Постановления

Постановление № 1459 от 30.12.2016

об утверждении Методологии анализа и качественной оценки молока и молочных продуктов

Тип документа: Постановления
Дата принятия: 30.12.2016

ПРАВИТЕЛЬСТВО РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА

ПОСТАНОВЛЕНИЕ

об утверждении Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

№ 1459 от 30.12.2016

(в силу 17.02.2019)

Мониторул Офичиал ал Р. Молдова № 50-59 ст. 115 от 17.02.2017

* * *

На основании Закона № 78-XV от 18 марта 2004 года о пищевых продуктах (Официальный монитор Республики Молдова, 2004 г., № 83-87, ст.431) Правительство

ПОСТАНОВЛЯЕТ:

1. Утвердить Методологию анализа и качественной оценки молока и молочных продуктов (прилагается).

2. Настоящее постановление вступает в силу через 24 месяца после его опубликования в Официальном мониторе Республики Молдова.

3. Контроль за выполнением настоящего Постановления возложить на Национальное агентство по безопасности пищевых продуктов.

ПРЕМЬЕР-МИНИСТР

Павел ФИЛИП

Контрасигнуют:

зам. премьер-министра,

министр экономики

Октавиан КАЛМЫК

зам. премьер-министра,

министр иностранных дел

и европейской интеграции

Андрей ГАЛБУР

министр сельского хозяйства

и пищевой промышленности

Эдуард ГРАМА

министр юстиции

Владимир ЧЕБОТАРЬ

№ 1459. Кишинэу, 30 декабря 2016 г.

Утверждена

Постановлением Правительства

№ 1459 от 30 декабря 2016 г.

МЕТОДОЛОГИЯ

анализа и качественной оценки молока и молочных продуктов

Настоящая методология анализа и качественной оценки молока и молочных продуктов (в дальнейшем – Методология ) перелагает Регламент (ЕС) № 273/2008 Комиссии от 5 марта 2008 года об установлении норм по применению Регламента (ЕС) № 1255/1999 Совета о методах анализа и качественной оценке молока и молочных продуктов, опубликованного в Официальном журнале Европейского Союза (JО) № L 088 от 29 марта 2008 года.

I. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Настоящая методология устанавливает соответствующие эталонные методы проведения аккредитованными национальными лабораториями химических, физических и микробиологических анализов молока и молочных продуктов (в дальнейшем – продукты ) как местного производства, так и импортируемых.

2. Под действие настоящей методологии подпадают группы продуктов с товарными позициями 0401-0406 и 2309 согласно Комбинированной товарной номенклатуре, утвержденной Законом № 172 от 25 июля 2014 года .

II. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

3. Эталонные методы химического, физического и микробиологического анализа и сенсорной оценки молока и молочных продуктов, а также нормы по применению соответствующих методов предусмотрены в приложении № 1.

4. Рутинные методы могут быть использованы для необходимых анализов при условии, что они будут утверждаться и проверяться аккредитованной лабораторией на основании эталонных методов. Результаты сравниваются с учетом установленных неравенств, повторяемости и воспроизводимости.

В случае оспаривания результат, полученный эталонным методом, является решающим.

5. Оценка соответствия партии установленному законом пределу, за исключением анализа маркеров, указывается в приложении № 2 и применяется в целях определения соответствия требованиям относительно состава.

6. Для сенсорной оценки молока и молочных продуктов, за исключением сливочного масла государственного резерва, в качестве эталонного метода используется либо стандарт SM ISO 22935-1:2015, SM ISO 22935-2:2015, SM ISO 22935-3:2015, либо другие сопоставимые методы.

7. Процедура, предусмотренная в приложении № 3, применяется в качестве эталонного метода для сенсорной оценки масла.

8. Метод анализа, предусмотренный в приложении № 4, используется в качестве эталонного метода для определения содержания триглицеридов энантовой кислоты в сливочном масле, топленом масле и сливках.

9. Метод анализа, предусмотренный в приложении № 5, используется в качестве эталонного метода для определения ванилина в масляном жире, сливочном масле и сливках.

10. Метод анализа, предусмотренный в приложении № 6, используется в качестве эталонного метода для определения содержания этилового эфира бета-апо-8'-каротиновой кислоты в масляном жире и в сливочном масле.

11. Метод анализа, предусмотренный в приложении № 7, используется в качестве эталонного метода для определения β-ситостерина и стигмастерина в сливочном масле и в масляном жире.

12. Масляный жир, сливочное масло и сливки считаются промаркированными, если полученные результаты соответствуют спецификациям, указанным в пунктах 12 и 13 приложения № 4, пункте 8 приложений № 5 и 6 и в пункте 12 приложения № 7.

13. Эталонный метод, предусмотренный в приложении № 8, гарантирует, что творог, полученный только с использованием овечьего, козьего или буйволиного молока или из смеси овечьего, козьевого и буйволиного молока, не содержит казеина из коровьего молока.

14. Считается, что присутствует казеин из коровьего молока в случаях, когда содержание казеина из коровьего молока в анализируемой пробе равно или превышает его содержание в эталонной пробе, содержащей 1% коровьего молока, в соответствии с приложением № 8.

15. Рутинные методы для обнаружения казеина из коровьего молока в сырах, предусмотренные в пунктах 13 и 14, могут использоваться при условии, что:

a) предел обнаружения составляет не более 0,5%;

b) отсутствуют ложноположительные результаты;

c) казеин из коровьего молока может быть обнаружен с необходимой чувствительностью даже после длительных периодов созревания, как и в случае обычных условий продажи.

В случае если не выполнено ни одно из условий, указанных в подпунктах а)-с) настоящего пункта, используются эталонные методы, предусмотренные в приложении № 8.

16. Обнаружение колиформных бактерий в сливочном масле, обезжиренном сухом молоке, казеине и казеинатах осуществляется в соответствии с эталонным методом, предусмотренным в приложении № 9.

17. Определение содержания лактозы в продуктах, подпадающих под действие товарного кода 2309 согласно Комбинированной товарной номенклатуре , осуществляется в соответствии с эталонным методом, предусмотренным в приложении № 10.

18. Обнаружение сычужной сыворотки в обезжиренном сухом молоке осуществляется в соответствии с эталонным методом, предусмотренным в приложении № 11.

19. Сычужная сыворотка в обезжиренном сухом молоке и в смесях, предназначенных для использования в качестве кормов для животных, обнаруживается в соответствии с эталонным методом, предусмотренным в приложении № 11. В случае обнаружения сычужной сыворотки применяется приложение № 12.

20. Обнаружение пахты в обезжиренном сухом молоке осуществляется в соответствии с эталонным методом, предусмотренным в приложении № 13.

21. Обнаружение остатков антимикробиотиков в обезжиренном сухом молоке осуществляется в соответствии с эталонным методом, предусмотренным в приложении № 14.

22. Определение содержания обезжиренного сухого молока в комбинированных кормах осуществляется в соответствии с эталонным методом, предусмотренным в приложении № 15.

23. Обнаружение крахмала в обезжиренном сухом молоке, денатурированном сухом молоке и в комбинированных кормах осуществляется в соответствии с эталонным методом, предусмотренным в приложении № 16.

24. Определение содержания влажности в сухих сливках осуществляется в соответствии с эталонным методом, предусмотренным в приложении № 17.

25. Определение содержания влажности в кислой сухой пахте, предназначенной для использования в кормах, осуществляется в соответствии с эталонным методом, предусмотренным в приложении № 18.

26. Определение чистоты молочного жира осуществляется в соответствии с эталонным методом, предусмотренным в приложении № 19.

27. Анализы осуществляются в лабораториях, аккредитованных согласно SM SR EN ISO/CEI 17025 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий, в которых имеется аналитическая система обеспечения качества, включая внутренние процедуры контроля качества.

28. В лаборатории должно иметься для консультирования подробное описание используемых систем обеспечения качества.

29. Лаборатории, аккредитованные в соответствии с международными эталонными стандартами, принятыми в качестве национальных стандартов, обеспечивают участие в тестах на компетентность в порядке, установленном в эталонном стандарте.

30. Отбор проб осуществляется в соответствии с настоящей методологией для соответствующего продукта. В случае отсутствия положения относительно отбора проб используется стандарт SM SR EN ISO 707:2012 Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб.

31. Отчеты по испытаниям, составленные лабораторией по результатам анализа, должны содержать достаточно сведений, предусмотренных в пунктах 5.10 стандарта SM SR EN ISO/CEI 17025, с тем чтобы можно было провести оценку результатов в соответствии с положениями приложений № 2 и 20.

32. В случае если оператор не принимает результаты анализа, осуществляется процедура, предусмотренная в приложении № 20.

33. В случае если производитель может доказать в течение пяти рабочих дней со дня отбора проб, что процедура отбора проб не была осуществлена правильно, лаборатория обязуется осуществить повторный отбор проб.

Приложение № 1

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Список эталонных методов

Часть I

Продукт

Параметр

Предел( 1 )

Эталонный метод

Примечание

Несоленое сливочное масло

Жирность, мин.

82% м/м

SM SR EN ISO 17189:2012

Вода, макс.

16% м/м

SM SR EN ISO 3727-1:2012

Нежирные твердые вещества, макс.

2% м/м

SM SR EN ISO 3727-2:2012

Кислотность

1,2 ммоль /100 г жира

SM ISO 1740:2015

Пероксидное число, макс.

0,3 миллиэквивалента кислорода /1000 г жиров

SM ISO 3976:2015

Примечание 1

Колиформные бактерии

Необнаруживаемые в 1 г

приложение № 9

Примечание 4

Посторонний жир

Необнаруживаемые путем анализа триглицеридов

приложение № 19

Маркеры стерина

Необнаруживаемые, β-ситостерин ≤ 40 мг/кг

приложение № 7

Другие маркеры:

- ванилин

Необнаруживаемый

приложение № 5

- этиловый эфир каротиновой кислоты

≤ 6 мг/кг

приложение № 6

- триглицериды энантовой кислоты

Необнаруживаемые

приложение № 4

Сенсорные признаки

По крайней мере, 4 из 5 пунктов для A, F и C

приложение № 3

Дисперсия воды

Не менее 4 пунктов

Примечание 2

Соленое сливочное масло

Жирность, мин.

80% м/м

SM SR EN ISO 17189:2012

Посторонний жир

приложение № 19

Вода, макс.

16% м/м

SM SR EN ISO 3727-1:2012

Нежирные твердые вещества (за исключением соли), макс.

2% м/м

SM SR EN ISO 3727-2:2012

Соль, макс.

2 % м/м

SM ISO 15648:2015

Маркеры:

- стерины

Смотри

приложение № 7

- ванилин

Смотри

приложение № 5

- этиловый эфир каротиновой кислоты

Смотри

приложение № 6

- триглицериды энантовой кислоты

Смотри

приложение № 4

Масляный жир, используемый для производства кондитерских изделий, мороженого и других пищевых продуктов

Жирность, мин.

99,8% м/м

SM ISO 8851-3:2015

Вода и нежирные твердые вещества, макс.

0,2% м/м

SM ISO 8851-1:2015 (вода)

SM ISO 8851-2:2015 (нежирные твердые вещества)

Кислотность

1,2 ммоль /100 г жиров

SM ISO 1740:2015

Пероксидное число, макс

0,5 миллиэквивалента кислорода /1000 г жиров

SM ISO 3976:2015

Примечание 1

Посторонний жир

Отсутствуют

приложение № 19

Аромат

Свежий

Запах

Без постороннего запаха

Прочее

Отсутствие нейтрализаторов, антиоксидантов и консервантов

Маркеры:

- стерины

Смотри

приложение № 7

- ванилин

Смотри

приложение № 5

- этиловый эфир каротиновой кислоты

Смотри

приложение № 6

- триглицериды энантовой кислоты

Смотри

приложение № 4

Масляный жир, предназначенный для непосредственного употребления в пищу

Жирность, мин

96% м/м

SM ISO 8851-3:2015

Посторонний жир

приложение № 19

Нежирные твердые вещества, макс.

2% м/м

SM SR EN ISO 3727-2:2012

Маркеры:

- стигмастерин (95% м/м)

15 г /100 кг масляного жира

приложение № 7

- стигмастерин (85% м/м)

17 г /100 кг масляного жира

приложение № 7

- триглицериды энантовой кислоты

10,34 г /100 кг масляного жира

приложение № 4

- этиловый эфир масляной кислоты и стигмастерин

- этиловый эфир масляной кислоты

приложение № 8 (стигмастерин)

Примечание 2

- этиловый эфир масляной кислоты и триглицериды энантовой кислоты

- этиловый эфир масляной кислоты

приложение № 5 (триглицериды энантовой кислоты)

Примечание 2

лецитин (E 322), макс.

0,5% м/м

Примечание 2

NaCl, макс.

0,75% м/м

SM ISO 15648:2015

Сводные жирные кислоты

1,2 ммоль /100 г жира

SM ISO 1740:2015

Пероксидное число, макс

0,5 миллиэквивалента кислорода /1000 г жира

SM ISO 3976:2015

Примечание 1

Аромат

Свежий

Запах

Без постороннего запаха

Прочее

Отсутствие нейтрализаторов, антиоксидантов и консервантов

Сливки

Жирность, мин.

35% м/м

SM EN ISO 2450:2014

Посторонний жир

приложение № 19

Маркеры:

- стерины

Смотри

приложение № 7

- ванилин

Смотри

приложение № 5

Примечание 2

- этиловый эфир каротиновой кислоты

Смотри

приложение № 6

- триглицериды энантовой кислоты

Смотри

приложение № 4

Примечание 2

Творог, полученный из овечьего и/или козьего молока

Коровье молоко

< 1% м/м

приложение № 8

Кислый казеин

Вода, макс.

12,00% м/м

SM ISO 5550:2015

Жирность, макс.

1,75% м/м

SM ISO 5543:2015

Свободная кислотность, макс.

0,30 мл раствора 0,1 N NaOH/г

SM SR ISO 5547:2012

Количество термофильных бактерий, макс.

30000/г

SM EN ISO 4833-1:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

Примечание 3

Колиформные бактерии

Отсутствуют в 0,1 г

приложение № 9

Примечание 3

Терм., макс.

5000/г

SM EN ISO 4833-1:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

Примечания 3 и 4

Сычужная сыворотка

Вода, макс.

12,00% м/м

SM ISO 5550:2015

Жирность, макс.

1,00% м/м

SM ISO 5543:2015

Зола, мин.

7,50% м/м

SM SR ISO 5545:2012

Количество термофильных бактерий, макс.

30000/г

SM EN ISO 4833-1:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

Примечание 3

Колиформные бактерии

Отсутствуют в 0,1 г

приложение № 9

Примечание 3

Терм., макс.

5000/г

SM EN ISO 4833-1:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

Примечания 3 и 4

Казеинаты

Вода, макс.

6,00% м/м

SM ISO 5550:2015

Молочные белки, мин.

88,00% м/м

SM SR ISO 5549:2012

Жирность, макс.

1,50% м/м

SM ISO 5543:2015

Зола, макс.

6,50% м/м

SM ISO 5544:2015

SM SR ISO 5545:2012

Нерастворимая зола

SM ISO 5544:2015

Лактоза, макс.

1,00% м/м

SM ISO 5548:2015

Количество термофильных бактерий, макс.

30000/г

SM EN ISO 4833-1:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

Примечание 3

Колиформные бактерии

Отсутствуют в 0,1 g

приложение № 9

Примечание 3

Терм., макс.

5000/г

SM EN ISO 4833-1:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

Примечания 3 и 4

Комбинированные корма и обезжиренное сухое молоко (SMP) (используемое в кормах)

Вода (кислая сухая пахта), макс.

5% м/м

приложение № 18

Белки, мин.

31,4% м/м нежирного сухого вещества

SM EN ISO 8968-1:2014

SM EN ISO 8968-3:2014

Вода (SMP), макс.

5% м/м

SM EN ISO 5537:2014

Жир (SMP), макс.

11% м/м

SM SR EN ISO 1736:2012

Сычужная сыворотка (SMP)

Отсутствует

приложение № 12

Крахмал (SMP)

Отсутствует

приложение № 16

Вода (смеси), макс.

5% нежирного вещества

SM EN ISO 5537:2014

Жир (смеси)

SM SR ISO 6492:2012

Сычужная сыворотка (смеси)

Отсутствует

приложение № 12

Содержание SMP (в конечном продукте), мин

50% м/м

приложение № 15

Жир (в конечном продукте), мин.

2,5% м/м или 5% м/м

SM SR ISO 6492:2012

Крахмал (в конечном продукте), мин.

2% м/м

приложение № 16

Медь (в конечном продукте)

25 ppm

SM SR EN ISO 6869:2012

SPM (спрей)

Жир, макс.

1,0% м/м

SM SR EN ISO 1736:2012

Белки, мин.

34 м/м нежирного сухого вещества

SM EN ISO 8968-1:2014

Вода, макс.

3,5% m/m

SM EN ISO 5537:2014

Кислотность, макс.

19,5 мл, 0,1 N NaOH, 10 г нежирных твердых веществ

SM ISO 6091:2014

Лактаты, макс.

150 мг /100 г нежирных твердых веществ

SM EN ISO 8069:2014

Фосфатаза

Отрицательно

SM EN ISO 11816-1:2014

Показатель нерастворимости, макс.

0,5 мл при 24°C

SM STB ISO 8156:2015

Обожженные частицы

Диск A или B (15,0 мг)

Примечание 2

Количество термофильных бактерий

40000/г

SM EN ISO 4833-1:2014

SM EN ISO 4833-2:2014

Примечание 3

Колиформные бактерии

Отрицательно /0,1 г

приложение № 9

Примечание 3

Пахта

Отрицательно

приложение № 13

Сычужная сыворотка

Отрицательно

приложение № 11

Кислая сыворотка

Отрицательно

Примечание 2

Агенты противомикробного действия

приложение № 14

( 1 ) Не нанося ущерба требованиям настоящей Методологии.

Часть II

Эталонные методы, перечисленные в части II,

могут использоваться для анализа молока и молочных продуктов

Продукт

Код

товарной

позиции

Параметр

Предел

Эталонный метод

Примечание

Молоко и сливки из молока, неконцентрированные, без сахара или других подсластителей

0401

Жиры (≤ 6% м/м)

Предельные значения указаны в описании кода NC для соответствующего продукта

SM EN ISO 1211:2015

Жир (> 6% м/м)

SM EN ISO 2450:2014

Молоко и сливки из молока, концентрированные с добавлением сахара или других подсластителей

0402

Жир (в жидкой форме)

SM EN ISO 1737:2015

Жир (в твердой форме)

SM SR EN ISO 1736:2012

Белки

SM EN ISO 8968-1:2014

SM EN ISO 8968-3:2014

Сахароза (нормальное содержание)

SM ISO 2911:2015

Сахароза (заниженное содержание)

Примечание 2

Твердые (подслащенное сгущенное молоко)

SM ISO 6734:2015

Твердые (выпаренное молоко или сливки)

SM ISO 6731:2014

Вода (сухое молоко)

SM EN ISO 5537:2014

Вода (сухие сливки)

Приложение № 17

Кислое молоко, ряженка, заквашенные сливки, йогурт, кефир и другие виды молока и сливок, ферментированные или кислые, даже концентрированные или с добавлением сахара либо других подсластителей, или ароматизированные, с добавлением фруктов, грецких орехов или какао

0403

Жир

SM EN ISO 1211:2015

SM SR EN ISO 1736:2012

SM EN ISO 2450:2014

SM EN ISO 7208:2014

SM SR ISO 8262-3:2012

Белки

SM EN ISO 8968-1:2014

SM EN ISO 8968-3:2014

Сахароза (нормальное содержание)

SM ISO 2911:2015

Сахароза (пониженное содержание)

Примечание 2

Вода (сухая кислая пахта)

Приложение № 18

Вода (сухая сладкая пахта)

SM EN ISO 5537:2014

Твердые (другие продукты)

Примечание 2

Сыворотка, концентрированная или с добавлением сахара, или других подсластителей; продукты, полученные из природных соединений молока, с добавлением сахара или других подсластителей, не перечисленных или не указанных в другой части

0404

Жиры

SM SR EN ISO 1736:2012

SM EN ISO 2450:2014

SM EN ISO 7208:2014

Белки

SM EN ISO 8968-1:2014

SM EN ISO 8968-3:2014

Сахароза (нормальное содержание)

SM ISO 2911:2015

Сахароза (пониженное содержание)

Примечание 2

0404 90

Белки

SM EN ISO 8968-1:2014

Вода

Примечание 2

Твердые

SM ISO 6734:2015

(Концентрированные продукты)

SM ISO 6731:2014

Сливочное масло и другие жиры, полученные из молока; молочная паста для бутербродов

0405

Жиры (в случае, если ≤ 85% м/м)

SM SR EN ISO 17189:2012

Сливочное

масло

Вода

SM SR EN ISO 3727-1:2012

Нежирные твердые вещества

SM SR EN ISO 3727-2:2012

NaCl

SM ISO 15648:2015

Жиры (в случае, если > 99% м/м)

SM SR EN ISO 17189:2012

Топленое сливочное масло

Вода (в случае, если < 99% м/м)

SM EN ISO 5536:2014

Творог и сыр каш

0406

Жиры

SM EN ISO 1735:2014

Твердые

SM SR EN ISO 5534:2014

Твердые (урда)

SM ISO 2920:2015

NaCl

SM SR EN ISO 5943:2012

Лактоза

SM ISO 5765-1:2015

SM ISO 5765-2:2015

Препараты, аналогичные тем, что используются для корма животных

2309

Лактоза

Приложение № 20

Примечания по списку эталонных методов:

Примечание 1: Отделение молочного жира согласно SM ISO 1740:2015 (в темном месте).

Примечание 2: Не было установлено ни одного эталонного метода.

Примечание 3: Проба приготовлена согласно SM SR EN ISO 6887-5:2014.

Примечание 4: Засев в течение 48 часов при температуре 55°C, с предупреждением высыхания среды культуры.

Примечание 5: % м/м нежирные твердые вещества = % м/м твердые – % м/м жир

Сокращения:

Мин. – минимум

Макс. – максимум

SNF – нежирные твердые вещества

PV – оценка пероксидов

A – внешний вид

F – запах

C – консистенция

ТВС – общее количество бактерий

Therm – количество термофильных бактерий

SMP – комбинированные корма и обезжиренное сухое молоко

SCM – подслащенное сгущенное молоко

EMC – выпаренное молоко или сливки

ISO – Международная организация по стандартизации

Приложение № 2

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Оценка соответствия партии

установленному законом пределу

1. В случае наличия регулирующей нормы, предусматривающей подробные процедуры отбора проб, данные процедуры должны соблюдаться. Во всех остальных случаях используется проба, составленная не менее чем из 3 единиц пробы, отбираемых случайно из партии, подвергнутой проверке. Также может быть приготовлена смешанная проба. Полученный результат сравнивается с установленными законом предельными значениями путем расчета доверительного интервала в 95% на основании двойного стандартного отклонения, где релевантное стандартное отклонение зависит:

1) от утверждения метода в рамках международного сотрудничества со значениями σ r и σ R ; или

2) в случае внутреннего утверждения от расчета внутренней воспроизводимости. Данный доверительный интервал сравнивается затем с погрешностью измерения результата.

2. В случае если метод был утвержден в рамках международного сотрудничества, стандартное отклонение повторяемости σ r и стандартное отклонение воспроизводимости σ R считаются установленными, и лаборатория может подтвердить соответствие с рабочими характеристиками утвержденного метода.

Рассчитывается среднее арифметическое значение x количества n повторяющихся измерений.

Рассчитывается расширенная погрешность (k = 2) от x на основании

В случае если конечный результат x измерения рассчитывается по формуле типа x = y 1 +y 2 , x = y 1 –y 2 , x = y 1 ·y 2 или x = y 1 /y 2 , соблюдаются обычные процедуры комбинирования стандартных отклонений, установленные в подобных случаях.

Считается, что партия не соблюдает установленного законом верхнего предела UL, если:

x – U > UL;

в противном случае, считается, что партия соблюдает UL.

Считается, что партия не соблюдает установленного законом нижнего предела LL, если

x + U < LL;

в противном случае, считается, что партия соблюдает LL.

3. В случаях, когда используются методы, не указанные в настоящей методологии, и не были проведены точные измерения, проводится внутреннее утверждение. Стандартное отклонение внутренней повторяемости s ir и стандартное отклонение внутренней воспроизводимости s iR вместо σ r и σ R , соответственно, используются в формулах расчета расширенной погрешности U.

Правила принятия решения те же, что указаны в пункте 1 настоящего приложения. Вместе с тем в случае если считается, что партия не соблюдает установленного законом предельного значения, измерения повторяются с использованием метода, указанного в настоящей методологии, после чего принимается решение в соответствии с пунктом 1 настоящего приложения.

Приложение № 3

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Сенсорная оценка сливочного масла

1. Цель процедуры сенсорной оценки сливочного масла заключается в предоставлении единого метода, применяемого на территории республики.

2. В целях применения настоящего приложения используемые термины определяются следующим образом:

1) сенсорная оценка – изучение характеристик продукта при помощи органов чувств;

2) группа испытателей – группа испытателей, отобранных лидером аккредитованной лаборатории, которые в период оценки работают самостоятельно, не общаясь между собой и не оказывая друг на друга никакого влияния;

3) испытатель – лицо, отобранное благодаря его способности проводить сенсорный анализ. Данный тип испытателя может иметь ограниченный опыт;

4) испытатель-эксперт – лицо с высокой сенсорной чувствительностью и с опытом деятельности в области сенсорной метрологии, которое способно проводить последовательные и надежные испытания различных продуктов. Данный тип испытателя обладает долгосрочной хорошей сенсорной памятью;

5) балльная оценка – сенсорная оценка, проводимая группой испытателей с использованием числовой шкалы. Необходимо использовать номенклатуру дефектов;

6) классификация – качественная классификация, осуществляемая на основании балльной оценки;

7) проверочные документы – документы, используемые для регистрации индивидуальных баллов по каждой характеристике, а также конечной классификации продукта (данный документ может использоваться и для регистрации химического состава).

3. Условиями в помещении для тестирования являются:

1) В помещении для тестирования испытатели не должны подвергаться влиянию внешних факторов.

2) В помещении для тестирования не должны присутствовать посторонние запахи, и уборка данного помещения должна быть несложной. Стены должны быть выкрашены в светлый, не отражающий цвет.

3) Помещение для тестирования и его освещение не должны влиять на свойства продукта, который предстоит оценивать.

4) Помещение должно быть оснащено адекватной системой контроля температуры, которая позволила бы поддерживать постоянную температуру сливочного масла. Температура сливочного масла в момент классификации должна составлять 12°C (±2°C).

4. Испытатель должен быть знаком с продуктами из сливочного масла и должен обладать необходимой компетентностью для проведения градации сенсорной чувствительности. Компетентность испытателя проверяется регулярно компетентным органом (не реже одного раза в год).

Общие требования и отборочные тесты, которые должны быть применены до официального использования нового испытателя, указаны в SM ISO 22935-1.

Профессиональная подготовка должна быть непрерывной, а лидер группы испытателей должен организовывать общее собрание, по крайней мере, один раз в квартал. Профессиональная подготовка группы испытателей осуществляется согласно SM EN ISO 8586.

Начальная подготовка должна покрывать следующие области:

1) общая теория и практическая значимость сенсорной оценки;

2) методы шкалы и описание сенсорных восприятий;

3) обнаружение и признание сенсорных характеристик и специфических сенсорных терминов;

4) базовая подготовка в области производства сливочного масла;

5) утвержденные характеристики и доказательства, которые помогли бы испытателю определить специфические ароматы и интенсивность аромата продукта.

5. Число испытателей в группе должно быть непарным, минимум три человека. Большинство членов группы должны быть сотрудниками аккредитованной лаборатории, но не должны работать в области молочной перерабатывающей промышленности.

До начала оценки следует учесть несколько факторов для получения оптимальных качественных показателей субъектами:

1) субъекты не должны страдать заболеваниями, которые могли бы отрицательно сказаться на их качественных показателях. В подобном случае соответствующий испытатель должен быть заменен в группе на другого испытателя;

2) субъекты должны являться вовремя для проведения оценки, а также располагать достаточным временем для проведения оценки;

3) субъекты не должны пользоваться веществами с сильным запахом, как, например, духи, лосьон после бритья, дезодорант и т.д., а также им следует избегать употребления пищевых продуктов с сильными ароматами (например, очень пряные) и т.д.;

4) субъекты не должны курить, пить или есть что-то, кроме воды, за полчаса до начала оценки.

6. Все испытатели должны регулярно участвовать в группах сенсорной оценки, чтобы сохранить свои компетенции. Их частота зависит от объема и производительности сливочного масла, и в той мере, в которой это возможно, следует организовывать не менее одной испытательной группы в месяц.

7. Очень важно, чтобы идентичность проб была неизвестна во время проведения оценки, с тем чтобы избежать любой возможности благоприятствования. Пробы должны быть закодированы.

Данный этап проводится до начала непосредственной оценки. Определяется температура сливочного масла во время его транспортировки в помещение для тестирования (6°C ± 2°C).

Когда сенсорная оценка проводится на холодильном складе, проба отбирается при помощи устройства для отбора проб сливочного масла. В случае проведения сенсорной оценки не на холодильном складе, отбирается проба массой не менее 500 г. Во время оценки температура сливочного масла должна составлять 12°C (±2°C). Следует избегать серьезных отклонений.

8. Сенсорная оценка должна осуществляться по следующим трем характеристикам: внешний вид, консистенция и аромат.

Внешний вид включает в себя следующие характеристики: цвет, видимая чистота, отсутствие физических загрязнений, отсутствие грибка, однородность водной дисперсии.

Консистенция включает в себя следующие характеристики: структура, текстура и твердость. Намазываемость на хлеб может быть проверена путем использования физических средств, если хозяйственный субъект хочет этого в целях удовлетворения требований клиента.

Структура представляет условие, касающееся связности продукта во время его употребления в пищу. Как правило, она ассоциируется с твердостью и намазываемостью на хлеб и должна быть однородной во всем продукте. Она тесно связана с текстурой и представляет собой способность продукта сохранять первоначальное положение. Она определяется сопротивлением масла разрезанию и может быть измерена механически, а также при помощи рецепторов ротовой полости и тактильных рецепторов.

Аромат представляет характеристику, воспринимаемую в ротовой полости, в основном при помощи вкусовых сосочков языка.

Запах – это характеристика, которая воспринимается при помощи носа и обонятельного органа чувств.

Существенное отклонение от рекомендуемой температуры препятствует надежной оценке консистенции и аромата. Температура крайне важна.

Классификацию сливочного масла следует отложить, если температура находится вне рекомендованного диапазона.

Каждая характеристика должна становиться предметом отдельной сенсорной оценки. Балльная оценка осуществляется в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

Баллы за сливочное масло

Внешний вид

Консистенция

Аромат + запах

Баллы

№ ( 1 )

Примечания

Баллы

(класс

качества)

№ ( 1 )

Примечания

Баллы

(класс

качества)

№ ( 1 )

Примечания

Очень хорошо

идеальный тип

наивысшее качество

(сухое равномерное вещество)

Очень хорошо

идеальный тип

наивысшее качество

(хорошая намазываемость на хлеб)

Очень хорошо

идеальный тип

наивысшее качество

(самый нежный аромат, абсолютно чистый)

Хорошо ( 2 )

отсутствуют очевидные недостатки

Хорошо ( 2 )

твердое

мягкое

Хорошо ( 2 )

отсутствуют очевидные недостатки

Приемлемо

(небольшие недостатки)

Приемлемо

(небольшие недостатки)

Приемлемо

(небольшие недостатки)

несвязанное (неплотное), влажное

деэмульгированное, рассыпчатое, ломкое,

нечистый,

неоднородное, двухцветное

пастообразное, с консистенцией теста, жирное,

посторонние ароматы,

с полосами,

липкое,

кислый,

пестрое, мраморированное,

твердое,

аромат печеного, аромат горелого,

гранулированное,

мягкое

аромат корма,

с отделением масел,

тяжелый, горькое,

чрезмерно яркий цвет,

пересоленное

слабая, светлая текстура

Слабо

(очевидные недостатки)

Слабо

(очевидные недостатки)

Слабо

(очевидные недостатки)

несвязанное (неплотное), влажное,

деэмульгированное, рассыпчатое, ломкое,

нечистый

с полосами,

пастообразное, с консистенцией теста, жирное,

посторонние ароматы,

пестрое, мраморированное,

липкое,

старый,

гранулированное,

твердое,

кислый,

с отделением масел,

мягкое

скисший запах, металлический запах,

чрезмерно яркий цвет,

запах корма,

гранулированное,

тяжелый, горькое,

посторонние вещества,

пересоленное,

заплесневелое,

заплесневелое, гнилое,

нерастворившаяся соль

запах химических веществ

Очень слабо

(существенные недостатки)

Очень слабо

(существенные недостатки)

Очень слабо

(существенные недостатки)

несвязанное (неплотное), влажное,

деэмульгированное, рассыпчатое, ломкое,

посторонние ароматы,

с полосами,

пастообразное, с консистенцией теста, жирное,

творожный, запах молочного творога,

пестрое, мраморированное,

липкое,

кислый,

гранулированное,

твердое,

пенистый,

с отделением масел,

мягкое

запах плесени,

чрезмерно яркий цвет,

горклый,

гранулированное,

с привкусом рыбы,

посторонние вещества,

с видом/запахом жира,

заплесневелое,

кислый запах, металлический запах,

нерастворившаяся соль

тяжелый, горькое,

пересоленное,

заплесневелое, гнилое,

с видом глазури,

запах химических веществ

(1) Пункт 10.

(2) Недостатки, перечисленные в категории “хорошее”, представляют собой очень незначительные отклонения от идеального типа.

Для получения однородных результатов иногда желательно, чтобы до начала оценки испытатели оценили совместно одну или несколько эталонных проб с точки зрения внешнего вида, консистенции и аромата.

Считается приемлемым следующее количество баллов:

Максимум

Необходимо

Внешний вид

Консистенция

Аромат / запах

В случае если не было набрано необходимое количество баллов, следует предоставить описание недостатка.

Количество баллов, присужденное каждым испытателем за каждую характеристику, должно быть зарегистрировано в проверочном документе.

Продукт принимается или отклоняется решением большинства испытателей.

Зачастую не следует регистрировать случаи, в которых разница между баллами, присужденными отдельными испытателями за каждую характеристику, превышает 1 балл (не чаще одного раза из 20 проб). В противном случае компетенция группы испытателей должна быть проверена руководителем группы испытателей.

9. На руководителя группы испытателей, который должен быть сотрудником аккредитованной лаборатории и который может быть членом группы испытателей, возлагается ответственность за всю процедуру испытания. Он регистрирует в проверочном документе баллы, присужденные отдельными испытателями по каждой характеристике, и подтверждает, был ли продукт принят или отклонен.

10. Недостатки сливочного масла представлены в таблице 2.

Таблица 2

Недостатки сливочного масла

I. Внешний вид:

несвязанное (неплотное), влажное

неоднородное, двухцветное

с полосами

пестрое, мраморированное

гранулированное

отделение масел

чрезмерно яркий цвет

светлая слабая текстура

гранулированное

10.

посторонние вещества

11.

заплесневелое

12.

нерастворившаяся соль

II. Консистенция:

13.

деэмульгированное, рассыпчатое, ломкое

14.

пастообразное, консистенция теста, жирное

15.

липкое

16.

твердое

17.

мягкое

III. Запах и аромат:

18.

запах отсутствует

19.

нечистый ( 1 )

20.

посторонние ароматы

21.

старый

22.

творожный, запах молочного творога

23.

кислый

24.

пенистый

25.

(a) аромат печеного

(b) аромат горелого

26.

запах плесени

27.

горклый

28.

маслянистый, с привкусом рыбы

29.

с видом/запахом жира

30.

(a) кислый запах

(b) металлический запах

31.

аромат корма

32.

твердый, горький

33.

пересоленное

34.

заплесневелое, гнилое

35.

с видом эмали

36.

запах химических веществ

( 1 ) Это обозначение должно использоваться как можно реже и только тогда, когда недостаток не может быть описан точнее.

Приложение № 4

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Определение содержания триглицеридов энантовой кислоты

в сливочном масле, топленом масле и сливках путем

хроматографического анализа в газовой фазе триглицеридов

1. Настоящий метод устанавливает метод для определения содержания триглицеридов энантовой кислоты в сливочном масле, топленом масле и сливках.

2. Содержание энантовой кислоты представляет содержание триглицеридов энантовой кислоты, определяемое с использованием процедуры, указанной в настоящем приложении.

Содержание энантовой кислоты выражается в кг/тонн продукта для топленого масла и сливочного масла, а для сливок – в кг/тонн молочного жира.

3. Молочный жир экстрагируется из различных продуктов в соответствии с SM ISO 14156. Количественное определение содержания триглицеридов энантовой кислоты в экстрагированном жире осуществляется с использованием хроматографического анализа в газовой фазе в капиллярной колонке (GC). Полученный результат пробы оценивается с применением стандарта, относящегося к триглицеридам капроновой кислоты.

4. Используются признанные реактивы аналитического качества:

1) н-гексан;

2) триглицериды эталонной капроновой кислоты, чистота не менее 99%;

3) триглицериды эталонной энантовой кислоты, чистота не менее 99%;

4) сульфат натрия, безводный (Na 2 SO 4 ).

5. Стандартное лабораторное оборудование:

1) аналитические весы с точностью до 1 мг;

2) мерные колбы емкостью 10 мл и 20 мл;

3) центробежные трубки емкостью 30 мл;

4) ротационный испаритель;

5) печь, позволяющая поддерживать температуру 50°C ± 5°C;

6) фильтровальная бумага средней пористости диаметром примерно 15 см;

7) аппаратура для газовой хроматографии:

a) газовый хроматограф, оборудованный форсункой с или без разделения или «колонкой» и детектором ионизации пламени;

b) хроматографическая колонка для газовой хроматографии со стационарной фазой, которая успешно использовалась в операции по отделению триглицеридов (100% диметилполисилоксан или 5% фенил-95% метилполисилоксан). Выбирается стационарная фаза, регулируется длина колонки (между 4 м и 15 м), внутренний диаметр (между 0,22 мм и 0,50 мм) и толщина слоя (0,12 μm или больше) с учетом опыта лаборатории и используемой системы инжекции. В любом случае выбранная колонка производит одновременно полное разделение между вершиной растворителя и триглицеридами капроновой кислоты, а также разрешение основной линии между пиками триглицеридов капроновой кислоты и триглицеридами энантовой кислоты;

8) шприц для впрыскивания емкостью 5 μl.

6. Проба, принимаемая в лаборатории, должна быть репрезентативной, она не должна быть повреждена или изменена во время транспортировки или в период хранения.

Рекомендуемый метод по отбору проб представлен в SM SR EN ISO 707:2012 Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб.

7. Приготовление пробы для анализа и анализируемого количества осуществляется в соответствии с SM ISO 14156:

1) топленое масло, сливочное масло;

a) растапливается от 50 г до 100 г пробы для анализа в печи.

b) добавляется от 0,5 г и 1 г безводного сульфата натрия в сложенную фильтровальную бумагу;

c) жир фильтруется через фильтровальную бумагу, содержащую безводный сульфат натрия. Фильтрат собирается в лабораторный стакан, который хранится в печи. Во время отстаивания большое внимание уделяется растопленному маслу в фильтровальной бумаге во избежание переноса сыворотки.

2) Сливки:

a) анализируемая проба доводится до температуры 20°C ± 2°C;

b) проба перемешивается или хорошо встряхивается;

c) адекватное количество анализируемой пробы разводится массовой долей 4% жира до получения 100 мл анализируемого количества;

d) выполняются те же действия, как и в случае сырого и гомогенизированного молока (SM ISO 14156) для экстракции жира из сливок;

e) взвешивается с точностью до 1 мг 1 г экстрагированного жира в мерном стакане емкостью 10 мл. Добавляется 1 мл раствора, указанного в подпункте 1) пункта 8. Добавляется н-гексан до получения общего количества в 10 мл, и все перемешивается до получения однородной смеси;

f) добавляется 1 мл раствора, указанного в литере b) подпункта 1 настоящего пункта, в мерную колбу емкостью 10 мл и растворяется н-гексаном до получения количества в 10 мл.

8. Приготовление калибровочных эталонов осуществляется следующим образом:

1) 100 мг триглицеридов энантовой кислоты разводятся в 10 мл гексана-н;

2) 100 мг триглицеридов капроновой кислоты разводятся в 10 мл гексана-н;

3) вводится 1 мл раствора, указанного в подпункте 2) настоящего пункта, в мерную колбу емкостью 10 мл. Добавляется н-гексан до получения количества в 10 мл;

4) вводится 1 мл раствора, указанного в подпункте 1) настоящего пункта, и 1 мл раствора, указанного в подпункте 2) настоящего пункта, в мерную колбу емкостью 10 мл. Добавляется н-гексан до получения количества в 10 мл;

5) вводится 1 мл раствора, указанного в подпункте 4) настоящего пункта, в мерную колбу емкостью 10 мл. Добавляется н-гексан до получения количества в 10 мл.

9. Хроматографическое определение осуществляется следующим образом:

1) впрыскивается два раза по 1 мкл эталонного раствора, указанного в подпункте 5) пункта 8;

2) впрыскивается по 1 мкл из каждого пробного раствора.

В случае использования системы впрыскивания в колонке как эталонный раствор, так и раствор пробы следует разбавить сильнее.

3) процедура, указанная в подпункте 1) настоящего пункта, повторяется для каждой третьей пробы для того, чтобы в начале и в конце серии проб можно было выполнить впрыскивание эталонного раствора. Результаты опираются на среднее арифметическое калибровочных коэффициентов эталонных хроматограмм.

10. По каждой хроматограмме интегрируются площади пиков триглицеридов энантовой и капроновой кислоты.

Данные инструкции повторяются для всех серий проб, в начале и в конце которых впрыскивается эталонный раствор. Непосредственно перед каждой серией проб впрыскивается два раза эталонный раствор STD 1 , и непосредственно после каждой серии проб впрыскивается два раза эталонный раствор STD 2 .

1) Калибровка:

a) для второй пробы STD 1 , Rf 1 (a) и Rf 1 (b) вычисляется коэффициент реактивности, где:

Rf 1 (a) или (b) = (площадь пика триглицеридов капроновой кислоты / площадь пика триглицеридов энантовой кислоты) × 100.

Рассчитывается средний коэффициент реактивности Rf 1 , где:

Rf 1 = [Rf 1 (a) + Rf 1 (b)]/2;

b) Аналогично рассчитывается средний коэффициент реактивности STD 2 , Rf 2 .

c) Рассчитывается средний коэффициент реактивности Rf:

Rf = (Rf 1 + Rf 2 )/2.

2) Анализируемые пробы.

Для каждой полученной хроматограммы пробы между STD 1 и STD 2 , рассчитывается содержание энантовой кислоты C (кг/тонн):

C = (площадь пика триглицеридов энантовой кислоты × Rf × 100)/(площадь пика триглицеридов капроновой кислоты × Wt × 1000), где:

Wt = масса отобранного жира (g);

100 = разводимый объем для пробы;

1000 = переводный коэффициент (для μg/г на кг/т).

Для проб сливочного масла учитывается содержание жира в сливочном масле и рассчитывается чистое значение степени концентрации C сливочное масло (кг/т сливочного масла):

C сливочное масло = Cжир × F,

где F – содержание жира в сливочном масле.

11. Предельные значения повторяемости и воспроизводимости выражаются для доверительного интервала в 95%, при этом возможно, что они не смогут быть применимы для других интервалов концентрации и матриц, чем показанные.

1) Повторяемость

Абсолютные разницы между двумя отдельными результатами теста, полученными одним и тем же методом, с использованием идентичного материала для проведения теста, в той же лаборатории и тем же аналитиком, с использованием одного и того же оборудования в течение короткого периода времени, составляют не более 0,35 кг/т в не более чем 5% всех случаев.

2) Воспроизводимость

Абсолютные разницы между двумя отдельными результатами теста, полученными одним и тем же методом, с использованием идентичного материала для проведения теста, в разных лабораториях разными аналитиками, с использованием различного оборудования, составляют не более 0,66 кг/т в не более чем 5% всех случаев.

12. Пределы допуска: нижний предел (в случае недостаточного количества):

1) для проверки правильной маркировки продукта необходимо отобрать три пробы исследуемого продукта;

2) сливочное масло и масляный жир:

a) доля примесей составляет 11 кг триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты в 95% на тонну сливочного масла, т.е. 10,45 кг/т;

b) результаты трех проб, полученных вследствие анализа продукта, используются для проверки доли и однородности примеси средства маркировки, а наименьший из результатов оценивается исходя из следующих предельных величин:

- 9,51 кг/т (95% минимальной доли примеси триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты 95%, отдельное определение);

- 6,89 кг/т (70% минимальной доли примеси триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты 95%, отдельное определение);

- используется концентрация средства маркировки пробы с наименьшим результатом, полученным путем интерполяции между 9,51 кг/т и 6,89 кг/т.

3) Сливки:

a) примесь составляет 10 кг триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты 95% на тонну молочного жира соответственно 9,5 кг/т промаркированного молочного жира;

b) результаты трех проб, полученные вследствие анализа продукта, используются для проверки доли и однородности примеси средства маркировки, а наименьший из результатов оценивается исходя из следующих предельных величин:

- 8,60 кг/т (95% минимальной доли примеси триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты 95%, отдельное определение);

- 6,23 кг/т (70% минимальной доли примеси триглицеридов энантовой кислоты со степенью чистоты 95%, отдельное определение);

- используется концентрация средства маркировки пробы с наименьшим результатом, полученным путем интерполяции между 8,60 кг/т и 6,23 кг/т.

13. Пределы допуска: верхний предел (в случае превышения количества на более чем 20%):

1) для проверки правильной маркировки продукта необходимо отобрать три пробы исследуемого продукта.

2) Сливочное масло и масляный жир.

Результаты трех проб, полученные вследствие анализа продукта, используются для проверки доли и однородности примеси средства маркировки, а средний из результатов оценивается с учетом следующего верхнего предела: 12,96 кг/т.

3) Сливки

Приложение № 5

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Определение содержания ванилина в масляном жире, сливочном масле

или сливках путем высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. Данный метод описывает процедуру для количественного определения ванилина в масляном жире, сливочном масле и сливках.

2. Экстракция заданного количества пробы при помощи смеси изопропанола/ этанола/ ацетонитрила (1:1:2). Осаждение большей части жира путем охлаждения до температуры между 15°C и 20°C, после которого следует центрифугирование и переливание.

Переливный раствор разбавляют водой и фильтруют. Фильтрат готов к определению содержания ванилина путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

3. Лабораторное оборудование:

1) холодильник для охлаждения в диапазоне температуры от 15°C до 20°C;

2) одноразовые шприцы емкостью 2 мл;

3) мембранный микрофильтр с величиной пор 0,45 мкм, устойчивый к раствору с 5% экстракционным раствором;

4) система жидкостной хроматографии, состоящая из насоса (с пропускной способностью 1,0 мл/мин), инжектора (автоматическое или ручное впрыскивание 20 μl), УФ-детектора (306 нм, 0,01 Å полный диапазон), регистратора или интегратора и колонного термостата с рабочей температурой 25°C;

5) аналитическая колонка (примерно 250 мм × 4,6 мм внутренний диаметр), заполненная LiChrospher RP 18 (Merck, 5 мкм) или аналогичная колонка;

6) колонка контроля (примерно 20 мм × 3 мм внутренний диаметр), заполненная LiChrospher RP 18 (5-10 мкм), или аналогичная колонка;

7) центрифуга, функционирующая при 2000 оборотов/мин.

4. Все реактивы используются для анализа в чистом виде.

1) Изопропанол

2) Этанол 96% (v/v)

3) Ацетонитрил

4) Экстракционный раствор

Смешивается изопропанол, этанол и ацетонитрил в пропорции 1:1:2 (v/v).

5) Ванилин (4-гидрокси-3-метоксибензальдегид) ≥ 98%

a) Основной раствор ванилина (= 500 μg/мл)

Примерно 50 мг (CM мг) ванилина взвешиваются с точностью до 0,1 мг в мерной колбе емкостью 100 мл, добавляются 25 мл экстракционного раствора, после чего колба дополняется водой.

b) Эталонный раствор ванилина (= 10 μg/мл)

Отмериваются пипеткой 5 мл основного раствора ванилина в мерную колбу емкостью 250 мл, после чего колба дополняется водой.

c) Метанол, подходящий по качеству для ВЭЖХ

d) Уксусная кислота, ледяная

e) Вода, подходящая по качеству для ВЭЖХ

f) Подвижная фаза ВЭЖХ

Смешиваются 300 мл метанола с примерно 500 мл воды и 20 мл уксусной кислоты в мерной колбе емкостью 1000 мл, после чего колба дополняется водой. Смесь фильтруется через фильтр с размером пор 0,45 мкм.

5. Процедура для количественного определения ванилина в масляном жире, сливочном масле и сливках происходит следующим образом:

1) Приготовление пробы для анализа

a) Сливочное масло

Проба нагревается до тех пор, пока не начнет растапливаться. Следует избегать перегрева свыше 30°C. Возможно, что сливочное масло не разделится на две фазы. Когда сливочное масло становится достаточно тягучим, оно равномерно перемешивается путем встряхивания. Сливочное масло перемешивается в течение 15 с до отбора пробы. Взвешиваются с точностью до 1 мг примерно 5 г (SM г) сливочного масла в мерной колбе емкостью 100 мл.

b) Масляный жир

Сразу же после отбора пробы емкость с масляным жиром помещается в печь, нагретую до температуры 40-50°C, где она и оставляется до полного растапливания масляного жира. Проба смешивается путем встряхивания или перемешивания, при этом следует избегать образования пузырьков в результате слишком интенсивного помешивания. Взвешивается с точностью до 1 мг примерно 4 г (SM г) масляного жира в мерной колбе емкостью 100 мл.

c) Сливки

Проба нагревается на водяной бане или в инкубаторе до температуры 35-40°C. Затем жир перемешивается до получения однородной массы путем встряхивания или, если необходимо, путем перемешивания. Проба быстро охлаждается до температуры 20 ± 2°C. Проба должна иметь однородный внешний вид, в противном случае процедуру следует повторить. Взвешиваются с точностью до 1 мг примерно 10 г (SM г) сливок в мерной колбе емкостью 100 мл.

2) Приготовление испытуемого раствора

К пробе (литера a), b) или с) подпункта 1) пункта 5) добавляются примерно 75 мл экстрагированного раствора. Смесь перемешивается и сильно встряхивается примерно в течение 15 минут, после чего емкость дополняется экстрагированным раствором. Примерно 10 мл данного экстракта переносятся в пробирку с крышкой. Пробирка помещается в холодильник примерно на 30 минут. Холодный экстракт центрифугируется в течение 5 минут при примерно 2000 об/мин и сразу же сцеживается. Сцеженный раствор охлаждается при комнатной температуре. Пипеткой отмеряются 5 мл сцеженного раствора в мерную колбу емкостью 100 мл, после чего колба дополняется водой. Аликвотная часть фильтруется при помощи шприца через мембранный микрофильтр. Фильтрат готов для определения ВЭЖХ.

3) Калибровка

Пипеткой отмеряются 5 мл эталонного раствора ванилина в мерную колбу емкостью 100 мл. Добавляются 5 мл экстракционного раствора, и колба дополняется водой до отметки. Данный раствор содержит 0,5 мкг/мл ванилина.

4) Определение путем ВЭЖХ

Система для проведения хроматографии стабилизируется примерно в течение 30 минут. Впрыскивается эталонный раствор (подпункт 3) настоящего пункта). Процедура повторяется до тех пор, пока разница между площадями пиков или высотами пиков между двумя последовательными впрыскиваниями не будет составлять менее 2%. В вышеописанных условиях время удержания составляет 9 минут. Калибровочный раствор (подпункт 3 настоящего пункта) анализируется два раза путем впрыскивания 20 мкл. Впрыскиваются 20 мкл испытуемого раствора (подпункт 3) настоящего пункта). Определяются площади пиков или высоты пиков для ванилина. После 10 впрыскиваний анализируемых проб (подпункт 2 настоящего пункта) вновь впрыскивается два раза калибровочный раствор (подпункт 3 настоящего пункта).

6. Для каждой партии испытуемого раствора определяется средняя площадь пиков (или высота) (AC) пиков ванилина в комбинации с двойными впрыскиваниями калибровочного раствора, каждый раз в начале и в конце каждой серии пробы (всего четыре площади или четыре высоты).

Рассчитывается калибровочный коэффициент (R):

R = AC/CM,

где CM – масса ванилина в мг.

Содержание (мг/кг) ванилина (C) в пробе рассчитывается по формуле:

C=[(AS × 20 × 0,96)/(SM × R)],

где:

AS – площадь пика или высота пика ванилина в анализируемой пробе;

SM – масса анализируемой пробы, выраженная в г (литера a), b) или c) подпункта 1 пункта 5).

При анализе содержания ванилина в сливках концентрация средства маркировки выражается в мг средства маркировки/кг молочного жира. Для этого С умножается на 100/f, где:

f – это содержание жира в сливках в процентах (м/м);

20 – коэффициент учета разбавления эталонного и анализируемого раствора;

0,96 – корректировочный коэффициент для содержания жира при первом разбавлении анализируемой пробы.

Вместо площадей пиков могут использоваться и высоты пиков (подпункт 3) пункта 8 настоящего приложения).

7. Точность метода исходит из величины для повторяемости и воспроизводимости:

1) Повторяемость (r)

Разница между результатами двух определений, выполненных в максимально короткий интервал времени одним и тем же аналитиком с использованием одних и тех же приборов, на том же анализируемом материале, не должна превышать 16 мг/кг.

2) Воспроизводимость

Разница между результатами двух определений, выполненных аналитиками в разных лабораториях при использовании различной аппаратуры на том же анализируемом материале, не должна превышать 27 мг/кг.

8. Из промаркированного продукта отбираются три пробы для проверки однородности.

1) Средство маркировки получается из ванили или из синтетического ванилина:

a) доля примеси для 4-гидрокси-3-метоксибензальдегида составляет 250 г на тонну масляного жира или сливочного масла. Для промаркированных сливок доля примеси составляет 250 г на тонну молочного жира;

b) результаты трех проб, полученные в рамках анализа продукта, используются для определения однородности примеси средства маркировки, при этом наименьший результат оценивается с учетом следующих предельных значений:

- 220,8 мг/кг (95% минимальной доли примеси);

- 158,3 мг/кг (70% минимальной доли примеси).

Используется концентрация средства маркировки пробы с наименьшим результатом, получаемым путем интерполяции между 220,8 мг/кг и 158,3 мг/кг.

2) Средство маркировки получается исключительно из стручков ванили или из их цельных экстрактов:

a) доля примеси для 4-гидрокси-3-метоксибензальдегида составляет 100 г на тонну масляного жира или сливочного масла. Для промаркированных сливок доля примеси составляет 100 г на тонну молочного жира;

b) результаты трех проб, полученные в рамках анализа продукта, используются для определения доли и однородности примеси средства маркировки, при этом наименьший результат оценивается с учетом следующих предельных значений:

- 78,3 мг/кг (95% минимальной доли примеси);

- 53,3 мг/кг (70% минимальной доли примеси).

Используется концентрация средства маркировки пробы с наименьшим результатом, получаемым путем интерполяции между 78,3 мг/кг и 53,3 мг/кг.

9. Регенерация примесей ванилина в случае 250 мг/кг сливочного масла варьирует от 97,0 до 103,8%. В среднем определяется содержание 99,9% со стандартным отклонением 2,7%.

Эталонный раствор содержит 5% экстрагированного раствора для компенсации расширения пика, вызванного присутствием 5% экстрагированного раствора в пробе. Таким образом, становится возможной классификация с учетом высоты пика.

Анализ опирается на линейную калибровочную линию с отрезком нулевой оси.

Линейность следует проверять во время первого анализа и затем через регулярные интервалы, а также после изменения или ремонта аппаратов ВЭЖХ, при этом используется подходящее смешивание эталонного раствора. Ванилин может расщепляться до ванилиновой кислоты, диванилина или прочих соединений под воздействием ферментов, содержащихся в непастеризованных сливках или в продуктах из непастеризованных сливок.

Приложение № 6

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Определение путем спектрометрии

содержания этилового эфира бета-апо-8'-каротиновой кислоты

в масляном жире и в сливочном масле

1. Настоящий метод описывает процедуру количественного определения содержания этилового эфира бета-апо-8'-каротиновой кислоты (этиловый эфир каротиновой кислоты) в масляном жире и в сливочном масле. Этиловый эфир каротиновой кислоты представляет собой сумму всех веществ, присутствующих в экстракте, полученном из проб, отобранных с соблюдением условий, описанных в данном методе, и поглощающих свет при 440 нм.

2. Масляный жир растворяется в нефтяном эфире, после чего измеряется поглощение при 440 нм. Содержание этилового эфира каротиновой кислоты определяется относительно внешней эталонной пробы.

3. Лабораторное оборудование:

1) мерные пипетки емкостью 0,25, 0,50, 0,75 и 1,0 мл;

2) спектрофотометр – подходящий для использования при 440 нм (и при 447-449 нм) с длиной оптического пути кюветы 1 см;

3) мерная колба емкостью 20 мл и 100 мл;

4) аналитические весы с чувствительностью 0,1 мг, с точностью измерения 1 мг, с делением шкалы 0,1 мг;

5) печь, 45°C ± 1°C;

6) беззольные фильтры для быстрой фильтрации.

4. Все используемые реактивы должны быть признанного качества.

1) Суспензия апо-каротиновой кислоты (примерно 20%):

a) содержание суспензии определятся следующим образом:

Суспензия нагревается до температуры 45°C и 50°C и перемешивается до получения однородной массы в закрытой оригинальной емкости. Взвешиваются примерно 400 мг в мерной колбе (емкостью 100 мл), которые растворяются затем в 20 мл хлороформа, после чего колба дополняется циклогексаном (раствор А). 5 мл раствора А дополняются циклогексаном до получения объема 100 мл. Измеряется поглощение при 447-449 нм (максимальная величина по сравнению с циклогексаном с использованием 1-см-кюветы измеряется в качестве холостой пробы).

Содержание эфира апо-каротиновой кислоты P (%) = (Abs max × 40000)/(M susp × 2550) или: (Abs max / 2550) × (100/5) × (100/5) × (100/M susp )

Abs max = максимальное поглощение калибровочного раствора;

M susp = масса суспензии (г);

2550 = эталонные лаборатории (1%, 1 см);

P = чистота (содержание) суспензии (%).

Суспензия эфира апо-каротиновой кислоты чувствительна к воздуху, теплу и свету. В закрытой (запечатанной в атмосфере азота) оригинальной упаковке она может храниться в прохладном месте в течение примерно 12 месяцев. После открытия емкости содержание следует использовать как можно быстрее.

b) Эталонный раствор эфира апо-каротиновой кислоты примерно 0,2 мг/мл.

Взвешивается с точностью до 1 мг примерно 0,100 г суспензии эфира апо-каротиновой кислоты (W) и растворяется в нефтяном бензине, после чего вся смесь переливается в мерную колбу емкостью 100 мл и дополняется нефтяным бензином до отметки.

Данный раствор содержит (W × P)/10 мг/мл эфира апо-каротиновой кислоты.

Раствор следует хранить в прохладном темном месте. Неиспользованный раствор следует ликвидировать по истечении одного месяца.

2) Нефтяной бензин (40-60°C)

3) Сульфат натрия безводный, гранулированный, предварительно высушиваемый в течение двух часов при температуре 102°C

4) Хлороформ

5) Циклогексан.

5. Процедура количественного определения содержания этилового эфира бета-апо-8'-каротиновой кислоты (этиловый эфир каротиновой кислоты) в масляном жире и в сливочном масле происходит следующим образом:

1) приготовление пробы для анализа;

a) масляный жир.

Проба растапливается в печи при температуре 45°C:

b) сливочное масло;

Проба растапливается в печи при температуре примерно 45°C, после чего репрезентативная часть фильтруется через 10 г сухого сульфата натрия. Данные шаги выполняются в темном помещении, куда не поступает сильный естественный и искусственный свет, при константной температуре 45°C. Отбирается подходящее количество масляного жира.

2) Определение

Взвешивается с точностью до 1 мг примерно 1 г масляного или молочного жира (литера b) подпункта 1 настоящего пункта, (M). Все количество помещается в мерную колбу емкостью 20 мл (V), после чего дополняется нефтяным бензином до отметки и основательно перемешивается.

Одна аликвотная часть смеси помещается в 1-см кювету, после чего измеряется поглощение 440 нм по сравнению с холостой пробой с нефтяным бензином. Концентрация эфира апо-каротиновой кислоты в растворе определяется путем сравнения с калибровочной кривой С (мкг/мл).

3) Калибровка.

В пять мерных колб емкостью 100 мл пипеткой отмеряется 0, 0,25, 0,5, 0,75 и 1,0 мл эталонного раствора эфира апо-каротиновой кислоты. После чего колбы полностью заполняются нефтяным бензином, и содержимое хорошо перемешивается.

Приблизительные концентрации раствора варьируют от 0 до 2 мкг/мл и вычисляются точно путем сравнения с концентрацией эталонного раствора эфира апо-каротиновой кислоты (W × P)/10 мг/мл. Измеряется поглощение 440 нм относительно холостой пробы с нефтяным бензином.

Величины поглощения записываются на оси y, а на оси x указывается концентрация эфира апо-каротиновой кислоты. Рассчитывается уравнение калибровочной кривой.

6. Содержание эфира апо-каротиновой кислоты, выраженное в мг/кг продукта, рассчитывается по следующим формулам:

масляный жир: (C × V)/M

сливочное масло: 0,82 (C × V)M,

где:

C – содержание эфира апо-каротиновой кислоты, в мкг/мл, считываемое с калибровочной кривой (подпункт 3) пункта 5);

V – объем (мл) испытываемого раствора (подпункт 2) пункта 5);

M – масса (г) пробы (подпункт 2) пункта 5);

0,82 – поправочный коэффициент для содержания молочного жира в сливочном масле.

7. Точность метода получается из величины для повторяемости и воспроизводимости:

1) Повторяемость:

a) анализ сливочного масла

Разница между результатами двух определений, выполненных в максимально короткий интервал времени одним и тем же аналитиком, с использованием одних и тех же приборов, на том же анализируемом материале, не должна превышать 1,4 мг/кг;

b) анализ масляного жира

2) Воспроизводимость

a) Анализ сливочного масла

Разница между результатами двух определений, выполненных аналитиками в разных лабораториях, при использовании различной аппаратуры на том же анализируемом материале, не должна превышать 4,7 мг/кг.

b) Анализ масляного жира

Разница между результатами двух определений, выполненных аналитиками в разных лабораториях, при использовании различной аппаратуры, на том же анализируемом материале, не должна превышать 5,3 мг/кг.

8. Для проверки правильной маркировки продукта следует отобрать три пробы промаркированного продукта.

1) Сливочное масло:

a) доля примеси для сливочного масла, с учетом фонового поглощения, составляет 22 мг/кг;

- 17,7 мг/кг (95% минимальной доли примеси);

- 12,2 мг/кг (70% минимальной доли примеси).

Используется концентрация средства маркировки в пробе с самым низким результатом, полученным путем интерполяции между 17,7 мг/кг и 12,2 мг/кг.

2) Масляный жир:

a) доля примеси для масляного жира с учетом фонового поглощения составляет 24 мг/кг;

- 19,2 мг/кг (95% минимальной доли примеси);

- 13,2 мг/кг (70% минимальной доли примеси).

Используется концентрация средства маркировки в пробе с самым низким результатом, полученным путем интерполяции между 19,2 мг/кг и 13,2 мг/кг.

Приложение № 7

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Определение содержания ситостерина или стигмастерина в сливочном масле

или масляном жире путем газовой капиллярной хроматографии

1. Данный метод описывает процедуру количественного определения содержания ситостерина и стигмастерина в сливочном масле и масляном жире. Содержание ситостерина представляет собой сумму β-ситостерина и 22-дигидро-β-ситостерина. Остальные стерины считаются незначительными.

2. Масляный жир или сливочное масло мылятся вместе со спиртовым раствором гидроксида калия, а немылящиеся компоненты экстрагируются при помощи эфира.

Стерины превращаются в триметилсилиловый эфир и анализируются путем газовой капиллярной хроматографии с бетулином в качестве внутренней эталонной пробы.

3. Лабораторное оборудование:

1) колба для омыления емкостью 150 мл, оборудованная обратным холодильником с соединениями с огранкой;

2) делительная воронка емкостью 500 мл;

3) колбы емкостью 250 мл;

4) воронка для выравнивания давления емкостью 250 мл или со схожей емкостью для сбора избыточного эфира;

5) стеклянная колонка, 350 мм × 20 мм, со спеченной фриттой;

6) водяная баня или нагревательный кожух;

7) пробирки для реактивов емкостью 2 мл;

8) газовый хроматограф, который подходит для использования с капиллярной колонкой, оборудованный системой отбора проб с делением и состоящий из следующих компонентов:

a) термостат колонного типа, который может поддерживать заданную температуру с точностью до ±1°C;

b) терморегулируемый испаритель;

c) пламенно-ионизационный детектор с усилителем сигнала;

d) записывающее устройство с интегратором для усилителя сигнала;

9) капиллярная колонка из кварцевого стекла, покрытая полностью BP1 или другим аналогичным материалом (или другая колонка с не меньшим разрешением) со стандартной толщиной 0,25 мкм. Колонка должна уметь разделять производные триметилсилила от ланостерола и ситостерина. Для этого подходит колонка длиной 12 м и с внутренним диаметром 0,2 мм;

10) микрошприц с иглой из нержавеющей стали емкостью 1 мкл для газовой хроматографии.

4. Все реактивы используются для анализа в чистом виде. Следует использовать дистиллированную воду или воду с не меньшей степенью чистоты.

1) этанол, чистота не менее 95%;

2) гидроксид калия, 60% раствор, путем растворения 600 г гидроксида калия (не менее 85%) в воде, после чего раствор дополняется водой до получения объема 1 л;

3) бетулин с чистотой не менее 99%:

a) растворы бетулина в диэтиловом эфире.

Концентрация раствора бетулина, используемого для определения содержания ситостерина, должна составлять 1,0 мг/мл;

Концентрация раствора бетулина, используемого для определения содержания стигмастерина, должна составлять 0,4 мг/мл.

4) диэтиловый эфир, чистый для анализа (без перекиси и остатков);

5) сульфат натрия безводный, гранулированный, высушиваемый заранее в течение двух часов;

6) силильный реактив (TRI-SIL) или аналогичный реактив (внимание: TRI-SIL – это огнеопасное и токсичное, едкое и потенциально канцерогенное вещество. Сотрудники лаборатории должны знать нормы безопасности во время использования TRI-SIL, а также предпринимать необходимые меры предосторожности);

7) ланостерол;

8) ситостерин, известная степень чистоты не менее 90% (Р).

Эталонный раствор ситостерина: ситостерин растворяется в диэтиловом эфире с концентрацией примерно 0,5 мг/мл (W 1 ) и точностью 0,001 мг/мл;

9) Стигмастерин, известная степень чистоты не менее 90% (Р)

Эталонный раствор стигмастерина: стигмастерин растворяется в диэтиловом эфире с концентрацией примерно 0,2 мг/мл (W 1 ) и точностью 0,001 мг/мл.

Эталонный раствор для проверки разрешения: 0,05 мг/мл ланостерола и 0,5 мг/мл ситостерина растворяются в диэтиловом эфире.

5. Приготовление эталонных растворов для хроматографии осуществляется следующим образом:

Внутренний эталонный раствор следует добавить одновременно в соответствующий эталонный раствор стерина и омыленную пробу (подпункт 2) пункта 6).

1) Эталонный раствор ситостерина для хроматографии: по 1 мл эталонного раствора ситостерина помещают в две пробирки. Эфир удаляется потоком азота. Добавляется 1 мл внутреннего эталонного раствора, эфир удаляется потоком азота.

2) Эталонный раствор стигмастерина для хроматографии: по 1 мл эталонного раствора стигмастерина помещают в две пробирки. Эфир удаляется потоком азота. Добавляется 1 мл внутреннего эталонного раствора, эфир удаляется потоком азота.

6. Приготовление неомыляемых компонентов осуществляется следующим образом:

1) Проба сливочного масла растапливается при температуре не более 35°С и основательно перемешивается.

Взвешивается, с точностью до 1 мг, примерно 1 г сливочного масла (W 2 ) или масляного жира в колбе емкостью 150 мл. Добавляются 50 мл этанола и 10 мл раствора гидроксида калия. Устанавливается обратный холодильник, и смесь нагревается в течение 30 минут до температуры примерно 75°C. Холодильник снимается, после этого необходимо подождать, пока колба не охладится до комнатной температуры.

2) 1,0 мл внутреннего эталонного раствора, при определении ситостерина и при определении стигмастерина, добавляется в колбу. Раствор основательно перемешивается. Содержание колбы выливается в делительную воронку емкостью 500 мл, в которой колба прополаскивается сначала с 50 мл воды, а затем 250 мл диетилового эфира. Делительная воронка сильно встряхивается в течение 2 минут, после этого следует подождать разделения фаз. Нижний слой воды сливается, а эфирный слой вытряхивается четыре раза с последовательным добавлением 100 мл воды.

Во избежание образования эмульсии важно, чтобы первые две смывки водой осуществлялись осторожно (10 вращений). Во время третьей смывки можно с силой встряхивать в течение 30 секунд. Если образовалась эмульсия, ее можно растворить путем добавления 5-10 мл этанола. При добавлении этанола необходимо обязательно интенсивно промыть водой два раза.

3) Прозрачная безмыльная эфирная фаза вымывается через стеклянную колонку с 30 г безводного сульфата натрия. Эфир удаляется в колбу емкостью 250 мл. Добавляется кусочек пористого материала, после этого жидкость полностью выпаривается на водяной бане или нагревательном кожухе, при этом собираются излишки растворителя, которые необходимо удалить.

В случае полного высыхания экстрактов пробы при слишком высокой температуре могут возникнуть потери стерина.

7. Приготовление триметилсилиловых эфиров осуществляется следующим образом:

1) Эфирный раствор, оставшийся в колбе, переливается вместе с 2 мл эфира в пробирку емкостью 2 мл, после чего эфир удаляется потоком азота. Колба промывается еще двумя 2 мл аликвотными частями эфира, при этом содержимое переливается в пробирку, и эфир удаляется потоком азота.

2) Проба силируется путем добавления 1 мл TRI-SIL. Пробирка закрывается и сильно встряхивается, чтобы проба растворилась. Если проба растворилась не полностью, проба нагревается до температуры 65-70°С. После этого проба настаивается в течение не менее 5 минут, прежде чем она впрыскивается в газовый хроматограф. Эталонные растворы силируются так же, как и пробы. Смесь для проверки разрешения силируется таким же образом, как и пробы.

Силирование следует проводить в безводной среде. О неполном силировании бетулина свидетельствует второй пик, расположенный вплотную рядом с пиком бетулина.

Остатки этанола в фазе силирования могут отрицательно сказаться на процессе силирования. Возможно, в фазе экстрагирования недостаточно хорошо выполнили промывку. В этом случае во время экстрагирования необходимо промыть пятый раз, при этом сильно встряхивать в течение 30 секунд.

8. Для анализа путем газовой хроматографии газовый хроматограф устанавливается в соответствии с инструкцией производителя.

Следует соблюдать следующие рабочие условия:

1) температура колонки 265°C;

2) температура инжектора 265°С;

3) температура детектора 300°C;

4) скорость течения несущего газа 0,6 мл/мин;

5) давление водорода 84 кПа;

6) давление воздуха 155 кПа;

7) соотношение разделения: от 10:1 до 50:1; соотношение разделения следует оптимизировать в соответствии с инструкциями производителя, затем проверяется линейность сигнала детектора в интересующем диапазоне концентрации.

Инжекторные трубки должны быть очищены после каждого использования или еженедельно в случае, если не используются;

8) количество впрыскиваемого вещества: 1 мкл раствора TMSE.

Прежде чем приступать к любому анализу, необходимо подождать, пока система не придет в равновесие и не будет обеспечен достаточно стабильный ответный сигнал.

Данные условия могут изменяться в зависимости от свойств колонки и газового хроматографа с тем, чтобы получить хроматограммы, которые полностью отвечают следующим требованиям:

a) пик ситостерина должен представлять достаточное разрешение по отношению к ланостеролу;

b) относительное время удержания следующих стеринов должно быть приблизительно следующим:

холестерин: 1,0;

стигмастерин: 1,3;

ситостерин: 1,5;

бетулин: 2,5;

c) время удержания бетулина должно составлять примерно 24 минуты.

9. Эталонный раствор впрыскивается следующим образом.

Впрыскивается 1 мкл эталонного силильного раствора (стигмастерина или ситостерина), после чего регулируются параметры для калибровки интегратора.

Снова впрыскивается 1 мкл силильного эталонного раствора для определения коэффициента реакции относительно бетулина.

Впрыскивается 1 мкл силильного испытуемого раствора, после чего измеряются площади пиков. В начале и в конце каждой серии проб впрыскивается эталонный раствор.

В общем, рекомендуется впрыскивать эталонный раствор после каждых шести испытываемых растворов.

Во время интеграции пика ситостерина необходимо учитывать площадь пика 22-дигидро-бета-ситостерина (стигмастинина), который вымывается непосредственно после ситостерина, если необходимо вычислить общий ситостерин.

10. Вычисление результатов осуществляется следующим образом.

Определяется площадь пиков стерина и пиков бетулина для эталонных растворов, впрыскиваемых в начале и в конце протока, и вычисляется R 1 :

R 1 – (средняя площадь пика стерина эталонного раствора)/(средняя площадь пика бетулина в эталонном растворе).

Определяется площадь пика стерина (стигмастерин и ситостерин) и пика бетулина и вычисляется R 2 :

R 2 – (площадь пика стерина в пробе)/(площадь пика бетулина в пробе);

W 1 – содержание стерина в эталонной пробе (мг) в 1 мл эталонного раствора;

W 2 – масса пробы (г);

P – степень чистоты эталонного стерина;

Содержание стерина в пробе (мг/кг) = [(R 2 )/(R 1 )] × [(W 1 )/(W 2 )] × P × 10.

11. Точность метода получается из величины для повторяемости и воспроизводимости:

1) Сливочное масло

a) повторяемость

Стигмастерин

Разница результатов двух определений, выполненных в максимально короткий интервал времени одним и тем же аналитиком, с использованием одних и тех же приборов, на том же анализируемом материале, не должна превышать 19,3 мг/кг.

Ситостерин

b) Воспроизводимость

Стигмастерин

Разница результатов двух определений, выполненных аналитиками в разных лабораториях, при использовании различной аппаратуры, на том же анализируемом материале, не должна превышать 31,9 мг/кг.

Ситостерин

Разница результатов двух определений, выполненных аналитиками в разных лабораториях, при использовании различной аппаратуры на том же анализируемом материале, не должна превышать 8,7% от среднего значения определений.

2) Масляный жир

a) Повторяемость

Стигмастерин

Ситостерин

b) Воспроизводимость

Стигмастерин

Ситостерин

12. Для проверки правильной маркировки продукта необходимо взять три пробы промаркированного продукта.

1) Сливочное масло

a) Стигмастерин

Доля примеси для стигмастерина составляет 150 г стигмастерина со степенью чистоты не менее 95% на тонну сливочного масла, то есть 142,5 мг/кг, или 170 г стигмастерина со степенью чистоты не менее 85% на тонну сливочного масла, то есть 144,5 мг/кг.

Результаты трех проб, полученные вследствие анализа продукта, используются для проверки доли и однородности примеси средства маркировки; наименьший из результатов оценивается исходя из следующих предельных значений:

- 115,8 мг/кг (минимальная доля примеси 95% для стигмастерина со степенью чистоты не менее 95%);

- 117,7 мг/кг (минимальная доля примеси 95% для стигмастерина со степенью чистоты 85%);

- 80,1 мг/кг (минимальная доля примеси 70% для стигмастерина со степенью чистоты 95%);

- 81,5 мг/кг (минимальная доля примеси 70% для стигмастерина со степенью чистоты 85%).

Используется концентрация средства маркировки в пробе с наименьшим результатом, который был получен путем интерполяции между 115,8 мг/кг и 80,1 мг/кг или между 117,7 мг/кг и 81,5 мг/кг.

b) Ситостерин

Доля примеси для ситостерина составляет 600 г ситостерина со степенью чистоты не менее 90% на тонну сливочного масла, то есть 540 мг/кг.

Результаты трех проб, полученные вследствие анализа продукта, используются для проверки доли и однородности примеси средства маркировки, а наименьший из результатов оценивается исходя из следующих предельных значений:

- 482,6 мг/кг (минимальная доля примеси 95% для ситостерина со степенью чистоты 90%);

- 347,6 мг/кг (минимальная доля примеси 70% для ситостерина со степенью чистоты 90%).

Используется концентрация средства маркировки в пробе с наименьшим результатом, который был получен вследствие интерполяции между 482,6 мг/кг и 347,6 мг/кг.

2) Масляный жир

a) Стигмастерин

Доля примеси для стигмастерина составляет 150 г стигмастерина со степенью чистоты не менее 95% на тонну масляного жира соответственно 142,5 мг/кг, или 170 г стигмастерина со степенью чистоты не менее 85% на тонну масляного жира соответственно 144,5 мг/кг.

- 118,5 мг/кг (минимальная доля примеси 95% для стигмастерина со степенью чистоты 95%);

- 120,4 мг/кг (минимальная доля примеси 95% для стигмастерина со степенью чистоты 85%);

- 82,9 мг/кг (минимальная доля примеси 70% для стигмастерина со степенью чистоты 95%);

- 84,3 мг/кг (минимальная доля примеси 70% для стигмастерина со степенью чистоты 85%).

Используется концентрация средства маркировки в пробе с наименьшим результатом, который был получен в вследствие интерполяции между 118,5 мг/кг и 82,9 мг/кг, или между 120,4 мг/кг и 84,3 мг/кг.

b) Ситостерин

Доля примеси для ситостерина составляет 600 г ситостерина со степенью чистоты не менее 90% на тонну масляного жира соответственно 540 мг/кг.

- 480,9 мг/кг (минимальная доля примеси 95% для ситостерина со степенью чистоты 90%);

- 345,9 мг/кг (минимальная доля примеси 70% для ситостерина со степенью чистоты 90%).

Используется концентрация средства маркировки в пробе с наименьшим результатом, который был получен вследствие интерполяции между 480,9 мг/кг и 345,9 мг/кг.

Приложение № 8

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Эталонный метод для обнаружения коровьего молока и казеина

в сырах, произведенных из овечьего, козьего, буйволиного молока

или из смеси овечьего, козьего и буйволиного молока

1. Данный метод описывает процедуру обнаружения коровьего молока и казеина в сырах, произведенных из овечьего, козьего, буйволиного молока или из смеси овечьего, козьего, буйволиного молока, путем изоэлектрической фокусировки γ-казеинов после плазмолиза.

2. Данный метод используется для чувствительного и специфического обнаружения коровьего молока и казеина (с и без термической обработки) в свежем и зрелом сыре из овечьего, козьего или буйволиного молока или из смеси овечьего, козьего или буйволиного молока. Данный метод не может использоваться для обнаружения фальсификации молока и сыра с использованием прошедшего термическую обработку концентрата сывороточного протеина крупного рогатого скота.

3. Принцип метода заключается в следующем:

1) казеин изолируется из сыра и эталонных проб;

2) изолированный казеин растворяется, после чего проводится расщепление плазмином;

3) обработанные плазмином казеины в присутствии мочевины и при окрашивании протеинов подвергаются изоэлектрической фокусировке;

4) Оценка осуществляется путем сравнения окрашенных γ 2 - и γ 3 -казеинов (подтверждение присутствия коровьего молока) между определяемыми пробами и эталонными пробами, вращающимися в том же геле и содержащими 0% и 1% коровьего молока.

4. За неимением других указаний необходимо использовать для анализа чистые реактивы. Воду необходимо дистиллировать два раза или следует взять воду соответствующей чистоты.

Следующие данные действительны для полиакриамидных гелей с содержанием мочевины, полученных в лаборатории, в формате 265 × 125 × 0,25 мм. В случае использования других рецептур или форматов гелей, возможно, понадобится откорректировать условия отделения.

Изоэлектрическая фокусировка

1) Реактивы для получения полиакриамидных гелей с содержанием мочевины

a) Исходный гель-раствор

Растворяются в воде:

4,85 г акриламида;

0,15 г N, N'-метилен-бис-акриламида (BIS);

48,05 г мочевины;

15,00 г глицерина (87% м/м);

после этого раствор доводится до количества 100 мл и переливается в бутылки из коричневого стекла и хранится в холодильнике.

Вместо указанного содержания твердых компонентов нейротоксичных акриламидов можно использовать доступные в продаже готовые растворы акриламида. В случае использования подобного раствора с содержанием 30% (м/м) акриламида и 0,8% (м/м) BIS вместо твердых компонентов следует использовать 16,2 мл раствора. Срок годности исходного гель-раствора составляет не более 10 дней; если проводимость составляет более 5 мкс, в раствор добавляются 2 г Amberlite MB-3, после чего раствор деионизируется при помешивании в течение 30 минут и затем фильтруется на мембранном фильтре 0,45 мкм.

b) Гель-раствор

Из исходного гель-раствора путем добавления различных амфолитов и добавок приготовляется гель-раствор:

9,0 мл исходного гель-раствора;

24 мг β-аланина;

500 мкл амфолита pH 3,5-9,5;

250 мкл амфолита pH 5-7;

250 мкл амфолита pH 6-8.

Гель-раствор перемешивается в течение 2-3 минут и подвергается сухой перегонке в ультразвуковой ванне или в вакууме.

Гель-раствор смешивается непосредственно перед наливанием (подпункт 2) пункта 6).

c) Растворы катализаторов

N, N, N' N' – тетраметилэтилендиамин (Temed)

40% м/м персульфата аммония (PER):

800 мг PER растворяются в воде, и раствор дополняется до получения количества 2 мл.

Следует использовать всегда свежеприготовленный раствор PER.

2) Контактная жидкость – керосин или н-декан

3) Анодный раствор

В воде растворяются 5,77 г фосфорной кислоты (85% м/м), после чего раствор дополняется водой до получения количества 100 мл.

4) Катодный раствор

В воде растворяются 2,00 г гидроксида натрия, после чего раствор дополняется водой до получения количества 100 мл.

Приготовление пробы

5) Реактивы для протеиновой изоляции

a) разбавленная уксусная кислота (к 25,0 мл уксусной кислоты добавляется вода до получения количества 100 мл);

b) дихлорметан;

c) ацетон;

6) белковый буферный раствор.

В дистиллированной воде растворяются:

5,75 г глицерина (87% м/м);

24,03 г мочевины;

250 мг дитиотреитола;

после чего раствор дополняется до получения количества в 50 мл.

Раствор следует хранить в холодильнике в течение не более одной недели.

7) Реактивы для расщепления казеинов плазмином

a) Буферный раствор карбоната аммония:

0,2 моль/л раствора NH 4 HCO 3 (1,58 г/100 мл воды), в который было добавлено 0,05 моль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA, 1,46 г/100 мл), титруется с 0,2 моль/л раствора карбоната аммония (1,92 г/100 мл воды), в который было добавлено 0,05 моль/л EDTA, до получения pH 8;

b) плазмин бычий с минимальной активностью 5 U/мл;

c) ε-аминокапроновая кислота для активации ферментов

2,624 г ε-аминокапроновой кислоты (6-амино-н-гексановая кислота) растворяются в 100 мл этанола 40% (v/v).

8) Эталонные пробы:

a) смеси створоженного овечьего и козьего молока с содержанием 0% и соответственно 1% коровьего молока;

b) приготовление временных эталонных проб в условии лаборатории из створоженного буйволиного молока с содержанием 0% и соответственно 1% коровьего молока.

Обезжиренное молоко приготавливается путем сепарирования сырого буйволиного молока или сборного коровьего молока при температуре 37°C (2500 г в течение 20 минут). После быстрого охлаждения емкости центрифуги вместе с содержимым до 6-8°C полностью удаляется верхний слой жира. Для приготовления 1% эталонного раствора 495 мл обезжиренного буйволиного молока добавляются в литровую стеклянную емкость вместе с 5,00 мл обезжиренного коровьего молока, после чего путем добавления разбавленной молочной кислоты (10% m/v) раствор доводится до получения pH 6,4. Температура устанавливается на 35°C, после чего добавляются 100 мкл телячьего сычуга, все перемешивается в течение одной минуты, а затем стеклянная емкость накрывается алюминиевой фольгой и настаивается в течение 1 часа при температуре 35°C для образования творога. После этого заквашенная проба молока, без предварительного перемешивания или сливания сыворотки, лиофилизуется. После лиофилизации продукт измельчается до получения равномерной и однородной смеси. Для приготовления 0% эталонного раствора используется тот же метод с обезжиренным буйволиным молоком. Эталонные растворы следует хранить при температуре -20°C.

Перед приготовлением эталонных проб рекомендуется проверить чистоту буйволиного молока путем изоэлектрической фокусировки обработанных плазмином казеинов.

Реактивы для окрашивания белка

9) Фиксирующий раствор

В воде растворяются 150 г трихлоруксусной кислоты, после чего раствор дополняется до получения количества 1000 мл.

10) Раствор для обесцвечивания

В дистиллированной воде растворяются до 500 мл метанола и 200 мл ледяной уксусной кислоты.

Ежедневно приготавливается свежий обесцвечивающий раствор. Он может приготавливаться из питающих растворов 50% (v/v) метанола и 20% (v/v) ледяной уксусной кислоты путем перемешивания равных частей.

11) Растворы для окрашивания

a) Растворы для окрашивания (питающий раствор 1)

3,0 г кумасси бриллиантового голубого G-250 растворяются в 1000 мл метанола 90% (v/v), перемешиваются при помощи магнитной мешалки (в течение примерно 45 минут), после чего фильтруются через два плиссированных фильтра на средней скорости.

b) Раствор для окрашивания (питающий раствор 2)

5,0 г сульфата пентагидрата меди растворяются в 1000 мл 20% уксусной кислоты (v/v).

c) Раствор для окрашивания (готовый к использованию раствор)

Непосредственно перед окрашиванием перемешиваются по 125 мл каждого питающего раствора.

Рекомендуется готовить раствор для окрашивания в день его использования.

5. Лабораторное оборудование:

1) стеклянные пластинки (265 × 125 × 4 мм); резиновый ролик (ширина вала 15 см); регулируемый стол;

2) пленочный носитель для геля (265 × 125 мм);

3) контрпленка (280 × 125 мм). Обе продольные стороны приклеиваются при помощи клеящей ленты (280 × 6 ×0,25 мм) (рисунок 1).

Рисунок 1. Изображение контрпленки

4) камера для электрической фокусировки с охлаждающей плитой с подходящим аккумулятором (≥ 2,5 кВ) или автомат для электрофореза;

5) ротационный криостат, регулируемый термостатом до температуры 12 ± 0,5°C;

6) центрифуга, регулируемая до 3000 г;

7) электродные полосы (длиной ≥ 265 мм);

8) капельные склянки из пластика для анодного и катодного раствора;

9) пробные аппликаторы (10 × 5 мм, вискоза или фильтровальная бумага с минимальным поглощением протеина);

10) ножницы, скальпель и пинцеты из высококачественной стали;

11) емкости из высококачественной стали для окрашивания и обесцвечивания;

12) регулируемый гомогенизирующий стержень (диаметр стержня 10 мм), диапазон частоты вращения 8000 – 20000 мин -1 ;

13) магнитная мешалка;

14) ультразвуковая ванна;

15) аппарат для сварки пленок;

16) микропипетка 25 мкл;

17) вакуумная центрифуга или сублимационная сушка;

18) водяная баня, регулируемая термостатом до температуры 35 и 40 ± 1°C;

19) денситометр регистрации при λ = 634 nm.

6. Процедура обнаружения коровьего молока и казеина в сырах, произведенных из овечьего, козьего, буйволиного молока или из смеси овечьего, козьего, буйволиного молока, осуществляется следующим образом:

1) приготовление пробы;

a) изолирование казеина

В центрифужную трубку емкостью 100 мл добавляется количество сыра или эталонной пробы, эквивалентное 5 г сухой массы. Затем добавляются 60 мл дистиллированной воды. После этого проба перемешивается при помощи гомогенизатора до получения однородной массы (8000-10000 об/мин). Путем добавления разбавленной уксусной кислоты уровень рН регулируется до 4,6, после этого пробы центрифугируются (в течение 5 минут, 3000 г). Жиры и сыворотка сцеживаются, а остаток гомогенизируется (20000 об/мин) в 40 мл дистиллированной воды, уровень рН в которой был отрегулирован путем добавления разбавленной уксусной кислоты до 4,5. После этого в раствор добавляются 20 мл дихлорметана, вся смесь гомогенизируется еще раз, а затем центрифугируется (в течение 5 минут при 3000 г). Слой казеина, плавающий между водянистой и органической фазами (рисунок 2), приподнимается при помощи лопаточки, для того чтобы можно было сцедить обе фазы. Казеин гомогенизируется еще раз в 40 мл дистиллированной воды и гомогенизируется вместе с 20 мл дихлорметана, а затем центрифугируется. Данная процедура повторяется до тех пор, пока обе экстракционные фазы не станут бесцветными (от двух до трех раз). Белковый остаток гомогенизируется вместе с 50 мл ацетона и фильтруется через плиссированный бумажный фильтр на средней скорости. Остающаяся на фильтре фракция промывается два раза, каждый раз 25 мл ацетона, высушивается на воздухе или потоком азота, после чего превращается в мелкий порошок в ступке.

Рисунок 2. Слой казеина, плавающий между водянистой и органической фазами

Сухие казеиновые изоляты следует хранить при температуре –20°C.

b) Расщепление плазмином ß-казеинов для увеличения концентрации γ-казеинов.

Приготавливается суспензия из 25 мг казеинового изолята (подпункт 1 настоящего пункта) в 0,5 мл буферного раствора карбоната аммония, которая затем гомогенизируется в течение 20 минут, например, в ультразвуковой ванне. Гомогенизированная суспензия нагревается до температуры 40°C, смешивается с 10 мкл плазмина, перемешивается, после чего в нее добавляются 200 мг твердой мочевины и затем 2 мг дитиотреитола.

Для улучшения симметрии фокусированных полос казеина рекомендуется лиофилизировать раствор после добавления ε-аминокапроновой кислоты, растворив остаток пробы в 0,5 мл буферного раствора мочевины.

2) Приготовление полиакриламидных гелей с содержанием мочевины

При помощи нескольких капель воды на стеклянную пластинку натягивается пленка для геля, при этом излишки воды удаляются при помощи бумажной салфетки. Таким же образом на другую стеклянную пластинку, прикрепленную на распорных держателях, натягивается контрпленка (0,25 мм). Пластинка устанавливается горизонтально на регулируемом столе.

Приготовленный свежий дегазированный гель-раствор соединяется с 10 мкл раствора катализатора Temed и 10 мкл раствора PER, хорошо перемешивается и выливается равномерно по центру контрпленки. Несущая пластинка для геля (пленкой вниз) устанавливается на край регулируемой пластинки с контрпленкой и опускается медленно до тех пор, пока между пленками не образуется тонкая гелевая пленка, распространяющаяся равномерно и без образования пузырей (рисунок 3). Пластинка с несущей пленкой для геля полностью опускается при помощи тонкой лопатки, три другие стеклянные пластинки используются в качестве прижимного веса. После завершения полимеризации (примерно 60 минут), путем наклона стеклянных пластинок, полимирезованный гель на несущей пластинке для геля снимается вместе с контрфольгой. Обратная сторона несущей фольги с гелем тщательно очищается от остатков геля и мочевины. «Гелевый сэндвич» сваривается по краям в шланг из фольги и хранится в холодильнике (не более 6 недель).

Рисунок 3. Техника складывания для получения очень тонких слоев полиакриламидного геля

a – клеящая лента для разбивки (0,25 мм);

b – покрывающая фольга;

c, e – стеклянные пластинки;

d – гель-раствор;

f – несущая фольга для геля.

Покрывающая фольга с распорными держателями может использоваться повторно. Полиакриламидный гель можно разрезать на куски равного размера, что рекомендуется в случае небольшого объема пробы или в случае использования автомата для электрофореза (два куска геля размером 4,5×5 см).

3) Изоэлектрическая фокусировка

Охлаждающий термостат устанавливается на температуру 12°C. Обратная сторона несущей фольги для геля протирается керосином, после чего несколько капель керосина наносятся по центру охлаждающегося блока. «Гелевый сэндвич», несущей фольгой вниз, раскатывается без образования пузырей. Выступающий керосин вытирается и покрывающая фольга снимается. Электродные полоски пропитываются соответствующими растворами для электродов, разрезаются по длине геля и выкладываются на предусмотренных для этого местах (расстояние между электродами 9,5 см).

Условия проведения изоэлектрической фокусировки:

Размер куска геля 265 × 125 × 0,25 мм

Этап

Время

(мин)

Напряжение

(В)

Сила тока

(мA)

Мощность

(Вт)

Вольт-часы

(В/ч)

1. Предварительная фокусировка

максимум 2500

максимум 15

константно 4

примерно 300

2. Фокусировка пробы ( 1 )

максимум 2500

максимум 15

константно 4

примерно 1000

3. Завершающая фокусировка

максимум 2500

максимум 5

максимум 20

примерно 3000

максимум 2500

максимум 6

максимум 20

примерно 3000

максимум 2500

максимум 7

максимум 25

примерно 3000

( 1 ) Нанесение пробы: После предварительной фокусировки (этап 1) 18 мкл пробы и эталонные растворы наносятся пипеткой на аппликаторы для проб (10×5 мм) и наносятся на расстоянии 1 мм друг от друга, а также на расстоянии 5 мм в продольном направлении от анода на гель, слегка придавливаясь. Процедура фокусировки проводится с соблюдением описанных выше условий. После 60-минутной фокусировки пробы необходимо осторожно снять аппликаторы для пробы.

В случае изменения толщины или ширины кусков геля следует отрегулировать соответствующим образом силу тока и мощность.

4) Окрашивание белка

a) Фиксирование белков

После прекращения подачи электрического тока электродные полосы снимаются. Гель помещается сразу же в емкость для окрашивания/обесцвечивания, наполненную 200 мл фиксирующего раствора, где он непрерывно встряхивается в течение 15 минут.

b) Промывка и окрашивание пластинки с гелем

Фиксирующий раствор полностью сливается, и пластинка с гелем промывается два раза по 30 секунд в 100 мл обесцвечивающего раствора. Обесцвечивающий раствор сливается, и миска наполняется 250 мл раствора для окрашивания. В течение 45 минут следует слегка поворачивать раствор для окрашивания, с тем чтобы он оказывал свое действие.

c) Обесцвечивание пластинки с гелем

Раствор для окрашивания сливается, пластинка с гелем промывается дважды в 100 мл обесцвечивающего раствора и затем не менее двух-трех раз по 15 минут помещается в 200 мл обесцвечивающего раствора, пока основание не станет прозрачным и бесцветным. Пластинка с гелем промывается, затем в дистиллированной воде (два раза по 2 минуты) и высушивается на воздухе (от 2 до 3 часов) или при помощи фена (примерно 10-15 минут).

Фиксация, промывание, окрашивание и обесцвечивание осуществляются при температуре 20°C. Данные процедуры нельзя проводить при более высокой температуре.

В случае если отдается предпочтение более чувствительному окрашивающему раствору с содержанием серебра, казеиновые пробы, обработанные плазмином, следует разбавить до 5 мг/мл.

7. Оценка осуществляется путем сравнения образцов белковых полос неизвестной пробы с эталонными пробами на одном и том же геле. Обнаружение коровьего молока в овечьем, козьем или буйволином сыре и в смесях из овечьего, козьего или буйволиного сыра осуществляется при помощи γ 3 - и γ 2 -казеинов, в случае которых изоэлектрические точки находятся в диапазоне рН 6,5 рН 7,5 (рисунки 4а, 4b и 5). Предел обнаружения данным методом составляет менее 0,5%.

Рисунок 4a. Изоэлектрическая фокусировка казеинов, обработанных плазмином,

в овечьем и козьем молоке, содержащем различные количества коровьего молока

% CM = содержание коровьего молока в процентах;

C = корова;

E = овца;

G = коза.

На рисунке изображена верхняя половина геля IEF.

Рисунок 4b. Изоэлектрическая фокусировка казеинов, обработанных плазмином,

в смесях из овечьего, козьего и буйволиного молока, содержащего

различные количества коровьего молока.

% CM = содержание коровьего молока в процентах;

1 + = проба, содержащая 1% коровьего молока, соединенная с чистым казеином из коровьего молока по центру протока геля.

C = корова;

E = овца;

G = коза;

B = буйволица.

На рисунке представлено общее разделительное расстояние геля IEF.

Рисунок 5. Серия денситограмм эталонных проб (STD) и проб сыра, приготовленного

из смеси овечьего и козьего молока, после изоэлектрической фокусировки

a, b – эталонная проба, содержащая 0, соответственно 1% коровьего молока;

c-g – проба сыра, содержащая 0, 1, 2, 3 и 7% коровьего молока.

C – корова;

E – овца;

G – коза.

Верхняя половина геля IEF была проанализирована при λ = 634 нм.

1) Визуальное определение

Для визуального определения содержания коровьего молока рекомендуется отрегулировать концентрацию проб и эталонных проб в зависимости от насыщенности овечьих, козьих и/или буйволиных γ 2 - и γ 3 -казеинов (смотри “γ 2 E, G, B” и “γ 3 E, G, B” на рисунках 4a и 4b и на рисунке 5). Только в данном случае содержание коровьего молока (менее, равное или более 1%) может быть определено в изучаемой пробе путем прямого сравнения насыщенности γ 2 - и γ 3 -казеинов из коровьего молока (смотри “γ 3 C” и “γ 2 C” на рисунках 4a, 4b и 5) с эталонными пробами с 0% или 1% содержанием (овца, коза) или полученными в лаборатории временными эталонными пробами (буйволиное молоко).

2) Денситометрическое определение

По возможности, при помощи денситометра определяется соотношение площадей пиков γ 2 - и γ 3 -казеинов (рисунок 5) между коровьим и овечьим, козьим и/или буйволиным молоком. Данная величина сравнивается с соотношением площадей пиков γ 2 - и γ 3 -казеинов в 1% эталонной пробе (овца, коза) или во временной полученной в лаборатории эталонной пробе (буйволица), находящейся в том же геле.

Данный метод предоставляет надежные результаты, если эталонная проба, содержащая 1% коровьего молока, реагирует однозначно положительно как на γ 2 -, так и на γ 3 -казеины, а 0% эталонная проба не реагирует. В остальных случаях метод следует оптимизировать, соблюдая в точности предписание по проведению метода.

Выборочная проба считается положительной, если оба казеина коровьего молока γ 2 и γ 3 или соответствующие соотношения площадей пиков являются большими или равными уровню 1% эталонной пробы.

Приложение № 9

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Эталонный метод

для обнаружения колиформных бактерий в сливочном масле,

обезжиренном сухом молоке, казеине и казеинатах

1. Подготовка проб осуществляется в соответствии со стандартом SM SR EN ISO 6887-5.

2. Обнаружение колиформных бактерий осуществляется в соответствии со стандартом SM ISO 4831.

Пробы соответственно 1 г сливочного масла, или 0,1 г обезжиренного сухого молока, или казеина/казеинатов вводятся в культурную среду.

По каждой пробе инокулируются три трубки.

3. В случае если по всем трем трубкам будут получены три отрицательных результата, результат определяется как «соответствует».

Если по трем трубкам будут получены 2 или 3 положительных результата, результат определяется как «не соответствует».

Если по трем трубкам будут получены 2 или 3 отрицательных результата, анализ повторяется с двумя трубками.

1) В случае если оба результата являются отрицательными, результат определяется как «соответствует».

2) В случае если хотя бы 1 результат является положительным, результат определяется как «не соответствует».

Приложение № 10

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Обнаружение лактозы в комбинированных кормах

1. Данный метод описывает процедуру определения лактозы в комбинированных кормах.

2. Под содержанием лактозы по данному методу понимается определенная массовая доля в процентном выражении.

Содержание безводной лактозы выражается в г/100 г.

3. Комбинированный корм реконструируется в воде. Раствор Биггс добавляется к разбавленной взвешенной аликвотной части, для того чтобы осели жир и белковые фракции комбинированного корма. Проба фильтруется (или центрифугируется), и профильтрованный продукт (или жидкая фракция) впрыскивается в колонку ВЭЖХ с катионитом (в виде свинца) вместе с водой, качество которой соответствует ВЭЖХ в качестве мобильной фазы. Вымытая лактоза определятся при помощи дифференциального рефрактометра.

4. За неимением других предписаний используются исключительно реактивы соответствующего качества для проведения анализа, а также дегазированная вода, качество которой соответствует ВЭЖХ.

1) Лактоза

Моногидрат D-лактозы [(C 12 H 22 )O 11 · H 2 O] может впитывать повышенную влажность. Перед использованием необходимо измерить фактическое содержание воды по методу Карла Фишера или выпарить повышенную влажность, поместив лактозу на 8 часов в печь при температуре 105°C.

2) Концентрированный раствор Биггс/Сийярто

9,10 г дигидрата ацетата цинка [Zn(CH 3 COO) 2 ·2H 2 O] и 5,46 г моногидрата фосфорно-вольфрамовой кислоты (H 3 [P(W 3 O 10 ) 4 ·H 2 O]) растворяются в примерно 70 мл воды, качество которой соответствует ВЭЖХ, в мерной колбе емкостью 100 мл.

Добавляются 5,81 мл ледяной уксусной кислоты (CH 3 COOH). Затем раствор дополняется водой, качество которой соответствует ВЭЖХ, до отметки 100 мл и перемешивается. Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение 1 года.

3) Разбавленный раствор Биггс/Сийярто

25 мл концентрированного раствора Биггс/Сийярто разбавляются водой в мерной колбе до достижения отметки 500 мл. Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение 1 месяца.

4) Приготовление воды, качество которой соответствует ВЭЖХ

Ультрачистая вода фильтруется через систему вакуумной фильтрации. Для улучшения мощности насоса и для получения стабильной базовой линии подвижную фазу следует ежедневно дегазировать доступным методом, например, продувкой гелием, обработкой ультразвуком, дегазированием в вакууме или в линии.

Для продления срока службы колонки следует убедиться, что процент содержания углекислого газа в растворителе является максимально низким и что исключено повторное поглощение.

5. Стандартное лабораторное оборудование, в частности, следующее:

1) Пластиковая колонка для ионного обмена ВЭЖХ

Наполнение колонки: 8% сополимер полистирола и дивинилбензола с поперечными связями с функциональными группами, способными к катионному обмену в форме свинца;

Размеры колонки: длина 300 мм, внутренний диаметр примерно 8 мм.

Можно использовать и колонки другого диаметра, если поток был настроен соответствующим образом.

2) Колонка контроля

Колонка контроля представляет собой комбинацию между отдельным катионообменником (H + ) и анионообменником, каждый встроенный в колонку примерно 30 мм × 4,6 мм (высота × внутренний диаметр). Колонки расположены рядами одна за другой или в форме смешанного слоя с AG 50W-X4, – 400 ячеек сети (H + ) и AG3-X4A, 200-400 ячеек сети (OH-) в соотношении 35:65 (м/м), будучи вставлены вручную в одну большую колонку примерно 20 × 9 мм (длина × внутренний диаметр).

3) Печь колонки

Печь должна быть в состоянии поддерживать константную температуру 85°C ± 1°C.

4) ВЭЖХ насос

Насос должен быть в состоянии обеспечить константный расход (при колебаниях < 0,5%) – 0,2-1,0 м/мин.

5) Система впрыскивания ВЭЖХ

Автоматический дискретизатор должен быть в состоянии впрыскивать объем, равный 25 мкл. Повторяемость должна составлять < 0,5%.

В качестве альтернативного решения может использоваться ручная система.

6) Детектор ВЭЖХ

Необходимо использовать высокочувствительный детектор показателя преломления с шумовым уровнем < 5·10 -9 RI.

7) Интегратор

Для регистрации данных, а также для генерирования площадей пиков или высот пиков, которые могут быть пересчитаны на концентрации лактозы, необходимо использовать программное обеспечение или интегратор.

8) Система очистки воды

Система должна быть в состоянии производить ультрачистую воду с удельным сопротивлением >14 MΩ·cm.

9) Система для фильтрования растворителя

Система должна быть в состоянии профильтровать воду через мембранный фильтр с размерами пор 0,45 мкм.

Многие системы очистки воды оборудованы встроенным 0,45 или 0,2 мкм фильтром. Можно отказаться от дополнительной фильтрации, если вода используется сразу же.

10) Аналитические весы

Весы с чувствительностью до 0,1 мг.

11) Водяная баня

В водяной бане должна поддерживаться константная температура в 40°C (±0,5).

12) Центрифуга

Центрифуга должна быть в состоянии ускорять трубки Eppendorf, или аналогичные, или большие по размерам типы трубок не менее 3000 г.

13) Мерная колба емкостью 50 мл

Емкость 50 мл, класс A.

При условии соблюдения коэффициента объема можно использовать и мерные колбы другой емкости.

14) Мерная колба емкостью 100 мл

Емкость 100 мл, класс A.

15) Мерная пипетка

Мерная пипетка емкостью 10 мл.

В качестве альтернативного решения может использоваться ручная вспомогательная пипетка емкостью 5 мл. В данном случае необходимо использовать два раза по 5 мл реактива (подпункт 3) пункта 4).

6. Важно, чтобы в лабораторию поступила проба, которая была отобрана в соответствии со стандартом SM SR EN 707, которая является действительно репрезентативной и не была повреждена во время транспортировки или хранения.

7. Эталонный раствор лактозы приготавливается следующим образом:

1) Эталонная проба 1

Примерно 50 мг моногидрата лактозы, взвешенные с точностью до 0,1 мг, растворяются в мерной колбе емкостью 100 мл. Затем колба заполняется водой до отметки максимального наполнения.

2) Эталонная проба 2

Примерно 100 мг моногидрата лактозы, взвешенные с точностью до 0,1 мг, растворяются в мерной колбе емкостью 100 мл. Затем колба заполняется водой до отметки максимального наполнения.

Эталонные растворы могут храниться при температуре примерно 5°C не более 1 недели.

8. Проба для анализа приготавливается следующим образом:

1) Восстановление пробы

Примерно 5 г сухого молока взвешиваются в колбе емкостью 50 мл. Масса определяется с точностью до 1 мг [W 1 , (11)]. После добавления 50 мл воды увеличение массы [W 2 , (11)] определяется с точностью до 0,01 г. Закрытая колба помещается на 30 минут в водяную баню, переворачиваясь несколько раз в течение этого времени. Затем колбу следует охладить до комнатной температуры.

2) Обработка пробы

Отбирается примерно 1 г данного раствора и помещается в мерную колбу емкостью 50 мл. Определяется масса [W 3 , (11)] с точностью до 1 мг. После этого сначала добавляются 20 мл воды, а затем 10 мл разбавленного раствора Биггс/Сийярто. Колба дополняется водой до отметки максимального наполнения. Колба осторожно встряхивается 5 раз в течение первых 30 минут.

По истечении 1 часа отбирается одна аликвотная часть и центрифугируется 10 минут с 3000 г (при меньшем отрезке времени могут использоваться и большие ускорения). Одна аликвотная часть жидкой фракции используется для анализа ВЭЖХ.

9. Анализ ВЭЖХ осуществляется следующим образом:

1) Предварительное приготовление к ВЭЖХ

a) Установка основной колонки и предварительной колонки

Предварительная колонка (подпункт 2) пункта 5) устанавливается снаружи печи (подпункт 3) пункта 5), а основная колонка (подпункт 1) пункта 5) устанавливается в печи.

Если печь не оборудована трубками для предварительного нагрева растворителя, растворитель должен подаваться в печь через трубу из высококачественной стали длиной примерно 15 см, прежде чем он попадет в колонку, крайне важно, чтобы растворитель был нагрет до поступления в колонку, в противном случае пики станут чрезмерно широкими.

b) Детектор и исходный расход

Для получения стабильной основной линии детектор ВЭЖХ следует включить не позднее чем за 24 часа до начала анализа. Внутренняя температура детектора регулируется на 35°C. В течение не менее 20 минут устанавливается расход 0,2 мл/мин. (подпункт 4) пункта 5), в то время как температура печи регулируется согласно комнатной температуре.

c) Печь колонки и конечный расход

Печь колонки регулируется на 85°C. После достижения данной температуры в течение 30 минут расход постепенно повышается с 0,2 мл/мин до 0,6 мл/мин (подпункт 4) пункта 5). Следует подождать пока прибор придет в равновесие при данном расходе и при температуре 85°C (2 часа или до достижения стабильной основной линии).

d) Интеграция

Необходимо тщательно выбирать параметры для регистрации и интеграции данных (подпункт 7) пункта 5), как, например, скорость передачи данных, чувствительность, временная константа, ширина пики и пороговая величина.

Время удерживания составляет для лактозы примерно 11 минут.

Многие программные обеспечения, используемые для регистрации данных (подпункт 7) пункта 5), делают возможным удобный теоретический чашечный подсчет. Теоретический чашечный подсчет эталонного раствора 1 проводится регулярно. Если результаты чашечного подсчета ниже исходной величины новой колонки на 25% и более, колонку следует заменить (подпункт 1) пункта 5).

e) Проверка предварительной колонки

Необходимо регулярно (т.е. не менее одного раза за каждый цикл анализа) проверять, в состоянии ли предварительная колонка отделять соли из пробы, для чего впрыскиваются 25 мкл 0,05% раствора натрия хлорида. Необходимо каждый раз заменять предварительную колонку, как только появляются пики.

2) Измерение эталонных проб

Каждый раз в начале цикла анализа впрыскиваются 25 мкл (подпункт 5) пункта 5) эталонной пробы 1, а затем эталонной пробы 2. Эти впрыскивания повторяются каждый раз после каждых 10-20 проб, а также по окончании цикла анализа.

3) Измерение проб

Впрыскиваются 25 мкл жидкой фракции (подпункт 2) пункта 8) пробы.

10. Расчет и представление результатов осуществляется следующим образом:

1) Калибровка

Как правило, результаты рассчитываются на основании площадей пиков. В том числе и при слишком сильном уровне шума могут использоваться площади результатов (в случае количественного определения при помощи высоты пиков существует незначительный риск неучета пиками компонентов в низкой концентрации, которые всего лишь частично, но недостаточно, могут быть разграничены от пика лактозы).

При помощи программного обеспечения (подпункт 7) пункта 5) рассчитывается линейная калибровочная кривая, проходящая через исходный уровень. Необходимо проверять кривую на вопрос возможного отклонения линейности (видимые отклонения линейности объясняются чаще всего ошибкой при приготовлении эталонного раствора 1 или 2, или плохой интеграцией, либо, что реже, неисправным инжектором).

В качестве исходных данных берутся концентрации лактозы, рассчитанные в мг/мл эталонного раствора 1 и 2 как безводные лактозы.

Подъем (RF) калибровочной линии зависит от соотношения между площадью и концентрацией в мг/мл.

2) Проба

Результат анализа выражается в г/100 г и рассчитывается при помощи программного обеспечения (подпункт 7) пункта 6) или по следующей формуле:

где:

C – концентрация лактозы в г/100 г сухого молока;

H – высота пика лактозы в пробе;

RF – калибровочный коэффициент (или подъем) калибровочной кривой в mV/мг/мл;

W 1 – масса пробы сухого молока в г (подпункт 1) пункта 8);

W 2 – масса воды, добавленной к пробе сухого порошка (подпункт 1) пункта 8);

W 3 – масса реконструированного раствора сухого молока в г (подпункт 2) пункта 8);

50 – объем использованной мерной колбы (подпункт 2) пункта 8);

0,1 – перерасчет результата в г/100 г.

11. Возможно, что величины, полученные в результате данного межлабораторного теста, смогут быть применимы только для указанных здесь диапазонов концентрации и матриц. Величины для повторяемости и воспроизводимости опираются на результаты межлабораторного теста, проведенного согласно SM SR ISO 5725-1.

1) Повторяемость

Абсолютная разница между двумя отдельными результатами анализа, полученными по одному и тому же методу с использованием одинакового материала для анализа в одинаковых лабораториях одними и теми же аналитиками при использовании одинакового оборудования, не превышает более 5% случаев, ХХХ (что следует проверить совместными опытами).

2) Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя отдельными результатами анализа, полученными по одному и тому же методу с использованием одинакового материала для анализа в различных лабораториях различными аналитиками при использовании различного оборудования, не превышает более 5% случаев, 0,5 г/100 г (что следует проверить совместными опытами).

Приложение № 11

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Обнаружение сухой сыворотки в сухом обезжиренном молоке

государственного резерва путем высокоэффективной

жидкостной хроматографии казеиномакропептидов (ВЭЖХ)

1. Данный метод позволяет обнаруживать сухую сыворотку в обезжиренном сухом молоке государственного резерва путем хроматографии казеиномакропептидов.

2. Под содержанием сухой сыворотки подразумевается массовая доля в процентах казеиномакропептидов, содержание которых было определено с применением описанного метода.

3. Принцип метода обнаружения сухой сыворотки в обезжиренном сухом молоке государственного резерва путем хроматографии казеиномакропептидов, состоящий из:

1) восстановления обезжиренного сухого молока в теплой воде, удаление жиров и протеинов при помощи трихлоруксусной кислоты с последующим центрифугированием или фильтрацией;

2) определение содержания казеиномакропептидов (КМП) в жидкой фракции путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);

3) оценка результатов путем сравнения с эталонными пробами из обезжиренного сухого молока, без или с добавлением известной доли сухой сыворотки.

4. Все применяемые реактивы должны использоваться для анализа в чистом виде. Следует использовать дистиллированную воду или эквивалентную воду с неменьшей степенью чистоты.

1) Раствор трихлоруксусной кислоты

240 г трихлоруксусной кислоты (CCl 3 COOH) растворяются в воде, после чего раствор дополняется водой до достижения количества 1000 мл. Раствор должен быть прозрачным и бесцветным.

2) Растворитель для вымывания, pH 6,0

1,74 г дифосфата калия (K 2 HPO 4 ), 12,37 g монофосфата калия (KH 2 PO 4 ) и 21,41 г сульфата натрия (Na 2 SO 4 ) растворяются приблизительно в 700 мл воды. В случае необходимости, уровень рН корректируется при помощи раствора фосфорной кислоты или гидроксида калия до 6,0.

Раствор дополняется водой до достижения 1000 мл и гомогенизируется.

Состав растворителя для вымывания может быть изменен таким образом, чтобы соблюдались требования, указанные в сертификате, эталонных растворов, или рекомендации производителя к упаковочному материалу колонки.

Раствор для вымывания фильтруется перед применением через мембранный фильтр с величиной пор 0,45 мкм.

3) Раствор для промывки

Одна часть ацетонитрила (CH 3 CN) смешивается с 9 частями воды, перед применением раствор фильтруется через мембранный фильтр с величиной пор 0,45 мкм.

Можно использовать любой другой раствор для промывки с бактерицидным действием, не сказывающийся отрицательно на разделяющей способности колонок.

3) Эталонные пробы

a) обезжиренное сухое молоко, отвечающее требованиям настоящего постановления (соответственно [0]);

b) то же сухое обезжиренное молоко, фальсифицированное путем добавления 5% (м/м) сухой сыворотки среднего состава (соответственно [5]).

5. Лабораторное оборудование:

1) аналитические весы;

2) по желанию, центрифуга с силой центрифугирования 2200 г, оборудования с центрифугальными трубками с заглушкой или колпаком емкостью 50 мл;

3) механический встряхивающий механизм;

4) магнитная мешалка;

5) стеклянная воронка диаметром примерно 7 см;

6) фильтровальная бумага, средняя скорость фильтрования диаметром примерно 12,5 см;

7) стеклянный фильтровальный механизм с мембранным фильтром с диаметром пор 0,45 мкм;

8) мерные пипетки, номинальный объем 10 мл или система пипетирования, при помощи которой за 2 минуты можно перенести объем в 10,0 мл;

9) питающая система для отдачи 20,0 мл воды с температурой примерно 50°;

10) водяная баня, регулируемая термостатом на 25 ± 0,5°C;

11) оборудование для ВЭЖХ включает в себя:

a) насос;

b) инжектор, ручной или автоматический, емкостью 15-30 мкл;

c) две колонки TSK 2000-SW в серии (длина 30 см, внутренний диаметр 0,75 см) или аналогичные колонки и предварительная колонка (3 см × 0,3 см), уплотненные с I 125 или материалом с аналогичной эффективностью;

d) печь с колонкой, регулируемой термостатом на 35 ± 1°C;

e) УФ – детектор с меняющейся длиной волны для проведения измерений при 205 нм с чувствительностью 0,008 A;

f) интегратор для измерения высоты пика.

Колонки могут использоваться и при комнатной температуре. В данном случае разделяющая способность несколько уменьшится. В этом случае температурные колебания во время серии анализов не должны превышать ± 5°С.

6. Пробы отбираются с соблюдением процедуры, описанной в стандарте SM SR EN ISO 707.

Пробы хранятся в условиях, гарантирующих их целостность и неизменяемость состава.

7. Процедура обнаружения сухой сыворотки в обезжиренном сухом молоке государственного резерва путем хроматографии казеиномакропептидов осуществляется следующим образом:

1) Приготовление пробы для анализа

Сухое молоко помещается в сосуд с герметической пробкой, емкость которого приблизительно в три раза превышает взятый объем сухого молока. Сосуд сразу же герметически закрывается. Сухое молоко основательно перемешивается путем многократного опрокидывания сосуда.

2) Навеска пробы

Взвешиваются 2,000 ± 0,001 г пробы в центрифугальной трубке или в подходящей закрывающейся емкости (50 мл).

3) Отделение жира и белков

a) Навеска пробы смешивается с 20,0 мл теплой воды (50°C). Порошок восстанавливается путем пятиминутного вращения на встряхивателе. Трубка помещается в водяную баню, где она оставляется при температуре 25°C.

b) В течение 2 минут при непрерывном помешивании магнитной мешалкой добавляются 10 мл трихлоруксусной кислоты, примерно 25°С.

c) 10 минут центрифугируется 2200 г или фильтруется через бумагу, первые 5 мл фильтрата следует удалить. Трубка помещается в водяную баню, где она оставляется на 60 минут.

4) Хроматографическое определение

a) Точно отмеренный объем 15-30 мкл жидкой фракции или фильтрата впрыскиваются в прибор для ВЭЖХ, при этом растворитель подается со скоростью течения 1,0 мл/мин.

В зависимости от внутреннего диаметра используемых колонок или в зависимости от инструкций производителя колонок можно использовать и другие скорости протекания.

На протяжении всего хроматографического анализа температура растворителя должна составлять 85°C, для того чтобы предотвратить образование газов в растворителе, а также нежелательный рост бактерий. Кроме того, можно применить и другие меры аналогичного действия.

Во время каждого перерыва колонки промываются водой. Растворитель никогда не должен оставаться в колонках.

Перед каждым перерывом длительностью более 24 часов, колонки ополаскиваются водой и промываются раствором в течение не менее 3 часов при скорости течения 0,2 мл/мин.

b) Результаты хроматографического анализа проб [E] получают в форме хроматограммы, на которой каждый пик идентифицируется за счет своего времени удержания RT:

Пик II

Второй пик хроматограммы c временем удержания RT примерно 12,5 минут

Пик III

Третий пик хроматограммы (соответственно CMP), c временем удержания RT примерно 15,5 минут

Выбор колонки (колонок) может отразиться на времени удержания различных пиков в порядке значимости.

Интегратор рассчитывает автоматически площадь А отдельных пиков.

A II :

площадь пика II

A III :

площадь пика III

Прежде чем приступать к количественной интерпретации, необходимо изучить внешний вид хроматограммы, для того чтобы определить возможные аномалии, обусловленные неисправностью прибора или колонок либо видом и происхождением анализируемых проб.

В случае возникновения сомнений, анализ следует повторить.

5) Калибровка

a) Для эталонных проб в точности применяется процедура, описанная в подпунктах 2)–4) настоящего пункта.

Необходимо использовать свежие приготовленные растворы, поскольку CMP расщепляются в среде 8% трихлоруксусной кислоты. Потеря оценивается при температуре 30°C до 0,2% в час.

b) Перед каждым хроматографическим определением проб необходимо предварительно обработать колонки путем повторного впрыскивания эталонного раствора (литера а) настоящего подпункта) до тех пор, пока площадь пика и время удержания для CMP не станут константными.

c) Определяется калибровочный коэффициент R после впрыскивания такого же объема фильтрата, как и в случае проб (литера а) настоящего подпункта).

8. Представление результатов осуществляется следующим образом:

1) Метод и формула расчета

a) Расчет калибровочного коэффициента R:

Пик II:

R II = 100/(A II [0])

где:

R II – калибровочный коэффициент для пика II;

A II [0] – площади пиков II в эталонных пробах [0], полученных согласно литере c) подпункта 5) пункта 7.

Пик III:

R III = W/(A III [5] – A III [0])

где:

R III – калибровочный коэффициент для пика III;

A III [0] и A III [5] – площади пика III в эталонных пробах [0] и, соответственно, [5], полученных согласно литере c) подпункта 5) пункта 7;

W – количество сыворотки в эталонной пробе [5], соответственно 5.

b) Расчет относительных площадей пиков пробы [E]

S II [E] = R II × A II [E]

S III [E] = R III × A III [E]

S IV [E] = R IV × A IV [E]

где:

S II [E], S III [E], S IV [E] – относительные площади пиков II, III и, соответственно, IV в пробе [E];

A II [E], A III [E] – площади пиков II и, соответственно, IV в пробе [E], полученной согласно литере b) подпункта 4) пункта 7;

R II , R III – калибровочные факторы, рассчитанные согласно литере a) настоящего подпункта.

c) Расчет относительного времени удержания для пика III пробы [E]:

RRT III [E] = (RT III [E])/(RT III [5]),

где:

RRT III [E] – относительное время удержания пика III в пробе [E];

RT III [E] – относительное время удержания пика III в пробе [E], полученной согласно литере b) подпункта 4) пункта 7;

RT III [5] – относительное время удержания пика III в контрольном образце [5], полученном согласно литере c) подпункта 5) пункта 7.

d) Существует линейная зависимость между временем удержания пика III, соответственно RRT III [E], и добавленным количеством сухой молочной сыворотки до концентрации 10%.

- RRT III [E] составляет < 1,000, если содержание сыворотки > 5%;

- RRT III [E] составляет ≥ 1,000, если содержание сыворотки ≤ 5%.

Возможный допуск для параметров RRT III составляет ± 0,002.

Как правило, величина RRT III [0] практически не отклоняется от 1,034. В зависимости от состояния колонок, данная величина может приближаться к 1,000, при этом она должна быть всегда больше этой величины.

2) Расчет содержания сухой молочной сыворотки в пробе:

W = S III [E] – [1,3 + (S III [0] – 0,9)],

где:

W – процентное содержание м/м сыворотки в пробе [E];

S III [E] – относительная площадь пика III в анализируемой пробе [E], полученной согласно литере b) подпункта 1) настоящего пункта;

1,3 – относительная средняя площадь пика III, выраженная в граммах молочной сыворотки на 100 g, определенная в нефальсифицированном сухом молоке различного происхождения. Данная величина была определена экспериментальным путем;

S III [0] – относительная площадь пика III, равная R III × A III [0]. Данные величины были получены при использовании методов, описанных в литере a) подпункта 1) настоящего пункта и, соответственно, в литере c) подпункта 5) пункта 7;

(S III [0] – 0,9) – коррекция средней относительной площади 1,3, в случае если S III [0] не равна 0,9. В экспериментальном порядке была установлена относительная средняя площадь пика III в контрольном образце [0], равная 0,9.

3) Точность метода

a) Повторяемость

Разница между результатами двух исследований, выполненных одновременно или сразу же один за другим, одним и тем же аналитиком, с использованием одних и тех же приборов, на том же анализируемом материале, не должна превышать массовую долю 0,2% м/м.

b) Воспроизводимость

Разница между двумя отдельными и независимыми результатами, полученными двумя аналитиками, работающими в разных лабораториях, на идентичном материале, не должна превышать 0,4% (м/м).

9. Предполагается, что сыворотка отсутствует при условии, что относительная площадь пика III, S III [E], выраженная в граммах сыворотки на 100 г продукта, составляет ≤ 2,0 + (S III [0] – 0,9), где

2,0 – максимально допустимая величина относительной площади пика III, с учетом относительной площади пика III, соответственно 1,3, а также с учетом неуверенности и воспроизводимости метода, обусловленными колебаниями в составе сухого молока (литера b) подпункта 3) пункта 8);

(S III [0] – 0,9) – необходимая коррекция в случае, если площадь S III [0] не равна 0,9 (подпункт 2) пункта 8).

Если относительная площадь пика III, S III [E] > 2,0 + (S III [0] – 0,9) и относительная площадь пика II, S II [E] ≤ 160, необходимо определить содержание молочной сыворотки по методу, описанному в подпункте 2) пункта 8.

Если относительная площадь пика III, S III [E] > 2,0 + (S III [0] – 0,9) и относительная площадь пика II, S II [E] ≤ 160, необходимо определить содержание общего белка (P%); после чего оценка результатов проводится согласно рисункам 1 и 2.

1) Непрерывная прямая линия показывает линейную регрессию, коэффициенты которой рассчитываются по методу наименьших квадратов.

Прямая пунктирная линия определяет верхний предел относительной площади пика III с вероятностью, что данный предел не превышается в 90% всех случаев.

Уравнения пунктирных прямых линий на рисунках 1 и 2 выглядят следующим образом:

S III = 0,376 P % – 10,7 (рисунок 1);

S III = 0,0123 S II [E] + 0,93 (рисунок 2);

и, соответственно, где:

S III – относительная площадь пика III, рассчитанная на основании содержания общего белка или на основании относительной площади пика S II [E];

P % – содержание общего белка в процентах по весу;

S II [E] – относительная площадь пробы, рассчитанной согласно литере b) подпункта 1) пункта 8.

Расстояние (T 1 и T 2 ) между определенной относительной площадью S III [E] и относительной площадью S III рассчитывается по следующим формулам: T 1 = S III [E] – [(0,376 P % – 10,7) + (S III [0] – 0,9)]T 2 = S III [E] – [(0,0123 S II [E] + 0,93) + (S III [0] – 0,9)].

2) Если T 1 и/или T 2 равны нулю или меньше нуля, невозможно обнаружить присутствие молочной сыворотки.

Если T 1 и T 2 больше нуля, проба содержит молочную сыворотку.

Содержание молочной сыворотки рассчитывается по формуле: W = T 2 + 0,91, где: 0,91 – расстояние между непрерывной прямой и пунктирной прямой по вертикальной оси.

Приложение № 12

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Определение сухой сыворотки в обезжиренном сухом молоке и в смесях,

содержащих обезжиренное сухое молоко и, по необходимости, жиры,

витамины, минеральные соли, сахарозу, антикоагулянты и/или

разжижающие средства и прочие вещества, в частности,

антиоксиданты и эмульгаторы

1. Под содержанием сухой молочной сыворотки подразумевается согласно данному методу массовая доля казеинмакропептидов в процентах.

2. Содержание казеинмакропептидов определяется согласно приложению № 11. Пробы с положительным результатом, в целях обнаружения казеинмакропептидов A, подвергаются анализу путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (ВЭЖХ). В качестве альтернативного решения пробы подвергаются сразу же анализу ВЭЖХ с обращенной фазой. Оценка результатов проводится путем сравнения с эталонными пробами из обезжиренного сухого молока с содержанием сыворотки и без сыворотки. Считается, что сухая сыворотка была обнаружена, если массовая доля превышает 1% (м/м).

3. Все реактивы используются для анализа в чистом виде. Следует использовать дистиллированную воду или воду с не меньшей степенью чистоты. Чистота ацетонитрила должна соответствовать требованиям спектроскопии или качества ВЭЖХ.

Реактивы, необходимые для проведения данной процедуры, перечислены в приложении № 11 к настоящей методологии.

Реактивы для ВЭЖХ с обращенной фазой.

1) Раствор трихлоруксусной кислоты

2) Растворитель для вымывания A и B

Растворитель для вымывания A: в мерную колбу емкостью 1000 мл помещаются 150 мл ацетонитрила (CH 3 CN), 20 мл изопропанола (CH 3 CHOHCH 3 ) и 1,00 мл трифторуксусной кислоты (TFA, CF 3 COOH). После чего колба дополняется водой до отметки 1000 мл.

Растворитель B: в мерную колбу емкостью 1000 мл помещаются 550 мл ацетонитрила, 20 мл изопропанола и 1,00 мл трифторуксусной кислоты. После чего колба дополняется водой до отметки 1000 мл. Растворитель фильтруется перед использованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

3) Хранение колонки

После проведения анализов колонка ополаскивается растворителем В (через градиент), а затем ацетонитрилом (30 минут, также через градиент). После этого колонка хранится в ацетонитриле.

4) Эталонные пробы

a) Сухое молоко, соответствующее требованиям государственного резерва (соответственно [0]).

b) То же сухое молоко, фальсифицированное путем добавления 5% (м/м) сухой сыворотки со средним составом (соответственно [5]).

c) То же сухое молоко, фальсифицированное путем добавления 50% (м/м) сухой сыворотки со средним составом (соответственно [50]).

4. Оборудование, необходимое для проведения данной процедуры, описано в приложении № 11 к настоящей методологии.

1) аналитические весы;

2) по желанию: центрифуга с силой центрифугирования 2200 г, оборудованная центрифугальными трубками с заглушкой или колпаком, емкостью приблизительно 50 мл;

3) механический встряхивающий механизм;

4) магнитная мешалка;

5) стеклянная воронка диаметром, примерно, 7 см;

6) фильтровальная бумага, средняя скорость фильтрования с диаметром примерно 12,5 см;

7) стеклянный фильтровальный механизм с мембранным фильтром с диаметром пор 0,45 мкм;

8) мерные пипетки, номинальный объем 10 мл, или система пипетирования, при помощи которой за 2 минуты можно перенести объем в 10,0 мл;

9) питающая система для отдачи 20,0 мл воды с температурой, примерно, 50°;

10) водяная баня, регулируемая термостатом на 25 ± 0,5°C;

11) оборудование для ВЭЖХ включает в себя:

a) систему насосов для бинарных градиентов;

b) инжектор, ручной или автоматический, емкостью 100 мкл;

c) колонка Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (длина 25 см, внутренний диаметр 0,46 см) или колонка с обращенной фазой с такой же величиной пор, на основе силикагеля;

d) печь с колонкой, регулируемой термостатом на 35 ± 1°C;

e) УФ детектор с меняющейся длиной волны для проведения измерений при 210 нм (при необходимости, можно использовать и длины волн до 220 нм) с чувствительностью 0,02 Å;

f) интегратор, при помощи которого можно провести интеграцию на общей основной линии или от впадины до впадины.

Колонка может использоваться и при комнатной температуре, при условии, что температура колеблется максимально на 1°C. В противном случае время удержания для CMPA сильно изменяется.

5. Отбор проб осуществляется в соответствии с процедурой, описанной в стандарте SM SR EN ISO 707.

Проба должна храниться в условиях, гарантирующих ее целостность и неизменность состава.

6. Процедура определений сухой сыворотки в обезжиренном сухом молоке и в смесях, содержащих обезжиренное сухое молоко и, по необходимости, жиры, витамины, минеральные соли, сахарозу, антикоагулянты и/или разжижающие средства и прочие вещества, в частности антиоксиданты и эмульгаторы, осуществляется следующим образом:

1) Приготовление пробы для анализа

2) Навеска пробы

Взвешиваются 2,000 ± 0,001 г пробы в центрифугальной трубке или в подходящей закрывающейся емкости (50 мл).

В случае смесей взвешивается количество пробы для анализа, в котором масса обезжиренной навески пробы составляла бы 2,00 г.

3) Отделение жира и белка

a) навеска пробы смешивается с 20,0 мл теплой воды (50°C). Порошок растворяется путем пятиминутного помешивания механической мешалкой, а в случае кислой пахты – в течение 30 минут. Трубка помещается в водяную баню, где она оставляется при температуре 25°C;

b) 10,0 мл раствора трихлоруксусной кислоты равномерно добавляются при температуре 25°C в течение двух минут, интенсивно перемешиваясь при помощи магнитной мешалки. Трубка помещается в водяную баню, где она оставляется на 60 минут;

c) в условиях 2200 г центрифугируются в течение 10 минут, а затем фильтруются через фильтровальную бумагу, при этом первые 5 мл фильтрата следует выбросить.

4) Хроматографическое определение

a) проводится анализ ВЭЖХ согласно процедуре, описанной в приложении № 11. В случае получения отрицательного результата, анализируемая проба не содержит сухой сыворотки. В случае получения положительного результата, проводится ВЭЖХ с обращенной фазой, описанной ниже. В качестве альтернативного решения может сразу же проводиться ВЭЖХ с обращенной фазой. Части кислой сухой пахты могут дать в случае применения метода, описанного в приложении № 1, ложноположительные результаты. В случае ВЭЖХ с обращенной фазой это исключено;

b) до проведения анализа ВЭЖХ с обращенной фазой необходимо оптимизировать условия градиентов. Время удержания CMP A , равное 26 ± 2 минуты, является оптимальным для систем градиентов с мертвым объемом, примерно 6 мл (объем, начиная с места, в котором встречаются растворители, до объема петли инжектора включительно). В случае систем градиентов с меньшим мертвым объемом (например, 2 мл) оптимальное время удержания составляет 22 минуты.

Анализу подвергаются растворы эталонных проб, не содержащие сыворотку, а также эталонных проб с 50% содержанием сыворотки.

Впрыскиваются 100 мкл жидкой фракции или фильтрата в аппарат ВЭЖХ, работающий в условиях, описанных в таблице 1.

Таблица 1

Условия градиентов во время анализа для

оптимального хроматографического определения

Время

(мин)

Проток

(мл/мин)

% A

% B

Кривая

Исходное

1,0

линейная

1,0

линейная

1,0

линейная

1,0

линейная

В процессе сравнения обеих хроматограмм необходимо определить длину пика CMP A .

При помощи следующей формулы можно рассчитать начальный состав растворителя, используемого для нормального градиента

% B = 10 – 2,5 + [13,5 + (RT cmpA – 26) / 6] × 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RT cmpA – 26) / 6) × 1,11,

где:

RT cmpA – время удержания CMP A в тестовом градиенте;

10 – исходный % B тестового градиента;

2,5 – % B на половине времени действия, за вычетом % B при запуске в нормальном градиенте;

13,5 – половина времени действия тестового градиента;

26 – необходимое время удержания для CMP A ;

6 – соотношение подъемов тестового градиента и нормального градиента;

30 – % B в начале минус % B по истечении 27 минут в тестовом градиенте;

27 – время действия тестового градиента.

c) Анализ растворов тестовых проб

Точно 100 мкл жидкой фракции или фильтрата (литера с) подпункта 3) настоящего пункта) впрыскиваются в аппарат ВЭЖХ, в который вводится растворитель для вымывания со скоростью 1,0 мл/минута.

Состав растворителя для вымывания в начале анализа был описан в литере b) подпункта 4) пункта 6 настоящего приложения. Как правило, он соответствует соотношению A:B = 76:24. Сразу же после впрыскивания образуется линейный градиент, который после 27 минут выдает процентное содержание В на 5% и выше. После этого начинается градиент, в котором состав растворителя для вымывания в течение 5 минут настраивается на 90% В. Данный состав остается неизменным в течение 5 минут, после чего в течение следующих 5 минут в виде линейного градиента он понижается до первоначального состава. В зависимости от вместимости насосной системы, следующее впрыскивание может быть проведено через 15 минут после достижения исходных условий.

Время удержания CMP A должно составлять 26 ± 2 минуты. Эта величина может быть получена путем изменения исходных и конечных условий первого градиента. Разница в процентах В в начале и в конце градиента должна составлять в каждом случае 5% В.

Растворители для вымывания должны быть дегазированы и поддерживаться и дальше в этом состоянии. Это очень важно для безупречной работы градиентной насосной системы. Стандартное отклонение времени удержания для пика CMP A должно составлять менее 0,1 минуты (n = 10).

Для каждой пятой пробы впрыскивается эталонная проба и вновь определяется калибровочный фактор R (подпункта 1) пункта 8).

d) На хроматограмме анализируемой пробы (E) время удержания пика CMP A составляет примерно 26 минут.

Интегратор рассчитывает автоматически высоту H пика CMP A . Длина основной линии проверяется для каждой хроматограммы. В случае неправильного положения основной линии, необходимо провести повторно анализ или интеграцию.

Если пик CMP A достаточно отграничен от остальных пиков, необходимо провести распределение согласно основной линии от впадины до впадины. Вертикали следует отметить на общей основной линии, которая должна начинаться вблизи от пика CMP A . Для эталонного раствора и испытываемых растворов необходимо использовать один и тот же тип интеграции. В случае общей основной линии, необходимо проверить консистенцию отдельных проб и эталонного раствора.

Для количественного определения необходимо в обязательном порядке проверять хроматограммы на беспорядочность, которая может быть вызвана нарушением в работе оборудования, соответственно, колонки, или по причине происхождения или типа анализируемых проб. В случае возникновения сомнений, анализ следует повторить.

5) Калибровка

a) эталонные пробы подвергаются процедурам, описанным в подпунктах 2)-4) пункта 6. Необходимо использовать свежие приготовленные растворы, поскольку CMP расщепляется в 8% трихлоруксусной кислоты при комнатной температуре. При температуре 4°C раствор может храниться в течение 24 часов. В случае продолжительных серий испытаний рекомендуется использовать охлажденную чашу в автоматическом пробоотборнике.

Литера b) подпункта 4) пункта 7 может быть опущена, если из предыдущих анализов известно процентное содержание В в начале анализа.

b) Перед хроматографическим определением проб необходимо впрыснуть 100 мкл эталонной пробы, не содержащей сыворотку [0].

На хроматограмме не должно появиться ни одного пика для времени удержания пика CMP A .

c) Калибровочный коэффициент определяется после впрыскивания такого же количества фильтрата, как и в случае проб (литера а) настоящего подпункта).

7. Представление результатов осуществляется следующим образом:

1) Метод и формула расчета

Расчет калибровочного коэффициента R:

Пик CMP A : R = W/H,

где:

R – калибровочный коэффициент пика CMP A ;

H – высота пика CMP A ;

W – содержание сыворотки в эталонной пробе.

2) Расчет содержания сухой сыворотки в пробе в процентах

W(E) = R × H(E),

где:

W(E) – массовая доля в процентах (м/м) сухой сыворотки в пробе (E);

R – калибровочный коэффициент пика CMP A (подпункт 1);

H(E) – высота пика CMP A пробы (E).

В случае если W(E) больше 1% и разница между соответствующим временем удержания и временем удержания эталонной пробы составляет меньше 0,2 минуты, в данном случае проба содержит сухую сыворотку.

3) Точность метода

a) Повторяемость

b) Воспроизводимость

Не определена.

c) Линейность

В диапазоне с 0 до 16% содержания сухой сыворотки должна присутствовать линейность при коэффициенте корреляции > 0,99.

Приложение № 13

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Обезжиренное сухое молоко: количественное определение

фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина

Метод: ВЭЖХ с обращенной фазой.

1. Данный метод описывает процедуру количественного определения фосфатидилсерина (PS) и фосфатидилэтаноламина (PE) в обезжиренном сухом молоке и подходит для обнаружения твердых веществ пахты в обезжиренном сухом молоке.

2. Содержание PS + PE представляет массовую долю вещества, определенную при помощи метода, описанного в настоящем приложении. Результат выражается в миллиграммах дипалмитоила фосфатидилэтаноламина (PEDP) на 100 г порошка.

3. Экстракция аминофосфолипидов из восстановленного сухого молока при помощи метанола. Определения PS и PE в качестве производного о-фтальдиальдегида (OPA) путем ВЭЖХ с обращенной фазой (RP) и путем флуоресцентной детекции. Квантификация содержания PS и PE в анализируемой пробе при помощи эталонной пробы с известным содержанием PEDP.

4. Все реактивы используются для анализа в чистом виде. Необходимо использовать дистиллированную воду или воду, как минимум, с такой же степенью чистоты, если не предусмотрено иное.

1) Эталонный материал: PEDP, со степенью чистоты не менее 99%

Эталонный материал хранится при температуре 18°C.

2) Реактивы для приготовления эталонных и испытываемых проб

а) метанол, по качеству пригодный для ВЭЖХ;

b) хлороформ, по качеству пригодный для ВЭЖХ;

c) моногидрохлорид триптамина;

3) Реактивы для получения производных продуктов о-фтальдиальдегида

a) гидроксид натрия, водный раствор 12 M;

b) борная кислота, водный раствор 0,4 M, отрегулированный при помощи гидроксида натрия до уровня pH 10,0;

c) 2-меркаптоэтанол;

d) o-фтальдиальдегид (OPA);

4) растворы для вымывания ВЭЖХ

a) растворы для вымывания приготавливаются использованием реактивов, по качеству пригодных для ВЭЖХ;

b) вода, пригодная по качеству для ВЭЖХ;

c) метанол для флуоресцентного измерения чистоты;

d) тетрагидрофуран;

e) дигидрогенфосфат натрия;

f) ацетат натрия;

g) уксусная кислота.

5. Лабораторное оборудование:

1) аналитические весы с точностью измерения 1 мг, деление 0,1 мг;

2) химические стаканы емкостью 25 и 100 мл;

3) пипетки емкостью 1 и 10 мл;

4) магнитная мешалка;

5) мерные пипетки емкостью 0,2, 0,5 и 5 мл;

6) мерные колбы емкостью 10, 50 и 100 мл;

7) шприцы емкостью 20 и 10 мкл;

8) ультразвуковая ванна;

9) центрифуга с центробежной силой 27000 × г;

10) стеклянные бутылочки емкостью примерно 5 мл;

11) мерный цилиндр емкостью 25 мл;

12) измерительный аппарат рН с точностью до 0,1 единицы рН;

13) оборудование для ВЭЖХ;

a) градиентный насос, мощность накачки 1,0 мл/мин при 200 бар;

b) автоматический пробоотборник с функцией дериватизации;

c) обогрев колонки для регулирования температуры колонки на 30°C ± 1°C;

d) флуоресцентный измерительный прибор, диапазон измерения 330 нм, диапазон эмиссии 440 нм;

e) интегратор или программное обеспечение для обработки данных для измерения площадей пиков;

f) лихросфер – 100 колонка (250 × 4,6 мм) или аналогичная колонка, заполненная октадецилсиланом с величиной частиц 5 мкм.

6. Отбор проб осуществляется в соответствии со стандартом SM SR EN ISO 707.

7. Процедура количественного определения фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина в обезжиренном сухом молоке осуществляется следующим образом:

1) Приготовление внутреннего эталонного раствора

a) в мерной колбе емкостью 100 мл взвешиваются 30,0 ± 0,1 мг моногидрохлорида триптамина, после чего колба заполняется до максимальной отметки метанолом;

b) 1 мл полученного раствора отбирается пипеткой и помещается в мерную колбу емкостью 10 мл, после чего колба заполняется метанолом до максимальной отметки для того чтобы получить концентрацию триптамина 0,15 мМ.

2) Приготовление пробы для анализа

a) в химическом стакане емкостью 25 мл взвешивается 1,000 ± 0,001 г пробы обезжиренного сухого молока. При помощи пипетки добавляются 10 мл дистиллированной воды, нагретой до температуры 40°C ± 1°C. Все содержимое перемешивается в течение 30 минут для того чтобы растворились возможные комочки;

b) после этого в мерную колбу емкостью 10 мл при помощи пипетки помещаются 0,2 мл восстановленного молока и при помощи шприца 10 мкл раствора триптамина с концентрацией 0,15 мМ, после чего колба до максимальной отметки заполняется метанолом. Раствор тщательно перемешивается путем опрокидывания колбы и обрабатывается ультразвуком в течение 15 минут;

c) после этого раствор центрифугируется в течение 10 минут в центрифуге при 27000 г × г, и жидкая фракция отбирается в стеклянную бутылочку.

Раствор для испытания хранится при температуре 4°C до проведения ВЭЖХ.

3) Приготовления постороннего эталонного раствора

a) в мерной колбе емкостью 50 мл взвешиваются 55,4 г PEDP, затем при помощи мерного цилиндра добавляются 25 мл хлороформа. Закрытая наглухо колба нагревается до температуры 50°C ± 1°C. Все содержимое тщательно перемешивается до тех пор, пока PEDP не растворится. После этого колба охлаждается до температуры 20°C и дополняется до максимальной отметки метанолом. Все содержимое перемешивается путем опрокидывания колбы;

b) при помощи пипетки 1 мл данного раствора помещается в мерную колбу емкостью 100 мл, после чего колба до максимальной отметки дополняется метанолом. При помощи пипетки 1 мл полученного раствора помещается в мерную колбу емкостью 10 мл, смешивается с 100 мкл раствора триптамина с концентрацией 0,15 мМ (подпункт 1) настоящего пункта), после чего колба дополняется метанолом до максимальной отметки. Раствор перемешивается путем опрокидывания колбы.

Эталонный раствор хранится при температуре 4°C до проведения анализа ВЭЖХ.

4) Приготовление реактива для дериватизации

25,0 ± 0,1 мг ОРА помещаются в мерную колбу емкостью 10 мл, перемешиваются с 0,5 мл метанола и тщательно перемешиваются до полного растворения ОРА. После этого колба заполняется до максимальной отметки раствором борной кислоты. При помощи шприца добавляются 20 мкл 2-меркаптоэтанола.

Реактив для дериватизации может храниться в течение 1 недели при температуре 4°C, оставаясь при этом стабильным.

5) Определение путем ВЭЖХ

a) Растворители для вымывания

Растворитель A: Дигидрогенфосфат натрия с концентрацией 0,3 мМ и раствор ацетата натрия с концентрацией 3 мМ (отрегулированный при помощи уксусной кислоты до уровня pH 6,5 ± 0,1): метанол: тетрагидрофуран = 558:440:2 (v/v/v).

Растворитель B: метанол.

b) Рекомендуемый градиент для вымывания:

Время (мин)

Растворитель

A (%)

Растворитель

B (%)

Протекание

(мл/мин)

Изначально

0,1

5,0

0,1

6,0

1,0

6,5

1,0

9,0

1,0

10,0

1,0

11,5

1,0

12,0

1,0

16,0

1,0

19,0

100

1,0

20,0

100

1,0

21,0

1,0

29,0

1,0

30,0

При определенных обстоятельствах может понадобиться незначительное изменение градиента вымывания, с тем чтобы получить разрешение, показанное на рисунке 1.

Температура колонки: 30°C.

c) Впрыскиваемый объем: 50 мкл реактива для дериватизации и 50 мкл испытываемого раствора

d) Уравновешивание колонки

Если колонка каждый день запускается заново, ее необходимо промывать в течение 15 минут растворителем В (100%), а затем в соотношении A:B = 40:60, после чего колонка приводится в равновесие при скорости протекания 1 мл/мин в течение 15 минут. После этого колонка работает вхолостую при впрыскивании метанола.

Прежде чем закрыть колонку на длительное хранение, ее необходимо промыть в течение 30 минут смесью из метанола и хлороформа в соотношении 80:20 (в/в).

e) Определение содержания PS + PE в анализируемой пробе.

f) Хроматографические анализы проводятся в соответствующей последовательности, при этом интервалы между прохождениями должны оставаться константными для того, чтобы получить константное время удержания. Посторонний эталонный раствор впрыскивается через каждые 5-10 анализируемых растворов для того, чтобы можно было оценить калибровочный коэффициент.

Примерно через 20-25 прохождений колонку следует промыть в течение 30 минут при помощи 100% раствора В (литера а) настоящего подпункта).

6) Режим интеграции

a) Пик PEDP

PEDP вымывается в качестве отдельного пика. Площадь пика определяется при помощи интеграции от углубления до углубления.

b) Пик триптамина

Триптамин вымывается в качестве отдельного пика (рисунок 1). Площадь пика определяется при помощи интеграции от углубления до углубления.

c) Группы пиков PS и PE

В описанных выше условиях (рисунок 1) PS выдает два частично разделенных основных пика, которым предшествует один меньший пик. PE выдает три частично разделенных пика. Общая площадь соответствующего пучка пиков определяется путем проведения основной линии, как это показано на рисунке 1.

Рисунок 1. Результат ВЭЖХ для производных продуктов ОРА фосфатидилсирина (PS)

и фосфатидилэтаноламина (PE) в экстракте метанола из

восстановленного обезжиренного сухого молока

8. Содержание PS и PE в анализируемой пробе рассчитывается по следующей формуле:

C = 55,36 × [(A 2 )/(A 1 )] × [(T 1 )/(T 2 )],

где:

C – содержание PS или PE (мг/г порошка) в анализируемой пробе;

A 1 – площадь пика PEDP в эталонном растворе (подпункт 3) пункта 7);

A 2 – площадь пика PS или PE в испытываемом растворе (подпункт 2) пункта 7);

T 1 – площадь пика триптамина в эталонном растворе (подпункт 3) пункта 7);

T 2 – площадь пика триптамина в испытываемом растворе (подпункт 2) пункта 7).

9. Точность метода получается из величины для повторяемости и воспроизводимости:

1) Повторяемость

Относительное отклонение повторяемости выражает изменчивость результатов, полученных одним и тем же аналитиком при использовании одинаковых приборов в одинаковых условиях с одной и той же пробой за короткий временной интервал, независимо друг от друга. При этом не должна быть превышена относительная величина в 2%. В случае проведения двух определений в данных условиях, относительная разница между обоими результатами не должна превышать 6% среднего арифметического результата.

2) Воспроизводимость

В случае проведения двух определений аналитиками в различных лабораториях при использовании различных приборов в разных условиях с разными испытываемыми пробами, относительная разница между обоими результатами не должна превышать 11% среднего арифметического результата.

Приложение № 14

к Методологии анализа и количественной

оценки молока и молочных продуктов

Обнаружение остатков антимикробиотиков

в обезжиренном сухом молоке

Используется тест-система для скрининга ингибитора для антимикробиотиков при использовании Geobacillus stearothermophilus var. calidolactis в качестве исследуемого организма, который отличается достаточной чувствительностью для того, чтобы обнаружить 4 мкг бензинпенициллина на кг молока и 100 мкг сульфонамидов на кг молока. Можно использовать доступные в продаже тесты, если они достаточно чувствительны к бензинпенициллину и сульфонамиду.

Для анализа используется восстановленное обезжиренное сухое молоко (1 г порошка + 9 мл дистиллированной воды). Тест проводится в соответствии со стандартом SM ISO/TS 26844:2015 или в соответствии с инструкциями производителя теста.

Положительные результаты интерпретируются следующим образом:

1. Наличие в-лактамов может быть обнаружено путем повторения теста при добавлении пенициллиназы в тест-систему.

Отрицательный результат: ингибитор является бета-лактам-антибиотиком.

Положительный результат: ингибитор не может быть обнаружен в результате данной процедуры, следовательно, переходим к шагу 2.

2. Наличие сульфонамидов может быть обнаружено путем повторения теста при добавлении р-аминобензойной кислоты в тест-систему.

Отрицательный результат: ингибитор является сульфонамидом.

Положительный результат: ингибитор не может быть обнаружен в результате данной процедуры, следовательно, переходим к шагу 3.

3. Присутствие одновременно бета-лактамов и сульфонамида можно обнаружить, если повторить тест при добавлении пенициллиназы + р-аминобензойной кислоты в тест-систему.

Отрицательный результат: ингибиторы являются бета-лактамным антибиотиком и сульфонамидом.

Положительный результат: ингибитор не может быть обнаружен в результате данной процедуры.

Приложение № 15

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Определение содержания обезжиренного сухого молока

в комбинированных кормах путем ферментативного

свертывания параказеина

1. Цель метода состоит в количественном определении содержания обезжиренного сухого молока в комбинированных кормах путем ферментативного свертывания параказеина.

2. Данный метод применяется для комбинированных кормов, содержание обезжиренного сухого молока в которых составляет не менее 10%. Присутствие большего количества пахты и/или определенных белков немолочного происхождения может привести к возникновению помех.

3. Принцип метода заключается в:

1) растворении казеина, содержащегося в комбинированном корме, при помощи экстракции при использовании раствора цитрата натрия;

2) получении необходимой концентрации ионов кальция для осаждения казеина путем добавления сычужного фермента;

3) содержание азота в выпавшем в осадок параказеине определяется по методу Кьельдаля, как он описан в стандарте SM EN ISO 8968-1:2014; содержание обезжиренного сухого молока рассчитывается на основании не менее 27,5% содержания казеина (пункт 8).

4. Все реактивы, используемые в целях проведения анализа, должны обладать необходимой степенью чистоты. Необходимо использовать дистиллированную воду или воду с аналогичной степенью чистоты. За исключением сычужного фермента, все используемые реактивы и растворы не должны содержать вещества, содержащие азот.

1) Тринатрий цитрат (раствор 1% м/в)

2) Хлорид кальция (раствор с концентрацией примерно 5 М)

75 г CaCl 2 · 2 H 2 O растворяются в 100 мл дистиллированной воды путем встряхивания (внимание: экзотермическая реакция). Раствор оставляется на ночь, после чего фильтруется. Раствор следует хранить в холодильнике.

3) Гидроксид натрия 0,1 N

4) Хлорводородная кислота 0,1 N

5) Жидкий телячий сычужный фермент (концентрация, примерно, 100 IMCU/мл). Раствор необходимо хранить в холодильнике при температуре от 4-6°C.

6) Реактивы для количественного определения азота по методу Кьельдаля, как он описан в стандарте SM EN ISO 8968-1:2014.

5. Стандартное лабораторное оборудование, содержащее:

1) ступка или машина для гомогенизации;

2) аналитические весы с точностью в 1 мг с делением 0,1 мг;

3) настольная центрифуга (500 г или 2000-3000 оборотов/мин) с трубками емкостью 50 мл и 2000 г;

4) магнитная мешалка (10-15 мм) со штоками;

5) химические стаканы емкостью 150-200 мл;

6) колбы емкостью 250 и 500 мл;

7) стеклянная воронка диаметром 60-80 мм;

8) беззольный фильтр для быстрого фильтрования диаметром 150 мм;

9) пипетки разного размера;

10) водяная баня с термостатом, регулируемая до температуры 37°C ± 1°C;

11) аппарат для измерения рН с точностью до 0,1 единиц;

12) термометры с точностью до 1°C.

6. Процедура определения содержания обезжиренного сухого молока в комбинированных кормах путем ферментативного свертывания параказеина осуществляется следующим образом:

1) Приготовление пробы

Размельчаются в ступке или обрабатываются в машине для гомогенизации от 10 до 20 г пробы, до получения однородной смеси.

2) Сухое молоко растворяется, а нерастворившийся остаток отделяется:

a) 1,000 ± 0,002 г гомогенизированного комбинированного корма взвешивается непосредственно в центрифугальной трубке емкостью 50 мл. 30 мл раствора тринатрий цитрата нагреваются до температуры 45°C ± 2°C и добавляются в трубку. Раствор перемешивается в течение не менее 5 минут при помощи магнитной мешалки, а затем хорошо встряхивается рукой;

b) пробы центрифугируются в течение 10 минут при 500 г (2000-3000 оборотов/мин), после чего жидкая фракция сливается в химический стакан емкостью от 150 до 200 мл. При сливании необходимо следить за тем, чтобы материал не утерялся;

c) тем же методом проводятся еще две экстракции из остатка. Оба новых экстракта добавляются к первому экстракту;

d) в случае осаждения жира, пробу необходимо охладить до затвердения жировой фазы, после чего затвердевший жир удаляется при помощи шпателя.

3) Свертывание казеина под воздействием сычужных ферментов

a) при постоянном помешивании 2 мл хлорида кальция добавляются покапельно к общему водному экстракту (примерно 100 мл). Уровень рН регулируется при помощи раствора NaOH или HCl до 6,4-6,5. Раствор оставляется на 15-20 минут на водяной бане с термостатом, настроенной на 37°C ± 1°C, до тех пор, пока не наступит солевое равновесие. Если раствор приобрел молочный вид, равновесие наступило;

b) жидкость переносится в одну (или две) центрифугальные трубки и центрифугируется в течение 10 минут при 2000 г, для того чтобы удалить осадки. Жидкая фракция сливается в одну (или две) центрифугальные трубки, без вымывания осадка;

c) жидкая фракция нагревается вновь до температуры 37°C ± 1°C. При постоянном помешивании в экстракции покапельно добавляется 0,5 мл сычужного фермента. Свертывание происходит в течение двух минут;

d) проба вновь помещается в водяную баню и оставляется там на 15 минут при температуре 37°C ± 1°C. Проба извлекается из бани, и коагулят измельчается путем помешивания. Проба центрифугируется в течение 10 минут при 2000 г. Жидкая фракция фильтруется через подходящую фильтровальную бумагу, и фильтровальная бумага сохраняется. Осадок промывается путем перемешивания в центрифугальной трубке 50 мл воды при температуре 35°C.

Еще раз проба центрифугируется в течение 10 минут при 2000 г. Жидкая фракция фильтруется через сохраненную фильтровальную бумагу.

4) Определение содержания азота в казеине

После промывания осадок при помощи дистиллированной воды пропускается через фильтровальную бумагу, сохраненную согласно литере d) подпункта 3) пункта 6). Фильтровальная бумага помещается в колбу Кьельдаля. Содержание азота определяется по методу Кьельдаля, как он описан в стандарте SM EN ISO 8968-1:2014.

7. Регулярно проводится холостой опыт, в ходе которого проба минерализируется по методу Кьельдаля, как он описан в стандарте SM EN ISO 8968-1:2014. Беззольная фильтровальная бумага увлажняется смесью из 90 мл цитрата натрия, 2 мл раствора хлорида кальция и 0,5 мл жидкого сычужного фермента, после чего три раза промывается по 15 мл дистиллированной воды.

Объем кислоты, необходимый для проведения холостого опыта, необходимо вычесть из объема, использованного для титрации пробы.

8. Содержание обезжиренного сухого молока в комбинированном корме рассчитывается по следующей формуле:

где:

N – процентное содержание азота в параказеине;

27,5 – коэффициент для пересчета установленного казеина на сухое обезжиренное молоко в процентах;

2,81 и 0,908 – коррекционные коэффициенты, полученные из регрессионного анализа.

9. Точность метода получается из величины для повторяемости и воспроизводимости:

1) Повторяемость

Разница между двумя отдельными результатами, полученными при использовании одной и той же пробы, в одной лаборатории одним и тем же аналитиком, не должна превышать 2,3 г обезжиренного сухого молока на 100 г проверенного комбикорма.

2) Воспроизводимость

По крайней мере, в 95% изученных случаев разница между двумя результатами, полученными двумя лабораториями при использовании одной и той же пробы, не должна превышать 6,5 г обезжиренного сухого молока на 100 г проверенного комбикорма.

10. Во время процедуры могут возникнуть следующие ситуации:

1) добавление большего количества определенных посторонних белков, в частности соевых белков, если они нагреваются вместе с обезжиренным сухим молоком, может дать в результате завышенные показатели, поскольку эти вещества оседают одновременно с молочным параказеином;

2) добавление пахты может дать в результате заниженные показатели, поскольку при определении учитывается только обезжиренная часть. Добавление определенных видов пахты, полученных из кислых сливок, может дать в результате существенно заниженные показатели, поскольку они растворяются не полностью в растворе цитрата;

3) добавление 0,5% или более лецитина может также привести к получению заниженных результатов;

4) использование обезжиренного сухого молока, нагретого до высокой температуры, может привести к получению завышенных результатов, поскольку определенные молочные белки оседают в осадок вместе с параказеином молока.

Приложение № 16

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Обнаружение крахмала в обезжиренном сухом молоке,

денатурированном сухом молоке и комбикорме

1. Данный метод описывает процедуры по обнаружению крахмала в качестве маркера в денатурированном сухом молоке.

Предел обнаружения по данному методу составляет примерно 0,05 г крахмала на 100 г пробы.

2. Процедура основывается на йодометрической реакции:

1) фиксация свободного йода коллоидами в водном растворе;

2) абсорбция мицеллами йода и окрашивание.

3. Используемые реактивы:

Раствора йода

1) йод – 1,0 г;

2) йодид калия – 2,0 г;

3) дистиллированная вода – 100 мл.

1,0 г йода и 2,0 г йодида калия растворяются в воде в мерной колбе емкостью 100 мл, после чего колба дополняется водой до отметки 100 мл, и весь раствор перемешивается.

4. Лабораторное оборудование:

1) аналитические весы;

2) кипящая водяная баня;

3) пробирка 25 мм × 200 мм.

5. 1,0 г пробы взвешивается с точностью до 0,1 г в пробирке.

Навеска пробы смешивается с 20 мл дистиллированной воды и растворяется путем встряхивания.

Пробирка помещается в кипящую водяную баню и оставляется там на пять минут.

Проба вынимается из водяной бани и охлаждается при комнатной температуре.

Добавляется 0,5 мл раствора йода, после чего проба встряхивается и оценивается цвет.

6. Окрашивание в синий цвет свидетельствует о наличии природного крахмала в пробе.

В случае если проба содержит модифицированный крахмал, может получиться другой цвет, не обязательно синий.

7. В зависимости от происхождения природного крахмала (например, кукурузный или картофельный) и от вида модифицированного крахмала, цвет, насыщенность цвета и вид под микроскопом могут отличаться. В случае присутствия модифицированного крахмала, происходит окрашивание в фиолетовый, красный или коричневый цвет, в зависимости от степени модифицирования кристаллической структуры природного крахмала.

Приложение № 17

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Определение содержания влаги в сухих сливках

1. Настоящее приложение описывает процедуру по определению содержания влаги в сухих сливках.

2. Содержание влаги представляет потерю массы, выявленную по методу, описанному в настоящей методологии. Оно выражается в массовой доле.

3. Навеска пробы высушивается при температуре 102 ± 2°C до получения константой массы, для определения потери массы.

4. Стандартное лабораторное оборудование, в частности:

1) аналитические весы с точностью измерения 1 мг, с делением 0,1 мг;

2) печь, хорошо проветриваемая, регулируемая термостатом до температуры 102 ± 2°C во всей рабочей зоне;

3) эксикатор, предусмотренный со свежим высушенным силикагелем с индикатором влажности или с любым другим эффективным сиккативом;

4) чаши с плоским дном, глубиной примерно 25 мм, диаметром примерно 50 мм, из подходящего материала (например, стекло, нержавеющая сталь, никель или алюминий), с хорошо усаживающейся и легко снимающейся крышкой;

5) бутылки с герметически закрывающимися пробками для перемешивания лабораторных проб.

5. Важно, чтобы лаборатория получила пробу для испытания, которая действительно является репрезентативной и которая не была повреждена во время транспортировки или хранения.

Отбор проб не является частью метода, описанного в настоящей методологии. В стандарте SM SR EN ISO 707 описан метод, рекомендуемый для отбора проб.

Пробы следует хранить таким образом, чтобы исключить разрешение или изменение их состава.

6. Проба для анализа основательно перемешивается путем многократного встряхивания и опрокидывания емкости с пробой (при необходимости, после переноса всех проб для анализа в герметичный сосуд достаточной емкости для осуществления данной процедуры).

В случае если таким образом не удается добиться полной однородности смеси, необходимо использовать (для двух отдельных определений) две навески приготовленных проб для анализа, взятых из двух точек, расположенных как можно дальше друг от друга.

7. Процедура определения содержания влаги в сухих сливках осуществляется следующим образом:

1) Приготовление чаши

a) Чаша без крышки и соответствующая крышка нагреваются в течение не менее одного часа в печи при температуре 102 ± 2°C.

b) Крышка устанавливается на чашу, и закрытая чаша помещается в эксикатор. После этого чаша должна охладиться до температуры помещения, в котором установлены весы. Чаша взвешивается с точностью до 1 мг, и результат регистрируется с точностью до 0,1 мг.

2) Навеска пробы

Примерно от 1 до 3 г приготовленной пробы для анализа помещаются в чашу. Крышка закрывается. Чаша взвешивается с точностью до 1 мг, и результат регистрируется с точностью до 0,1 мг.

3) Определение

a) Крышка снимается, и чаша вместе с соответствующей крышкой помещается на 2 часа в печь, нагретую до температуры 102 ± 2°C.

b) Крышка вновь устанавливается на чашу, и закрытая чаша помещается в эксикатор. После этого чаша охлаждается до температуры помещения, в котором установлены весы. Чаша взвешивается с точностью до 1 мг, и результат регистрируется с точностью до 0,1 мг.

c) Крышка чаши открывается, и чаша вместе с соответствующей крышкой нагревается еще раз в течение 1 часа в печи. Затем повторяется шаг, описанный в литере b) настоящего подпункта.

d) Таким образом, чаша продолжает нагреваться и взвешиваться до тех пор, пока масса после повторного взвешивания не будет отличаться от предыдущего взвешивания на более чем на 1 мг в большую или меньшую сторону.

Для расчета используется наименьшая из зарегистрированных масс.

8. Содержание влаги, выраженное в г/100 г, определяется следующим образом:

где:

m 0 – масса чаши и крышки, выраженная в граммах (литера b подпункта 1) пункта 7);

m 1 – масса чаши, крышки и навески пробы перед сушкой, выраженная в граммах (подпункт 2) пункта 7);

m 2 – масса чаши, крышки и навески пробы после сушки, выраженная в граммах (литера d) подпункта 3) пункта 7).

Результат протоколируется с точностью до двух десятых после запятой.

9. Точность метода получается из величины для повторяемости и воспроизводимости:

1) Повторяемость

Абсолютная разница между результатами двух отдельных, не зависящих друг от друга испытаний, полученными одним и тем же методом при использовании одинакового испытываемого материала, в одной и той же лаборатории, одним и тем же аналитиком, при использовании одного и того же оборудования, в течение короткого промежутка времени, должна составлять не более 5% случаев 0,20 г влажности на 100 г продукта.

2) Воспроизводимость

Абсолютная разница между результатами двух отдельных проб, полученными одним и тем же методом при использовании идентичного материала для анализа в разных лабораториях разными аналитиками и при использовании различного оборудования, должна составлять не более 5% случаев 0,40 г влажности на 100 г продукта.

10. Протокол анализа включает следующие данные:

1) все данные, необходимые для определения пробы;

2) использованный метод по отбору проб, если он известен;

3) использованный метод проверки, со ссылкой на настоящий международный стандарт;

4) все рабочие условия, не указанные в настоящем международном стандарте, или которые расцениваются как факультативные, а также подробные сведения по всем инцидентам, которые могли бы повлиять на результаты испытания;

5) полученный(е) результат(ы) испытания, и, в случае, если проверяется повторяемость, полученный конечный результат, указанный ранее.

Приложение № 18

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Определение содержания влажности в кислой сухой пахте

1. Настоящее приложение описывает процедуру по определению содержания воды в кислой сухой пахте, предназначенной для корма.

2. Проба высушивается в вакууме, и потеря массы определяется путем взвешивания.

3. Лабораторное оборудование:

1) аналитические весы с точностью измерения до 1 мг, деление 0,1 мг;

2) чаши из металла, устойчивого к коррозии, или из стекла, с герметически закрывающейся крышкой, на полезной площади которых проба может быть распределена таким образом, чтобы примерно 0,3 г располагались на 1 см 2 ;

3) регулируемая вакуумная печь с электрическим подогревом с масляным насосом и механизмом для подачи горячего воздуха, высушиваемого в башне, наполненной, например, оксидом кальция или сульфатом кальция (с указателем влажности);

4) эксикатор с действенным сиккативом;

5) печь с термостатом с вентиляцией 102 ± 2°C.

4. Чаша вместе с крышкой нагревается в печи в течение не менее 1 часа. После установления крышки чаша помещается сразу же в эксикатор. Чаша вынимается и охлаждается до комнатной температуры, затем чаша взвешивается с точностью до 1 мг, и результат регистрируется с точностью до 0,1 мг.

Чаша открывается, и в чашу помещаются примерно 5 г пробы. Чаша взвешивается с допуском в 1 мг с точностью до 0,1 мг, и результат регистрируется. Чаша вместе с крышкой помещается в вакуумную печь и нагревается до температуры 83°C. Для того чтобы воспрепятствовать чрезмерному снижению температуры печи, чашу необходимо поместить в печь как можно быстрее.

Давление повышается до 100 торр (13,3 кПа). Проба высушивается при этом давлении в печи в горячем сухом воздухе до тех пор, пока потеря массы не прекратится (примерно в течение 4 часов).

Продолжительность сушки исчисляется с момента, когда температура в печи достигла вновь отметки в 83°C. Давление в печи необходимо осторожно вновь снизить до уровня атмосферного давления. После открытия печи чаша сразу же закрывается и вынимается из печи. Чаша помещается в эксикатор на 30-45 минут. Затем чаша взвешивается с точностью до 1 мг, и результат протоколируется с точностью до 0,1 мг. Проба высушивается еще раз в течение 30 минут при температуре 83°C в вакуумной печи и вновь взвешивается. Чаша нагревается и взвешивается так часто, пока масса при повторном взвешивании не будет отличаться от результата предыдущего взвешивания не более чем на 1 мг в большую или меньшую сторону. Для расчета необходимо взять наименьшую из зарегистрированных масс.

5. Расчет влажности:

% влажность = (m 1 – m 2 ) / (m 1 – m 0 ) × 100%,

где:

m 0 – масса чаши и крышки;

m 1 – масса чаши, крышки и навеска пробы перед сушкой;

m 2 – масса чаши, крышки и навеска пробы после сушки.

Результаты регистрируются с точностью до 0,1 г /100 г.

6. Точность метода получается из величины для повторяемости и воспроизводимости:

1) Предел повторяемости

Абсолютная разница результатов двух отдельных, не зависящих друг от друга испытаний, полученных одним и тем же методом при использовании одинакового испытываемого материала, в одной и той же лаборатории, одним и тем же аналитиком, при использовании одного и того же оборудования, в течение короткого промежутка времени, должна составлять в не более 5% случаев более 0,4 г воды на 100 г сухой пахты.

2) Предел воспроизводимости

Абсолютная разница результатов двух отдельных проб, полученных одним и тем же методом при использовании идентичного материала для анализа в разных лабораториях разными аналитиками и при использовании различного оборудования, должна составлять в не более 5% случаев более 0,6 г воды на 100 г кислой сухой пахты.

Приложение № 19

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Эталонный метод определения чистоты молочного жира

путем газового хроматографического анализа триглицеридов

1. Настоящая методология описывает эталонный метод по определению чистоты молочного жира при помощи газового хроматографического анализа триглицеридов. Могут быть обнаружены как жиры растительного, так и жиры животного происхождения, такие как говяжий жир, топленый жир.

При помощи определенных формул триглицеридов проверяется состав молочного жира. Данный метод применяется в основном для анализа сырого коровьего молока и продуктов, получаемых из сырого коровьего молока, независимо от условий кормления, выращивания и лактации. Только вскармливание чистыми растительными маслами в чрезмерно большом количестве (например, рапсовое масло), может привести к ложноположительным результатам. Молочные продукты некоторых коров также могут привести к ложноположительным результатам.

Данный метод применим в частности при исследовании жира, экстрагированного из молочных продуктов, содержащих чистый молочный жир с немодифицированным составом, например, сливочное масло, сливки, молоко или сухое молоко. Техническая обработка молочного жира, например, отделение холестерина или фракционирование, может привести к получению ложноположительных результатов. То же самое касается и молочного жира, полученного из обезжиренного молока или пахты. В случае жиров, экстрагированных из сыра, данный метод не всегда можно применять, поскольку процесс созревания изменяет состав жира таким образом, что в результате могут быть получены ложноположительные результаты.

Масляная кислота (н-масляная кислота) (С 4 ) встречается исключительно в молочном жире и позволяет провести количественную оценку более низкого до умеренного содержания молочного жира в жире растительного и животного происхождения. Однако по причине очень различных процентов содержания C 4 (массовая доля, примерно, от 3,1% и 3,8%) проблематично получить качественные и количественные данные по посторонним жирам, содержащимся в массовых фракциях чистого молочного жира в количестве до 20%.

Практически количественные результаты не могут на практике быть выведены из содержания стерина в жирах растительного происхождения, поскольку зависят от условий производства и обработки. Кроме того, качественное определение посторонних жиров со стерином не является однозначным.

2. Под содержанием чистоты молочного жира подразумевается отсутствие жиров растительного и животного происхождения, подтвержденное при помощи метода, описанного в настоящей методологии.

Чистота определяется при помощи величин S, рассчитываемых на основании состава триглицеридов. Массовые фракции триглицеридов выражаются в процентных долях.

3. Жир, экстрагированный из молока или молочных продуктов, анализируется путем газовой хроматографии в закупоренной колонке или в короткой капиллярной колонке, для определения триглицеридов (ТГ), различие которых проводится по общему числу атомов углерода. При введении массовых фракций (в процентных долях) молекул жира различных размеров (C 24 до C 54 , используя только четные числа) в соответствующих формулах триглицеридов рассчитываются значения S. Превышение значений S предельных величин, определенных для чистого молочного жира, свидетельствует о присутствии постороннего жира.

Значение S представляет собой сумму массовых фракций ТГ, умноженную на соответствующие условные коэффициенты.

4. Используемые реактивы:

1) газ-носитель: азот или как альтернатива гелий или водород, в любом случае с чистотой не менее 99,995%;

2) эталонные пробы жира для приготовления эталонной пробы молочного жира, согласно подпункту 3) пункта 7:

a) насыщенные эталонные триглицериды; соответствующие продукты можно найти в продаже;

b) эталонный раствор холестерина;

3) безводный метанол (CH 3 OH);

4) н-гексан (CH 3 (CH 2 )4CH 3 );

5) н-гептан (CH 3 (CH 2 )5CH 3 );

6) прочие газы: водород с чистотой не менее 99,995%, без органических загрязнений (C n H m < 1 мl/l); синтетический воздух, без органических загрязнений (C n H m < 1 мl/l);

7) безводный сульфат натрия (Na 2 SO 4 ).

5. Лабораторное оборудование:

1) Аппарат для высокотемпературной газовой хроматографии

Аппарат для высокотемпературной газовой хроматографии должен выдерживать температуру не менее 400°C и должен быть оборудован пламенно-ионизационным детектором. Перегородки, используемые в инжекторе, выдерживают высокую температуру и характеризуются очень малыми потерями. Если газовый хроматограф оборудован капиллярной трубой, следует использовать инжектор для колонки. Колонка, инжектор и/или насадки детектора (если имеются) должны соединяться при использовании графитовых уплотнителей.

2) Колонка хроматографа

a) Заполненная колонка

Для анализа используется стеклянная колонка с внутренним диаметром 2 мм и длиной 500 мм, заполненная стационарной фазой 13% OV-1 в стационарной фазе от 125 мкм до 150 мкм (от 100 до 120 ячеек сети) Gas ChromQ. Подготовка, силанизация, набивка и предварительная обработка заполненной колонки осуществляются в соответствии с инструкцией № 1.

В качестве альтернативы можно использовать капиллярную колонку.

b) Капиллярная колонка

Для анализа используется короткая капиллярная колонка например длиной 5 м, с неполярной стационарной фазой, выдерживающая температуру не менее 400°C. Колонка должна пройти предварительную обработку 20 анализами раствора молочного жира в течение от 2 до 3 дней при использовании настроек, указанных литере b) подпункта 4) пункта 9. В конечном итоге калибровочные коэффициенты должны составлять 1, и в любом случае не превышать 1,20.

Можно использовать колонки разных размеров, а также прочие неполярные фазы, устойчивые к воздействию высоких температур. при условии соблюдения настоящей методологии.

3) Колонка Extrelut емкостью 1–3 мл, заполненная силикагелем, используемая исключительно для экстракции молочного жира в соответствии с подпунктом 3) пункта 7.

4) Графитовые уплотнители, устойчивые к воздействию температуры не ниже 400°C, используемые для соединения колонки газового хроматографа, а также для соединения инжектора и/или насадок детектора.

5) Водяная баня, регулируемая для поддержания константной температуры 50°C ± 2°C.

6) Печь, регулируемая для поддержания константной температуры 50°C ± 2°C и 100°C ± 2°C.

7) мкл-пипетки.

8) Мерная пипетка емкостью 5 мл.

9) Колба с круглым дном, емкостью 50 мл.

10) Колба Эрленмейер с номинальным объемом 250 мл.

11) Воронка.

12) Фильтровальная бумага с мелкими порами.

13) Ротационный выпарной аппарат.

14) Ампулы с номинальным объемом 1 мл, оборудованные обжимной крышкой из алюминия с политетрафтор-этиленовым покрытием или закручивающейся крышкой.

15) Шприцы для впрыскивания, в которых поршень не достает до пика шприца (газовый хроматограф с заполненной колонкой).

При помощи данных шприцов обеспечивается лучшая повторяемость результатов.

16) Аналитические весы с точностью измерения до 1 мг, с возможностью деления 0,1 мг.

6. В лабораторию отправляется репрезентативная проба. Проба не должна повредиться или измениться во время транспортировки или хранения.

Отбор проб осуществляется в соответствии со стандартом SM SR EN ISO 707.

7. Проба для анализа приготавливает по одному из следующих трех методов экстракции молочного жира.

1) Отделение от сливочного масла и масляного жира

Растапливаются от 50 до 100 г пробы для анализа на водяной бане или в печи при температуре 50°C от 0,5 до 1,0 г сульфата натрия помещаются на фильтровальную бумагу. Колба Эрленмейер емкостью 250 мл и воронка с уложенной в ней фильтровальной бумагой нагреваются в печи. Печь должна быть установлена на температуру 50°C. После нагрева колба, воронка и установленная в ней фильтровальная бумага оставляются в печи. Там происходит фильтрование жирового слоя растопленной пробы. При этом необходимо следить за тем, чтобы не произошло переноса сыворотки.

Если в распоряжении имеется небольшое количество пробы, можно использовать меньшую пробу для анализа, отрегулировав соответствующим образом всю процедуру. При использовании меньшей навески пробы существует, однако, высокий риск того, что проба перестанет быть репрезентативной.

Сливочное масло может быть приготовлено из сливок путем взбивания и вымывания образующихся комочков.

Молочный жир, полученный по методу, описанному в настоящем пункте, практически не содержит фосфолипидов.

2) Экстракция по методу гравиметрического анализа по Резе-Готтлибу

Жировая фракция испытываемой пробы экстрагируется с применением метода гравиметрического анализа, описанного в одном из следующих стандартов: SM EN ISO 1211:2015, SM EN ISO 2450:2014 или SM EN ISO 7328.

Если полученный молочный жир содержит фосфолипиды, пик холестерина будет на 0,1% выше. Состав триглицеридов, стандартизированный на 100%, включая холестерин, пострадает в этом случае весьма незначительно.

3) Экстракция молока при помощи силикагелевой колонки

При помощи мкл-пипетки 0,7 мл испытываемой пробы, доведенной до температуры 20°C, помещается в колонку Extrelut емкостью от 1 до 3 мл. В течение примерно 5 минут проба распределяется равномерно по силикагелю.

Для денатурации белково-жировых комплексов при помощи мерной пипетки в колонку Extrelut добавляется 1,5 мл метанола. Затем при помощи 20 мл н-гексана жировая фракция экстрагируется из испытываемой пробы. H-гексан следует добавлять медленно в малом количестве. Стекший растворитель улавливается в колбу с круглым дном емкостью 50 мл, которая предварительно была высушена до получения константной известной массы. Масса взвешивается с точностью до 1 мг, а результат регистрируется с точностью до 0,1 мг.

После экстракции следует подождать, пока жидкость полностью не вытечет из колонки. Растворители дистиллируются из элюата в ротационном выпарном аппарате. Водяная баня выпарного аппарата устанавливается на температуру между 40 и 50°C. После того как растворители дистиллированы, колба с круглым дном высушивается. Затем колба взвешивается с точностью до 1 мг, а результат регистрируется с точностью до 0,1 мг. Определяется полученная масса жира, из которой вычитывается масса высушенной пустой колбы с круглым дном.

Экстракции жира по методам Гербера, Вейбулля-Бернтропа или Шмида-Бондзински-Ранцлаффа или осаждение молочного жира при помощи детергентов (метод BDI) не подходят для анализа ТГ, поскольку в случае данных методов в жировую фазу переходит большее количество частичных глицеридов и фосфолипидов. Соответственно настоящая методология может применяться ограниченно для определенных продуктов, в частности, в случае сыров.

8. Для газовой хроматографии с заполненной колонкой 5%-ный раствор жира, приготовленного согласно пункту 7, растворяется в н-гексане или н-гептане. В зависимости от размеров колонки, в случае использования заполненной колонки в сочетании с капиллярной колонкой, концентрация должна составлять не более 1% (0,53 мм, открытая трубка большого диаметра).

В зависимости от используемой колонки, а также от массы жира, полученного в соответствии с подпунктом 3) пункта 7, определяется количество растворителя, добавляемого в колбу к испытываемой пробе. Для этого анализа материал взвешивается с точностью до 1 мг, а результат регистрируется с точностью до 0,1 мг. Лишний материал необходимо полностью растворить.

Примерно 1 мл раствора пробы переносится в ампулу.

9. Хроматографическое определение триглицеридов происходит следующим образом:

1) Смещение основных линий

Для минимизации подъема основной линии колонка подготавливается согласно литере b) подпункта 2) пункта 5 (капиллярная колонка) или согласно инструкции № 1 (заполненная колонка).

По причине высокой температуры колонки, анализ ТГ является особенно чувствительным к подъему основной линии при высоких изотопных значениях углерода.

2) Техника впрыскивания

a) Заполненная колонка

Во избежание дискриминирующих эффектов и для получения лучших количественных результатов с компонентами триглицеридов с высокой температурой кипения, используется техника «горячего впрыскивания». Игла наполняется воздухом, при этом раствор жира набирается в шприц. Игла устанавливается в инжектор. Перед впрыскиванием игла нагревается в течение примерно 3 секунд. После этого быстро впрыскивается все содержимое шприца.

b) Капиллярная колонка

Если впрыскивание осуществляется при помощи системы холодного впрыскивания в колонку, игла шприца вводится, и содержимое шприца сразу же впрыскивается. Игла в отверстии инжектора удерживается до тех пор, пока не прекратится широкое размытие пика растворителя.

Как правило, оптимальное время удержания составляет примерно 3 секунды.

3) Калибровка

a) Краткое описание

Для калибровки испытываемых проб два или три раза анализируется молочный жир, стандартизованный в начале дня. На основании последнего анализа стандартизированного молочного жира определяются калибровочные коэффициенты (массовая фракция / фракция площади) ТГ и холестерина, которые затем используются для следующих проб для анализа (подпункт 1) пункта 11):

где:

w Si – массовая доля ТГ или холестерина в процентном выражении в стандартизированном молочном жире;

A Si – числовое значение площади пика отдельных ТГ или холестерина в стандартизированном молочном жире;

стандартизированный молочный жир с известным составом ТГ приготавливается в соответствии с литерой b) или c) настоящего подпункта.

b) Эталонная проба молочного жира, доступная в продаже

Калибровочный коэффициент отдельных компонентов испытываемой пробы определяется наилучшим образом при условии использования стандартизированного молочного жира с сертифицированным составом ТГ.

c) Лабораторная эталонная проба молочного жира

Приготавливается примерно 1 г эталонной смеси жира (подпункт 2) пункта 4). Для того чтобы получить состав ТГ, схожий с составом в молочном жире, используются насыщенные C 24 , C 30 , C 36 , C 42 , C 48 и C 54 , а также холестерин; предпочтительнее использовать C 50 и C 52 ). Масса определяется путем взвешивания с точностью до 1 мг, а результат регистрируется с точностью до 0,1 мг.

Раствор эталонной смеси жира анализируется несколько раз в н-гексане или н-гептане согласно подпункту 4) настоящего пункта. В соответствующей серии анализа необходимо также многократно анализировать молочный жир с приблизительным составом.

Определяются калибровочные коэффициенты ТГ эталонной смеси жира. Предварительные калибровочные коэффициенты ТГ, не содержащиеся в смеси, могут быть интерполированы математическим путем. Определенные калибровочные коэффициенты переносятся на молочный жир для получения стандартизированного состава. Полученный таким образом молочный жир может храниться при температуре не выше –18°C в азоте в течение нескольких лет.

4) Условия хроматографического анализа

Использование заполненных колонок или капиллярных колонок дает в результате, как правило, разрешение, показанное на рисунке 1. Распределение ТГ с четными изотопными числами, как правило, не происходит, и его следует избегать.

a) Заполненная колонка

Температурный режим: исходная температура печи устанавливается на 210°C. Данная температура поддерживается в течение 1 минуты. После этого температура повышается на 6°C/мин, до достижения 350°C. Данная (конечная) температура поддерживается в течение 5 минут.

Температура для детектора и инжектора: в обоих случаях температура устанавливается на 370°C.

Газ-носитель: азот подается при константной скорости протекания примерно 40 мл/мин. Поток газа-носителя регулируется таким образом, чтобы C 54 вымывался при температуре 341°C.

Продолжительность анализа – 29,3 мин.

Впрыскиваемый объем – впрыскивается 0,5 мкл 5% раствора пробы (фракция объема).

Если не проводится анализ ТГ, необходимо поддерживать исходную температуру в печи. В детекторе и инжекторе поддерживаются указанные температуры. Скорость протекания газа-носителя поддерживается на указанной высоте и на протяжении ночи, и в выходные дни. Таким образом, гарантируются оптимальные рабочие показатели колонки.

b) Капиллярная колонка

Температурный режим: исходная температура печи устанавливается на 80°C. Данная температура поддерживается в течение 0,5 мин. После этого температура сначала повышается на 50°C/мин до 190°C, а затем на 6°C/мин до 350°C. Данная (конечная) температура поддерживается в течение 5 минут.

Температура детектора устанавливается на 370°C.

Газ-носитель – используется азот с константной скоростью протекания приблизительно 3 мл/мин.

Продолжительность анализа – 34,4 мин.

Впрыскиваемый объем – впрыскивается 0,5 мкл 1% раствора пробы (фракция объема).

Данные настройки сохраняются и в режиме ожидания для того чтобы гарантировать оптимальные рабочие показатели системы (литера а) настоящего подпункта).

Настройки для проведения анализа, указанные в настоящем подпункте, подходят для колонки с большим внутренним диаметром (0,53 мм ID). В случае использования колонок другого размера или фаз необходимо, по возможности, отрегулировать настройки.

10. Пики хроматограммы оцениваются при помощи интеграционной системы, которая может составить основную линию и провести обратную интеграцию. На рисунке 1 показана правильно интегрированная хроматограмма. Хроматограмма на рисунке 2, напротив, демонстрирует спорадическую ошибку в основной линии C 54 , которая сказывается на процентном содержании всех ТГ. Пики, возникающие после C 54 , не учитываются в анализе.

Триглицериды с нечетным числом ацил-КоА (2n + 1) следует комбинировать с предшествующими ТГ с четными числом (2n). Низкое содержание C 56 не принимается во внимание. Процентные доли площадей остальных ТГ, включая холестерин, умножаются на соответствующие калибровочные коэффициенты стандартизированного молочного жира (последняя калибровка) и нормализуются в целом на 100% согласно подпункту 1) пункта 11.

Рисунок 1. Пример хроматограммы триглицеридов молочного жира

с правильной основной линией

Рисунок 2. Пример хроматограммы триглицеридов молочного жира

со смещенной основной линией

Для проверки условий проведения измерений необходимо сравнить значения с коэффициентами вариации различных ТГ, указанными в таблице 1. Коэффициенты основываются на 19 последовательных анализах одной и той же пробы молочного жира.

Если коэффициенты вариации существенно превышают значения, указанные в таблице 1, условия проведения хроматографического анализа считаются неадекватными.

Таблица 1

Коэффициенты вариации компонентов триглицеридов

(19 последовательных анализов)

Триглицерид

КВ%

C 24

10,00

C 26

2,69

C 28

3,03

C 30

1,76

C 32

1,03

C 34

0,79

C 36

0,25

C 38

0,42

C 40

0,20

C 42

0,26

C 44

0,34

C 46

0,37

C 48

0,53

C 50

0,38

C 52

0,54

C 54

0,60

Значения, указанные в таблице 1, не являются обязательными, а предлагают ориентировочные значения для контроля качества.

Даже если учитываются более высокие значения коэффициентов вариации, должны быть соблюдены пределы для повторяемости и воспроизводимости, указанные в пункте 12.

11. Результаты рассчитываются и выражаются следующим образом:

1) Состав триглицеридов

a) Расчет

Массовая фракция отдельных ТГ (для i = C 24 , C 26 , C 28 , C 30 , C 32 , C 34 , C 36 , C 38 , C 40 , C 42 , C 44 , C 46 , C 48 , C 50 , C 52 , и C 54 ) и холестерина, w i , выраженная в процентах от общего содержания ТГ в испытываемой пробе, и рассчитывается по следующей формуле:

где:

A i – числовое значение площади пика отдельных ТГ в испытываемой пробе;

RF si – калибровочный коэффициент отдельных ТГ в испытываемой пробе (подпункт 3) пункта 9).

b) Представление результатов анализа

Результаты указываются с точностью до двух десятых.

2) Значения S

a) Расчет

Значения S в процентном выражении рассчитываются путем введения W i (литера а) подпункт 1) настоящего пункта), для вычисления соответствующих процентных долей ТГ в формулах (3)-(7). Необходимо использовать все формулы, независимо от типа предполагаемых посторонних жиров.

Формулы для соевого масла, подсолнечного масла, оливкового масла, рапсового масла, льняного масла, масла из зародышей пшеничного зерна, кукурузного масла, хлопкового масла и рыбьего жира

S = 2,098 3 · w C30 + 0,728 8 · w C34 + 0,692 7 · w C36 + 0,635 3 · w C38 + 3,745 2 · w C40 – 1,292 9 · w C42 + 1,354 4 · w C44 + 1,701 3 · w C46 + 2,528 3 · w C50 (3)

Кокосовое и пальмоядровое масло

S = 3,745 3 · w C32 + 1,113 4 · w C36 + 1,364 8 · w C38 + 2,154 4 · w C42 + 0,427 3 · w C44 + 0,580 9 · w C46 + 1,292 6 · w C48 + 1,030 6 · w C50 + 0,995 3 · w C52 + 1,239 6 · w C54 (4)

Пальмовое масло и говяжий жир

S = 3,664 4 · w C28 + 5,229 7 · w C30 – 12,507 3 · w C32 + 4,428 5 · w C34 – 0,201 0 · w C36 + 1,279 1 · w C38 + 6,743 3 · w C40 – 4,271 4 · w C42 + 6,373 9 · w C46 (5)

Топленое сало

S = 6,512 5 · w C26 + 1,205 2 · w C32 + 1,733 6 · w C34 + 1,755 7 · w C36 + 2,232 5 · w C42 + 2,800 6 · w C46 + 2,543 2 · w C52 + 0,989 2 · w C54 (6)

Всего

S = – 2,757 5 · w C26 + 6,407 7 · w C28 + 5,543 7 · w C30 – 15,324 7 · w C32 + 6,260 0 · w C34 + 8,010 8 · w C40 – 5,033 6 · w C42 + 0,635 6 · w C44 + 6,017 1 · w C46 (7)

b) Представление результатов анализа

Результаты анализа указываются с точностью до двух десятых.

3) Выявление посторонних жиров

Пять значений S, полученных согласно литере а) подпункта 2) настоящего пункта, сравниваются с соответствующими значениями S, представленными в таблице 2.

Таблица 2

Предельные значения S для чистых молочных жиров

Посторонний жир

Формула

Предельные значения S ( 1 )

Соевое масло, подсолнечное масло, оливковое масло, рапсовое масло, льняное масло, масло из зародышей пшеничного зерна, кукурузное масло, хлопковое масло и рыбий жир

(3)

98,05–101,95

Кокосовое и пальмоядровое масло

(4)

99,42–100,58

Пальмовое масло и говяжий жир

(5)

95,90–104,10

Топленое сало

(6)

97,96–102,04

Всего

(7)

95,68–104,32

( 1 ) Рассчитано с соблюдением доверительного интервала 99%, таким образом, добавление посторонних жиров указывается только, если пределы, выявленные соответствующими формулами (таблица 1), превышены.

Считается, что анализируемая проба является чистым жиром, если все пять значений S находятся в диапазоне максимальных пределов, указанных в таблице 2. Если одно значение S превышает соответствующие максимальные пределы, предполагается, что проба содержит посторонний жир.

При помощи некоторых формул (3)-(6), определенные посторонние жиры могут быть обнаружены проще, чем при использовании формулы для общего содержания жира (7) (таблица 1). Положительный результат, полученный по одной из формул (3)-(6), не позволяет, однако, сделать вывод о типе постороннего жира.

Инструкция № 2 представляет процедуру расчета содержания жира растительного или животного происхождения в сфальсифицированном молочном жире. Данная процедура не была официально подтверждена и поэтому разъясняется для общего сведения.

12. Точность метода получается из величины для повторяемости и воспроизводимости:

1) Межлабораторный анализ

Значения для повторяемости и вопроизводимости были получены при помощи формул (3)-(7) для чистого молочного жира и не могут применяться для других матриц, чем те, что указаны здесь.

2) Повторяемость

Абсолютная разница результатов двух отдельных испытаний, полученных одним и тем же методом при использовании одинакового испытываемого материала, в одной и той же лаборатории, одним и тем же аналитиком, при использовании одного и того же оборудования, в течение короткого промежутка времени, не должна превышать в не более 5% случаях предельные значения, указанные в таблице 3.

Таблица 3

Предельные значения для повторяемости, r,

рассчитанные по формулам (3)-(7)

Посторонний жир

Формула

r %

(3)

0,67

Кокосовое и пальмоядровое масло

(4)

0,12

Пальмовое масло и говяжий жир

(5)

1,20

Топленое сало

(6)

0,58

Всего

(7)

1,49

3) Воспроизводимость

Абсолютная разница результатов двух отдельных проб, полученных одним и тем же методом при использовании идентичного материала для анализа в разных лабораториях разными аналитиками и при использовании различного оборудования, не должна превышать в более 5% случаев предельные значения, указанные в таблице 4.

Таблица 4

Предельные значения для воспроизводимости, R,

рассчитанные по формулам (3) – (7)

Посторонний жир

Формула

R %

(3)

1,08

Кокосовое и пальмоядровое масло

(4)

0,40

Пальмовое масло и говяжий жир

(5)

1,81

Топленое сало

(6)

0,60

Всего

(7)

2,07

13. Исходя из повторяемости, r, и воспроизводимости, R, может быть рассчитана расширенная погрешность измерения значения S.

Учет расширенной погрешности (на основании двойных анализов) в случае предельных значений S, указанных в таблице 2, приводит к расширенным предельным значениям S. Данные расширенные значения представлены в таблице 5.

Таблица 5

Расширенные предельные значения S для чистого молочного

жира с учетом расширенной погрешности измерения

Посторонний жир

Формула

Расширенные

предельные

значения S

(3)

97,36–102,64

Кокосовое и пальмоядровое масло

(4)

99,14–100,86

Пальмовое масло и говяжий жир

(5)

94,77–105,23

Топленое сало

(6)

97,65–102,35

Всего

(7)

94,42–105,58

14. Протокол анализа включает следующие данные:

1) все данные, необходимые для определения пробы;

2) использованный метод по отбору проб (если он известен);

3) использованный метод проверки со ссылкой на данный международный стандарт;

4) все рабочие условия, не указанные в настоящем международном стандарте, или которые расцениваются как факультативные, а также подробные сведения обо всех инцидентах, которые могли бы повлиять на результаты испытания;

5) полученный(е) результат(ы) испытания, а также если проверяется повторяемость, полученный конечный результат.

Инструкция № 1

Приготовление заполненной колонки

1. Реактивы и оборудование, которые используются:

1) Толуол (C 6 H 5 CH 3 ).

2) Раствор диметилдихлорсилана [Si(CH 3 ) 2 Cl 2 ].

50 мл диметилдихлорсилана растворяются в 283 мл толуола.

3) Раствор масла-какао с массовой фракцией 5% масла-какао в н-гексане или н-гептане.

4) Стационарная фаза, 3-% OV-1 при 125 мкм до 150 мкм (от 100 до 120 ячеек сита) Gas ChromQ.

5) Стеклянная колонка, исходя из внутреннего диаметра 2 мм и длины 500 мм в форме U.

6) Оборудование для наполнения заполненной колонки:

a) наполняемая колонка с закручивающимися колпачками, с отметкой, до которой колонка заполняется стационарной фазой;

b) мелкое сито, размер ячеек 100 мкм, с закручивающимся колпачком для закрытия стеклянной колонки;

c) силанизированная стекловата, дезактивированная;

d) вибратор для равномерного распределения стационарной фазы при наполнении;

e) системы для силанизации стеклянной поверхности колонки;

f) бутыль Вульфа;

g) насос для отсоса воды.

2. После присоединения бутыли Вульфа к водоструйному насосу, шланг помещается в раствор диметилдихлорсилана. Колонка заполняется данным раствором, при этом запорный кран закрыт. После открытия запорного крана оба шланга вынимаются. Колонка закрепляется на станине. Затем колонка при помощи пипетки полностью заполняется раствором диметилдихлорсилана.

Рисунок 3. Система для силанизации (дезактивация

стеклянной поверхности колонки)

Пояснение:

1 – трубка 1;

2 – трубка 2;

3 – водоструйный насос;

4 – запорный кран;

5 – стеклянная колонка;

6 – диметилдихлорсилан и толуол.

Колонка остается в вертикальном положении в течение 20-30 минут. Затем бутыль Вульфа заменяется на колбу для отсасывания. Колонка опустошается будучи подключена к водоструйному насосу (рисунок 4). Пустая колонка промывается 75 мл толуола и 50 мл метанола путем погружения шланга 2 в растворитель. Промытая колонка сушится при температуре 100°C примерно в течение 30 минут.

Рисунок 4. Аппарат для промывания

Пояснение:

1 – трубка 1;

2 – трубка 2;

3 – водоструйный насос;

4 – колба для фильтрации;

5 – стеклянная колонка;

6 – промывочное средство.

3. Колонка наполняется при помощи аппарата, показанного на рисунке 5. Стационарная фаза заполняется в колонку для наполнения до отметки. Дно заполняемой стеклянной колонки закрывается пробкой длиной в 1 см из силанизированной и сжатой стекловаты. Колонка закрывается мелким ситом.

Рисунок 5. Заполнение стеклянной колонки

Пояснение:

1 – отверстие для поступления азота;

2 – колонка для наполнения, которая заполняется OV-1 до отметки;

3 – заполняемая стеклянная колонка;

4 – закручивающийся колпачок с фильтром, здесь ощущается давление, оказываемое стекловолокном и стационарной фазой.

Колонка заполняется стационарной фазой под давлением (300 кПА при подаче азота). Для получения однородного, равномерного и надежного заполнения необходимо вводить и вытаскивать вибратор в колонку. После заполнения на противоположном конце заполненной колонки устанавливается надежная пробка из силанизированной стекловаты. Лишний материал отрезается. Пробка вдавливается в колонку на несколько миллиметров при помощи шпателя.

4. Во избежание загрязнений, во время выполнения шагов (a)–(c), задний конец колонки не должен быть подключен к детектору. Заполненная колонка подвергается следующей предварительной обработке:

1) колонка промывается азотом в течение 15 минут, при скорости протекания 40 мл/минуту. Печь для газовой хроматографии устанавливается на температуру 50°C;

2) колонка нагревается на 1°C/мин до достижения 355°C, со скоростью протекания азота 10 мл/минут;

3) температура колонки поддерживается на уровне 355°C в течение 12-15 часов;

4) в колонку впрыскивается два раза 1 мкл раствора какао-масла, после чего необходимо соблюдать температурный режим, указанный в литере а) подпункта 4) пункта 9;

Масло-какао состоит практически полностью из кипящих C 50 до C 54 триглицеридов и сокращает таким образом необходимые усилия по предварительной обработке в колонке согласно соответствующим калибровочным коэффициентам;

5) в течение 2-3 дней двадцать раз впрыскивается 0,5 мкл раствора молочного жира, приготовленного согласно пункту 8, используя указания для заполненной колонки, согласно литере а) подпункта 4) пункта 9.

Для анализа испытываемых проб могут использоваться исключительно колонки с калибровочным коэффициентом приблизительно 1. Калибровочные коэффициенты не должны превышать 1,20.

Инструкция № 2

Квантификация содержания постороннего жира

1. В таблице 1 представлены предельные значения для обнаружения различных посторонних жиров, рассчитанные при доверительном интервале в 99%. В средней колонке указываются предельные значения, полученные по самой оптимальной формуле из формул (3)-(6).

Предельные значения для обнаружения, полученные по общей формуле (7), указанные в колонке справа, несколько выше. Как правило, формула (7) используется только для квантификации посторонних жиров.

При помощи всех формул могут быть обнаружены также комбинации различных посторонних жиров. Диапазоны колебаний триглицеридов в различных посторонних жирах одного типа не оказывают большого влияния на предельные значения для обнаружения.

Как в случае использования отдельных формул, так и при использовании общей формулы, необходимо соблюдать предельные значения отдельных формул. В определенных случаях для квантификации используется значение S общей формулы.

Таблица 6

Предельные значения для обнаружения добавления посторонних

жиров в молоко в процентном выражении (доверительный

интервал 99%)

Посторонний жир

Отдельная формула %

Общая формула %

Соевое масло

2,1

4,4

Подсолнечное масло

2,3

4,8

Оливковое масло

2,4

4,7

Кокосовое масло

3,5

4,3

Пальмовое масло

4,4

4,7

Пальмоядровое масло

4,6

5,9

Рапсовое масло

2,0

4,4

Льняное масло

2,0

4,0

Масло из зародышей пшеничного зерна

2,7

6,4

Масло из зародышей кукурузного зерна

2,2

4,5

Хлопковое масло

3,3

4,4

Топленое сало

2,7

4,7

Говяжий жир

5,2

5,4

Гидрированный рыбий жир

5,4

6,1

2. Количественное определение содержания постороннего жира осуществляется в том случае, если было превышено, как минимум, одно предельное значение S (таблица 2 или таблица 5). Для получения количественных данных массовая доля постороннего жира или смеси посторонних жиров, содержащаяся в анализируемой пробе, рассчитывается в процентном выражении wf, по следующей формуле:

S – результат, полученный по формулам (3)-(7), при использовании данных ТГ молочного жира, в который был добавлен посторонний жир или смесь посторонних жиров;

S f – константная величина, зависящая от типа добавленного постороннего жира.

Если не известен тип постороннего жира, добавленного в молочный жир, используется общее значение S f , равное 7,46 (таблица 7). Значение S, рассчитанное по формуле (7), используется и тогда, когда превышены не значения S данной формулы, а предельные значения другой формулы.

Если известны виды посторонних жиров, используются соответствующие значения S f , указанные в таблице 7, и вводятся в формулу (8). Для расчета значения S из формул (3)-(6) выбирается соответствующая форма молочного жира.

Таблица 7

Значения S f для различных посторонних жиров

Посторонний жир

S f

Не известен

7,46

Соевое масло

8,18

Подсолнечное масло

9,43

Оливковое масло

12,75

Кокосовое масло

118,13

Пальмовое масло

7,55

Пальмоядровое масло

112,32

Рапсовое масло

3,30

Льняное масло

4,44

Масло из зародышей пшеничного зерна

27,45

Масло из зародышей кукурузного зерна

9,29

Хлопковое масло

41,18

Топленое сало

177,55

Говяжий жир

17,56

Рыбий жир

64,12

3. Результаты анализа указываются с точностью до двух десятых.

Приложение № 20

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Процедура, применяемая в случае спорных результатов

(химический анализ)

1. На основании заявления производителя проводится еще один анализ в другой лаборатории, уполномоченной компетентным органом, с применением соответствующего метода, при условии, что имеются запечатанные дубликатные пробы продукта и что они хранятся в первой лаборатории, которая проводила тесты в адекватных условиях. Заявление подается в течение 7 рабочих дней после объявления результатов по первому анализу. Анализ проводится в течение 21 рабочего дня после подачи заявления. Первая лаборатория отправляет данные пробы, на основании заявления участника рынка и за его счет, во вторую лабораторию. Данная лаборатория должна быть уполномочена для проведения всех анализов и обладать компетенциями для их проведения.

2. Расширенная погрешность измерения (k = 2) среднего значения ӯ 1 для n 1 повторных измерений в лаборатории 1 и среднего значения ӯ 2 для n 2 повторных измерений в лаборатории 2:

и соответственно

где:

r – стандартное отклонение повторяемости: а

R – стандартное отклонение воспроизводимости соответствующего метода.

Если результат y измерения в лабораториях рассчитывается по формуле

y = x 1 + x 2 , y = x 1 – x 2 , y = x 1 · x 2 или y = x 1 /x 2 ,

в данных случаях необходимо соблюдать стандартные процедуры для комбинации стандартных отклонений, чтобы определить погрешность.

3. Чтобы проверить, находятся ли результаты обеих лабораторий для метода в диапазоне стандартного отклонения σ R для воспроизводимости, рассчитывается расширенная погрешность измерения разницы ӯ 1 – ӯ 2 :

4. Если абсолютное значение разницы средних значений |ӯ 1 – ӯ 2 |, полученных в лабораториях, не превышает погрешность

результаты обеих лабораторий соответствуют требованиям к отклонению r для воспроизводимости, а среднее арифметическое средних значений обеих лабораторий:

принимается за конечный результат. В данном случае расширенная погрешность измерения составляет:

Соответствующая партия бракуется, поскольку она не соответствует установленному законом максимально допустимому предельному значению UL, если

В противном случае считается, что партия соответствует UL.

Соответствующая партия бракуется, поскольку она не соответствует установленному законом минимальному предельному значению LL, если

В противном случае считается, что партия соответствует LL.

Если абсолютное значение разницы средних значений обеих лабораторий |ӯ 1 – ӯ 2 | превышает погрешность,

считается, что результаты обеих лабораторий не соблюдают требования стандартного отклонения для воспроизводимости.

В случае если второй анализ подтверждает первый, партия отклоняется как несоответствующая. В противном случае партия принимается как соответствующая.

Конечные результаты сообщаются лаборатории производителя как можно быстрее. Расходы по проведению второго анализа несет производитель только в том случае, если партия была отклонена.