de folosire printr-o membrană filtrantă cu pori cu diametrul de 0,45 μm.

3) Conservarea coloanei

După analize, coloana se clăteşte cu eluantul B (cu un gradient), iar apoi se clăteşte cu acetonitril (cu un gradient timp de 30 de minute). Coloana se păstrează în acetonitril.

4) Probele etalon

a) Lapte praf degresat care îndeplineşte cerinţele pentru depozitare publică (respectiv, [0]).

b) Acelaşi lapte praf degresat modificat cu 5% (m/m) zer închegat praf cu compoziţie standard (respectiv [5]).

c) Acelaşi lapte praf degresat modificat cu 50% (m/m) zer închegat praf cu compoziţie standard (respectiv [50]).

4. Aparatura necesară pentru procedura descrisă este cea descrisă în anexa nr.11 la prezenta Metodologie;

1) balanţă analitică;

2) centrifugă opţională cu o forţă de centrifugare de 2 200 g, prevăzută cu tuburi astupate sau acoperite pentru centrifugare cu o capacitate de aproximativ 50 ml;

3) agitator mecanic;

4) agitator magnetic;

5) coloane de sticlă cu diametrul de aproximativ 7 cm;

6) filtre de hîrtie cu filtrare medie cu diametrul de aproximativ 12,5 cm;

7) dispozitiv de sticlă pentru filtrare prevăzut cu membrană filtrantă cu diametrul porilor de aproximativ 0,45 μm;

8) pipete gradate de 10 ml sau un sistem prin care pot trece 10,0 ml în două minute;

9) sistem prin care pot trece 20,0 ml de apă la aproximativ 50°C;

10) baie termostat de apă, reglată la 25 ± 0,5°C;

11) echipament pentru HPLC format din:

a) sistem binar de pompare reglabil;

b) injector, manual sau automat, cu o capacitate de 100 μl;

c) coloană Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (lungime 25 cm, diametru intern 0,46 cm) sau o coloană în fază inversată cu pori mari pe bază de silice echivalentă;

d) cuptor cu coloană termostat, reglat la 35 ± 1 °C;

e) detector UV cu lungime de undă variabilă care permite realizarea de măsurători la 210 nm (în cazul în care este necesar se poate folosi o lungime de undă mai mare, de pînă la 220 nm) cu o sensibilitate de 0,02 Å;

f) integrator cu ajutorul căruia se poate realiza integrarea la linia de bază comună sau la linia de bază.

Se poate lucra cu coloana la temperatura camerei, cu condiţia ca temperatura să nu varieze cu mai mult de 1°C; în caz contrar, se înregistrează o variaţie mult prea mare a timpului de retenţie al CMP_A.

5. Probele se prelevează conform procedurii descrise de standardul SM SR EN ISO 707.

Probele se depozitează în condiţii în care nu poate surveni nici o deteriorare sau modificare a compoziţiei.

6. Procedura de determinare a substanţelor solide din zer închegat în laptele praf degresat şi în amestecurile ce conţin lapte praf degresat şi, după caz, grăsime, vitamine, săruri minerale, zaharoză, agenţi anticoagulanţi şi/sau agenţi fluidizanţi şi alţi agenţi fluidizanţi, în special antioxidanţi şi emulsificatori se realizează în felul următor:

1) Prepararea probei pentru analiză

Se transferă laptele praf într-un recipient cu o capacitate aproximativ triplă faţă de volumul laptelui praf, prevăzut cu un capac etanş la aer. Recipientul se închide imediat. Laptele praf se amestecă bine prin răsturnări repetate ale recipientului.

2) Cantitatea analizată

Se cîntăresc 2,00 ± 0,001 g din proba analizată într-un tub de centrifugare sau într-un balon astupat adecvat (50 ml).

În cazul amestecurilor, se cîntăreşte o anumită cantitate din proba analizată, astfel încît să rezulte o cantitate de probă degresată de 2,00 g.

3) Îndepărtarea grăsimii şi a proteinelor

a) Se adaugă 20,0 ml de apă caldă (50 °C) la cantitatea analizată. Se dizolvă laptele praf agitîndu-se cinci minute sau 30 de minute în cazul zarei acide cu ajutorul unui agitator mecanic. Tubul se introduce în baia de apă şi se lasă să se echilibreze la 25 °C.

b) Se adaugă constant 10,0 ml de soluţie de acid tricloroacetic la aproximativ 25 °C timp de peste două minute, amestecîndu-se puternic cu ajutorul unui agitator magnetic. Tubul se introduce într-o baie de apă şi se lasă timp de 60 de minute.

c) Se centrifughează 2 200 g timp de 10 minute sau se filtrează prin hîrtie, eliminîndu-se primii 5 ml de filtrat.

4) Determinarea cromatografică

a) Se efectuează analiza HPLC conform descrierii din anexa nr.11. În cazul în care se obţine un rezultat negativ, proba analizată nu conţine solide din zer închegat în cantităţi detectabile. În cazul în care rezultatul este pozitiv, se aplică procedura HPLC în fază inversată descrisă mai jos. Ca soluţie alternativă, se poate aplica direct metoda HPLC în fază inversată. Prezenţa zarei acide praf poate provoca apariţia unor rezultate fals pozitive folosind metoda descrisă în anexa nr.11. Metoda HPLC în fază inversă exclude această posibilitate.

b) Înainte de realizarea analizei HPLC în fază inversă se optimizează condiţiile de gradient. Pentru sistemele reglabile cu un volum mort de aproximativ 6 ml (volum de la punctul în care solvenţii se întîlnesc pînă la bucla injectorului inclusiv) timpul de retenţie de 26 ± 2 minute pentru CMP_A este optim. Pentru sistemele reglabile cu un volum mort mai mic (de exemplu, 2 ml) timpul optim de retenţie este de 22 de minute.

Se recoltează soluţii de probă etalon cu şi fără 50% zer închegat.

Se injectează 100 μl de supranatant sau de filtrat în sistemul HPLC care funcţionează în condiţiile de gradient de explorare din tabelul 1.

Tabelul 1

Condiţii de gradient de explorare

pentru optimizarea cromatografiei

Compararea celor două cromatograme trebuie să indice poziţia vîrfului CMP_A.

Cu ajutorul formulei de mai jos se poate calcula compoziţia iniţială a solventului care se foloseşte pentru gradientul normal % B = 10 – 2,5 + [13,5 + (RT_cmpA – 26) / 6] × 30 / 27% B = 7,5 + (13,5 + (RT_cmpA – 26) / 6) × 1,11,

unde:

RT_cmpA – timpul de retenţie al CMP_A la gradientul de explorare;

10 – % B iniţial al gradientului de explorare;

2,5 – % B în punctul de mijloc minus % B iniţial la gradientul normal;

13,5 – timpul corespunzător punctului de mijloc;

26 – timpul necesar de retenţie pentru CMP_A;

6 – raportul pantelor gradienţilor de explorare şi normal;

30 – % B iniţial minus % B la 27 minute la gradientul de explorare;

27 – timpul de rulare al gradientului de explorare.

c) Prelevarea soluţiilor din probele analizate

Se injectează 100 μl de supernatant sau filtrat (subpunctul 3) litera c) din prezentul punct), măsurat cu precizie în aparatul HPLC funcţionînd la un debit de 1,0 ml de soluţie eluantă pe minut.

Compoziţia eluantului la începutul analizei se obţine ca la punctul 6 subpunctul 4) litera b) din prezenta anexă. În mod normal este de aproximativ A:B = 76:24. Imediat după injectare se porneşte un gradient liniar, rezultatul fiind un procent al B cu 5% mai mare peste 27 minute. Apoi se porneşte un gradient liniar, datorită căruia, după cinci minute, compoziţia eluantului este de 90% B. Compoziţia se menţine timp de cinci minute, după care compoziţia se modifică în cinci minute, ia un gradient liniar, ajungînd la compoziţia iniţială. În funcţie de volumul intern al sistemului de pompare, următoarea injectare se poate face la 15 minute după ce se ajunge la condiţiile iniţiale.

Timpul de retenţie al CMP_A trebuie să fie de 26 ± 2 minute. Acesta se poate obţine prin modificarea condiţiilor iniţiale şi finale ale primului gradient. Cu toate acestea, diferenţa la nivelul % B în condiţiile iniţiale şi finale ale primului gradient trebuie să se menţină la 5% B.

Eluanţii trebuie degazaţi suficient şi trebuie, de asemenea, să se menţină degazaţi. Acest lucru este esenţial pentru buna funcţionare a sistemului de pompare reglabil. Deviaţia standard a timpului de retenţie al vîrfului CMP_A trebuie să fie sub 0,1 minute (n = 10).

După fiecare cinci probe se injectează proba de referinţă şi se foloseşte pentru calcularea noului coeficient de răspuns R (punctul 8 subpunctul 1).

d) Rezultatele analizei cromatografice a probei analizate (E) se obţin sub forma unei cromatograme în care vîrful CMP_A este identificat pe baza timpului său de retenţie de aproximativ 26 minute.

Integratorul calculează automat înălţimea vîrfului H pentru vîrful CMP_A. Se verifică poziţia liniei de bază în fiecare cromatogramă. În cazul în care poziţia liniei de bază este incorectă, analiza sau integrarea se repetă.

În cazul în care vîrful CMP_A este suficient de bine separat de alte vîrfuri, se foloseşte alocarea liniei de bază tip bază la bază sau, dacă nu, se folosesc perpendiculare trase pe o linie de bază comună, care să aibă punctul de plecare lîngă vîrful CMP_A. Se foloseşte pentru etalon şi pentru probe acelaşi tip de integrare şi, în cazul liniei de bază comune, se verifică consistenţa pentru probe şi etalon.

Este extrem de important să se examineze aspectul fiecărei cromatograme înainte de interpretarea cantitativă pentru a se detecta orice eventuale anomalii datorate fie funcţionării necorespunzătoare a aparatului sau a coloanelor, fie originii sau naturii probei analizate. În cazul în care există dubii, analiza se repetă.

5) Calibrare

a) se aplică cu exactitate procedura descrisă la punctul 6 subpunctele 2)-4) folosindu-se probele etalon. Se folosesc soluţii proaspăt preparate, întrucît CMP se degradează într-un mediu 8% tricloroacetic la temperatura camerei. La 4 °C soluţia este stabilă timp de 24 de ore. Pentru seriile lungi de analize este de preferabil ca în injectorul automat să se folosească o tavă răcită pentru probe.

Punctul 7 subpunctul 4) litera b) se poate omite în cazul în care se cunoaşte % B în condiţiile iniţiale din analizele efectuate anterior.

b) Înainte de determinarea cromatografică a probei se injectează 100 μl din proba etalon care nu conţine zer închegat [0].

Pe cromatogramă nu trebuie să apară un vîrf pentru timpul de retenţie al vîrfului CMP_A.

c) Se determină coeficientul de răspuns R prin injectarea aceluiaşi volum de filtrate (litera a) din prezentul subpunct) folosit şi în probe.

7. Exprimarea rezultatelor se efectuează în felul următor:

1) Metoda de calcul şi formula

Calcularea coeficientului de răspuns R:

Vîrful CMP_A: R = W/H,

unde:

R – coeficientul de răspuns al vîrfului CMP_A;

H – înălţimea vîrfului CMP_A;

W – cantitatea de zer din proba etalon.

2) Calcularea procentului de zer închegat praf din probă

W(E) = R × H(E),

unde:

W(E) – procentul (m/m) de zer închegat în proba (E);

R – coeficientul de răspuns al vîrfului CMP_A (subpunctul 1);

H(E) – înălţimea vîrfului CMP_A al probei (E).

În cazul în care W(E) este mai mare de 1% şi diferenţa dintre timpul de retenţie şi cel al probei etalon este mai mic de 0,2 minute, atunci sînt prezente substanţe solide din zer închegat.

3) Precizia metodei

a) Repetabilitate

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări efectuate simultan sau în cel mai scurt interval de timp posibil de acelaşi operator care utilizează aceeaşi aparatură pe material de analiză identic nu trebuie să depăşească 0,2% m/m.

b) Reproductibilitate

Nedeterminată.

c) Liniaritate

De la 0 la 16% zer închegat se obţine o relaţie de liniaritate cu un coeficient de corelare > 0,99.

Anexa nr.13

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Lapte praf degresat: determinarea cantitativă

a fosfatidilserinei şi a fosfatidiletanolaminei

Metoda: HPLC în fază inversă.

1. Această metodă descrie o procedură de determinare cantitativă a fosfatidilserinei (PS) şi a fosfatidiletanolaminei (PE) din laptele praf degresat (SMP) şi este adecvată pentru determinarea substanţelor solide din zară din SMP.

2. Conţinutul de PS + PE reprezintă fracţiunea de masă a substanţei determinate prin procedura descrisă în prezenta anexă. Rezultatul se exprimă în miligrame de dipalmitoil fosfatidiletanolamină (PEDP) în 100 g praf.

3. Extragerea aminofosfolipidelor cu metanol din lapte praf reconstituit. Determinarea PS şi PE ca derivaţi ai o-ftaldialdehidei (OPA) prin HPLC în fază inversă (RP) şi prin detectare prin fluorescenţă. Cuantificarea conţinutului de PS şi PE din proba analizată prin referire la o probă etalon conţinînd o cantitate cunoscută de PEDP.

4. Toţi reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puţin echivalentă, cu excepţia cazurilor în care se precizează altceva.

1) Material etalon: PEDP, cu o puritate de cel puţin 99%

Materialul etalon se depozitează la 18 °C.

2) Reactivi pentru prepararea probei etalon şi a probei pentru analiză

a) Metanol de calitate HPLC

b) Cloroform de calitate HPLC

c) Monoclorhidrat de triptamină

3) Reactivi pentru derivarea o-ftaldialdehidei

a) Hidroxid de sodiu, soluţie de apă 12 M

b) Acid boric, soluţie de apă 0,4 M ajustată cu hidroxid de sodiu pînă la un pH de 10,0

c) 2-mercaptetanol

d) o-ftaldialdehidă (OPA)

4) Solvenţi de eluare HPLC

a) La prepararea solvenţilor de eluare se folosesc reactivi de calitate HPLC

b) Apă de calitate HPLC

c) Metanol cu puritate fluorimetrică testată

d) Tetrahidrofuran

e) Fosfat monosodic

f) Acetat de sodium

g) Acid acetic

5. Aparatură de laborator:

1) Balanţă analitică cu o capacitate de cîntărire avînd o precizie de 1 mg, cu o capacitate de citire de 0,1 mg

2) Pahare de laborator cu capacitate de 25 şi 100 ml

3) Pipete cu o capacitate de 1 şi 10 ml

4) Agitator magnetic

5) Pipete gradate cu o capacitate de 0,2, 0,5 şi 5 ml

6) Baloane cotate cu capacitate de 10, 50 şi 100 ml

7) Seringi cu capacitate de 20 şi 100 μl

8) Baie ultrasonic

9) Centrifugă care poate opera la 27 000 × g

10) Fiole de sticlă cu capacitate de aproximativ 5 ml

11) Cilindru gradat cu capacitate de 25 ml

12) Aparat de măsurare a pH-ului cu o precizie de 0,1 unităţi pH

13) Echipament HPLC

a) Sistem de pompare reglabil care poate funcţiona la 1,0 ml/min. la 200 bari

b) Aparat de prelevare automată de probe cu posibilitate de derivare

c) Încălzitor de coloană care poate menţine coloana la o temperatură de 30 °C ± 1 °C

d) Detector de fluorescenţă care poate opera la o lungime de undă de excitare de 330 nm şi la o lungime de undă de emisie 440 nm

e) Integrator sau software de procesare de date care poate măsura suprafaţa vîrfului

f) Licrosferă – 100 coloană (250 × 4,6 mm) sau o coloană echivalentă umplută cu octadecilsilan (C 18) cu particule de 5 μm

6. Prelevarea probelor se realizează conform standardului SM SR EN ISO 707.

7. Procedura de determinare cantitativă a fosfatidilserinei şi a fosfatidiletanolaminei din laptele praf degresat se realizează în felul următor:

1) Prepararea soluţiei etalon intern

a) Se cîntăresc 30,0 ± 0,1 mg de monoclorhidrat de triptamină într-un balon cotat de 100 ml şi se completează cu metanol pînă la marcaj.

b) Se pipetează 1 ml din această soluţie într-un balon cotat de 10 ml şi se completează cu metanol pînă la marcaj pentru a se obţine o concentraţie de triptamină de 0,15 mM.

2) Prepararea soluţiei din proba pentru analiză

a) Se cîntăresc 1,000 ± 0,001 g din proba de SMP într-un pahar de laborator de 25 ml. Se adaugă cu o pipetă 10 ml de apă distilată cu temperatura de 40 °C ± 1 °C şi se amestecă cu un agitator magnetic timp de 30 de minute pentru a se dizolva toate cocoloaşele.

b) Se pipetează 0,2 ml din laptele reconstituit într-un balon cotat de 10 ml, se adaugă 100 μl din soluţia de triptamină de 0,15 mM cu ajutorul unei seringi şi se completează la volum cu metanol. Se amestecă cu grijă prin răsturnare şi se sonichează timp de 15 minute.

c) Se centrifughează la 27 000 g × g timp de 10 minute şi se colectează supranatantul într-o fiolă de sticlă.

Soluţia probă se depozitează la 4 °C pînă la finalizarea analizei HPLC.

3) Prepararea soluţiei etalon extern

a) Se cîntăresc 55,4 g de PEDP într-un balon cotat de 50 ml şi se adaugă aproximativ 25 ml de cloroform cu ajutorul unui cilindru gradat. Se încălzeşte balonul astupat la 50 °C ± 1 °C şi se amestecă cu atenţie pînă cînd se dizolvă PEDP. Balonul se răceşte la 20 °C şi se completează la volum cu metanol şi amestecă prin răsturnare.

b) Se pipetează 1 ml din această soluţie într-un balon cotat de 100 ml şi se completează la volum cu metanol. Se pipetează 1 ml din această soluţie într-un balon cotat de 10 ml şi se adaugă 100 μl de soluţie de triptamină de 0,15 mM (subpunctul 1) din prezentul punct) şi se completează la volum cu metanol. Se amestecă prin răsturnare.

Soluţia probă de referinţă se depozitează la 4 °C pînă la finalizarea analizei HPLC.

4) Prepararea reactivului de derivare

Se cîntăresc 25,0 ± 0,1 mg de OPA într-un balon cotat de 10 ml şi se adaugă 0,5 ml de metanol şi se amestecă cu atenţie pentru ca OPA să se dizolve. Se completează pînă la marcaj cu soluţie de acid boric şi se adaugă 20 μl de 2-mercaptetanol cu o seringă.

Reactivul de derivare se depozitează la 4 °C într-o fiolă brună, rămînînd stabil timp de o săptămînă.

5) Determinarea prin HPLC

a) Solvenţi de eluare

Solventul A: Soluţie 0,3 mM de fosfat monosodic şi 3 mM de soluţie de acetat de sodiu (ajustată cu acid acetic la un pH de 6,5 ± 0,1):metanol: tetrahidrofuran = 558:440:2 (v/v/v).

Solventul B: metanol.

b) Gradient de eluare recomandat:

Este posibil să fie nevoie de o uşoară modificare a gradientului de eluare pentru a se obţine rezoluţia din figura 1.

Temperatura coloanei: 30 °C.

c) Volumul injectat: 50 μl reactiv de derivare şi 50 μl soluţie probă.

d) Echilibrarea coloanei

Sistemul se porneşte în fiecare zi, se clăteşte coloana cu solvent B 100% timp de 15 minute, apoi se reglează la A:B = 40:60 şi se echilibrează la 1 ml/min. timp de 15 minute. Se lucrează cu o probă martor injectîndu-se metanol.

Înainte de o depozitare pe termen lung coloana se clăteşte cu metanol: cloroform = 80:20 (v/v) timp de 30 de minute.

e) Se determină conţinutul de PS + PE din proba analizată.

f) Se realizează secvenţa de analize cromatografice lăsîndu-se un timp constant între seriile de analize pentru a se obţine timpi de reţinere constanţi. Soluţia etalon extern se injectează la fiecare 5-10 soluţii probă pentru a se calcula coeficientul de răspuns

Coloana se curăţă prin clătire cu solvent B 100% (litera a) din prezentul subpunct) timp de cel puţin 30 de minute la fiecare 20-25 de serii.

6) Modul de integrare

a) Vîrful PEDP

PEDP este eluat ca un singur vîrf (figura 1). Se determină suprafaţa vîrfului prin integrare la linia de bază.

b) Vîrful triptaminei

Triptamina este eluată ca un singur vîrf (figura 1). Suprafaţa vîrfului se determină prin integrare la linia de bază.

c) Grupurile de vîrfuri ale PS şi PE

În condiţiile descrise (figura 1), PS eluează sub forma a două vîrfuri principale parţial fără rezoluţie, precedate de un vîrf minor. PE eluează sub forma a trei vîrfuri principale parţial fără rezoluţie. Se determină întreaga suprafaţă a fiecărei aglomerări de vîrfuri, stabilindu-se linia de bază ca în figura 1.

Figura 1. Model HPLC al derivaţilor OPA ai fosfatidilserinei (PS) şi ai

fosfatidiletanolamidei (PE) în extractul de metanol al laptelui praf reconstituit

8. Conţinutul de PS şi PE din proba analizată se calculează după cum urmează:

C = 55,36 × [(A₂)/(A₁)] × [(T₁)/(T₂)],

unde:

C – conţinutul de PS sau PE (mg/100 g praf) din proba analizată;

A₁ – suprafaţa vîrfului PEDP din soluţia etalon din probă (punctul 7 subpunctul 3);

A₂ – suprafaţa vîrfului PS sau PE din soluţia din probă (punctul 7 subpunctul 2);

T₁ – suprafaţa vîrfului triptaminei din soluţia etalon din probă (punctul 7 subpunctul 3);

T₂ – suprafaţa vîrfului triptaminei din soluţia din probă (punctul 7 subpunctul 2).

9. Precizia metodei rezultă din valorile pentru repetabilitate şi reproductibilitate:

1) Repetabilitate

Derivaţia standard relativă a repetabilităţii, care exprimă variabilitatea rezultatelor independente de analiză obţinute de acelaşi operator care foloseşte aceeaşi aparatură în aceleaşi condiţii şi probe pentru analiză identice într-un interval scurt de timp, nu trebuie să depăşească relativ 2%. În cazul în care se obţin două determinări în aceste condiţii, diferenţa relativă dintre cele două rezultate nu trebuie să fie mai mare de 6% din media aritmetică a rezultatelor.

2) Reproductibilitate

În cazul în care se realizează două determinări de către operatori din laboratoare diferite care folosesc aparatură diferită în condiţii diferite şi aceeaşi probă pentru analiză, diferenţa relativă dintre cele două rezultate nu trebuie să fie mai mare de 11% din media aritmetică a rezultatelor.

Anexa nr.14

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Detectarea reziduurilor antimicrobiotice în laptele praf degresat

Se foloseşte un test de selecţie al unui inhibitor microbian în care se foloseşte Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis ca microorganism de test şi care este suficient de sensibil pentru a detecta 4 μg benzilpenicilină per kg de lapte şi 100 μg sulfamidină per kg de lapte. Sînt disponibile şi se pot folosi kituri comerciale pentru analize în cazul în care acestea au sensibilitatea necesară la benzilpenicilină şi sulfamidină.

Pentru analiză, se foloseşte lapte praf degresat reconstituit (1 g praf +9 ml apă distilată). Testul se realizează în conformitate cu standardul SM ISO/TS 26844:2015 sau în conformitate cu instrucţiunile producătorului kitului pentru analize.

Rezultatele pozitive se interpretează după cum urmează:

1. Prezenţa β-lactamilor poate fi confirmată prin repetarea analizei, adăugîndu-se penicilinază în sistemul de analiză:

Rezultat negativ: Substanţa inhibitoare este un antibiotic β-lactam.

Rezultatul pozitiv rămîne: Substanţa inhibitoare nu poate fi identificată prin această procedură, se continuă cu 2.

2. Prezenţa sulfamidelor poate fi confirmată prin repetarea analizei, adăugîndu-se acid p-aminobenzoic în sistemul de analiză:

Rezultat negativ: Substanţa inhibitoare este o sulfamidă.

Rezultatul pozitiv rămîne: Substanţa inhibitoare nu poate fi identificată prin această procedură, se continuă cu 3.

3. Prezenţa combinaţiei dintre β-lactam şi sulfamidă poate fi confirmată prin repetarea analizei, adăugîndu-se penicinilază + acid p-aminobenzoic în sistemul de analiză:

Rezultat negativ: Substanţele inhibitoare sînt un antibiotic β-lactam şi o sulfamidă.

Rezultat pozitiv: Substanţa inhibitoare nu poate fi identificată prin această procedură.

Anexa nr.15

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Determinarea cantitativă a laptelui praf degresat în furajele

combinate prin coagularea enzimatică a paracazeinei

1. Scopul metodei este determinarea cantitativă a laptelui praf degresat în furajele combinate prin coagularea enzimatică a paracazeinei.

2. Această metodă se aplică furajelor combinate conţinînd cel puţin 10% lapte praf degresat; prezenţa unor cantităţi mari de zară şi/sau de anumite proteine care nu provin din lapte pot duce la apariţia unor interferenţe.

3. Principiul metodei constă în:

1) dizolvarea cazeinei conţinute în furajele combinate prin extragere cu soluţie de citrat de sodiu;

2) ajustarea concentraţiei de ioni de calciu la nivelul necesar pentru precipitarea paracazeinei se realizează prin adăugarea de cheag;

3) conţinutul de azot al precipitatului de paracazeină se determină prin metoda Kjeldahl, aşa cum este descrisă în standardul SM EN ISO 8968-1:2014; cantitatea de lapte praf degresat se calculează pe baza unui conţinut minim de cazeină de 27,5% (punctul 8).

4. Toţi reactivii utilizaţi trebuie să fie de calitate analitică recunoscută. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puţin echivalentă. Cu excepţia cheagului, toţi reactivii şi toate soluţiile trebuie să nu conţină substanţe azotate.

1) Citrat trisodic (soluţie 1% m/v)

2) Clorură de calciu (aproximativ 5 M de soluţie)

Se dizolvă 75 g de CaCl₂ · 2 H₂O în 100 ml de apă distilată prin scuturare (se acordă atenţie reacţiei exotermice). Soluţia se lasă peste noapte şi apoi se filtrează. Soluţia se păstrează în refrigerator.

3) Hidroxid de sodiu 0,1 N

4) Acid clorhidric 0,1 N

5) Cheag lichid de viţel (tărie de aproximativ 100 IMCU/ml). Se păstrează în refrigerator la 4-6°C.

6) Reactivii pentru determinarea cantitativă a azotului în conformitate cu metoda Kjeldahl descrisă în standardul SM EN ISO 8968-1:2014

5. Aparatură obişnuită de laborator ce cuprinde:

1) mojar sau omogenizator;

2) balanţă analitică cu o capacitate de cîntărire avînd o precizie de 1 mg, cu o capacitate de citire de 0,1 mg;

3) centrifugă de masă (500 g sau 2 000-3 000 rpm) cu tuburi de 50 ml şi 2 000 g;

4) agitator magnetic (10-15 mm) cu minimagneţi;

5) pahare de laborator de 150-200 ml;

6) baloane de 250 şi 500 ml;

7) conducte de sticlă cu diametru de 60-80 mm;

8) filtre fără cenuşă cu filtrare rapidă cu diametrul de 150 mm;

9) pipete cu diverse volume nominale;

10) Baie de apă cu termostat la 37°C ± 1°C;

11) aparat de măsurare a pH-ului cu o precizie de 0,1 unităţi;

12) termometre cu o precizie de 1°C.

6. Procedura de determinare cantitativă a laptelui praf degresat în furajele combinate prin coagularea enzimatică a paracazeinei se realizează în felul următor:

1) Prepararea probei

Se zdrobesc în mojar sau se omogenizează în rîşniţă 10-20 g din probă pentru a se obţine un amestec omogen.

2) Dizolvarea laptelui praf şi separarea reziduului insolubil

a) Se cîntăresc 1,000 ± 0,002 g de furaje combinate bine omogenizate direct într-un tub de centrifugare de 50 ml. Se adaugă 30 ml de soluţie de citrat trisodic încălzit în prealabil la 45 °C ± 2 °C. Se amestecă timp de cel puţin cinci minute cu ajutorul unui agitator magnetic sau prin scuturare puternică cu mîna.

b) Se centrifughează la 500 g (2 000-3 000 rpm) timp de 10 minute şi se decantează cu atenţie supranatantul apos limpede într-un pahar de laborator de 150-200 ml, pentru a nu se pierde material.

c) Se realizează încă două extrageri de reziduu prin aceeaşi procedură şi se adaugă extractele la primul.

d) În cazul în care se formează un strat de ulei la suprafaţă, se răceşte în refrigerator pînă cînd grăsimile se solidifică şi se îndepărtează stratul solid cu o spatulă.

3) Coagularea cazeinei cu enzime din cheag

a) Se amestecă continuu şi se adaugă prin picurare 2 ml de clorură de calciu la întregul extract apos (aproximativ 100 ml). Se ajustează pH-ul la 6,4-6,5 cu soluţii de NaOH sau de HCl. Se introduce în baia de apă controlată prin termostat la 37 °C ± 1 °C timp de 15-20 minute pentru a se obţine un echilibru salin. Acesta este indicat de o uşoară tulburare.

b) Lichidul se transferă într-un tub de centrifugare şi se centrifughează la 2 000 g timp de 10 minute pentru a se îndepărta substanţele precipitate. Se transferă supranatantul, fără a se spăla sedimentul, în alt tub de centrifugare.

c) Supranatantul se aduce din nou la temperatura de 37 °C ± 1 °C. În timp ce se amestecă extractul, se adaugă prin picurare 0,5 ml de cheag lichid. Coagularea se produce în două minute.

d) Proba se introduce din nou în baia de apă şi se lasă la o temperatură de 37 °C ± 1 °C timp de 15 minute. Proba se scoate din baie, iar coagulul se sparge prin amestecare. Se centrifughează la 2 000 g timp de 10 minute. Se filtrează supranatantul printr-o hîrtie de filtru adecvată şi se păstrează hîrtia de filtru. Precipitatul se clăteşte în tubul de centrifugare cu 50 ml de apă la aproximativ 35 °C, amestecîndu-se precipitatul.

Se centrifughează din nou la 2 000 g timp de 10 minute. Supranatantul se filtrează prin hîrtia de filtru păstrată.

4) Determinarea azotului din cazeină

După clătire, precipitatul se transferă cantitativ în hîrtia de filtru rămasă de la punctul 6 subpunctul 3 litera d) cu ajutorul apei distilate. Hîrtia de filtru uscată se transferă în balonul Kjeldhal. Se determină azotul prin metoda Kjeldahl în conformitate cu standardul SM EN ISO 8968-1:2014.

7. Se efectuează cîte un test cu probă martor supusă la mineralizare prin metoda Kjeldhal în conformitate cu standardul SM EN ISO 8968-1:2014, folosindu-se o hîrtie de filtru fără cenuşă umezită cu un amestec de 90 ml de soluţie de citrat de sodiu, 2 ml soluţie de clorură de calciu, 0,5 ml de cheag lichid şi spălat cu 3 × 15 ml de apă distilată.

Volumul de acid folosit pentru testul cu probă martor se ia din volumul de acid folosit pentru titrarea probei.

8. Procentul de lapte praf concentrat din furajul combinat se calculează cu ajutorul formulei de mai jos:

unde:

N – procentul de azot din para-cazeină;

27,5 – coeficientul de transformare a cazeinei determinate în procentul de lapte praf degresat;

2,81 şi 0,908 – coeficienţii de corecţie obţinuţi prin analiza regresiei.

9. Precizia metodei rezultă din valorile pentru repetabilitate şi reproductibilitate:

1) Repetabilitate

Analiza probelor martor pentru aceeaşi probă realizată de acelaşi operator în acelaşi laborator trebuie să dea rezultate echivalente cu cele pentru o cantitate nu mai mare de 2,3 g de lapte praf degresat în 100 g de furaj combinat.

2) Reproductibilitate

În cel puţin 95% din cazurile studiate, analiza probelor martor pentru aceeaşi probă realizată de două laboratoare trebuie să dea rezultate echivalente cu cele pentru o cantitate nu mai mare de 6,5 g de lapte praf degresat în 100 g de furaj combinat.

10. Pe parcursul procedurii pot apărea următoarele situaţii:

1) Adăugarea unor procente mari de proteine care nu provin din lapte şi, în special, de proteine din soia care sînt încălzite împreună cu laptele praf degresat poate genera rezultate prea mari din cauza coprecipitării cu paracazeina din lapte.

2) Adăugarea de zară poate duce la obţinerea unor cifre mai mici din cauza faptului că se determină numai cantitatea fără grăsime. Adăugare de zară acidă poate genera rezultate considerabil mai mici din cauza dizolvării incomplete în soluţia de citrat.

3) Adăugarea de 0,5% sau mai multă lecitină poate, de asemenea, genera rezultate cu valori mici.

4) Încorporarea de lapte praf degresat tratat la temperaturi înalte poate genera obţinerea de valori prea mari din cauza coprecipitării anumitor proteine cu paracazeina din lapte.

Anexa nr.16

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Detectarea amidonului din laptele praf degresat,

laptele praf denaturat şi furajele combinate

1. Prin această metodă se detectează amidonul utilizat ca marcator în laptele praf denaturat.

Limita de detectare a metodei este de aproximativ 0,05 g de amidon în 100 g de probă.

2. Reacţia se bazează pe cea folosită în iodometrie:

1) fixarea iodului liber din soluţie apoasă de către coloizi;

2) absorbţia de către miceliile de amidon şi prin colorare.

3. Reactivii utilizaţi sînt:

Soluţie de iod

1) iod – 1,0 g;

2) iodură de potasiu - 2,0 g;

3) apă distilată - 100 ml.

Se dizolvă 1,0 g de iod şi 2,0 g de iodură de potasiu în apă, într-un balon cotat de 100 ml cu un singur marcaj. Se diluează cu apă pînă la marcajul de 100 ml.

4. Aparatură de laborator:

1) balanţă analitică;

2) baie de apă care fierbe;

3) eprubete, 25 mm × 200 mm.

5. Se cîntăreşte 1,0 g din probă cu o precizie de 0,1 g şi se transferă într-o eprubetă.

Se adaugă 20 ml de apă distilată şi se amestecă pentru a se dispersa proba.

Se introduce în baia de apă şi se lasă timp de 5 minute.

Se scoate din baia de apă şi se răceşte la temperatura camerei.

Se adaugă 0,5 ml de soluţie de iod şi se amestecă, observîndu-se culoarea rezultată.

6. Culoarea albastră indică prezenţa amidonului natural în probă.

În cazul în care proba conţine amidon modificat, poate rezulta o altă culoare decît albastru.

7. Culoarea, intensitatea culorii şi aspectul observat la microscop al amidonului variază în funcţie de originea amidonului natural (de exemplu, porumb sau cartof) şi de tipul de amidon modificat din probă.

În prezenţa amidonului modificat, culoarea rezultată este violet, roşu sau maro, în funcţie de amploarea modificării din structura cristalină a amidonului natural.

Anexa nr.17

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Determinarea conţinutului umed în smîntîna deshidratată

1. Prezenta anexă precizează o metodă de determinare a conţinutului umed în smîntîna deshidratată.

2. Conţinutul umed reprezintă pierderea de masă determinată prin procedura specificată în prezenta Metodologie.

Acesta este exprimat ca procent de masă.

3. Uscarea unei cantităţi analizate la 102 ± 2 °C pînă se obţine o masă constantă şi cîntărirea în vederea determinării pierderii de masă.

4. Aparatură obişnuită de laborator, în special următoarele:

1) balanţă analitică cu o capacitate de cîntărire avînd o precizie de 1 mg, cu o capacitate de citire de 0,1 mg;

2) cuptor de uscare, bine ventilat, care poate fi menţinut prin termostat la 102 ± 2 °C în întregul spaţiu de lucru;

3) desicator, prevăzut cu silicagel proaspăt uscat cu indicator higroscopic sau un alt desicat eficace;

4) vase cu fundul plat, avînd o adîncime de aproximativ 25 mm, cu diametru de aproximativ 50 mm, confecţionate dintr-un material adecvat (de exemplu, sticlă, oţel inoxidabil, nichel sau aluminiu), prevăzute cu capace potrivite şi uşor de desfăcut;

5) sticle cu dopuri etanşe, pentru amestecarea probelor de laborator.

5. Proba primită în laborator nu trebuie să fie deteriorată sau modificată în timpul transportului sau pe durata depozitării.

Prelevarea probelor nu face parte din metoda specificată în prezenta Metodologie. În standardul SM SR EN ISO 707 este prezentată metoda recomandată de prelevare a probelor.

Probele se depozitează în condiţii în care nu poate surveni nici o deteriorare sau modificare a compoziţiei.

6. Se amestecă proba cu grijă prin scuturarea şi răsturnarea repetată a recipientului (în cazul în care este necesar, după transferarea tuturor probelor pentru analiză într-un recipient etanş cu o capacitate suficientă care să permită realizarea acestei operaţii).

În cazul în care nu se obţine omogenizarea completă prin această procedură, se iau cantităţile analizate (pentru două determinări separate) din proba pregătită la două puncte situate cît mai departe posibil unul de celălalt.

7. Procedura de determinare a conţinutului umed în smîntîna deshidratată se realizează în felul următor:

1) Prepararea vasului

a) Se încălzesc un vas neacoperit şi capacul acestuia în cuptor, reglat la 102 ± 2 °C, timp de cel puţin o oră.

b) Se aşază capacul pe vas şi se transferă vasul acoperit în desicator; se lasă să se răcească la temperatura sălii de balanţe şi se cîntăreşte cu o precizie de 1 mg, înregistrînd greutatea la 0,1 mg.

2) Cantitatea analizată

Se transferă aproximativ 1-3 g din proba pregătită în vas, se acoperă cu capacul şi se cîntăreşte cu o precizie de 1 mg, înregistrînd greutatea la 0,1 mg.

3) Determinare

a) Se descoperă vasul şi se aşază împreună cu capacul acestuia în cuptor, reglat la 102 ± 2 °C, timp de două ore.

b) Se reaşază capacul şi se transferă vasul acoperit în desicator; se lasă să se răcească la temperatura sălii de balanţe şi se cîntăreşte cu o precizie de 1 mg, înregistrînd greutatea la 0,1 mg.

c) Se descoperă vasul şi se încălzeşte din nou, împreună cu capacul, în cuptor, timp de o oră. Se repetă apoi operaţia de la litera b) din prezentul subpunct.

d) Se repetă procedura de încălzire şi cîntărire pînă cînd masa scade cu 1 mg sau mai puţin sau creşte între două cîntăriri succesive.

Se foloseşte pentru calcule cea mai mică masă înregistrată.

8. Conţinutul umed, exprimat în g/100 g, este egal cu:

unde:

m₀ – masa vasului şi a capacului exprimată în grame (punctul 7 subpunctul 1 litera b));

m₁ – masa vasului, a capacului şi a cantităţii analizate exprimată în grame înainte de uscare (punctul 7 subpunctul 2);

m₁ – masa vasului, a capacului şi a cantităţii analizate exprimată în grame după uscare (punctul 7 subpunctul 3) litera d)).

Rezultatul se raportează cu două zecimale.

9. Precizia metodei rezultă din valorile pentru repetabilitate şi reproductibilitate:

1) Repetabilitate

Diferenţa absolută dintre rezultatele a două determinări separate, obţinute prin aceeaşi metodă cu material de analiză identic, în acelaşi laborator, de către acelaşi operator, folosind aceeaşi aparatură, într-un interval scurt de timp, va depăşi în nu mai mult de 5% din cazuri 0,20 g de conţinut umed per 100 g de produs.

2) Reproductibilitate

Diferenţa absolută dintre rezultatele a două determinări separate, obţinute prin aceeaşi metodă cu material de analiză identic, în laboratoare diferite, de către operatori diferiţi, folosind aparatură diferită, va depăşi în nu mai mult de 5% din cazuri 0,40 g de conţinut umed per 100 g de produs.

10. Raportul de analiză specifică:

1) toate informaţiile necesare pentru identificarea completă a probei;

2) metoda de prelevare a probelor, dacă aceasta este cunoscută;

3) metoda de analiză folosită în conformitate cu prezentul standard internaţional;

4) toate detaliile de funcţionare care nu sînt specificate în prezentul standard internaţional sau sînt considerate opţionale, alături de detalii asupra oricăror incidente care ar fi putut influenţa rezultatul (rezultatele);

5) rezultatul (rezultatele) de analiză obţinut(e) şi, în cazul în care repetabilitatea a fost verificată, rezultatul final obţinut menţionat anterior.

Anexa nr.18

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Determinarea umidităţii în zara praf acidă

1. Prezenta anexă precizează o metodă de determinare a conţinutului de umiditate din zara praf acidă destinată iniţial furajelor.

2. Proba se usucă în vid. Pierderea de masă se determină prin cîntărire.

3. Aparatură de laborator:

1) Balanţă analitică cu o capacitate de cîntărire avînd o precizie de 1 mg, cu o capacitate de citire de 0,1 mg.

2) Vase din metal care nu se corodează sau de sticlă cu capace etanşe la aer; o suprafaţă de lucru care să permită întinderea probei la aproximativ 0,3 g/cm².

3) Cuptor electric reglabil cu vid prevăzut cu pompă de ulei şi cu un mecanism de introducere a aerului uscat fierbinte printr-un turn conţinînd, de exemplu, oxid de calciu sau sulfat de calciu (conţinînd indicator de umiditate).

4) Desicator cu agent de uscare eficient.

5) Cuptor de uscare ventilat cu temperatura controlată de un termostat la 102 ± 2 °C.

4. Se încălzesc un vas şi capacul acestuia în cuptor timp de cel puţin o oră. Se aşază capacul pe recipient şi se transferă imediat în desicator; se lasă să se răcească la temperatura camerei şi se cîntăreşte cu o precizie de 1 mg, înregistrînd masa la 0,1 mg.

Se descoperă vasul, se transferă aproximativ 5 g din probă în vas şi se cîntăreşte cu o precizie de 1 mg, înregistrînd masa la 0,1 mg. Se aşază vasul împreună cu capacul în cuptorul cu vid preîncălzit la 83 °C. Pentru a împiedica scăderea temperaturii din cuptor la o valoare inacceptabilă, vasul se introduce în cuptor cît mai rapid posibil.

Se măreşte presiunea pînă la 100 Torr (13,3 kPa) şi se lasă să se usuce la o masă constantă (timp de aproximativ patru ore) la această presiune într-un curent de aer fierbinte şi uscat.

Timpul de uscare se calculează din momentul în care temperatura cuptorului revine la 83 °C. Presiunea cuptorului se reduce cu grijă pînă la nivelul presiunii atmosferice. Se deschide cuptorul, vasul se acoperă imediat cu capacul, se scoate vasul din cuptor şi se lasă să se răcească în desicator timp de 30-45 minute şi se cîntăreşte cu o precizie de 1 mg, înregistrînd masa la 0,1 mg. Se usucă timp de încă 30 de minute în cuptorul cu vid la 83 °C şi se cîntăreşte din nou. Se repetă procedura de încălzire şi cîntărire pînă cînd masa vasului şi a capacului scade cu 1 mg sau mai puţin sau creşte între două cîntăriri succesive. Se foloseşte pentru calcule cea mai mică masă înregistrată.

5. Calcularea umidităţii:

% Umiditate = (m₁ – m₂) / (m₁ – m₀) × 100%,

unde:

m₀ – masa vasului şi a capacului;

m₁ – masa recipientului, a capacului şi a cantităţii analizate înainte de uscare;

m₂ – masa recipientului, a capacului şi a cantităţii analizate după uscare.

Rezultatele se înregistrează cu o precizie de 0,1 g/100 g.

6. Precizia metodei rezultă din valorile pentru repetabilitate şi reproductibilitate:

1) Limita de repetabilitate

Diferenţa absolută dintre rezultatele a două determinări separate, obţinute prin aceeaşi metodă cu material de analiză identic, în acelaşi laborator, de către acelaşi operator, folosind aceeaşi aparatură, într-un interval scurt de timp, va depăşi, în nu mai mult de 5% din cazuri, 0,4 g de apă/100 g de zară praf.

2) Limita de reproductibilitate

Diferenţa absolută dintre rezultatele a două determinări separate, obţinute prin aceeaşi metodă cu material de analiză identic, în laboratoare diferite, de către operatori diferiţi, folosind aparatură diferită, va depăşi, în nu mai mult de 5% din cazuri, 0,6 g de apă/100 g de zară praf acidă.

Anexa nr.19

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Metoda de referinţă pentru determinarea purităţii grăsimilor din lapte

prin analiza cromatografică în fază gazoasă a trigliceridelor

1. Prezenta Metodologie descrie o metodă de referinţă pentru determinarea purităţii grăsimii din lapte utilizînd analiza cromatografică în fază gazoasă a trigliceridelor. Pot fi detectate atît grăsimile vegetale, cît şi cele animale, cum ar fi seul de vită şi untura.

Cu ajutorul anumitor formule pentru trigliceride se poate determina integritatea grăsimilor din lapte. În principiu, metoda descrisă se aplică laptelui de vacă în vrac sau produselor derivate din acesta, indiferent de condiţiile de hrănire, reproducere sau lactaţie. Rezultatele fals pozitive pot să apară doar în cazul hrănirii excesive cu uleiuri vegetale pure, cum ar fi uleiul de rapiţă. De asemenea, produsele de lapte obţinute de la fiecare vacă în parte pot produce rezultate fals pozitive.

Metoda este aplicabilă în special grăsimilor extrase din produsele de lapte care ar trebui să conţină grăsimi pure din lapte a căror compoziţie este nemodificată, cum ar fi untul, smîntîna, laptele şi laptele praf. Tratamentul tehnologic al grăsimilor din lapte, cum ar fi eliminarea colesterolului sau fracţionarea, poate produce rezultate fals pozitive. Acest lucru se aplică şi în cazul grăsimii din lapte obţinută din laptele degresat sau zară. Metoda nu este întotdeauna aplicabilă pentru grăsimea extrasă din brînză, deoarece procesul de maturare poate afecta compoziţia grăsimii atît de mult încît se obţin rezultate fals pozitive.

Acidul butiric (n-butanoic) (C₄) apare exclusiv în grăsimile din lapte şi permite realizarea estimării cantitative a cantităţilor mici pînă la cele medii de grăsimi din lapte în grăsimile vegetale şi animale. Totuşi, datorită variaţiilor mari ale C₄ în procente aproximative ale intervalului fracţiunii de masă de 3,1% şi 3,8%, este dificil de furnizat informaţii calitative şi cantitative referitoare la fracţiunile de masă de pînă la 20% ale grăsimilor străine din grăsimile pure din lapte.

Practic, rezultatele cantitative nu pot fi obţinute din conţinutul de steroli al grăsimilor vegetale, deoarece acestea depind de condiţiile de producţie şi de prelucrare. Mai mult, determinarea calitativă a grăsimilor vegetale cu ajutorul sterolilor este ambiguă.

2. Puritatea grăsimii din lapte se defineşte ca absenţa grăsimilor vegetale sau animale, determinate cu ajutorul procedurii specificate în prezenta Metodologie.

Puritatea este determinată cu ajutorul valorilor S care sînt obţinute din compoziţia trigliceridelor. Fracţiunile de masă ale trigliceridelor sînt exprimate procentual.

3. Grăsimea extrasă din lapte sau produse de lapte este analizată prin gaz-cromatografie cu ajutorul unei coloane umplute sau al unei coloane capilare scurte în scopul determinării trigliceridelor (TG) care sînt separate prin numărul total de atomi de carbon. Prin introducerea fracţiunii de masă a moleculelor de grăsime de diferite dimensiuni (C₂₄ pînă la C₅₄, utilizînd doar numere pare pentru atomii de C), exprimată procentual, în formule adecvate pentru trigliceride, se pot calcula valorile S. Prezenţa grăsimilor străine este detectată dacă valorile S depăşesc limitele stabilite pentru grăsimile pure din lapte.

Valoarea S este suma tuturor fracţiunilor de masă a TG, înmulţită cu coeficienţii respectivi definiţi.

4. Reactivi utilizaţi sînt:

1) gaz vector: azot sau, ca alternativă, heliu, sau hidrogen, avînd toate o puritate de cel puţin 99,995%;

2) grăsimi standard pentru standardizarea unei grăsimi standard din lapte în conformitate cu punctul 7 subpunctul 3:

a) trigliceride etalon saturate; în comerţ sînt disponibile produse adecvate;

b) colesterol etalon;

3) metanol (CH₃OH), fără apă;

4) n-hexan (CH₃(CH₂)4CH₃);

5) n-heptan (CH₃(CH₂)5CH₃);

6) alte gaze: hidrogen, puritate de cel puţin 99,995%, fără impurităţi organice (C_nH_m < 1 μl/l); aer sintetic, fără impurităţi organice (C_nH_m < 1 μl/l);

7) sulfat de sodiu anhidru (Na₂SO₄).

5. Aparatură de laborator:

1) Gaz-cromatograf pentru temperatură înaltă

Gaz-cromatograful de temperatură înaltă trebuie să fie adecvat pentru temperaturi de cel puţin 400 °C şi să fie prevăzut cu detector cu ionizare în flacără. Pereţii despărţitori utilizaţi pentru injector trebuie să reziste la temperaturi înalte şi trebuie să prezinte un grad foarte scăzut de “curgere”. Pentru gaz-cromatograful (GC) cu coloane capilare se foloseşte un injector pentru coloane. Întotdeauna se utilizează garnituri de grafit pentru a conecta atît coloanele, cît şi injectorul şi/sau racordurile detectorului (acolo unde este cazul).

2) Coloana de cromatografie

a) Coloană umplută

Se utilizează o coloană de sticlă cu diametru intern de 2 mm şi lungime de 500 mm, umplută cu OV-1 3% în fază staţionară la 125 μm pînă la 150 μm (100 pînă la 120 ochiuri de sită) Gas ChromQ. Prepararea, silanizarea, umplerea şi condiţionarea coloanei umplute sînt descrise în instrucţiunea nr.1.

Ca o alternativă, se poate utiliza o coloană capilară.

b) Coloană capilară

Se utilizează o coloană capilară scurtă, de exemplu, de lungime de 5 m cu o fază staţionară nepolară care poate rezista la temperaturi de sau peste 400°C. Coloana se condiţionează prin efectuarea a 20 de analize pentru o soluţie de grăsime din lapte (punctul 8) în decurs de 2 pînă la 3 zile cu ajutorul indicaţiilor date la punctul 9 subpunctul 4) litera b).Apoi, coeficienţii de răspuns (punctul 9 subpunctul 3) se vor apropia de valoarea 1, dar vor fi mai mici de 1,20.

Se pot utiliza coloane cu dimensiuni diferite şi cu faze diferite nepolare, rezistente la temperaturi înalte, atît timp cît performanţa acestora corespunde cu prezenta Metodologie.

3) Coloană Extrelut cu capacitatea de 1 ml pînă la 3 ml cu gel de siliciu, necesară extracţiei grăsimii din lapte în conformitate cu punctul 7 subpunctul 3).

4) Garnituri de grafit, rezistente la temperaturi de cel puţin 400 °C, care sînt folosite pentru a conecta atît coloanele GC, cît şi injectorul şi/sau racordurile detectorului.

5) Baie de apă, care să menţină o temperatură de 50 °C ± 2 °C.

6) Cuptor care funcţionează la 50 °C ± 2 °C şi 100 °C ± 2 °C.

7) Micropipetă.

8) Pipetă gradată, avînd capacitatea de 5 ml.

9) Balon cu fund rotund, avînd capacitatea de 50 ml.

10) Balon Erlenmeyer, cu volum nominal de 250 ml.

11) Pîlnie.

12) Filtru de hîrtie cu pori fini.

13) Evaporator rotativ.

14) Fiole, cu volum nominal de 1 ml, prevăzute cu capac de aluminiu acoperit cu politetrafluoroetilen, care se ataşează sau se înşurubează.

15) Seringă de injectare al cărei piston nu trebuie să ajungă la vîrful acului (GC cu coloană umplută).

Cu aceste seringi se obţine o repetabilitate mai mare a rezultatelor.

16) Balanţă analitică, cu care se pot cîntări greutăţi pînă la aproximativ 1 mg, cu capacitate de citire de 0,1 mg.

6. O probă trebuie trimisă la laborator. În timpul transportului sau al depozitării, aceasta nu trebuie să fie deteriorată sau modificată.

Prelevarea probelor se efectuează conform SM SR EN ISO 707.

7. Pentru prepararea probelor pentru analiză se foloseşte una dintre următoarele trei metode de extracţie a grăsimii din lapte.

1) Izolarea din unt sau ulei de unt

Se topesc 50 g pînă la 100 g din proba pentru analiză la 50 °C, utilizînd o baie de apă sau un cuptor. Se pun 0,5 pînă la 1,0 g de sulfat de sodiu într-un filtru de hîrtie pliat. Preîncălziţi un balon Erlenmeyer de 250 ml şi o pîlnie cu filtrul de hîrtie introdus în cuptorul reglat la 50 °C. Stratul de grăsime din proba topită se filtrează, în timp ce balonul preîncălzit, pîlnia şi dispozitivul de filtrare introdus se menţin în cuptor. Trebuie acordată atenţia corespunzătoare, astfel încît serul să nu fie transferat.

Poate fi folosită o cantitate mai mică din proba analizată doar în cazurile în care este disponibilă o cantitate limitată de probă, iar procedura trebuie adaptată în consecinţă. Cu toate acestea, manipularea unei cantităţi mai mici de probă implică un risc mai mare de obţinere a unei mostre nereprezentative.

Untul poate fi obţinut din smîntînă prin agitarea şi spălarea temeinică a granulelor de unt rezultate.

Grăsimea din lapte obţinută prin utilizarea procedurii descrise în prezentul punct nu va conţine aproape deloc fosfolipide.

2) Extracţia conform metodei gravimetrice Röse-Gottlieb

Fracţiunea grăsimilor se extrage din proba pentru analiză prin utilizarea metodei gravimetrice descrisă în unul dintre standardele SM EN ISO 1211:2015, SM EN ISO 2450:2014 sau SM EN ISO 7328.

Dacă în grăsimea din lapte sînt prezente fosfolipide, se va obţine un vîrf de colesterol cu aproape 0,1% mai mare. Influenţa asupra compoziţiei TG standardizate la 100%, inclusiv colesterolul, este deci neglijabilă

3) Extracţia din lapte utilizînd coloane cu silicagel

Se adaugă cu ajutorul micropipetei 0,7 ml din proba pentru analiză la o temperatură de 20 °C într-o coloană Extrelut de 1 ml pînă la 3 ml. Se lasă să se distribuie uniform pe silicagel timp de aproximativ 5 min.

Pentru denaturarea complexelor protein-lipidice, se adaugă în coloana Extrelut 1,5 ml de metanol, cu ajutorul pipetei gradate. În consecinţă, fracţiunea grăsimilor se extrage din proba pentru analiză cu 20 ml de n-hexan. n-Hexanul se adaugă treptat în cantităţi mici. Solventul drenat se colectează într-un balon cu fund rotund de 50 ml, care a fost uscat în prealabil, pînă la obţinerea unei mase constante cunoscute, cîntărită cu o precizie de 1 mg, înregistrînd masa la 0,1 mg.

După extracţie, coloana se lasă să se scurgă pînă la golire. Solvenţii din eluant se distilează într-un evaporator rotativ cu baia de apă reglată la o temperatură între 40 °C şi 50 °C. După distilarea solvenţilor, se usucă şi se cîntăreşte în continuare balonul cu fund rotund şi conţinutul acestuia cu o precizie de 1 mg înregistrînd masa la 0,1 mg. Se determină masa grăsimii rezultată prin scăderea din masa obţinută a masei balonului uscat cu fund rotund.

Extracţia grăsimilor prin metodele Gerber, Weibull-Berntrop sau Schmid-Bonzynski-Ratzlaff sau izolarea grăsimilor din lapte cu ajutorul detergenţilor (metoda BDI) nu sînt adecvate pentru analiza TG, deoarece cantităţi semnificative de gliceride parţiale sau de fosfolipide pot trece în fază grasă. În consecinţă, aplicarea prezentei Metodologii este limitată la anumite produse, în particular la brînză.

8. Pentru gaz-cromatografia cu coloană umplută, se prepară o soluţie de grăsime (punctul 7) de 5% (fracţe de volum) în n-hexan sau n-heptan. În funcţie de dimensiunile coloanei, se foloseşte o concentraţie de 1% (0,53 mm, tub deschis de diametru mare) sau mai mică în cazul injectării coloanei cu o coloană capilară.

În funcţie de coloana utilizată şi de masa grăsimilor obţinute la punctul 7 subpunctul 3), se determină cantitatea de solvent care trebuie adăugată la proba pentru analiză din balon pe baza cîntăririi cu o precizie de 1 mg şi a înregistrării masei la 0,1 mg. Cantitatea rămasă se dizolvă complet.

Se transferă aproximativ 1 ml din soluţia de probă într-o fiolă.

9. Determinarea cromatografică a trigliceridelor are loc în felul următor:

1) Deviaţia liniei de bază

Pentru a reduce creşterea liniei de bază, coloana trebuie condiţionată după cum este specificat la punctul 5 subpunctul 2) litera b) (coloana capilară) sau în instrucţiunea nr.1 (coloana umplută).

Din cauza temperaturii înalte a coloanei, analiza TG este în mod particular sensibilă la creşterile liniei de bază pentru valorile mari ale numărului de atomi de carbon.

2) Tehnica injectării

a) Coloana umplută

Pentru evitarea efectelor de discriminare, se aplică tehnica injectării fierbinţi în scopul îmbunătăţirii cuantificării componentelor trigliceridice cu punct înalt de fierbere. Se umple acul cu aer prin tragerea soluţiei grase în seringă. Acul se introduce în injector. Înaintea injectării, acul se încălzeşte timp de aproximativ 3 s. Apoi, conţinutul seringii se injectează rapid.

b) Coloană capilară

Cînd se foloseşte injectarea la rece în coloană, se introduce acul seringii şi se injectează imediat. Timpul de retenţie al acului în orificiul de injectare trebuie să fie în aşa fel încît să se poată evita curbele ample ale vîrfului solventului.

În mod normal, timpul optim de retenţie este de aproximativ 3 s.

3) Calibrare

a) Generalităţi

Pentru calibrarea probelor analizate se realizează două pînă la trei analize ale grăsimilor standardizate din lapte la începutul fiecărei zile. Se foloseşte ultima analiză a grăsimilor standardizate din lapte pentru determinarea coeficienţilor de răspuns (fracţiunea de masă/fracţiunea de arie) ai TG şi ai colesterolului care se aplică următoarelor probe pentru analiză (punctul 11 subpunctul 1):

(1),

unde:

w _si – fracţiunea de masă, exprimată procentual, pentru fiecare dintre TG sau pentru colesterolul din grăsimea standardizată din lapte;

A _si – valoarea numerică a ariei de vîrf pentru fiecare TG sau pentru colesterolul din grăsimea standardizată din lapte.

Se utilizează fie litera b), fie litera c) din prezentul subpunct pentru a obţine grăsimi standardizate din lapte care au o compoziţie cunoscută de TG.

b) Grăsimi comerciale standard din lapte

Cea mai bună metodă de determinare a coeficientului de răspuns pentru fiecare compus al probei pentru analiză o reprezintă utilizarea grăsimilor standardizate din lapte care au o compoziţie de TG certificată.

c) Grăsimi standard din lapte obţinute în laborator

Se prepară aproximativ 1 g din amestecul de grăsimi standard (punctul 4 subpunctul 2, care conţine cel puţin trigliceridele saturate C₂₄, C₃₀, C₃₆, C₄₂, C₄₈ şi C₅₄, precum şi colesterol; în plus, de preferinţă, C₅₀ şi C₅₂) prin cîntărire cu o precizie de 1 mg, înregistrînd masa la 0,1 mg, pentru a obţine o compoziţie relativă a TG asemănătoare cu grăsimile din lapte.

Se analizează în mod repetat o soluţie de amestec de grăsimi standard în n-hexan sau n-heptan, conform subpunctului 4) din prezentul punct. Păstrînd aceeaşi desfăşurare secvenţională, se analizează repetat compoziţia aproximativă a grăsimilor din lapte.

Din amestecul de grăsimi standard, se determină coeficienţii de răspuns ai TG. Coeficienţii de răspuns parţial ai TG, care nu există în amestec, se pot calcula prin interpolare matematică. Coeficienţii de răspuns obţinuţi se aplică grăsimilor din lapte pentru a obţine o compoziţie standardizată. Grăsimile standardizate din lapte astfel obţinute au un termen de valabilitate de mai mulţi ani, în condiţii de depozitare cu azot şi la o temperatură maximă de – 18 °C.

4) Condiţii de cromatografie

Utilizarea coloanelor umplute sau a coloanelor capilare are ca rezultat o rezoluţie asemănătoare cu figura 1. Descompunerea trigliceridelor cu număr par de atomi de C nu se observă în mod obişnuit şi trebuie evitată.

a) Coloana umplută

Programul de temperatură – temperatura iniţială a cuptorului se fixează la 210 °C. Această temperatură se menţine timp de 1 min. Apoi temperatura se măreşte cu 6 °C/min. pînă ajunge la 350 °C. Această temperatură (finală) se menţine timp de 5 min.

Temperaturile pentru detector şi injector – ambele temperaturi se fixează la 370 °C.

Gazul vector – se utilizează azotul cu un debit constant de aproximativ 40 ml/min. Debitul exact al gazului vector se ajustează astfel încît C₅₄ este eluată la o temperatură de 341 °C.

Durata analizei – 29,3 min.

Volumul injectat – se injectează 0,5 μl din soluţia de probă de 5% (fracţiune de volum).

Dacă nu se desfăşoară nici o analiză a TG, se menţine temperatura iniţială a cuptorului, se menţin temperaturile detectorului şi injectorului şi se menţine rata de flux a gazului vector la un nivel constant, de asemenea şi în timpul nopţii, în weekend sau în timpul concediilor. Acest lucru asigură performanţa optimă a coloanei.

b) Coloană capilară

Programul de temperatură – temperatura iniţială a cuptorului se fixează la 80 °C. Această temperatură se menţine timp de 0,5 min. Apoi temperatura se măreşte cu 50 °C/min. pînă la 190 °C şi, apoi, cu 6 °C/min. pînă la 350 °C. Această temperatură (finală) se menţine timp de 5 min.

Temperatura detectorului – se fixează la 370 °C.

Gazul vector – se utilizează azotul la un debit constant de aproximativ 3 ml/min.

Durata analizei – 34,4 min.

Volumul injectat – se injectează 0,5 μl din soluţia de probă de 1% (fracţiune de volum).

Aceste setări se menţin şi în timpul perioadei de standby, pentru a se asigura performanţe optime (litera a) din prezentul subpunct).

Setările analitice prezentate la prezentul subpunct sînt adecvate pentru utilizarea unei coloane cu diametru interior larg (0,53 mm ID). Dacă se utilizează o coloană cu alte dimensiuni sau altă fază, trebuie aplicate condiţii diferite.

10. Se evaluează vîrfurile de pe cromatogramă cu un sistem de integrare cu care se poate trasa o linie de bază şi cu care se poate realiza o reintegrare. În figura 1 este prezentată o cromatogramă integrată corect, în timp ce în figura 2 este prezentată o eroare sporadică la sfîrşitul liniei de bază după C₅₄ care influenţează procentajul tuturor trigliceridelor. Vîrfurile eluate după C₅₄ se exclud din evaluare.

Trigliceridele cu număr acil-C impar (2n + 1) se combină cu trigliceridele anterioare cu număr par (2n). Nu se iau în considerare conţinutul mic de C₅₆. Aria procentelor trigliceridelor rămase, inclusiv colesterolul, se înmulţeşte cu coeficienţii de răspuns corespunzători ai grăsimii standard din lapte (de la ultima calibrare) şi se normalizează global la 100 conform punctului 11 subpunctul 1.

Figura 1. Exemplu de cromatogramă trigliceridică

a grăsimii din lapte cu linia de bază trasată corect

Figura 2. Exemplu de cromatogramă trigliceridică

 a grăsimii din lapte cu linia de bază trasată incorect

Pentru controlarea condiţiilor de măsurare, se compară coeficienţii de variaţie, CV, exprimaţi procentual pentru diferite trigliceride prezentate în tabelul 1 şi care se bazează pe 19 analize consecutive pentru aceeaşi probă de grăsime din lapte.

Dacă valorile CV sînt semnificativ mai mari decît valorile date în tabelul 1, condiţiile de cromatografie nu sînt adecvate.

Tabelul 1

Coeficienţii de variaţie pentru conţinutul

de trigliceride (19 analize consecutive)

Valorile prezentate în tabelul 1 nu sînt obligatorii, dar sînt orientative pentru controlul calităţii.

Cu toate acestea, în cazul în care se acceptă valori mai mari ale CV, trebuie să se respecte limitele de repetabilitate şi de reproductibilitate din clauza 12.

11. Rezultatele se calculează şi se exprimă în felul următor:

1) Compoziţia de trigliceride

a) Calcularea

Se calculează fracţiunea de masă pentru fiecare TG (pentru i = C₂₄, C₂₆, C₂₈, C₃₀, C₃₂, C₃₄, C₃₆, C₃₈, C₄₀, C₄₂, C₄₄, C₄₆, C₄₈, C₅₀, C₅₂, şi C₅₄) şi pentru colesterol, wi , exprimat ca procent, din conţinutul total de TG al probei pentru analiză prin utilizarea formulei următoare:

(2),

unde:

A_i – valoarea numerică a ariei vîrfului pentru fiecare dintre TG din proba pentru analiză;

RF _si – coeficientul de răspuns pentru fiecare TG determinată prin calibrare (punctul 9 subpunctul 3).

b) Exprimarea rezultatelor analizei

Rezultatele se exprimă cu două zecimale.

2) Valorile S

a) Calcularea

Valorile S, exprimate procentual, se calculează prin introducerea wi (subpunctul 1 litera a) din prezentul punct), calculat pentru procentul adecvat de TG în formulele de la (3) la (7). Se folosesc toate formulele, indiferent de tipul suspectat de grăsime străină.

Ulei de soia, de floarea-soarelui, de măsline, de rapiţă, de in, de germeni de grîu, de germeni de porumb, din seminţe de bumbac şi de peşte

S = 2,098 3 · w _C30 + 0,728 8 · w _C34 + 0,692 7 · w _C36 + 0,635 3 · w _C38 + 3,745 2 · w _C40 –

1,292 9 · w _C42 + 1,354 4· w _C44 + 1,701 3 · w _C46 + 2,528 3 · w _C50 (3)

Grăsime de palmier şi grăsime din sîmburi de palmier

S = 3,745 3 · w _C32 + 1,113 4 · w _C36 + 1,364 8 · w _C38 + 2,154 4 · w _C42 + 0,427 3 · w _C44 +

0,580 9 · w _C46 + 1,292 6· w _C48 + 1,030 6 · w _C50 + 0,995 3 · w_C52 + 1,239 6 · w _C54 (4)

Ulei de palmier şi seu de vită

S = 3,664 4 · w _C28 + 5,229 7 · w _C30 – 12,507 3 · w _C32 + 4,428 5 · w _C34 – 0,201 0 · w _C36 +

 1,279 1 · w _C38 + 6,743 3· w _C40 – 4,271 4 · w _C42 + 6,373 9 · w_C46 (5)

Untură

S = 6,512 5 · w _C26 + 1,205 2 · w _C32 + 1,733 6 · w _C34 + 1,755 7 · w _C36 +

2,232 5 · w _C42 + 2,800 6 · w _C46 + 2,543 2· w _C52 + 0,989 2 · w _C54 (6)

Total

S = – 2,757 5 · w _C26 + 6,407 7 · w _C28 + 5,543 7 · w _C30 – 15,324 7 · w _C32 + 6,260 0 · w _C34 +

 8,010 8 · w _C40 – 5,033 6 · w _C42 + 0,635 6 · w _C44 + 6,017 1 · w_C46 (7)

b) Exprimarea rezultatelor analizei

Rezultatele se exprimă cu două zecimale.

3) Detectarea grăsimilor străine

Se compară cele 5 valori S obţinute la subpunctul 2) litera a) din prezentul punct cu limitele S corespunzătoare prezentate în tabelul 2.

Tabelul 2

Limitele S pentru grăsimile pure din lapte

_________________________

(¹) Calculată pentru un nivel de încredere de 99%, astfel încît adăugarea de grăsimi străine este indicată doar dacă limitele de detectare ale formulei respective sînt depăşite (tabelul 1).

Proba pentru analiză se consideră grăsime pură din lapte dacă toate cele 5 valori S sînt cuprinse între limitele menţionate în tabelul 2. Cu toate acestea, dacă o valoare S este în afara limitelor corespunzătoare, se consideră că proba conţine grăsime străină.

Cu toate că fiecare formulă de la (3) la (6) este mai sensibilă pentru anumite grăsimi străine decît formula totală (7) (tabelul 1), un rezultat pozitiv obţinut doar cu o singură formulă de la (3) la (6) nu permite tragerea unor concluzii cu privire la tipul de grăsime străină.

Instrucţiunea nr.2 prezintă o modalitate de calcul al conţinutului de grăsime vegetală sau animală în grăsimea impură din lapte. Acest procedeu nu este validat, fiind doar orientativ.

12. Precizia metodei rezultă din valorile pentru repetabilitate şi reproductibilitate:

1) Analiză interlaboratoare

Valorile pentru repetabilitate şi reproductibilitate sînt determinate pe baza formulelor de la (3) la (7), utilizîndu-se grăsimi pure din lapte, fiind posibil ca acestea să nu fie aplicabile în cazul altor matrice decît cele prezentate.

2) Repetabilitate

Diferenţa absolută dintre două rezultate individuale ale unui singur test, obţinute cu aceeaşi metodă aplicată asupra unor materiale de testare identice, în acelaşi laborator, de către acelaşi operator, utilizîndu-se acelaşi echipament, la un interval scurt de timp, nu va depăşi limitele din tabelul 3 în peste 5% din cazuri.

Tabelul 3

Limitele de repetabilitate, r, pentru formulele de la (3) la (7)

3) Reproductibilitate

Diferenţa absolută dintre două rezultate ale unui singur test, obţinute cu aceeaşi metodă aplicată asupra unor materiale de testare identice, în laboratoare diferite, de către operatori diferiţi, utilizîndu-se un echipament diferit, nu va depăşi limitele din tabelul 4 în peste 5% din cazuri.

Tabelul 4

Limitele de reproductibilitate, R, pentru formulele de la (3) la (7)

13. Incertitudinea extinsă pentru valoarea S se poate calcula cu ajutorul repetabilităţii, r, şi a reproductibilităţii, R.

Introducerea incertitudinii extinse (pe baza probelor martor) între limitele S din tabelul 2 are ca rezultat extinderea limitelor S prezentate în tabelul 5.

Tabelul 5

Limitele S extinse pentru grăsimile pure din lapte,

inclusiv incertitudinea extinsă

14. Raportul de analiză specifică:

1) toate informaţiile necesare pentru identificarea completă a probei;

2) metoda utilizată pentru prelevarea probelor, dacă se cunoaşte;

3) metoda de analiză utilizată în conformitate cu prezentul standard internaţional;

4) toate detaliile operaţionale care nu sînt specificate în prezentul standard internaţional sau care sînt considerate opţionale, împreună cu detaliile referitoare la orice incident care ar putea influenţa rezultatul (rezultatele) testului;

5) rezultatul (rezultatele) testului care a fost obţinut şi, dacă repetabilitatea a fost verificată, rezultatul final stabilit care a fost obţinut.

Instrucţiunea nr.1

Prepararea coloanei umplute

1. Reactivii şi echipamentele ce se utilizează sînt:

1) Toluen (C₆H₅CH₃).

2) Soluţie de dimetildiclorsilan [Si(CH₃)₂Cl₂]

Se dizolvă 50 ml de dimetildiclorsilan în 283 ml de toluen.

3) Soluţie de unt de cocos, cu o fracţiune de masă de 5% unt de cocos în n-hexan sau n-heptan

4) Fază staţionară, 3-% OV-1 la 125 μm pînă la 150 μm (100 pînă la 120 ochiuri de sită) Gas ChromQ

5) Coloană de sticlă, avînd un diametru intern de 2 mm şi o lungime de 500 mm, în formă de U

6) Echipament pentru umplerea coloanei

a) Coloană de umplere, cu capac care se înşurubează, prevăzut cu un marcaj pînă la care se poate umple cu cantitatea necesară de fază staţionară

b) Sită fină, cu dimensiunea ochiurilor de sită de aproximativ 100 μm, cu capac care se înşurubează pentru etanşeizarea coloanei de sticlă

c) Vată de sticlă silanizată, dezactivată

d) Vibrator pentru distribuţia uniformă a fazei staţionare în timpul umplerii

e) Dispozitive de silanizare pentru silanizarea suprafeţei de sticlă a coloanei

f) Vas Woulff

g) Pompă de aspiraţie a apei.

2. După conectarea vasului Woulff la pompa de aspiraţie a apei, se introduce tubul 2 (figura 3) în soluţia de dimetilclorsilan. Se umple coloana cu această soluţie prin închiderea robinetului. Se deschide robinetul din nou şi apoi se îndepărtează cele două tuburi. Se fixează coloana pe stativ. Se umple complet cu soluţia de dimetildiclorsilan cu ajutorul unei pipete.

Figura 3. Dispozitivul de silanizare (dezactivarea suprafeţei de sticlă)

Legendă

1 – tub 1;

2 – tub 2;

3 – pompă de aspiraţie;

4 – robinet;

5 – coloană de sticlă;

6 – dimetildiclorsilan şi toluen.

Se lasă coloana în poziţie verticală între 20 şi 30 min. Apoi se înlocuieşte vasul Woulff cu un balon de filtrare. Se goleşte coloana prin conectarea acesteia la pompa de aspiraţie a apei (figura 4). Se clăteşte repetat coloana golită cu 75 ml de toluen şi 50 ml metanol prin introducerea tubului 2 în solvent. Coloana clătită se usucă în cuptor la 100 °C timp de aproximativ 30 min.

Figura 4. Dispozitivul de clătire

Legendă

1 – tub 1;

2 – tub 2;

3 – pompă de aspiraţie a apei;

4 – balon de filtrare;

5 – coloană de sticlă;

6 – agent de clătire.

3. Coloana se umple cu ajutorul dispozitivului reprezentat în figura 5. Coloana de umplere se umple cu fază staţionară pînă la marcaj. Capătul inferior al coloanei de sticlă se sigilează cu un dop de vată comprimată de sticlă silanizată cu o lungime de aproximativ 1 cm. Capătul coloanei de sticlă se închide cu o sită fină.

Figura 5. Umplerea coloanei de sticlă

Legendă

1 – orificiu de pătrundere a azotului;

2 – coloana de umplere care trebuie umplută cu OV-1 pînă la marcaj;

3 – coloana de sticlă care trebuie umplută;

4 – capac care se înşurubează, cu filtru, prin care fibrele de sticlă şi faza staţionară sînt comprimate.

Coloana se umple cu faza staţionară sub presiune (300 kPa şi debit de azot). Pentru a se obţine o umplere uniformă, continuă şi fermă, în timpul umplerii se deplasează vibratorul în sus şi în jos pe coloana de sticlă. După umplere, la capătul celălalt al coloanei umplute se ataşează un dop solid de vată de sticlă silanizată. Capetele care ies în exterior se taie. Dopul se împinge în interiorul coloanei cu cîţiva milimetri cu ajutorul unei spatule.

4. Pentru a se evita contaminarea, în timpul etapelor de la (a) la (c), capătul din spate al coloanei nu se conectează la detector. Coloana umplută se condiţionează după cum urmează:

1) coloana se spală cu azot timp de 15 min, la un debit de 40 ml/min. şi o temperatură a cuptorului GC de 50 °C;

2) coloana se încălzeşte cu 1 °C/min. pînă la 355 °C, cu un debit al azotului de 10 ml/min;

3) coloana se menţine la 355 °C, timp de 12 h pînă la 15 h;

4) se injectează de două ori 1 μl de soluţie de unt de cocos, utilizîndu-se programul de temperatură al coloanei umplute prezentat la punctul 9 subpunctul 4) litera a);

Untul de cocos este format aproape în întregime din trigliceride C₅₀ pînă la C₅₄ cu punct ridicat de fierbere, reducîndu-se eforturile condiţionării coloanei în conformitate cu coeficienţii de răspuns respectiv;

5) se injectează de 20 de ori 0,5 μl de soluţie de grăsimi din lapte timp de 2 pînă la 3 zile conform punctului 8, utilizînd indicaţiile pentru coloana umplută prezentate la punctul 9 subpunctul 4) litera a).

La probele pentru analiză se utilizează doar coloane cu coeficienţi de răspuns aproape de 1. Coeficienţii de răspuns nu trebuie să depăşească 1,20.

Instrucţiunea nr.2

Cuantificarea conţinutului de grăsimi străine

1. Tabelul 1 prezintă limitele de detectare pentru diferite grăsimi străine calculate pentru un interval de încredere de 99%. Coloana din mijloc indică limitele de detectare pentru cele mai bune formule de la (3) la (6).

Limitele de detectare a formulei totale (7), indicate de coloana din extrema dreaptă, sînt ceva mai mari. În principiu, formula (7) este necesară doar pentru cuantificarea grăsimilor străine.

Cu ajutorul tuturor formulelor pot fi detectate, de asemenea, combinaţii ale diferitor tipuri de grăsimi străine. Diferenţa de compoziţie a TG dintre probele individuale ale unui tip de grăsime străină nu influenţează semnificativ limitele de detectare.

Dacă se folosesc ambele formule individuale şi ecuaţia totală, se aplică limitele de detectare ale ecuaţiilor individuale. Cu toate acestea, în anumite cazuri, valoarea S pentru formula totală este necesară pentru cuantificare.

Tabelul 6

Limitele de detectare cu o precizie de 99 % pentru grăsimile

străine adăugate în grăsimile din lapte exprimate procentual

2. Determinarea cantitativă a grăsimii străine se realizează doar dacă cel puţin una dintre limitele S (tabelul 2 sau tabelul 5) este depăşită. Pentru a se obţine informaţii cantitative, se calculează fracţiunea de masă a grăsimii străine sau fracţiunea de masă a amestecului de grăsimi străine din proba pentru analiză, w _f, exprimată procentual, cu ajutorul formulei următoare:

unde:

S – rezultatul obţinut prin introducerea datelor despre TG din grăsimea din lapte, la care s-a adăugat o grăsime străină sau un amestec de grăsimi străine, în una dintre formulele de la (3) la (7);

S _f – o constantă care depinde de tipul de grăsime străină adăugat.

Dacă nu se cunoaşte tipul de grăsime străină adăugat la grăsimea din lapte, se utilizează o valoarea generală pentru S _f de 7,46 (tabelul 7). Se utilizează întotdeauna valoarea S obţinută din formula (7), chiar dacă limitele S pentru aceasta nu sînt depăşite, spre deosebire de limitele altei formule.

Dacă se cunosc grăsimile străine, valorile individuale S_f ale acestora (tabelul 7) se introduc în formula (8). Pentru a se calcula valoarea S, se alege formula relevantă pentru grăsimea străină din formulele de la (3) la (6).

Anexa nr.20

la Metodologia de analiză şi evaluare

calitativă a laptelui şi a produselor lactate

Procedura aplicabilă cînd rezultatele unei analize

sînt contestate (analiză chimică)

1. La cererea producătorului, se poate realiza o analiză suplimentară prin metoda relevantă în alt laborator acreditat, cu condiţia să fie disponibile probe martor sigilate din produs care să fi fost depozitate în siguranţă de primul laborator care a efectuat analizele. Cererea se face în termen de 7 zile lucrătoare de la notificarea rezultatelor primei analize. Analiza este efectuată în termen de 21 de zile lucrătoare de la primirea cererii. Primul laborator trimite aceste probe unui al doilea laborator, la cererea şi pe cheltuiala producătorului. Cel de-al doilea laborator trebuie să aibă competenţe dovedite în realizarea analizelor în cauză.

2. Incertitudinile extinse (k = 2) pentru valoarea medie ӯ₁ pentru măsurătorile n₁ repetate în laboratorul 1 şi pentru valoarea medie ӯ₂ pentru măsurătorile n₂ repetate în laboratorul 2 sunt:

şi respectiv 

unde:

σ_r – deviaţia standard a repetabilităţii: iar

σ_R – deviaţia standard a reproductibilităţii pentru metoda relevantă.

Dacă rezultatul y al măsurătorii în laboratoare este calculat folosind o formulă de tipul:

y = x₁ + x₂, y = x₁ - x₂, y = x₁ ˇ x₂ or y = x₁ / x₂,

în astfel de cazuri trebuie urmate modalităţile obişnuite de combinare a deviaţiilor standard pentru a obţine incertitudinea.

3. Pentru a verifica dacă rezultatele celor două laboratoare corespund cu deviaţia standard σ_R a reproductibilităţii metodei, se calculează incertitudinea extinsă a diferenţei ӯ₁- ӯ₂.

4. .

Dacă valoarea absolută a diferenţei dintre valorile medii obţinute de laborator nu este mai mare decît incertitudinea ,

,

rezultatele celor două laboratoare corespund cu deviaţia standard σ_r a reproductibilităţii, iar media aritmetică a valorilor medii obţinute de cele două laboratoare:

este raportată drept rezultat final. În acest caz, incertitudinea extinsă este:

.

Lotul este respins pentru că nu respectă limita legală superioară UL în cazul în care:

În caz contrar, lotul este acceptat ca respectînd UL.

Lotul este respins pentru că nu respectă limita legală inferioară LL în cazul în care:

În caz contrar, lotul este acceptat ca respectînd LL.

Dacă valoarea absolută a diferenţei dintre valorile medii | obţinute de laborator este mai mare decît incertitudinea

 ,

rezultatele celor două laboratoare nu respectă deviaţia standard a reproductibilităţii.

În cazul în care a doua analiză o confirmă pe prima, lotul este respins ca fiind neconform. În caz contrar, lotul este acceptat ca fiind conform.

Rezultatele finale trebuie notificate de către laborator producătorului cît mai curînd posibil. În cazul în care lotul este respins, costurile celei de-a doua analize sînt suportate de către producător.