Hotărâre nr. 232 din 10.04.2020

GUVERNUL REPUBLICII MOLDOVA

H O T Ă R Â R E

pentru aprobarea Normei sanitar-veterinare privind cerinţele de supraveghere

şi metodele de diagnostic al bolilor la animalele acvatice

nr. 232  din  10.04.2020

 (în vigoare 15.08.2020) 

Monitorul Oficial al R. Moldova nr. 115-117 art. 349 din 15.05.2020

* * *

În temeiul art.29 din Legea nr.221/2007 privind activitatea sanitar-veterinară (republicată în Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2013, nr.125-129, art.396), cu modificările ulterioare, Guvernul

HOTĂRĂŞTE:

Prezenta hotărâre transpune Decizia de punere în aplicare (UE) 2015/1554 a Comisiei din 11 septembrie 2015 de stabilire a unor norme pentru aplicarea Directivei 2006/88/CE în ceea ce priveşte cerinţele referitoare la supraveghere şi la metodele de diagnostic, publicată în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene L 247/1 din 23 septembrie 2015.

1. Se aprobă Norma sanitar-veterinară privind cerinţele de supraveghere şi metodele de diagnostic al bolilor la animalele acvatice (se anexează).

2. Controlul asupra executării prezentei hotărâri se pune în sarcina Agenţiei Naţionale pentru Siguranţa Alimentelor.

3. Prezenta hotărâre intră în vigoare la expirarea a 3 luni de la data publicării.

Aprobată

prin Hotărârea Guvernului nr.232/2020

NORMA SANITAR-VETERINARĂ

privind cerinţele de supraveghere şi metodele

de diagnostic al bolilor la animalele acvatice

Capitolul I

DISPOZIŢII GENERALE

1. Norma sanitar-veterinară privind cerinţele de supraveghere şi metodele de diagnostic al bolilor la animalele acvatice (în continuare – Normă sanitar-veterinară) stabileşte cerinţele aplicabile supravegherii sanitar-veterinare a bolilor la animale acvatice şi a metodelor de diagnostic care trebuie utilizate la determinarea prezenţei sau absenţei bolilor ca: septicemia hemoragică virală (SHV), necroza hematopoietică infecţioasă (NHI), boala herpetică a crapului koi (KHVD), anemia infecţioasă a somonului (AIS), infecţia cu Marteilia refringens, infecţia cu Bonamia ostreae, boala petelor albe (white spot disease – WSD), la animalele acvatice.

2. În sensul prezentei Norme sanitar-veterinare se aplică definiţiile indicate în Norma sanitar-veterinară privind condiţiile de sănătate a animalelor şi produselor de acvacultură şi măsurile de prevenire şi combatere a anumitor boli la animalele acvatice, aprobată prin Hotărârea Guvernului nr.239/2009.

3. Agenţia Naţională pentru Siguranţa Alimentelor (în continuare – Agenţie) asigură că normele privind programele de supraveghere şi de eradicare, metodele de eşantionare şi de diagnostic stabilite sunt respectate atunci când statutul “indemn de boală” se acordă, retras sau restabilit pentru o zonă sau un compartiment al acesteia, pentru una sau mai multe dintre bolile specificate la punctul 1.

4. Agenţia asigură că metodele de control, precum şi metodele de diagnostic stabilite sunt respectate în cursul efectuării examenelor de laborator, pentru a confirma sau a exclude prezenţa unei boli specificate la punctul 1.

5. Agenţia se asigură că măsurile minime de supraveghere şi cerinţele minime pentru înlăturarea măsurilor de limitare a răspândirii bolilor sunt respectate atunci când se aplică măsuri de supraveghere şi când se înlătură măsurile de limitare a răspândirii uneia sau a mai multora dintre bolile specificate la punctul 1, într-o zonă sau un compartiment al acesteia, care nu sunt declarate indemne de respectivele boli.

Capitolul II

CERINŢE DE SUPRAVEGHERE ŞI METODE DE DIAGNOSTIC ÎN CEEA CE PRIVEŞTE SEPTICEMIA

 HEMORAGICĂ VIRALĂ (SHV) ŞI NECROZA HEMATOPOIETICĂ INFECŢIOASĂ (NHI)

Secţiunea 1

Cerinţe referitoare la programele de supraveghere şi de eradicare a SHV şi a NHI

în vederea obţinerii şi menţinerii statutului sanitar “indemn de boală” şi cerinţe

referitoare la măsurile de prevenire a răspândirii respectivelor boli

6. Supravegherea sanitar-veterinară şi eşantionarea pentru septicemia hemoragică virală (SHV), boală cauzată de virusul septicemiei hemoragice virale (VSHV), cunoscut şi sub denumirea de virusul Egtved, un virus aparţinând genului Novirhabdovirus din familia Rhabdoviridae, şi necroza hematopoietică infecţioasă (NHI), boală cauzată de virusul necrozei hematopoietice infecţioase (VNHI), virus care aparţine genului Novirhabdovirus, din familia Rhabdoviridae, se efectuează în perioada din an în care temperatura apei este mai mică de 14 °C sau atunci când este probabil ca temperatura apei să atingă valorile minime anuale.

7. În cazul în care este necesară supravegherea individualizată a populaţiilor sălbatice, numărul şi distribuţia geografică a punctelor de prelevare sunt determinate astfel încât să se obţină o acoperire rezonabilă a zonei sau a compartimentului. Punctele de prelevare sunt reprezentative pentru ecosisteme diferite în care se găsesc populaţii sălbatice aparţinând speciilor sensibile.

8. Atunci când fermele sau populaţiile sălbatice fac obiectul controalelor sau al eşantionării mai des decât o dată pe an, intervalul dintre controalele sanitare şi dintre fiecare colectare a eşantioanelor este de cel puţin patru luni şi este cât mai lung posibil, ţinând cont de cerinţele privind temperatura prevăzute la punctul 6.

9. Toate unităţile de producţie, cum ar fi iazurile, bazinele şi cuştile din plasă, se supun controalelor sanitare în vederea stabilirii prezenţei peştilor morţi, debilitaţi sau cu un comportament anormal. Să se acorde o atenţie deosebită punctelor de evacuare a apei, unde peştii debilitaţi au tendinţa de a se acumula din cauza curentului.

10. Peştii din speciile sensibile urmează să fie incluşi în eşantioane:

1) dacă sunt prezenţi păstrăvi-curcubeu, sunt selectaţi pentru eşantionare numai peştii din această specie, cu excepţia cazului în care sunt prezente alte specii sensibile care prezintă semnele tipice de SHV sau de NHI, dacă păstrăvii-curcubeu nu sunt prezenţi, eşantionul este reprezentativ pentru toate celelalte specii sensibile care sunt prezente;

2) dacă sunt prezenţi peşti debilitaţi, cu un comportament anormal sau care au murit recent, dar care nu sunt descompuşi, aceşti peşti sunt selectaţi;

3) dacă se utilizează mai mult de o sursă de apă pentru producţia de peşte, se includ în eşantion peştii din toate sursele de apă, peştii sunt colectaţi în aşa fel încât toate părţile fermei şi toate clasele de vârstă grupate pe ani sunt reprezentate proporţional în eşantion.

11. Pentru obţinerea statutului sanitar “indemn de boală” (categoria I) în ceea ce priveşte SHV şi NHI, o zonă sau un compartiment cu un statut sanitar de categoria a III-a cu privire la SHV sau la NHI sau la ambele boli poate obţine statutul sanitar de categoria I în ceea ce priveşte aceste boli, cu condiţia ca toate fermele care deţin specii sensibile în zona sau în compartimentul în cauză să respecte cerinţele stabilite în Norma sanitar-veterinară privind condiţiile de sănătate a animalelor şi produselor de acvacultură şi măsurile de prevenire şi combatere a anumitor boli la animalele acvatice, aprobată prin Hotărârea Guvernului nr.239/2009. Punctele în care se prelevează eşantioane de la populaţiile sălbatice selecţionate în conformitate cu capitolul respectiv sunt supuse unuia dintre următoarele programe de supraveghere:

1) modelul A – program de supraveghere cu durata de doi ani.

Fermele sau punctele de prelevare au fost obiectul controalelor sanitare şi al eşantionării timp de o perioadă minimă de doi ani consecutivi, astfel cum se prevede în tabelul nr.1 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară.

În această perioadă de doi ani, testarea tuturor eşantioanelor prin utilizarea metodelor de diagnostic are rezultate negative în ceea ce priveşte fie SHV, fie NHI, fie ambele, şi este exclusă orice suspiciune privind fie SHV, fie NHI, fie ambele, în conformitate cu metodele de eşantionare şi de diagnostic;

2) modelul B – program de supraveghere cu durata de patru ani, cu eşantion de dimensiuni reduse:

fermele sau punctele de prelevare au fost obiectul controalelor sanitare şi al eşantionării timp de o perioadă minimă de patru ani consecutivi.

În această perioadă de patru ani, testarea tuturor eşantioanelor prin utilizarea metodelor de diagnostic are rezultate negative în ceea ce priveşte fie SHV, fie NHI, fie ambele, şi este exclusă orice suspiciune privind fie SHV, fie NHI, fie ambele, dacă, în timpul punerii în aplicare a programului de supraveghere este confirmată o infecţie fie cu SHV, fie cu NHI, fie cu ambele într-o fermă inclusă în programul de supraveghere respectiv şi, prin urmare, a fost retras statutul sanitar de categoria a II-a al fermei, ferma respectivă poate să îşi recâştige imediat statutul sanitar de categoria a II-a şi să continue punerea în aplicare a programului de supraveghere pentru a obţine statutul sanitar “indemn de boală” fără să pună în aplicare un program de eradicare, cu condiţia că ferma este o fermă al cărei statut sanitar în ceea ce priveşte fie SHV, fie NHI, fie ambele este independent de starea de sănătate a populaţiilor de animale acvatice din apele naturale din vecinătate cu privire la aceste boli.

Ferma a fost golită, curăţată, dezinfectată şi supusă unei perioade de vid sanitar, care durează cel puţin şase săptămâni, şi a fost repopulată cu peşti provenind din zone sau din compartimente care au un statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte fie SHV, fie NHI, fie ambele.

12. Pentru obţinerea statutului sanitar “indemn de boală” (categoria I) în ceea ce priveşte SHV şi NHI, o zonă sau un compartiment cu statut sanitar de categoria a V-a cu privire la SHV, la NHI, fie la ambele poate obţine statutul sanitar de categoria I în privinţa acestor boli, cu condiţia că toate fermele care deţin specii sensibile în zona sau în compartimentul în cauză au făcut obiectul unui program de eradicare.

13. Măsurile de control sunt aplicate în mod efectiv în zonă de izolare, care include un perimetru de protecţie şi un perimetru de supraveghere. Aceasta este instaurată în vecinătatea fermei (fermelor) declarate în mod oficial infectată (infectate) fie cu SHV, fie cu NHI, fie cu ambele boli menţionate.

Zona de izolare este definită de la caz la caz, luând în considerare factorii care influenţează riscurile de răspândire a bolii menţionate la peştii de crescătorie şi la cei sălbatici, cum ar fi: numărul, rata mortalităţii şi distribuţia cazurilor de mortalitate a peştilor în cadrul fermei infectate fie cu SHV, fie cu NHI, fie cu ambele; distanţa la care se găsesc fermele învecinate şi densitatea acestora; apropierea de abatoare; fermele cu care se intră în contact; speciile prezente la ferme; practicile de acvacultură aplicate în fermele afectate şi în fermele învecinate acestora; condiţiile hidrodinamice şi alţi factori pertinenţi din punct de vedere epidemiologic care sunt identificaţi.

14. Un perimetru de protecţie este stabilit în imediata vecinătate a fermei declarate în mod oficial infectată fie cu SHV, fie cu NHI, fie cu ambele boli menţionate, în zonele interioare: întregului bazin hidrografic al fermei declarate în mod oficial infectată. Agenţia poate limita extinderea perimetrului la anumite părţi ale bazinului hidrografic sau ale suprafeţei fermei, cu condiţia să nu se compromită prevenirea răspândirii bolii menţionate, în afara perimetrului de protecţie. Agenţia stabileşte un perimetru de supraveghere în zonele interioare: unei zone situate în exteriorul perimetrului de protecţie stabilit.

15. Toate fermele în care sunt ţinute specii sensibile stabilite în anexa nr.3 la Norma sanitar-veterinară privind condiţiile de sănătate a animalelor şi produselor de acvacultură şi măsurile de prevenire şi combatere a anumitor boli la animalele acvatice, aprobată prin Hotărârea Guvernului nr.239/2009, care se află în perimetrul de protecţie şi care nu sunt declarate în mod oficial infectate fie cu SHV, fie cu NHI, fie cu ambele, sunt obiectul unei anchete oficiale care include prelevarea de eşantioane pentru testarea a 10 peşti, în cazul în care se observă semne clinice sau post-mortem compatibile cu infecţia SHV, NHI sau cu ambele, sau pentru testarea a cel puţin 30 de peşti, în cazul în care nu se observă semne clinice sau post-mortem şi un control sanitar-veterinar, în fermele în care testele au avut rezultate negative. Controalele sanitar-veterinare continuă o dată pe lună, pe parcursul perioadei în care temperatura apei este mai mică de 14 °C, cu excepţia cazului în care iazurile sau cuştile din plasă sunt acoperite cu gheaţă, până când se renunţă la perimetrul de protecţie.

16. Toate fermele declarate în mod oficial infectate fie cu SHV, fie cu NHI, fie cu ambele sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unei perioade de vid sanitar, care este de cel puţin şase săptămâni. După golirea tuturor fermelor declarate în mod oficial infectate care se găsesc în acelaşi perimetru de protecţie, să se respecte o perioadă de vid sanitar sincronizat de cel puţin trei săptămâni. Prezenta măsură se aplică, de asemenea, noilor ferme declarate în mod oficial infectate în timpul punerii în aplicare a programului de eradicare.

Când intervine o perioadă de vid sanitar pentru fermele declarate în mod oficial infectate, perimetrele de protecţie sunt transformate în perimetre de supraveghere.

Agenţia decide, în baza unei evaluări a riscurilor, să solicite golirea, curăţarea, dezinfecţia şi o perioadă de vid sanitar pentru alte ferme care se află în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite. În cazul acestor ferme, durata perioadei de vid sanitar este stabilită de către Agenţie, în baza unei evaluări a riscurilor de la caz la caz.

17. Toate fermele declarate în mod oficial infectate fie cu SHV, fie cu NHI, fie cu ambele boli menţionate şi toate celelalte ferme care sunt obiectul unui vid sanitar, situate în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite, sunt repopulate cu peşti care provin din zone sau din compartimente cu statutul sanitar “indemn de boală” (categoria I).

Repopularea poate să aibă loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial infectate sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar.

18. Pentru toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul care fac obiectul programului de eradicare, precum şi, în cazul în care este necesară supravegherea populaţiilor sălbatice, punctele de prelevare selectate fac apoi obiectul programului de supraveghere.

19. Pentru restabilirea statutului “indemn de boală”, compartimentele care cuprind o singură fermă, care au fost declarate anterior indemne de bolile menţionate, al cărui statut sanitar în ceea ce priveşte aceste boli este independent de cel al apelor naturale din vecinătate şi al cărui statut sanitar de categoria I a fost retras, poate redobândi statutul sanitar de categoria I imediat ce Agenţia a confirmat că sunt respectate următoarele condiţii:

1) ferma pentru care s-a confirmat în mod oficial infectarea fie cu SHV, fie cu NHI, fie cu ambele a fost golită, curăţată, dezinfectată şi supusă unei perioade de vid sanitar, cu o durată de şase săptămâni şi mai mult;

2) ferma pentru care s-a confirmat în mod oficial infectarea fie cu SHV, fie cu NHI, fie cu ambele a fost repopulată cu peşti provenind din zone sau din compartimente care au un statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte fie SHV, fie NHI, fie ambele.

20. Pentru menţinerea statutului sanitar “indemn de boală” (categoria I) în ceea ce priveşte fie SHV, fie NHI, fie ambele, când este necesară o supraveghere individualizată pentru menţinerea statutului sanitar de categoria I, toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză sunt supuse inspecţiei sanitare, iar peştii sunt eşantionaţi, ţinând cont de nivelul riscului de contaminare a fermei cu bolile menţionate.

21. La determinarea frecvenţei controalelor sanitare pentru compartimentele care au statut sanitar de categoria I, al căror statut sanitar depinde de starea de sănătate a populaţiilor de animale acvatice din apele naturale din vecinătate, riscul de contaminare se consideră ridicat.

22. Statutul “indemn de boală” se menţine doar atât timp cât toate eşantioanele testate au rezultate negative pentru bolile menţionate şi atât timp cât a fost exclusă orice suspiciune privind fie SHV, fie NHI, fie ambele.

23. Pentru eliminarea măsurilor de prevenire a răspândirii bolilor, o zonă sau un compartiment care are statutul sanitar de categoria a V-a în ceea ce priveşte fie SHV, fie NHI, fie ambele poate obţine statutul sanitar de categoria a III-a cu privire la aceste boli, cu condiţia că:

1) cerinţele prevăzute la punctele 12-16 sunt îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, se instaurează vidul sanitar, fermele în cauză fac obiectul unei măsuri alternative care să ofere garanţii aproape identice în ceea ce priveşte eradicarea fie a virusului VNHI, fie a virusului VSHV, fie a ambelor virusuri din mediul fermei;

2) toate fermele declarate în mod oficial infectate şi toate celelalte ferme care sunt obiectul unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu subpunctul 1), situate în perimetrele de protecţie şi de supraveghere stabilite, să fie repopulate cu peşti provenind din zone sau din compartimente cu statut sanitar de categoria I, a II-a sau a III-a în ceea ce priveşte fie SHV, fie NHI, fie ambele;

3) repopularea să aibă loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial infectate sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu subpunctul 1).

24. Sunt prelevate şi examinate următoarele organe: splina, rinichiul, inima, encefalul. În cazul în care prelevarea se face de la genitori, lichidul ovarian sau seminal poate fi, de asemenea, examinat. În cazul alevinilor, peştii întregi având sub 4 cm lungime pot fi fragmentaţi cu ajutorul unui foarfece steril sau al unui scalpel după eliminarea părţii corpului care se găseşte în spatele orificiului anal. În cazul în care un eşantion este constituit din peşti întregi cu lungimea cuprinsă între 4 cm şi 6 cm, sunt colectate viscerele, inclusiv rinichii. Se permite comasarea fragmentelor de organe care provin de la cel mult 10 peşti.

25. Pentru obţinerea şi menţinerea statutului “indemn de boală” fie pentru SHV, fie pentru NHI, fie pentru ambele sunt stabilite următoarele metode:

1) izolarea virusului în culturi celulare, urmată de identificare prin utilizarea testului imunoenzimatic (ELISA), testului de imunofluorescenţă indirectă (IFAT), testului de neutralizare a virusului sau testului RT-PCR în timp real (reacţie în lanţ de transcripţie inversă a polimerazei –RT-qPCR);

2) RT-qPCR.

26. În cazul în care trebuie confirmată sau exclusă suspiciunea privind fie SHV, fie NHI, fie ambele, ferma în legătură cu care există suspiciuni face obiectul cel puţin al unui control şi al unei prelevări de eşantioane de la 10 peşti, în cazul în care se observă semne clinice sau post-mortem compatibile cu infecţia SHV, NHI sau cu ambele, sau de la cel puţin 30 de peşti, în cazul în care nu se observă semne clinice sau post-mortem. Eşantioanele se testează folosind una sau mai multe dintre metodele de diagnostic: izolarea convenţională a virusului în cultură celulară, urmată de identificarea virusului prin metodă imunochimică sau moleculară; detectarea virusului prin RT-qPCR; alte tehnici de diagnostic cu eficacitate similară dovedită, cum ar fi testul de imunofluorescenţă indirectă (IFAT), testul imunoenzimatic (ELISA), RT-PCR şi imunohistochimia (IHC).

27. Prezenţa SHV se consideră ca fiind confirmată dacă una sau mai multe dintre aceste metode de diagnostic au avut rezultate pozitive pentru virusul SHV (VSHV). Prezenţa NHI se consideră ca fiind confirmată dacă una sau mai multe dintre aceste metode de diagnostic au avut rezultate pozitive pentru virusul NHI (VNHI). Confirmarea primului caz de SHV sau de NHI în zone sau în compartimente care nu au fost infectate anterior să se bazeze pe izolarea convenţională a virusului în cultură celulară sau pe testul RT-qPCR.

28. Se permite excluderea suspiciunii privind SHV, NHI sau ambele, în cazul în care rezultatele culturilor celulare sau ale testului RT-qPCR nu furnizează nicio altă dovadă referitoare la prezenţa SHV, a NHI sau a ambelor.

Secţiunea a 2-a

Metode şi proceduri de diagnostic pentru supravegherea şi confirmarea NHI şi a SHV

29. În cazul în care sunt prelevate eşantioane şi sunt realizate examene de laborator în scopul obţinerii sau al menţinerii statutului “indemn de boală” în ceea ce priveşte NHI sau SHV, trebuie aplicate metodele şi procedurile de diagnostic stabilite în prezenta secţiune.

30. Ţesuturile utilizate pentru examinarea virusologică pe cultură celulară înainte de a fi trimise sau transferate către un laborator acreditat, sunt prelevate cu ajutorul unor instrumente de disecţie sterile şi plasate în tuburi de plastic sterile, care conţin un mediu de cultură celulară care conţine 10% ser fetal bovin, 200 UI de penicilină, 200 μg de streptomicină şi 200 μg de kanamicină pe mililitru sau alte antibiotice cu eficacitate dovedită (în continuare – mediu de transport).

31. Cantitatea de ţesuturi de peşte necesară pentru examenul virusologic pe cultură celulară şi pentru RT-qPCR depinde de dimensiunile peştilor. Astfel, ţesuturile din care se prelevează eşantioane sunt alevinul întreg (dacă lungimea corpului este mai mică de 4 cm), viscerele, inclusiv rinichii (dacă lungimea corpului este mai mare de 4 cm şi mai mică de 6 cm) sau, pentru peştii de dimensiuni mai mari, rinichii, splina, inima şi/sau encefalul, precum şi lichidul ovarian al peştilor reproducători în perioada depunerii icrelor.

Lichidul ovarian sau seminal sau fragmente de organe de la cel mult 10 peşti pot fi reunite într-un tub steril care conţine cel puţin 4 ml de mediu de transport. Masa ţesuturilor din fiecare eşantion este cel puţin 0,5 grame (g).

32. Examenul virusologic pe cultură celulară trebuie să înceapă cel târziu la 48 de ore după colectarea eşantioanelor. În cazuri excepţionale, examenul virusologic poate începe cel târziu la 72 de ore după colectarea materialului de examinat, cu condiţia că acesta este protejat de un mediu de transport şi sunt respectate condiţiile de temperatură în timpul transportului.

33. Eşantioane pentru testul RT-PCR sau RT-qPCR (reacţia în lanţ de transcripţie inversă a polimerazei) se prelevează de la peşti, cu ajutorul unui instrument steril şi sunt transferate într-un tub de plastic steril care conţine mediul de transport. Într-un tub se pot colecta ţesuturi de la 10 peşti; acestea constituie un eşantion general. Cu toate acestea, în cazul în care cantitatea de inocul este mică, pot fi utilizate ţesuturi de la cel mult cinci peşti. În mod alternativ, eşantioanele pot fi comasate în reactivi de stabilizare a ARN-ului, în conformitate cu recomandările producătorilor, dar fiecare peşte trebuie prelucrat separat şi nu se comasează cu alţi peşti în eşantioane, dată fiind cantitatea redusă de material care urmează să fie folosită pentru extracţie. Peştele întreg poate fi, de asemenea, trimis la un laborator acreditat.

34. Tuburile care conţin ţesuturi de peşte într-un mediu de transport şi care sunt destinate culturii celulare sau analizei RT-PCR/RT-qPCR sunt amplasate în recipiente izolate, cum ar fi cutiile de polistiren cu pereţi groşi, împreună cu o cantitate suficientă de gheaţă sau de alt agent de răcire cu efect de răcire similar, pentru a asigura refrigerarea eşantioanelor pe durata transportului către laboratorul acreditat. Trebuie evitată congelarea eşantioanelor. Temperatura unui eşantion pe durata transportului nu trebuie să depăşească 10 °C şi recipientul de transport să mai conţină gheaţă în momentul primirii sau unul sau mai multe blocuri refrigeratoare trebuie să mai fie parţial sau total congelate.

35. Se pot trimite la laboratorul acreditat peşti întregi dacă sunt respectate, pe durata transportului, condiţiile de temperatură care nu trebuie să depăşească 10 °C. Peştele întreg se ambalează în hârtie absorbantă şi se expediază într-un sac de plastic. Pot fi, de asemenea, expediaţi peşti vii.

36. Se acceptă colectarea materialului de diagnostic suplimentar în cazul în care laboratorul de diagnostic acreditat este de acord, în vederea unor examinări suplimentare.

37. În cazul în care se întâlnesc dificultăţi de ordin practic care împiedică prelucrarea eşantioanelor în intervalul de 48 de ore de la colectarea ţesuturilor de peşte, se admite congelarea acestora într-un mediu de transport la – 20 °C sau la o temperatură inferioară şi efectuarea unui examen virusologic în decurs de 14 zile. Cu toate acestea, ţesuturile de peşte pot fi congelate şi dezgheţate numai o singură dată înaintea examinării. Trebuie păstrate evidenţe care să ofere detalii privind motivul fiecărei congelări a eşantioanelor de ţesuturi de peşte.

La laboratorul acreditat, ţesuturile de peşte conţinute în tuburi sunt complet omogenizate, cu ajutorul unui stomacher, al unui blender sau al unui mojar cu pistil şi nisip steril şi plasate apoi în suspensie în mediul de transport de origine.

38. În cazul în care un eşantion este constituit dintr-un peşte întreg cu lungimea sub 4 cm, acesta trebuie fragmentat cu ajutorul unui foarfece steril sau al unui scalpel după eliminarea părţii corpului care se găseşte în spatele orificiului anal. În cazul în care un eşantion este constituit dintr-un peşte întreg cu lungimea cuprinsă între 4 cm şi 6 cm, se vor colecta viscerele, inclusiv rinichii. În cazul în care un eşantion este constituit dintr-un peşte întreg cu lungimea mai mare de 6 cm, eşantioanele de ţesut sunt colectate conform punctelor 30-33. Eşantioanele de ţesut se fragmentează cu ajutorul unui foarfece steril sau al unui scalpel, se omogenizează şi se plasează în suspensie în mediul de transport. Raportul final dintre ţesuturi şi mediul de transport este ajustat în laboratorul acreditat la 1:10.

39. Omogenatul este centrifugat într-o centrifugă cu răcire, la o temperatură cuprinsă între 2 şi 5 °C, la 2 000-4 000 x g, timp de 15 minute, iar supernatantul trebuie colectat şi poate fi tratat, fie timp de 4 ore la 15 °C, fie timp de o noapte la o temperatură de 4-8 °C cu antibiotice. Dacă eşantionul a fost expediat într-un mediu de transport, tratamentul supernatantului cu antibiotice nu este necesar.

40. În cazul în care se întâlnesc dificultăţi, cum ar fi un incubator defect sau probleme cu culturile celulare, care împiedică inocularea celulelor în cele 48 de ore de la colectarea eşantioanelor de ţesuturi de peşte, se poate congela supernatantul la – 80 °C şi se poate efectua un examen virusologic în decurs de 14 zile.

41. Dacă supernatantul colectat este conservat la – 80 °C în intervalul de 48 de ore de la prelevarea eşantioanelor, acesta poate fi reutilizat o singură dată pentru un examen virusologic.

42. Înainte de a inocula celulele, se amestecă supernatantul în proporţie egală cu un amestec de antiseruri împotriva serotipurilor indigene ale virusului necrozei pancreatice infecţioase (NPI), diluate corespunzător, şi se incubează astfel timp de cel puţin o oră la 15 °C sau timp de cel mult 18 ore la 4 °C. Titrul antiserului este de cel puţin 1:2 000 într-un test de neutralizare a plajelor cu 50 % reducerea plajelor.

43. Tratarea tuturor inoculilor cu antiser împotriva virusului NPI are drept scop prevenirea apariţiei efectului citopatic (ECP), datorat virusului NPI, în culturile celulare inoculate. Acest tratament permite reducerea duratei examenelor virusologice, precum şi a numărului de cazuri în care apariţia ECP ar trebui considerată ca un indicator potenţial al virusului SHV sau NHI.

44. Dacă eşantioanele provin din unităţi de producţie considerate indemne de NPI, tratamentul inoculilor cu antiser împotriva virusului NPI poate fi omis.

45. Prepararea eşantioanelor pentru programele de supraveghere care utilizează testul RT-PCR, RT-qPCR şi care au fost plasate într-un mediu de transport se efectuează conform proceduri prevăzute la punctele 37-44.

46. După centrifugare, se colectează supernatantul şi se extrage ARN-ul. Dacă nu trebuie realizată o examinare suplimentară imediat după centrifugare, eşantioanele trebuie congelate imediat la – 20 °C sau la o temperatură inferioară acesteia.

47. Pentru analiza ţesuturilor de peşte conservate în reactiv de stabilizare a ARN-ului, se realizează alte operaţiuni în termenele următoare, pe eşantioane depozitate la diferite temperaturi:

eşantioane depozitate la 37 °C: o zi;

eşantioane depozitate la 25 °C: o săptămână;

eşantioane depozitate la 4 °C: o lună;

eşantioane depozitate la – 20 °C: termen nelimitat.

48. Eşantioanele generale conservate în reactiv de stabilizare a ARN-ului sunt tratate la fel ca eşantioanele individuale în reactiv de stabilizare a ARN-ului. În cazul eşantioanelor generale conservate în reactiv de stabilizare a ARN-ului, volumul eşantionului nu trebuie să depăşească volumul recomandat de producător pentru extracţia ARN-ului cu ajutorul kiturilor. Dacă sunt comasate eşantioane mai mari, kiturile sau metodele de extracţie sunt adaptate în consecinţă. Eşantioanele colectate în reactivi de stabilizare a ARN-ului nu se utilizează pentru culturi celulare.

49. La comasarea eşantioanelor, întrucât protocoalele RT-qPCR au o sensibilitate similară sau mai mare decât cea a metodelor de cultură celulară, se poate accepta utilizarea, pentru PCR, a supernatantului obţinut din ţesuturi de peşte omogenizate provenind din organe prelevate de la maximum 10 peşti şi comasate în mediul de cultură celulară. Cu toate acestea, datorită cantităţii mult mai mici de inocul utilizate pentru PCR, comparativ cu cultura celulară, toate ţesuturile de peşte sunt omogenizate cu atenţie înainte de gruparea materialului pentru extracţie. Acelaşi principiu se aplică şi în cazul în care se prelevează eşantioane în reactivi de stabilizare a ARN-ului. Însă, în acest caz, este adesea dificil să se colecteze material reprezentativ de la maximum 10 peşti într-un tub, iar numărul de peşti per eşantion general trebuie, prin urmare, redus la 2-5.

50. La examinarea virusologică pe cultură celulară şi medii de cultură se cultivă celule din linia celulară 2 de la alevini din specia Lepomis macrochirus (BF-2) sau din linia celulară 2 din gonade de păstrăv-curcubeu (RTG-2) şi celule de Epithelioma papulosum cyprini (EPC) sau de Pimephales promelas (FHM) la o temperatură cuprinsă între 20 şi 30 °C într-un mediu adecvat, şi anume mediu Eagle (Eagle′s Minimum essential medium – MEM) sau o variantă a acestuia, la care s-au adăugat ser fetal bovin 10% şi antibiotice în concentraţii standard.

51. Atunci când celulele sunt cultivate în flacoane închise, se recomandă să se tamponeze mediul cu bicarbonat. Mediul folosit pentru cultura celulară în unităţi deschise poate fi tamponat cu tris(hidroximetil)aminometan-HCl (Tris-HCl) (23 mM) şi cu bicarbonat de sodiu (6 mM). PH-ul să fie de 7,6 ± 0,2.

52. Culturile celulare care se folosesc pentru inoculare cu material tisular de la peşti sunt tinere, culturi celulare de o zi în monostrat, pot fi acceptate culturi cu vârste situate în intervalul de 4-48 de ore. Celulele sunt în faza de creştere activă în momentul inoculării.

53. La examinarea virusologică pe cultură celulară se inoculează o suspensie de organe tratată cu antibiotice în culturile celulare în două diluţii, şi anume diluţia iniţială şi, în plus, o diluţie de 1:10 din aceasta, rezultând diluţii finale ale materialului tisular în mediul de cultură celulară de 1:100 şi de 1:1 000, pentru a se evita interferenţele omologilor. Trebuie inoculate cel puţin două linii celulare, astfel cum se menţionează la punctele 50-52. Raportul dintre cantitatea de inocul şi volumul mediului de cultură celulară este de aproximativ 1:10.

54. Pentru fiecare diluţie şi fiecare linie celulară să se utilizeze o suprafaţă de cel puţin 2 cm², ceea ce corespunde unui godeu dintr-o placă de cultură celulară cu 24 de godeuri. Plăci de cultură celulară sunt utilizate atunci când este posibil.

55. Culturile celulare inoculate sunt incubate la 15 °C timp de şapte până la 10 zile. În cazul în care culoarea mediului de cultură celulară se modifică din roşu în galben, indicând o acidifiere a mediului, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei soluţii sterile de bicarbonat sau cu ajutorul unor substanţe echivalente, pentru a garanta sensibilitatea culturii celulare la infecţia virală.

56. Cel puţin la fiecare şase luni sau în cazul în care se suspectează o scădere a sensibilităţii celulare se efectuează titrarea stocurilor de virusuri SHV şi NHI congelate, pentru a se verifica sensibilitatea culturilor celulare la infecţie.

57. Culturile celulare inoculate sunt verificate prin microscopie cu regularitate, cel puţin de trei ori pe săptămână, pentru a se observa apariţia ECP, cu un grosisment între 40 x şi 150 x. În cazul în care ECP este evident, se încep imediat procedurile de identificare a virusului în conformitate cu punctul 64.

58. În cazul în care nu se produce niciun ECP după prima incubaţie de şapte până la 10 zile, se procedează la o subcultivare pe culturi celulare proaspete, folosindu-se o suprafaţă celulară similară cu cea din cultura primară.

59. Părţi alicote din mediu (supernatant) provenind de la toate culturile sau godeurile care constituie cultura primară se reunesc într-un pool pentru fiecare linie celulară, la 7-10 zile de la inoculare. Poolurile respective sunt apoi inoculate pe culturi celulare omoloage, nediluate şi diluate 1:10 (rezultând în final diluţii ale supernatantului de 1:10 şi, respectiv, 1:100), în conformitate cu descrierea de la punctul 53. Se inoculează, de asemenea, părţi alicote de 10% din mediul care constituie cultura primară direct într-un godeu cu culturi celulare proaspete (subcultivare godeu la godeu). Inocularea poate fi precedată de o preincubare a diluţiilor cu antiser împotriva virusului NPI la o diluţie corespunzătoare, în conformitate cu descrierea de la punctele 39-44.

60. Se incubează culturile inoculate timp de 7-10 zile la 15 °C şi se examinează ţinându-se cont de dispoziţiile de la punctul 57.

61. În cazul în care se produce un ECP toxic în cursul primelor trei zile de incubaţie, se realizează o subcultivare în acest stadiu, dar în acest caz celulele sunt incubate timp de şapte zile şi supuse unei noi subcultivări, cu durata de incubaţie tot de şapte zile. În cazul în care se produce un ECP toxic după trei zile, celulele sunt pasate o dată şi incubate pentru a se ajunge la numărul total de 14 zile de la prima inoculare. Nu trebuie să existe semne de toxicitate în cursul ultimelor şapte zile de incubaţie.

62. În cazul în care se produce o contaminare bacteriană în pofida tratamentului cu antibiotice, subcultivarea este precedată de o centrifugare la 2 000-4 000 × g timp de 15-30 de minute, la o temperatură de 2-5 °C, sau de o filtrare a supernatantului printr-un filtru (membrană cu un procent scăzut de absorbţie a proteinelor) de 0,45 μm sau de ambele. În plus, subcultivarea trebuie să urmeze aceleaşi proceduri ca cele descrise pentru producerea ECP toxic de la prezentul punct.

63. În cazul în care nu se produce ECP, testul poate fi declarat negativ.

64. Dacă se observă apariţia ECP într-o cultură celulară, mediul (supernatantul) este colectat şi examinat prin una sau mai multe din următoarele tehnici: testul imunoenzimatic (ELISA), testul de imunofluorescenţă (IF), neutralizarea, RT-PCR sau RT-qPCR. În cazul în care aceste teste nu au permis identificarea definitivă a virusului într-o săptămână, supernatantul trebuie trimis la un laborator acreditat de referinţă naţional sau la un laborator acreditat de referinţă internaţional pentru bolile peştilor, în vederea identificării imediate.

65. Se efectuează un test ELISA sandviş dublu anticorp pentru identificarea izolatului de virus. Plăcile de microtitrare sunt umplute cu 50 μl/godeu (0,9 pg) de soluţie de imunoglobuline (Ig) din antiseruri de iepure împotriva virusului NHI sau a virusului SHV, purificate cu proteina A, de calitate dovedită, diluate într-un tampon de carbonat (pH 9,6) care conţine 15 mM azidă de sodiu, şi sunt incubate la 4 °C de-a lungul unei perioade cuprinse între 18 ore şi două săptămâni.

66. Pe o placă de diluare, fiecare eşantion care conţine 1% Triton X-100 şi controalele pozitive se diluează cu o soluţie tampon şi anume, tampon fosfat salin (PBS)-T-BSA, 1% BSA în patru raporturi de diluţie şi, respectiv, nediluat, 1:4, 1:16 şi 1:64. Se spală plăcile ELISA în PBS care conţine 0,05% Tween-20 (PBS-T) şi 50 μl din fiecare diluţie se transferă de pe placa de diluare pe placa ELISA spălată şi umplută.

67. Plăcile ELISA se incubează timp de 30 de minute la 37 °C, apoi se spală şi se lasă la incubat timp de 30 de minute la 37 °C în prezenţa anticorpilor monoclonali specifici (şi anume, MAb IP5B11 pentru identificarea VHSV şi Hyb 136-3 pentru identificarea VNHI). Se transferă pe placa ELISA 50μl anticorpi antişoarece de iepure conjugaţi cu peroxidază din hrean (HRP), diluaţi 1:1 000 în PBS-T-BSA. După o nouă spălare, sunt declanşate reacţiile adăugând 50 μl de orto-fenilendiamină (OPD) în fiecare godeu. Plăcile ELISA se incubează timp de 20 de minute la temperatura camerei, în întuneric, iar reacţia se opreşte prin adăugarea a 100 μl de 0,5 M H₂SO₄ în fiecare godeu.

68. Absorbanţa este monitorizată la o lungime de undă de 492 şi 620 nm într-un cititor ELISA. Eşantioanele sunt declarate pozitive sau negative, după compararea rezultatelor testului cu valorile absorbanţei pentru controalele pozitive şi negative. În general, eşantioanele cu absorbanţă totală (A) < 0,5 pentru material nediluat sunt considerate negative, eşantioanele cu valori A cuprinse între 0,5 şi 1,0 sunt considerate suspecte, iar eşantioanele cu valori A > 1,0 sunt considerate pozitive.

69. Pot fi folosite alte variante ELISA cu eficacitate similară dovedită, în locul celor menţionate la prezenta secţiune.

70. Imunofluorescenţa (IF) se aplică pentru identificarea agenţilor patogeni listaţi VSHV şi VNHI şi se efectuează prin infectarea celulelor în plăci cu 96 de godeuri “Black”, plăci clasice cu 24 de godeuri sau pe lamele în plăci cu 24 de godeuri. La identificarea VNHI sau a VSHV sau a ambelor virusuri prin infectarea celulelor pe lamele, se aplică următorul protocol:

1) lamelele sunt însămânţate cu celule la o densitate care să asigure o confluenţă între 60% şi 90% după 24 de ore de la cultivare. Dacă este posibil se folosesc celule EPC în acest scop, datorită aderenţei lor ridicate la suprafeţele de sticlă, dar se pot folosi şi alte linii celulare, de exemplu BF-2, RTG-2 sau FHM. Se inoculează 150 μl de supernatant al culturii celulare în două diluţii diferite (1:10 şi 1:1 000) în două exemplare pe culturi monostrat cu vârsta de o zi şi se incubează la 15 °C timp de 24 de ore;

2) ulterior, se elimină mediul de cultură celulară şi monostraturile de celule infectate sunt fixate cu 0,5 ml soluţie apoasă de acetonă rece (80% vol/vol). Fixarea are loc sub hota de tiraj timp de 15 minute la temperatura camerei, apoi se îndepărtează soluţia de acetonă şi se usucă lamelele la aer timp de cel puţin 30 de minute. În acest stadiu, plăcile sunt prelucrate imediat sau depozitate la o temperatură de – 20 °C, în vederea utilizării ulterioare;

3) anticorpii monoclonali specifici (şi anume, MAb IP5B11 pentru identificarea VSHV şi Hyb 136-3 pentru identificarea VNHI) sunt diluaţi în PBST 0,01 M, cu pH 7,2, la diluţia recomandată de către furnizorul de anticorpi monoclonali. Aceştia sunt adăugaţi apoi la monostraturile fixate, utilizându-se 50-100 μl pentru fiecare godeu, şi plăcile se incubează timp de o oră la 37 °C într-o etuvă umedă;

4) lamelele sunt spălate uşor de trei ori cu PBS care conţine 0,05% Tween-20 (PBS-T), iar tamponul se elimină complet după ultima clătire. Ulterior, celulele sunt incubate timp de o oră la 37 °C cu anticorpi împotriva imunoglobulinelor de şoarece conjugaţi cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) sau cu tetrametilrodamină-5(şi 6)-izotiocianat (TRITC), utilizaţi ca anticorpi primari, diluaţi în conformitate cu instrucţiunile furnizorului. Acestea se spală din nou cu PBS-T şi se usucă. Culturile colorate se montează pe lame de sticlă, folosindu-se o soluţie de glicerol salin şi se examinează la lumină ultravioletă incidentă. Se folosesc oculare de 10 × sau 12 × şi obiective de × 25 sau × 40, ale căror aperturi numerice sunt > 0,7 şi, respectiv, > 1,3.

71. Alternativ, se pot aplica şi alte tehnici IF cu privire la culturile celulare, la fixare şi la anticorpii de referinţă, cu o eficacitate similară dovedită.

72. În procesul de neutralizare se elimină celulele din supernatantul colectat, prin centrifugare (2 000-4 000 × g) sau prin filtrare cu membrană (0,45 μm) cu procent scăzut de absorbţie a proteinelor, apoi se diluează supernatantul 1:100 şi 1:10 000 în mediul de cultură celulară.

73. Se amestecă părţi alicote din minimum două diluţii ale supernatantului şi se incubează separat timp de 60 de minute la 15 °C în părţi egale cu următorii reactivi:

1) ser care conţine anticorpi împotriva VSHV la o diluţie de 1:50 (vol:vol);

2) ser care conţine anticorpi împotriva VNHI la o diluţie de 1:50 (vol:vol);

3) amestec de antiser împotriva serotipurilor indigene ale VNPI la o diluţie de 1:50 (vol:vol);

4) doar mediu (control pozitiv).

50 μl din fiecare amestec format din supernatantul cu virusul de identificat şi ser se inoculează pe cel puţin două culturi celulare şi se incubează la 15 °C. Se urmăreşte apariţia ECP, aşa cum este descris la punctul 57.

74. Tulpinile de VSHV şi izolatele care nu reacţionează la testele de neutralizare se identifică prin IF sau ELISA.

75. Se pot aplica şi alte teste de neutralizare, cu eficacitate similară dovedită.

76. Toate manipulările ARN-ului se realizează pe gheaţă, utilizând mănuşi.

77. Se extrage ARN-ul prin metoda fenol-cloroform sau prin cromatografie de afinitate pe coloane, în conformitate cu instrucţiunile producătorului. Pot fi utilizate kituri de extracţie a ARN-ului disponibile pe piaţă, care permit obţinerea unui ARN de înaltă calitate, ce poate fi utilizat în protocoalele RT-PCR detaliate la punctele de mai jos.

78. ARN-ul este resuspendat în apă distilată fără ARN-ază (şi anume, apă tratată cu 0,1% pirocarbonat de dietil) sau cu o soluţie tampon de eluţie adecvată.

79. Următorii primeri se utilizează pentru detectarea VNHI:

Primer sens 5′-AGA-GAT-JRC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

Primer antisens 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Se utilizează următoarele cicluri (RT-PCR într-o singură etapă):

un ciclu: 50 °C timp de 30 de minute; un ciclu: 95 °C timp de două minute; 30 de cicluri: 95 °C timp de 30 de secunde, 50 °C timp de 30 de secunde, 72 °C timp de 60 de secunde; un ciclu: 72 °C timp de şapte minute şi imersie la temperatura de 4 °C.

80. Următorii primeri se utilizează pentru detectarea VSHV:

VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Se utilizează următoarele cicluri (RT-PCR într-o singură etapă):

50 °C timp de 30 de minute, 95 °C timp de 15 minute, 35 de cicluri la 94 °C timp de 30 de secunde, 55 °C timp de 30 de secunde şi 68 °C timp de 60 de secunde. Ulterior, reacţia se menţine la o temperatură de 68 °C timp de şapte minute.

Cantitatea şi specificitatea reacţiilor RT-PCR se evaluează prin electroforeză în gel de agaroză 1,5% cu bromură de etidiu, iar produşii de reacţie sunt examinaţi prin transiluminare ultravioletă. Pentru VNHI se poate observa un produs de amplificare prin PCR de 693 pb. În ceea ce priveşte VSHV, dimensiunea produsului de amplificare este de 505 pb.

Rezultatele PCR pot varia în funcţie de condiţiile în care este realizată metoda, şi se permite optimizarea protocoalelor termice, în funcţie de termociclul utilizat. Se pot obţine rezultate fals pozitive din cauza unor erori în ceea ce priveşte ataşarea primerilor sau din cauza contaminării în laboratorul acreditat. Prin urmare, pentru a se evita orice dubiu, sunt incluse controale pozitive şi negative adecvate şi produse de amplificare a secvenţei. În ceea ce priveşte primerii VSHV, utilizarea celulelor BF-2 necesită o atenţie specială, deoarece primerii pot reacţiona cu ADN-ul/ARN-ul liniei celulare, producând rezultate fals pozitive de dimensiuni similare. În cazul în care testul se realizează pe supernatant provenind de la celule BF-2, toate fragmentele amplificate prin PCR sunt secvenţiate.

81. Amplificarea VSHV se efectuează utilizând următorul primer şi următoarea sondă:

Primer sens: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

sondă: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

RT-qPCR într-o singură etapă: pentru fiecare serie de plăci se includ controale pozitive şi negative.

Succesiunea ciclurilor: 50 °C timp de 30 de minute, 95 °C timp de 15 minute, 40 de cicluri la 94 °C timp de 15 secunde, 60 °C timp de 40 de secunde şi 72 °C timp de 20 de secunde; se ajustează dacă este necesar. Alternativ, se pot aplica şi alte versiuni de RT-PCR sau de RT-qPCR, cu eficacitate similară dovedită.

82. Amplificarea VNHI se efectuează utilizând următorii primeri şi următoarea sondă:

Primer sens: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

Primer antisens: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′;

sondă: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

RT-qPCR în două etape: se acordă multă atenţie manipulării tuburilor între reacţii, pentru a preveni contaminarea.

Succesiunea ciclurilor (după etapa în timp real): 50 °C timp de două minute, 95 °C timp de 10 minute, apoi 40 de cicluri la 95 °C timp de 15 secunde şi 60 °C timp de un minut; se efectuează ajustări, dacă este necesar.

Alternativ, se pot aplica şi alte versiuni de RT-PCR sau de RT-qPCR, cu eficacitate dovedită.

83. În cazul în care este necesar un examen de laborator pentru confirmarea sau infirmarea prezenţei NHI sau a SHV sau a ambelor boli, se utilizează următoarele metode de diagnostic;

1) izolarea convenţională a virusului, urmată de identificarea acestuia prin seroneutralizare sau prin metode imunochimice sau moleculare;

2) detectarea virusului prin RT-PCR sau RT-qPCR;

3) alte tehnici de diagnostic, cum ar fi IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.

84. Pentru izolarea convenţională a virusului, urmată de identificarea acestuia şi selectarea eşantioanelor trebuie selectaţi pentru examinare cel puţin 10 peşti care prezintă semnele tipice de NHI sau de SHV.

85. Materialul tisular poate fi supus şi altor tehnici de diagnostic, cum ar fi IFAT pe secţiuni congelate sau imunohistochimie pe material tisular fixat cu formol, dar şi unui examen virusologic, în conformitate cu punctul 83 subpunctul 1) sau 2), la mai puţin de 48 de ore de la prelevarea de eşantioane, dacă s-a obţinut un rezultat negativ sau s-a obţinut un rezultat pozitiv cu un material care reprezintă primul caz de NHI sau SHV.

86. În cazul în care se efectuează titrarea în vederea verificării sensibilităţii culturilor celulare la infecţie, se utilizează cel puţin două izolate de VSHV şi un izolat de VNHI. Aceste izolate sunt reprezentative pentru principalele grupe de virusuri. Se folosesc izolate bine definite. Loturile de virusuri având un număr redus de pasaje pe culturi celulare sunt cultivate în flacoane de culturi celulare pe celule BF-2 sau RTG-2 pentru VSHV şi pe celule EPC sau FHM pentru VNHI. Se foloseşte un mediu de cultură celulară la care se adaugă cel puţin 10% ser. Pentru inoculare se foloseşte un indicator MOI cu valoare scăzută (< 1). Atunci când ECP este total, virusul este colectat prin centrifugarea supernatantului culturii celulare la 2 000 × g timp de 15 minute, sterilizat prin filtrare printr-o membrană de 0,45 μm şi repartizat în criotuburi etichetate. Virusul este păstrat la – 80 °C. La o săptămână după congelare, se decongelează în apă rece trei fiole din fiecare virus şi se titrează pe liniile celulare respective. Fiecare izolat de virus se decongelează şi se titrează cel puţin o dată la şase luni sau în cazul în care se suspectează o scădere a sensibilităţii unei linii celulare. Procedurile de titrare se descriu în detaliu şi se aplică aceeaşi procedură de fiecare dată. Titrarea prin diluţie limită să cuprindă cel puţin şase replicări din fiecare serie de diluţii. Titrurile sunt comparate cu titrurile obţinute anterior. În cazul în care titrul unuia dintre cele trei izolate de virus scade cu un factor de 2 log sau mai mult faţă de titrul iniţial, linia celulară nu mai este folosită în scopuri de supraveghere.

În cazul în care se conservă în laboratorul acreditat linii celulare diferite, fiecare linie se examinează separat. Registrele cu evidenţele de laborator se păstrează cel puţin 10 ani.

Capitolul III

METODE DE SUPRAVEGHERE ŞI DE DIAGNOSTIC ÎN CEEA CE PRIVEŞTE BOALA

HERPETICĂ A CRAPULUI KOI (KOI HERPESVIRUS DISEASE – KHVD)

Secţiunea 1

Cerinţe referitoare la programele de supraveghere şi de eradicare

 în vederea obţinerii şi menţinerii statutului sanitar “indemn de boală”

 în ceea ce priveşte boala herpetică a crapului koi (KHVD)

87. Boala herpetică a crapului koi (KHVD) este o boală cauzată de virusul herpetic al crapului koi (koi herpesvirus – KHV), care aparţine familiei Alloherpesviridae. Denumirea ştiinţifică este herpesvirusul 3 al ciprinidelor (cyprinid herpesvirus 3 – CyHV-3). În cazul în care este necesară supravegherea individualizată a populaţiilor sălbatice, precum şi prevenirea răspândirii infecţiei cu virusul herpetic al crapului koi (KHV), numărul şi distribuţia geografică a punctelor de prelevare sunt determinate astfel încât să se obţină o acoperire rezonabilă a zonei sau a compartimentului. Punctele de prelevare sunt, de asemenea, reprezentative pentru ecosisteme diferite în care se găsesc populaţiile sălbatice sensibile, şi anume râuri şi lacuri.

88. Supravegherea individualizată se bazează pe monitorizarea regulată a siturilor care deţin specii sensibile. Monitorizarea se efectuează când temperatura apei a atins niveluri propice apariţiei bolii (> 15 °C) şi cel mai devreme la două săptămâni după data la care au fost atinse aceste temperaturi. Toţi peştii bolnavi sau care prezintă un comportament anormal găsiţi fac obiectul eşantionării şi al testelor.

89. Sunt incluşi în eşantion peşti care sunt ţinuţi o perioadă de timp îndelungată la temperaturi propice dezvoltării virusului, şi anume o perioadă de două până la trei săptămâni la temperaturi cuprinse între 15 °C şi 26 °C. Poate fi acceptată metoda descrisă în continuare:

1) colectarea unei subpopulaţii în momentul transferului din iazul de iarnă în iazul de vară şi menţinerea peştilor în aceeaşi apă ca cea a iazului de vară până la obţinerea temperaturii minime cerute; sau

2) colectarea eşantioanelor în timpul recoltării sau în timpul altor operaţiuni de manipulare a peştilor care fac parte din practicile de gestionare normale. Eşantioanele se colectează între 24 şi 72 de ore după astfel de practici de gestionare, pentru a spori şansele de detectare a KHV.

90. Atunci când fermele sau populaţiile sălbatice fac obiectul controlului sau al eşantionării de mai multe ori pe an, intervalul dintre controale sau dintre prelevări trebuie să fie cât mai lung posibil în sezonul în care este probabil ca temperatura apei să atingă valorile maxime anuale, fără a depăşi limita de 28 °C.

91. Toate unităţile de producţie, cum ar fi iazurile şi bazinele, sunt supuse controlului în vederea stabilirii prezenţei peştilor morţi, debilitaţi sau cu un comportament anormal.

Specia Cyprinus carpio şi încrucişările acesteia, cum ar fi Cyprinus carpio × Carassius auratus, sunt prelevate atunci când sunt prezente în fermă.

92. Peştii care urmează a fi colectaţi drept eşantioane sunt selectaţi după cum urmează:

1) dacă sunt prezenţi peşti debilitaţi, cu un comportament anormal sau care au murit recent, dar care nu sunt descompuşi, aceşti peşti trebuie selectaţi;

2) dacă se utilizează mai mult de o sursă de apă pentru producţia de peşte, trebuie incluşi în eşantion peştii care reprezintă toate sursele de apă;

3) peştii sunt colectaţi în aşa fel încât toate părţile fermei şi toate clasele de vârstă grupate pe ani sunt reprezentate proporţional în eşantion.

93. Pentru obţinerea statutului sanitar “indemn de boală” (categoria I) în ceea ce priveşte KHVD, o zonă sau un compartiment cu un statut sanitar de categoria a III-a cu privire la KHVD poate obţine statutul sanitar de categoria I atunci când toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză respectă cerinţele referitoare la statutul “indemn de boală”.

Punctele în care se prelevează eşantioane de la populaţiile sălbatice selecţionate în conformitate cu partea respectivă sunt supuse unuia dintre următoarele programe de supraveghere:

1) modelul A – program de supraveghere cu durata de doi ani.

Fermele sau punctele de prelevare au fost obiectul controlului şi al eşantionării timp de o perioadă minimă de doi ani consecutivi şi au rezultate negative în ceea ce priveşte KHV şi este exclusă orice suspiciune privind KHVD;

2) modelul B – program de supraveghere cu durata de patru ani, cu eşantion de dimensiuni reduse. Fermele sau punctele de prelevare au fost obiectul controlului şi al eşantionării timp de o perioadă minimă de patru ani consecutivi.

În această perioadă de patru ani, testarea tuturor eşantioanelor, prin utilizarea metodelor de diagnostic stabilite la punctele 122-123, au rezultate negative în ceea ce priveşte KHV şi este exclusă orice suspiciune privind KHVD.

94. În cazul în care, în timpul punerii în aplicare a programului de supraveghere de patru ani, este confirmată o infecţie cu KHV într-o fermă inclusă în programul de supraveghere respectiv şi, prin urmare, a fost retras statutul sanitar de categoria a II-a al fermei, ferma respectivă poate să îşi recâştige imediat statutul sanitar de categoria a II-a şi să continue punerea în aplicare a programului de supraveghere pentru a obţine statutul sanitar “indemn de boală” fără să pună în aplicare un program de eradicare, astfel cum este descris în prezenta secţiune, cu condiţia ca ferma să îndeplinească următoarele condiţii:

1) statutul fermei în ceea ce priveşte KHVD este independent de starea de sănătate a populaţiilor de animale acvatice din apele naturale din vecinătate în ceea ce ţine de această boală;

2) aceasta a fost golită, curăţată, dezinfectată şi supusă unei perioade de vid sanitar, care este de cel puţin şase săptămâni;

3) ferma a fost repopulată cu peşti proveniţi din zone sau din compartimente care au un statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte KHVD.

95. Programul de eradicare prevede că o zonă sau un compartiment cu statut sanitar de categoria a V-a în ceea ce priveşte KHVD poate obţine statutul sanitar de categoria I cu privire la această boală atunci când toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză sunt obiectul cel puţin al unui program de eradicare.

Măsurile de control sunt aplicate în mod efectiv şi o zonă de izolare, care include un perimetru de protecţie şi un perimetru de supraveghere, este instaurată în vecinătatea fermei (fermelor) declarate în mod oficial infectată (infectate) cu KHV.

Zona de izolare este definită de la caz la caz, luând în considerare factorii care influenţează riscurile de răspândire a KHVD la peştii de crescătorie şi la cei sălbatici, cum ar fi: numărul, rata mortalităţii şi distribuţia cazurilor de mortalitate a peştilor în cadrul fermei infectate cu KHV; distanţa la care se găsesc fermele învecinate şi densitatea acestora; apropierea de abatoare; fermele cu care se intră în contact; speciile prezente la ferme; practicile de acvacultură aplicate în fermele afectate şi în fermele învecinate acestora; condiţiile hidrodinamice şi alţi factori pertinenţi din punct de vedere epidemiologic care sunt identificaţi.

96. Pentru stabilirea perimetrului de protecţie şi de supraveghere, se stabileşte un perimetru de protecţie în imediata vecinătate a fermei declarate în mod oficial infectată cu KHV şi acest perimetru trebuie să corespundă întregului bazin hidrografic al fermei declarate în mod oficial infectată cu KHV.

97. Agenţia poate limita extinderea perimetrului la anumite părţi ale bazinului hidrografic, cu condiţia să nu se creeze impedimente prevenirii răspândirii KHVD. Agenţia stabileşte un perimetru de supraveghere în afara perimetrului de protecţie, perimetrul de supraveghere trebuind să corespundă unei zone situate în jurul perimetrului de protecţie stabilit.

98. Toate fermele în care sunt ţinute specii sensibile, care se află în perimetrul de protecţie şi care nu sunt declarate în mod oficial infectate cu KHV sunt obiectul unei anchete oficiale care include cel puţin următoarele elemente:

1) prelevarea de eşantioane pentru testarea a 10 peşti, în cazul în care se observă semne clinice sau post-mortem compatibile cu KHVD, sau pentru testarea a 30 de peşti, în cazul în care nu se observă semne clinice sau post-mortem;

2) în fermele în care testele au avut rezultate negative, controalele sanitar-veterinare continuă o dată pe lună pe parcursul sezonului în care este probabil ca temperatura apei să depăşească 15 °C, până când se renunţă la perimetrul de protecţie.

99. Toate fermele declarate în mod oficial infectate cu KHV sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unei perioade de vid sanitar, care durează cel puţin şase săptămâni. După golirea tuturor fermelor declarate în mod oficial infectate care se găsesc în acelaşi perimetru de protecţie, să se respecte o perioadă de vid sanitar sincronizat de cel puţin trei săptămâni.

Prevederile prezentului punct se referă şi noilor ferme declarate în mod oficial infectate în timpul punerii în aplicare a programului de eradicare.

100. Atunci când intervine o perioadă de vid sanitar pentru fermele declarate în mod oficial infectate, perimetrele de protecţie sunt transformate în perimetre de supraveghere.

101. Agenţia decide, în baza unei evaluări a riscurilor, să solicite golirea, curăţarea, dezinfecţia şi o perioadă de vid sanitar pentru alte ferme care se află în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite. Durata perioadei de vid sanitar este stabilită de către Agenţie, în baza unei evaluări a riscurilor de la caz la caz.

102. Toate fermele declarate în mod oficial infectate cu KHV şi toate celelalte ferme care au făcut obiectul unui vid sanitar, situate în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite, sunt repopulate cu peşti provenind din zone sau din compartimente care au un statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte KHVD; sau pentru o perioadă de tranziţie, cu peşti provenind din zone sau din compartimente cu un program de supraveghere a KHVD aprobat.

103. Repopularea să aibă loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial infectate cu KHV sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar în conformitate cu punctele 99-101.

104. Toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul care fac obiectul programului de eradicare precum şi, în cazul în care este necesară supravegherea populaţiilor sălbatice, punctele de prelevare selectate sunt apoi obiectul programului de supraveghere prevăzut la punctul 93.

105. Un compartiment care cuprinde o singură fermă, care are statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte KHVD, al cărui statut sanitar privind KHVD este independent de cel al apelor naturale din vecinătate şi al cărui statut sanitar de categoria I a fost retras, poate redobândi statutul de categoria I cu privire la KHVD imediat ce Agenţia a confirmat că sunt respectate următoarele condiţii:

1) ferma a fost golită, curăţată, dezinfectată şi supusă unei perioade de vid sanitar, care a fost de cel puţin şase săptămâni;

2) ferma a fost repopulată cu peşti provenind din zone sau din compartimente care au un statut sanitar de categoria I sau din compartimente cu un program de supraveghere a KHVD aprobat (statut sanitar de categoria a II-a).

106. În cazul în care este necesară o supraveghere individualizată pentru menţinerea statutului sanitar de categoria I, toate fermele care deţin specii sensibile enumerate în anexa nr.3 la Norma sanitar-veterinară privind condiţiile de sănătate a animalelor şi produselor de acvacultură şi măsurile de prevenire şi combatere a anumitor boli la animalele acvatice, aprobată prin Hotărârea Guvernului nr.239/2009, din zona sau din compartimentul acesteia sunt supuse inspecţiei sanitare şi eşantionării în conformitate cu tabelul nr.5 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară, ţinând cont de nivelul riscului de contaminare a fermei cu KHV.

107. În compartimentele cu statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte KHVD, care includ una sau mai multe ferme al căror statut sanitar cu privire la KHVD este dependent de statutul sanitar al apelor naturale din vecinătate privind această boală, frecvenţa controalelor sanitare trebuie să corespundă numărului cu risc ridicat, prevăzut în tabelul nr.6 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară.

108. În zonele sau în compartimentele în care există un număr limitat de ferme, iar supravegherea individualizată a acestor ferme nu furnizează date epidemiologice suficiente, programele de supraveghere în vederea menţinerii statutului sanitar “indemn de boală” includ puncte de prelevare selecţionate în conformitate cu cerinţele prevăzute la punctele 128-131.

109. Dintre aceste puncte de prelevare, 50% sunt obiectul inspecţiei şi prelevării de eşantioane în fiecare an, prin rotaţie. Eşantionarea să se realizeze în conformitate cu tabelul nr.6 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară. Eşantioanele sunt selectate, pregătite şi examinate astfel cum este descris în secţiunea a 2-a, iar examenele de laborator trebuie să aibă rezultate negative în ceea ce priveşte prezenţa agentului KHVD.

110. Statutul “indemn de boală” se menţine doar atât timp cât toate eşantioanele testate au rezultate negative pentru KHVD şi orice suspiciune privind KHVD este exclusă.

111. Cerinţe specifice pentru eliminarea măsurilor de prevenire a răspândirii bolilor prevăzute de Norma sanitar-veterinară privind condiţiile de sănătate a animalelor şi produselor de acvacultură şi măsurile de prevenire şi combatere a anumitor boli la animalele acvatice, aprobată prin Hotărârea Guvernului nr.239/2009, în vederea obţinerii statutului sanitar de categoria a III-a în ceea ce priveşte KHVD, prevăd că o zonă sau un compartiment care are statutul sanitar de categoria a V-a cu privire la KHVD poate obţine statutul sanitar de categoria a III-a privind această boală, cu condiţia că:

1) cerinţele prevăzute la punctele 79-101 sunt îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, se instaurează vidul sanitar, fermele în cauză sunt obiectul unei măsuri alternative care oferă garanţii aproape identice în ceea ce priveşte eradicarea virusului KHV din mediul fermei;

2) toate fermele declarate în mod oficial infectate şi toate celelalte ferme care sunt obiectul unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu subpunctul 1), situate în perimetrele de protecţie şi de supraveghere stabilite, sunt repopulate cu peşti provenind din zone sau din compartimente cu statut sanitar de categoria I, a II-a sau a III-a în ceea ce priveşte KHVD;

3) repopularea are loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial infectate sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu subpunctul 1).

112. Pentru obţinerea şi menţinerea statutului sanitar “indemn de boală” în ceea ce priveşte KHVD, trebuie examinate ţesuturile care sunt părţi din branhii şi rinichi. Se permite comasarea fragmentelor de organe care provin de la cel mult doi peşti. Metoda de diagnostic PCR în timp real (qPCR) este folosită pentru a obţine sau pentru a menţine statutul menţionat în ceea ce priveşte KHVD, în conformitate cu metodele şi cu procedurile stabilite în secţiunea a 2-a din prezentul capitol.

113. Pentru anchetele oficiale, care au drept scop confirmarea sau excluderea suspiciunii privind KHVD, sunt examinate ţesuturile care sunt părţi din branhii şi rinichi. Este posibilă comasarea fragmentelor de organe care provin de la cel mult doi peşti.

În ancheta oficială se include cel puţin un control sanitar-veterinar şi o prelevare de eşantioane de la 10 peşti, în cazul în care se observă semne clinice sau post-mortem compatibile cu infecţia cu KHV, sau de la 30 de peşti, în cazul în care nu se observă semne clinice sau post-mortem.

114. Eşantioanele se testează folosind metoda de diagnostic stabilită la capitolul III, secţiunea a 2-a. Prezenţa infecţiei se consideră confirmată cu KHV în cazul în care KHV este detectat cu ajutorul PCR. Suspiciunea privind KHVD poate fi exclusă în cazul în care acest test nu furnizează nicio altă dovadă referitoare la prezenţa KHV.

Secţiunea a 2-a

Metode şi proceduri de diagnostic detaliate pentru supravegherea

şi confirmarea bolii herpetice a crapului koi (KHVD)

115. În cazul în care este necesar un examen de laborator pentru confirmarea prezenţei KHVD, în scopul diagnosticării se pot utiliza peşti (expediaţi vii sau sacrificaţi şi ambalaţi separat în recipiente aseptice sigilate) sau, alternativ, organe congelate sau fragmente de organe conservate în etanol de concentraţie 80% – etanol absolut sau într-un mediu de transport viral (în vederea prelucrării în termen de 48 de ore de la colectare) pentru testare prin metode bazate pe PCR convenţională sau pe qPCR.

116. Pentru detectarea KHV, sunt colectate branhiile şi rinichii. În plus, splina, encefalul şi intestinul pot fi incluse într-un eşantion suplimentar separat. În cazurile de infecţie acută pot fi comasate ţesuturi provenind de la cel mult cinci peşti.

În anumite cazuri pot fi utilizate şi alte eşantioane care nu prevăd sacrificarea, cum ar fi sângele, frotiurile din branhii, biopsia branhiilor şi prelevările de mucus (se utilizează la peşti foarte valoroşi în cazul suspiciunii privind prezenţa KHV).

117. ADN-ul este extras în conformitate cu procedurile standard.

Pot fi utilizate kituri de extracţie a ADN-ului disponibile pe piaţă, care permit obţinerea unui ADN de înaltă calitate, ce poate fi utilizat în protocoalele PCR menţionate la punctele 118-120.

118. Pentru detectarea KHV se efectuează următorul test qPCR:

Primer sens (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Primer antisens (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

sondă (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 95 °C timp de 15 minute, apoi 40 de cicluri la 94 °C timp de 15 secunde şi la 60 °C timp de 60 de secunde. Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive şi negative. Cu toate acestea, alternativ se pot aplica şi alte versiuni de qPCR, cu eficacitate similară dovedită.

Se utilizează testul descris în prezenta secţiune, care vizează gena timin kinaza (TK) a KHV. Cu toate acestea, în locul acestuia pot fi folosite alte teste PCR cu sensibilitate şi specificitate similare demonstrate.

Primer sens (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;

Primer antisens (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 95 °C timp de cinci minute, urmat de 35 de cicluri la 95 °C timp de 30 de secunde, la 52 °C timp de 30 de secunde, la 72 °C timp de un minut şi un ciclu la 72 °C timp de 10 minute. Dimensiunea produsului ar trebui să fie de 409 pb.

119. Rezultatele PCR pot varia în funcţie de condiţiile în care este realizată metoda, şi anume ar putea fi necesară optimizarea protocoalelor termice, în funcţie de ciclul termic utilizat. Se pot obţine rezultate fals pozitive din cauza unor erori în ceea ce priveşte ataşarea primerilor sau din cauza contaminării. Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive şi negative. Cu toate acestea, alternativ se pot aplica şi alte versiuni de PCR, cu eficacitate similară dovedită.

120. Prima detectare într-o anumită zonă este confirmată prin secvenţiere sau trimisă la un laborator acreditat naţional de referinţă sau la un laborator acreditat de referinţă internaţional pentru bolile peştilor, în scopul identificării imediate a virusului.

121. În cazul în care sunt prelevate eşantioane şi sunt realizate examene de laborator în scopul obţinerii sau al menţinerii unui anumit statut sanitar în ceea ce priveşte KHVD, trebuie aplicate metodele şi procedurile de diagnostic detaliate prevăzute de prezenta secţiune.

122. Se includ în eşantion peşti care sunt ţinuţi o perioadă de timp îndelungată la temperaturi propice dezvoltării virusului (şi anume o perioadă de două până la trei săptămâni la temperaturi cuprinse între 15 °C şi 26 °C). Eşantioanele sunt colectate la minimum 24 de ore, dar nu mai târziu de 72 de ore după practicile de gestionare care pot reactiva virusul la peştii-vector, în vederea sporirii şanselor de detectare a KHV.

123. În scopul supravegherii KHVD, se pot trimite peşti vii sau sacrificaţi şi ambalaţi separat în recipiente aseptice sigilate sau, alternativ, organe congelate sau fragmente de organe conservate în alcool 80%-100% sau într-un mediu de transport viral (în vederea prelucrării în termen de 48 de ore după colectare) pentru testare, prin metode bazate pe PCR. Pentru supravegherea KHVD se va colecta ţesut din branhii şi din rinichi. Dacă este posibil, să se evite comasarea ţesuturilor de la mai mulţi peşti şi să se comaseze ţesuturi care provin de la cel mult doi peşti. Eşantioanele de dimensiune mai mare sunt omogenizate cu ajutorul unui mojar şi pistil sau al unui stomacher şi trebuie prelevate subeşantioane extrase înainte de clarificare, în vederea extracţiei ADN-ului. În mod alternativ, pot fi colectate subeşantioane din fiecare ţesut inclus în eşantion şi pot fi introduse în tuburi pentru liză.

124. ADN-ul este extras în conformitate cu procedurile standard. Pot fi utilizate kituri de extracţie a ADN-ului disponibile pe piaţă, ce poate fi utilizat în protocoalele PCR menţionate la punctul 125.

Raportul acceptabil dintre ţesuturi şi mediu este de 1:9 g/v. Testele sunt realizate pe 20-25 mg de ţesut.

125. Pentru supravegherea KHV trebuie utilizată qPCR. În cazul în care apar eşantioane pozitive într-o zonă care nu a fost anterior confirmată pozitiv, rezultatele testelor sunt confirmate:

1) fie prin secvenţierea produsului PCR sau Nested PCR, obţinut din eşantioane. Secvenţa consens obţinută trebuie să coincidă (cel puţin în proporţie de 98%) cu secvenţele de referinţă;

2) fie, alternativ, eşantioanele pot fi trimise la un laborator acreditat naţional de referinţă pentru confirmare.

126. Trebuie aplicat protocolul qPCR după cum urmează:

Primer sens (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

Primer antisens (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

sondă (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 95 °C timp de 15 minute, apoi 50 de cicluri la 94 °C timp de 15 secunde şi la 60 °C timp de 60 de secunde. Rezultatele qPCR pot varia în funcţie de condiţiile în care este realizată metoda, şi anume ar putea fi necesară optimizarea protocoalelor termice, în funcţie de ciclul termic utilizat. Se pot obţine rezultate fals pozitive din cauza unor erori în ceea ce priveşte ataşarea primerilor sau din cauza contaminării în laboratorul acreditat. Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive şi negative. Cu toate acestea, alternativ, se pot aplica şi alte versiuni de qPCR, cu eficacitate similară dovedită.

127. Pentru confirmarea prezenţei infecţiei cu KHV se utilizează protocolul Nested PCR descris în tabelul nr.8 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară, urmat de secvenţierea produsului de amplificare.

Rezultatele PCR pot varia în funcţie de condiţiile în care este realizată metoda, şi anume ar putea fi necesară optimizarea protocoalelor termice, în funcţie de termociclul utilizat. În plus, se pot obţine rezultate fals pozitive din cauza unor erori în ceea ce priveşte ataşarea primerilor sau din cauza contaminării în laboratorul acreditat. Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive şi negative. Alternativ, se pot aplica şi alte versiuni de PCR, cu eficacitate similară dovedită. Secvenţierea poate fi efectuată de către laboratorul acreditat sau de către societăţile externe specializate în secvenţiere. Rezultatele secvenţierii sunt analizate comparând secvenţele cu secvenţele de referinţă ale KHV cunoscute (numere de acces la GenBank AP008984, DQ657948 şi DQ177346). Secvenţa consens obţinută trebuie să coincidă cel puţin în proporţie de 98% cu aceste secvenţe de referinţă.

Capitolul IV

METODE DE SUPRAVEGHERE ŞI DE DIAGNOSTIC ÎN CEEA

CE PRIVEŞTE ANEMIA INFECŢIOASĂ A SOMONULUI (AIS)

Secţiunea 1

Cerinţe referitoare la programele de supraveghere şi de eradicare

 în vederea obţinerii şi menţinerii statutului sanitar “indemn de boală”

în ceea ce priveşte anemia infecţioasă a somonului (AIS)

128. În cazul în care fermele fac obiectul controalelor sanitar-veterinare în ceea ce priveşte anemia infecţioasă a somonului (AIS), boală cauzată de virusul anemiei infecţioase a somonului cu deleţie în regiunea cu polimorfism mare (VAIS), virus care aparţine genului Isavirus, din familia Orthomyxoviridae, şi al eşantionării de mai multe ori pe an, intervalul dintre controalele sanitar-veterinare sau dintre prelevări este cât mai lung posibil.

129. În cazul în care este necesară supravegherea individualizată a populaţiilor sălbatice, numărul şi distribuţia geografică a punctelor de prelevare sunt determinate astfel încât să se obţină o acoperire rezonabilă a zonei sau a compartimentului. Punctele de prelevare sunt, de asemenea, reprezentative pentru ecosisteme diferite în care se găsesc populaţiile sălbatice sensibile.

130. Se efectuează controale sanitar-veterinare în toate unităţile de producţie, cum ar fi iazurile, bazinele şi cuştile din plasă, pentru a depista prezenţa peştilor morţi, debilitaţi sau cu un comportament anormal. Se acordă o atenţie deosebită punctelor de evacuare a apei, unde peştii debilitaţi au tendinţa de a se acumula din cauza curentului.

131. Eşantionul se completează cu peşti muribunzi sau care au murit recent, dar care încă nu sunt în stare de putrefacţie. În procesul de prelevare se dă prioritate peştilor care prezintă semne de anemie, sângerări sau prezintă alte semne clinice care denotă tulburări circulatorii. Dacă somonul de Atlantic este una dintre speciile sensibile prezente în cadrul sitului, trebuie prelevate cu prioritate eşantioane din somonul de Atlantic. Dacă nu există somon de Atlantic în ferma piscicolă, trebuie prelevate eşantioane de la alte specii sensibile. Dacă se utilizează mai mult de o sursă de apă pentru producţia de peşte, trebuie incluşi în eşantion peştii care reprezintă toate sursele de apă. Peştii selectaţi includ peşti colectaţi în aşa fel încât toate unităţile de producţie, cum ar fi cuştile din plasă, bazinele şi iazurile fermei, precum şi toate clasele de vârstă grupate pe ani sunt reprezentate proporţional în eşantion.

132. Cerinţe specifice pentru obţinerea statutului sanitar de categoria I în ceea ce priveşte AIS prevăd că o zonă sau un compartiment cu statut sanitar de categoria a III-a privind AIS poate obţine statutul sanitar de categoria I cu privire la această boală, atunci când toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză respectă cerinţele relevante şi atunci când toate aceste ferme şi punctele în care se prelevează eşantioane de la populaţiile sălbatice selecţionate sunt supuse următorului program de supraveghere:

1) fermele sau punctele de prelevare sunt obiectul controalelor sanitare şi al eşantionării timp de o perioadă minimă de doi ani consecutivi, astfel cum se prevede în tabelul nr.9 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară;

2) în această perioadă de doi ani, testarea tuturor eşantioanelor prin utilizarea metodelor de diagnostic stabilite la capitolul IV, secţiunea a 2-a, a avut rezultate negative în ceea ce priveşte virusul anemiei infecţioase a somonului cu deleţie în regiunea cu polimorfism mare şi a fost exclusă orice suspiciune privind AIS;

3) în cazul în care, în timpul punerii în aplicare a programului de supraveghere, este confirmată AIS la o fermă inclusă în programul de supraveghere şi, prin urmare, statutul sanitar de categoria a II-a a fost retras, trebuie efectuat un program de eradicare în conformitate cu punctele 133-141.

133. O zonă sau un compartiment cu statut sanitar de categoria a V-a în ceea ce priveşte AIS poate obţine statutul sanitar de categoria I privind această boală, atunci când toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză au făcut obiectul unui program de eradicare.

Măsurile minime de control stabilite de către Agenţie, care sunt aplicate în mod efectiv şi, în special, o zonă de izolare, care include un perimetru de protecţie şi un perimetru de supraveghere, a fost instaurată în vecinătatea fermei (fermelor) declarate în mod oficial infectată (infectate) cu virusul anemiei infecţioase a somonului cu deleţie în regiunea cu polimorfism mare sau în care a fost confirmată prezenţa AIS.

134. Zona de izolare trebuie definită de la caz la caz, luând în considerare factorii care influenţează riscurile de răspândire a AIS la peştii de crescătorie sau la cei sălbatici, cum ar fi: numărul, rata mortalităţii şi distribuţia cazurilor de mortalitate a peştilor în cadrul fermei infectate cu virusul anemiei infecţioase a somonului cu deleţie în regiunea cu polimorfism mare sau în care a fost confirmată prezenţa AIS; distanţa la care se găsesc fermele învecinate şi densitatea acestora; apropierea de abatoare; fermele cu care se intră în contact; speciile prezente la ferme; practicile de acvacultură aplicate în fermele afectate şi în fermele învecinate acestora; condiţiile hidrodinamice şi alţi factori pertinenţi din punct de vedere epidemiologic care sunt identificaţi.

Pentru stabilirea perimetrului de protecţie şi a celui de supraveghere se aplică cerinţe minime în ceea ce priveşte delimitarea geografică a acestor perimetre descrise în prezenta secţiune.

135. Un perimetru de protecţie se stabileşte în imediata vecinătate a fermei declarate în mod oficial infectată cu AIS şi acesta trebuie să corespundă întregului bazin hidrografic al fermei declarate în mod oficial infectată cu AIS. Agenţia poate limita extinderea perimetrului la anumite părţi ale bazinului hidrografic, cu condiţia să nu se compromită prevenirea răspândirii AIS.

136. Un perimetru de supraveghere se stabileşte în afara perimetrului de protecţie, acesta trebuie să corespundă unei zone situate în jurul perimetrului de protecţie, înscrisă într-un cerc cu raza de 10 km, calculată din centrul perimetrului de protecţie; sau unei zone echivalente stabilite în baza unor date hidrodinamice sau epidemiologice corespunzătoare; sau în zonele interioare: unei zone situate în exteriorul perimetrului de protecţie stabilit.

137. Toate fermele în care sunt ţinute specii sensibile, care se află în perimetrul de protecţie şi care nu sunt declarate în mod oficial infectate cu AIS sunt obiectul unei anchete oficiale care include cel puţin următoarele elemente:

1) prelevarea de eşantioane pentru testarea a minimum 10 peşti muribunzi, în cazul în care se observă semne clinice sau post-mortem compatibile cu AIS sau pentru testarea a minimum 30 de peşti, în cazul în care nu se observă semne clinice sau post-mortem;

2) un control sanitar-veterinar. În fermele pentru care testele sanitar-veterinare au rezultate negative, controalele trebuie să continue o dată pe lună până când se renunţă la perimetrul de protecţie, în conformitate cu punctul 138.

138. Toate fermele declarate în mod oficial infectate cu virusul anemiei infecţioase a somonului cu deleţie în regiunea cu polimorfism mare sau în care a fost confirmată prezenţa AIS sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unei perioade de vid sanitar timp de cel puţin trei luni. Se poate renunţa la perimetrele de protecţie şi de supraveghere atunci când toate fermele situate în perimetrul de protecţie sunt golite, curăţate, dezinfectate şi, ulterior, a fost respectată o perioadă de vid sanitar sincronizat de cel puţin şase săptămâni. Atunci când intervine o perioadă de vid sanitar pentru fermele declarate în mod oficial infectate, perimetrele de protecţie sunt transformate în perimetre de supraveghere.

Agenţia decide, în baza unei evaluări a riscurilor, să solicite golirea, curăţarea, dezinfecţia şi o perioadă de vid sanitar pentru alte ferme care se află în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite. În cazul acestor ferme, durata perioadei de vid sanitar este stabilită de către Agenţie, în baza unei evaluări a riscurilor de la caz la caz.

139. Toate fermele declarate în mod oficial infectate cu virusul anemiei infecţioase a somonului cu deleţie în regiunea cu polimorfism mare sau în care a fost confirmată prezenţa AIS şi toate celelalte ferme care au făcut obiectul unui vid sanitar, situate în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite, sunt repopulate cu peşti care provin din zone sau din compartimente cu statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte AIS.

140. Repopularea poate să aibă loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial infectate sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar în conformitate cu punctul 138.

141. Toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul care fac obiectul programului de eradicare precum şi, în cazul în care este necesară supravegherea populaţiilor sălbatice, punctele de prelevare selectate în conformitate cu punctele 128-131, fac apoi obiectul programului de supraveghere prevăzut la punctul 132.

142. Un compartiment care cuprinde o singură fermă care are statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte AIS, al cărui statut sanitar este independent de cel al apelor naturale din vecinătate şi al cărui statut sanitar de categoria I a fost retras, poate redobândi statutul imediat ce Agenţia a confirmat că sunt respectate următoarele condiţii:

1) ferma a fost golită, curăţată, dezinfectată şi supusă unei perioade de vid sanitar, care durează cel puţin şase săptămâni;

2) ferma a fost repopulată cu peşti provenind din zone sau din compartimente care au un statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte AIS.

143. În cazul în care este necesară o supraveghere individualizată pentru menţinerea statutului sanitar de categoria I, toate fermele care deţin specii sensibile enumerate în anexa nr.3 la Norma sanitar-veterinară privind condiţiile de sănătate a animalelor şi produselor de acvacultură şi măsurile de prevenire şi combatere a anumitor boli la animalele acvatice, aprobată prin Hotărârea Guvernului nr.239/2009, din zona sau din compartimentul în cauză sunt supuse controalelor sanitare şi eşantionării în conformitate cu tabelul nr.10 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară, ţinând cont de nivelul riscului de contaminare a fermei cu AIS.

144. La determinarea frecvenţei controalelor sanitare pentru compartimentele care au statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte AIS şi al căror statut sanitar privind AIS depinde de statutul sanitar al apelor naturale din vecinătate în care există somon de Atlantic (Salmo salar), riscul de contaminare cu AIS este considerat ridicat.

145. Statutul sanitar “indemn de boală” în ceea ce priveşte AIS se menţine doar atât timp cât toate eşantioanele testate utilizând metodele de diagnostic prevăzute la punctul 149 au rezultate negative pentru virusul anemiei infecţioase a somonului cu deleţie în regiunea cu polimorfism mare şi este exclusă orice suspiciune privind AIS, în conformitate cu metodele de diagnostic prevăzute la capitolul IV, secţiunea a 2-a.

146. O zonă sau un compartiment care are statutul sanitar de categoria a V-a în ceea ce priveşte virusul anemiei infecţioase a somonului cu deleţie în regiunea cu polimorfism mare poate obţine statutul de categoria a III-a cu condiţia că:

1) cerinţele prevăzute la punctele 133-138 sunt îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, să se instaureze vidul sanitar. Fermele în cauză sunt obiectul unei măsuri alternative care să ofere garanţii aproape identice în ceea ce priveşte eradicarea VAIS din mediul fermei;

2) toate fermele declarate în mod oficial infectate şi toate celelalte ferme care au făcut obiectul unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu subpunctul 1), situate în perimetrele de protecţie şi de supraveghere stabilite, sunt repopulate cu peşti provenind din zone sau din compartimente cu statut sanitar de categoria I, a II-a sau a III-a în ceea ce priveşte AIS;

3) repopularea are loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial infectate sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu subpunctul 1);

4) nu a fost confirmată infecţia cu virusul anemiei infecţioase a somonului cu deleţie în regiunea cu polimorfism mare în cursul perioadei de doi ani care a urmat punerii în aplicare a măsurilor menţionate la subpunctele 1), 2) şi 3) şi au fost excluse suspiciunile în cursul acestei perioade, în conformitate cu procedurile stabilite la punctul 150.

147. Ţesuturile care se examinează sunt:

1) histologie: rinichi anterior, ficat, inimă, pancreas, intestin, splină şi branhii;

2) imunohistochimie: rinichi median şi inimă, inclusiv valvele şi bulbus arteriosus;

3) analiza RT-qPCR: rinichi median şi inimă;

4) cultura virusurilor: rinichi median, inimă, ficat şi splină.

148. Este posibilă comasarea fragmentelor de organe care provin de la cel mult cinci peşti.

149. Metoda de diagnostic care trebuie utilizată pentru a obţine sau a menţine statutul sanitar “indemn de boală” în ceea ce priveşte AIS este RT-qPCR, urmată de secvenţierea eşantioanelor pozitive în conformitate cu metodele şi cu procedurile detaliate stabilite în capitolul IV, secţiunea a 2-a.

În cazul în care rezultatul RT-qPCR este pozitiv, se testează eşantioanele suplimentare înainte de punerea în aplicare a primelor măsuri de combatere. Aceste eşantioane trebuie testate după cum urmează în capitolul IV, secţiunea a 2-a.

Examinarea eşantioanelor se efectuează prin RT-qPCR şi include secvenţierea genei HE pentru a verifica deleţia în regiunea cu polimorfism mare şi examinarea în preparate tisulare, cu ajutorul unor anticorpi specifici împotriva VAIS (şi anume, IHC pe secţiuni fixate sau IFAT pe amprente tisulare), sau izolarea şi identificarea VAIS într-o cultură celulară de la cel puţin un eşantion prelevat de la orice peşte care provine din fermă.

150. În cazul în care trebuie confirmată sau exclusă suspiciunea privind AIS, trebuie respectată următoarea procedură în ceea ce priveşte inspecţia, prelevarea de eşantioane şi testarea:

1) ancheta oficială include cel puţin un control sanitar-veterinar şi o prelevare de eşantioane de la 10 peşti muribunzi, în cazul în care se observă semne clinice sau post-mortem compatibile cu AIS. În cazul în care nu se observă semne clinice sau post-mortem compatibile cu AIS, inspecţia sanitară este urmată de prelevarea de eşantioane specifice de la cel puţin 30 de peşti muribunzi sau peşti care au murit recent, cu constituţie normală. Eşantioanele sunt testate în conformitate cu metodele de diagnostic prevăzute la subpunctul 2);

2) în cazul în care rezultatul RT-qPCR este pozitiv pentru virusul anemiei infecţioase a somonului cu deleţie în regiunea cu polimorfism mare, trebuie testate eşantioane suplimentare înainte de punerea în aplicare a primelor măsuri de combatere. Suspiciunea privind infecţia cu VAIS trebuie confirmată în conformitate cu următoarele criterii, utilizând metodele şi procedurile detaliate stabilite în capitolul IV, secţiunea a 2-a: depistarea VAIS prin RT-qPCR, inclusiv secvenţierea genei HE pentru a verifica deleţia în regiunea cu polimorfism mare, precum şi depistarea VAIS în preparate tisulare, cu ajutorul unor anticorpi specifici împotriva VAIS (şi anume, IHC pe secţiuni fixate sau IFAT pe amprente tisulare); sau depistarea VAIS prin RT-qPCR, inclusiv secvenţierea genei HE pentru a verifica deleţia în regiunea cu polimorfism mare; şi izolarea şi identificarea VAIS într-o cultură celulară de la cel puţin un eşantion prelevat de la orice peşte care provine din fermă;

3) în cazul în care sunt prezente semne clinice, modificări patologice macroscopice sau există rezultate histopatologice compatibile cu AIS, rezultatele sunt coroborate în vederea depistării virusului utilizând două metode de diagnostic care au principii de detectare independente, precum RT-qPCR şi IHC.

Suspiciunea privind AIS poate fi exclusă în cazul în care testele şi controalele realizate într-o perioadă de 12 luni de la data la care apare suspiciunea nu furnizează nicio altă dovadă referitoare la prezenţa AIS.

Secţiunea a 2-a

Metode şi proceduri de diagnostic detaliate pentru supravegherea

 şi confirmarea anemiei infecţioase a somonului (AIS)

151. În cazul în care sunt prelevate eşantioane şi sunt realizate examene de laborator în scopul programelor de supraveghere şi de eradicare sau pentru a confirma sau a exclude prezenţa AIS, trebuie aplicate metodele şi procedurile detaliate prevăzute de prezenta secţiune.

152. În scopul examinării de laborator pentru depistarea prezenţei AIS, eşantioanele de peşti nu se comasează, în măsura în care este posibil. În scopul supravegherii AIS, se acceptă comasarea a 2-5 peşti.

153. Se prelevează eşantioane pentru analiza RT-PCR de la toţi peştii care fac parte din eşantion. Se prelevă un fragment de rinichi median de la peşti cu ajutorul unui instrument steril şi acesta se transferă într-un microtub de centrifugare care conţine 1 ml de soluţie de conservare a ARN-ului, cu eficacitate dovedită.

Într-un tub cu soluţie de transport se pot colecta ţesuturi de la cel mult cinci peşti. Acesta constituie un eşantion general. Greutatea ţesutului dintr-un eşantion este de 0,5 g. În cazul în care peştii sunt prea mici pentru a preleva eşantioane cu greutatea necesară, se pot preleva fragmente din rinichi, inimă, splină, ficat sau cecurile pilorice, în această ordine a preferinţelor, pentru a se obţine o greutate de 0,5 g.

154. Ţesuturile destinate unei examinări histologice sunt prelevate numai de la peştii sacrificaţi recent, cu constituţie normală, care prezintă semne clinice sau care au făcut obiectul unor constatări post-mortem compatibile cu prezenţa AIS. Se prelevă orice leziune externă sau internă şi, în toate cazurile, de la fiecare peşte se prelevă, cu ajutorul unui scalpel, eşantioane de rinichi median, de inimă, de ficat, de pancreas, de intestin, de branhii şi de splină, care apoi sunt transferate într-o soluţie salină tamponată cu formol 8-10% (vol/vol). Raportul dintre agentul de fixare şi ţesuturi este de cel puţin 20:1, pentru a garanta o conservare satisfăcătoare a ţesuturilor. Pentru imunohistochimie (IHC) trebuie prelevate eşantioane de rinichi median şi de inimă.

155. Ţesuturile utilizate pentru examinarea virusologică pe cultură celulară se prelevă de la toţi peştii din eşantion. De la peşti se prelevă, cu ajutorul unui instrument steril, fragmente de ficat, de rinichi anterior sau median, de inimă şi de splină, care sunt transferate în tuburi de plastic ce conţin 9 ml de mediu de transport. Într-un tub care conţine soluţie de transport se pot colecta ţesuturi prelevate de la cel mult cinci peşti. Acestea constituie un eşantion general. Greutatea ţesutului dintr-un eşantion este de 1,0 ± 0,5 g.

156. Se transportă peşti întregi către laboratorul acreditat în cazul în care sunt îndeplinite condiţiile termice pe durata transportului. Peştii întregi sunt înfăşuraţi în hârtie absorbantă şi expediaţi într-un sac de plastic.

Pot fi transportaţi peşti vii, dar numai sub supravegherea laboratorului acreditat naţional de referinţă pentru bolile peştilor şi ţinând cont de aspectele suplimentare referitoare la dezinfecţie şi la biosecuritate aferente transportului de peşti vii.

157. Eşantioanele de sânge şi tuburile cu ţesuturi de peşte destinate examenului virusologic sau analizei RT-PCR sunt amplasate în recipiente izolate, cum ar fi cutiile de polistiren cu pereţi groşi, cu o cantitate suficientă de gheaţă sau de blocuri refrigeratoare pentru a asigura refrigerarea eşantioanelor pe durata transportului către laboratorul acreditat. Se evită congelarea şi recipientul de transport trebuie să aibă încă gheaţă în momentul recepţiei sau unul sau mai multe dintre blocurile refrigeratoare să fie încă parţial sau complet îngheţate. În mod excepţional, eşantioanele destinate analizei RT-PCR şi cele destinate examenului virusologic pot fi congelate rapid şi transportate spre laboratorul acreditat la o temperatură de – 20 °C sau mai mică.

158. Pentru analiza RT-PCR a ţesuturilor conservate în RNAlater, extracţia ARN-ului se realizează în următoarele termene, care variază în funcţie de temperatura la care sunt depozitate eşantioanele:

eşantioane depozitate la 37 °C: o zi;

eşantioane depozitate la 25 °C: o săptămână;

eşantioane depozitate la 4 °C: o lună;

eşantioane depozitate la – 20 °C: termen nelimitat.

159. În cazul în care ţesuturile de peşti sunt transportate într-un agent de fixare, în vederea examenului histologic, expedierea se face în tuburi etanşe, amplasate în recipiente rezistente la şoc. Trebuie evitată congelarea acestor eşantioane.

160. Examenul virusologic pe cultură celulară se începe cât mai curând posibil şi cel târziu la 48 de ore după colectarea eşantioanelor. În cazuri excepţionale, examenul virusologic poate începe cel târziu la 72 de ore după colectarea materialului examinat, cu condiţia că acesta este protejat de mediul de transport şi sunt respectate condiţiile de temperatură pe durata transportării.

161. Sub rezerva aprobării de către laboratorul acreditat de diagnostic, se pot colecta şi pregăti alte ţesuturi de peşti decât cele menţionate la secţiunea a 2-a din prezentul capitol, în vederea unor examinări suplimentare.

162. În cazul în care se efectuează examene de laborator în scopul obţinerii sau al menţinerii unui anumit statut sanitar în ceea ce priveşte AIS sau în scopul confirmării prezenţei AIS sau al excluderii suspiciunii privind această boală, trebuie aplicate metodele şi procedurile detaliate prevăzute în secţiunea a 2-a din prezentul capitol.

163. Metoda de diagnostic care trebuie utilizată pentru depistarea VAIS este RT-qPCR. Întrucât rezultatele RT-qPCR pot varia în funcţie de condiţiile în care este realizată metoda, sunt incluse controale şi produse de amplificare pozitive şi negative adecvate, pentru a se evita orice dubiu.

164. Toate manipulările ARN-ului se realizează pe gheaţă, utilizând mănuşi. Se extrage ARN-ul total prin metoda fenol-cloroform sau prin cromatografie de afinitate pe coloane, în conformitate cu instrucţiunile producătorului.

ARN-ul purificat este resuspendat în apă distilată fără ARN-ază (şi anume, apă tratată cu 0,1% pirocarbonat de dietil).

Concentraţia şi puritatea ARN-ului extras este estimată măsurând densitatea optică la 260 nm şi la 280 nm. O metodă alternativă constă în includerea de controale interne care vizează genomul virusului, astfel cum se menţionează la punctul 165.

165. Pot fi utilizate mai multe metode RT-PCR pentru amplificarea genomului VAIS. Se poate efectua RT-PCR în două etape, reacţiile de RT şi de PCR desfăşurându-se în două tuburi distincte. Cu toate acestea, este posibilă şi o reacţie într-o singură etapă, în care cele două reacţii au loc într-un singur tub. Atunci când este posibil, se foloseşte metoda într-o singură etapă, căci utilizarea unui singur tub reduce la minimum riscul de contaminare încrucişată, dat fiind că nu trebuie transferat conţinutul. Se consideră că această metodă are aceeaşi sensibilitate ca şi metoda în două etape.

166. Trebuie utilizaţi primerii şi testul descrişi la acest punct, şi anume perechea de Primeri ILA1 sau ILA2 care vizează segmentul 8 şi care sunt apreciaţi drept adecvaţi pentru depistarea VAIS în cazul focarelor şi la peştii-vector. Primerul antisens ILA2 nu corespunde izolatelor care provin din America de Nord. În aceste cazuri trebuie utilizat un alt primer.

Primer sens (ILA1): 5′-GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;

Primer antisens (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 50 °C timp de 30 de minute; un ciclu la 94 °C timp de 15 minute; 40 de cicluri la 94 °C timp de 30 secunde, la 55 °C timp de 30 de secunde şi la 72 °C timp de 60 de secunde; un ciclu la 72 °C timp de cinci minute. Dimensiunea produsului: 155 pb.

167. Rezultatele PCR pot varia în funcţie de condiţiile în care este realizată metoda, şi anume ar putea fi necesară optimizarea protocoalelor termice, în funcţie de termociclul utilizat. În plus, se pot obţine rezultate fals pozitive din cauza unor erori în ceea ce priveşte ataşarea primerilor sau din cauza contaminării în laboratorul acreditat. Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive şi negative. Cu toate acestea, alternativ, se pot aplica şi alte versiuni de RT-PCR, cu eficacitate similară dovedită.

168. Utilizarea RT-qPCR poate creşte specificitatea şi, probabil, sensibilitatea. Metoda se desfăşoară mai rapid, deoarece nu este necesară etapa electroforezei în gel, şi reduce riscul de contaminare încrucişată, deoarece este posibil să se estimeze cantitatea de ARN viral genomic în tubul cu materialul testat. Un inconvenient al RT-qPCR este faptul că adesea nu este posibilă secvenţierea produselor de amplificare. Cu toate acestea, în cazul în care există îndoieli cu privire la specificitatea produsului de amplificare, trebuie efectuat un alt test specific VAIS în vederea verificării rezultatului.

Trebuie utilizat testul descris la prezentul punct, care vizează segmentul 8. Atunci când este posibil, se foloseşte metoda într-o singură etapă, deoarece testul realizat într-un singur tub reduce la minimum riscul de contaminare încrucişată.

Primer sens: 5′- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;

Primer antisens: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;

sondă: 5′-FAM- CATCGTCGCTGCAGTTC – MGBNFQ-3′.

Pentru fiecare serie de plăci trebuie incluse controale pozitive şi negative. Succesiunea ciclurilor: un ciclu la 50 °C timp de 30 de minute; un ciclu la 95 °C timp de 15 minute; 40 de cicluri la 94 °C timp de 15 secunde, la 60 °C timp de 60 de secunde. Se efectuează ajustări, dacă este necesar. Alternativ, se pot aplica şi alte versiuni de RT-PCR sau de RT-qPCR, cu eficacitate similară dovedită.

169. Secvenţierea produselor PCR amplificate:

Primer sens (ILAs6-3F): 5′-ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;

Primer antisens (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA -3′.

Pentru fiecare serie de plăci se includ controale pozitive şi negative.

Succesiunea ciclurilor (RT-PCR într-o singură etapă): un ciclu la 50 °C timp de 30 de minute; un ciclu la 94 °C timp de 15 minute; 40 de cicluri la 94 °C timp de 30 de secunde, la 55 °C timp de 30 de secunde, la 72 °C timp de 60 de secunde; un ciclu la 72 °C timp de cinci minute. Se efectuează ajustări, dacă este necesar. Alternativ, se pot aplica şi alte versiuni de RT-PCR sau de RT-qPCR, cu eficacitate similară dovedită.

Alternativ, poate fi folosită următoarea metodă de secvenţiere a HPR în segmentul 6:

Primer sens: 5′-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;

Primer antisens: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′.

Dimensiunea produsului: 304 nt dacă HPR0.

Pot fi utilizate teste RT-PCR cu sensibilitate şi specificitate similare celor ale testelor descrise la prezentul punct.

170. Puritatea produsului de amplificare obţinut prin RT-PCR se verifică prin electroforeză în gel înainte de secvenţiere. Dacă apare un singur fragment pur, acesta se purifică direct din reacţia PCR. Dacă sunt prezente mai multe fragmente amplificate, fragmentul care interesează este purificat prin electroforeză în gel. Purificarea fragmentelor PCR din soluţii sau gel de agaroză se efectuează cu ajutorul unor coloane de afinitate pentru fragmente de PCR, în conformitate cu instrucţiunile producătorului.

171. Secvenţierea este efectuată cu ajutorul primerilor de amplificare, de către societăţile externe specializate în secvenţiere. Rezultatele sunt analizate cu ajutorul instrumentului de căutare BLAST, iar secvenţele sunt comparate cu alte secvenţe cunoscute din baza de date de nucleotide a Centrului Naţional de Informaţii Biotehnologice din SUA (National Centre for Biotechnical Information – NCBI).

172. Secvenţierea elimină orice dubiu în ceea ce priveşte specificitatea unui produs amplificat prin RT-PCR.

173. Ţesuturile pot fi păstrate la – 80 °C. Ţesuturile pot fi congelate şi dezgheţate numai o singură dată înaintea examinării acestora. În scopul supravegherii şi al controlului, examinarea se efectuează cât mai rapid posibil.

Fiecare eşantion (amestec de ţesuturi într-o soluţie de transport) este complet omogenizat cu un omogenizator validat, centrifugat la 2 000-4 000 × g timp de 15 minute la 0-6 °C, apoi supernatantul este filtrat (0,45 μm) şi incubat cu un volum egal dintr-un amestec diluat corespunzător de antiseruri contra serotipurilor indigene ale VNPI. Titrul antiserului este de cel puţin 1:2 000 într-un test de neutralizare a plajelor cu 50% reducerea plajelor. Amestecul este incubat timp de o oră la 15 °C. Acesta constituie inoculul.

174. Tratamentul tuturor inoculilor cu antiser împotriva virusului necrozei pancreatice infecţioase (virus care, în anumite regiuni ale Europei, este prezent în 50% din eşantioanele de peşte) are ca scop împiedicarea apariţiei ECP datorat virusului NPI în culturile celulare inoculate. Acest tratament poate fi efectuat pentru reducerea duratei examenelor virusologice, precum şi a numărului de cazuri în care apariţia ECP ar trebui considerată ca un indicator potenţial al VAIS. Atunci când eşantioanele provin din unităţi de producţie considerate indemne de NPI, tratamentul inoculilor cu antiser împotriva virusului NPI poate fi omis.

175. Pentru izolarea primară a virusului AIS trebuie folosite celule de rinichi de la somonul de Atlantic (ASK). Se pot utiliza şi alte linii celulare cu o eficacitate şi o sensibilitate confirmate pentru izolarea VAIS, ţinând cont de variabilitatea tulpinii şi de capacitatea diverselor tulpini de a se reproduce în linii celulare diferite. Celulele ASK par să suporte izolarea şi creşterea izolatelor de virus cunoscute până în prezent, atât timp cât numărul de pasaje este redus. În celulele ASK poate apărea un efect citopatic (ECP) mai clar decât în alte linii celulare sensibile, precum SHK-1 (celule de rinichi anterior de somon-1).

176. Se cultivă celule ASK (maximum 65 de pasaje) într-un mediu L-15 care conţine 10% ser fetal bovin, 2% (vol/vol) de L-glutamină la 200 mM şi 0,08% (vol/vol) de 2-mercaptoetanol la 50 mM în plăci multigodeu. Se inoculează o suspensie de organe tratată cu antiser în culturi celulare tinere în fază de creştere activă, în scopul obţinerii unei diluţii finale a materialului tisular într-un mediu de cultură celulară de 1:1 000. Pentru fiecare organ, se adaugă 40 μl din suspensia de inocul la un godeu care conţine 2 ml de mediu de cultură celulară. Pentru a reduce la minimum riscul contaminării încrucişate, se utilizează plăci separate, cu douăsprezece sau douăzeci şi patru de godeuri, în cazul eşantioanelor care provin din situri de acvacultură diferite.

177. Se păstrează o placă neinoculată care va servi drept control negativ. Se inoculează o altă placă cu un izolat de referinţă al VAIS, care va servi drept control pozitiv, şi se procedează în felul următor: se inoculează 100 μl dintr-un preparat stoc de VAIS (titru minim 10⁷ doza infectantă pentru 50% din culturile celulare (TCID 50 ml^{– 1})) în primul godeu şi se amestecă. Se transferă un volum din această materie din primul în al doilea godeu pentru a se obţine o diluţie de 1:10 şi se amestecă. Se repetă operaţiunea pe întreaga placă pentru a se obţine şase diluţii de 1:10. Preparatul stoc de VAIS poate fi depozitat la – 80 °C timp de cel puţin doi ani.

Cu toate acestea, o dată dezgheţat, acesta este utilizat în termen de trei zile. Se iau măsuri pentru prevenirea contaminării încrucişate a plăcilor de testare cu materialul controlului pozitiv. Сontroalele pozitive se aşază separat şi se manipulează separat de plăcile de testare. Ca alternativă la includerea unui control pozitiv pentru fiecare inoculare, se poate realiza la fiecare şase luni un test de sensibilitate a celulelor ASK la izolatele VAIS.

178. Se incubează eşantioanele la 15 ± 2 °C timp de cel mult 15 zile. Se examinează culturile celulare de două ori la microscop pentru depistarea ECP, mai întâi între a cincea şi a şaptea zi, apoi între a douăsprezecea şi a paisprezecea zi de la inoculare. Dacă un amestec prezintă ECP, se iniţiază imediat proceduri de identificare a virusului în conformitate cu punctele 180-181. În cazul în care nu se observă niciun ECP până în a paisprezecea zi, se efectuează un test de imunofluorescenţă indirectă (IFAT), un test de hemadsorbţie sau RT-PCR.

179. Subcultivarea se va efectua între a treisprezecea şi a cincisprezecea zi. Se adaugă supernatant de cultură în godeurile de pe plăci multigodeu care conţin celule proaspete în fază activă de creştere, la o diluţie adecvată (1/10), apoi se lasă să incubeze la 14 ± 2 °C timp de cel mult 18 zile. Se examinează culturile celulare de două ori la microscop pentru depistarea ECP, mai întâi între a cincea şi a şaptea zi, apoi între a paisprezecea şi a optsprezecea zi de la inoculare. Dacă un amestec prezintă ECP, se iniţiază imediat procedurile de identificare a virusului în conformitate cu punctele 180-181.

Dacă între a paisprezecea şi a optsprezecea zi nu se observă ECP, se efectuează un test de hemadsorbţie sau RT-PCR. Dacă în decurs de şapte zile de la incubaţie se observă un efect citotoxic, se realizează o subcultivare în acest stadiu şi se lasă celulele la incubat timp de 14 până la 18 zile, apoi celulele sunt supuse unei noi subcultivări cu durata de incubaţie de 14 până la 18 zile. Dacă efectul citotoxic apare după şapte zile, se realizează o singură subcultivare şi celulele se lasă la incubat astfel încât să se ajungă la un număr total de 28 până la 36 de zile de incubaţie de la prima inoculare.

În cazul contaminării bacteriene a culturii primare, se reia testul, pe un omogenat de ţesuturi depozitat la – 80 °C. Înaintea inoculării, omogenatul de ţesuturi este centrifugat la 4 000 × g timp de 15-30 de minute, la o temperatură cuprinsă între 0 şi 6 °C, iar supernatantul este filtrat la 0,22 μm. Dacă are loc contaminarea bacteriană în cursul fazei de subcultivare, supernatantul se filtrează la 0,22 μm, se inoculează unor celule proaspete şi se lasă la incubat o nouă perioadă de 14 până la 18 zile.

180. În cazul depistării ECP, indiferent de stadiu, sau în cazul unui test de hemadsorbţie pozitiv, se efectuează identificarea virusului. Metodele de predilecţie pentru identificarea VAIS sunt RT-PCR în conformitate cu punctul 163 şi imunofluorescenţa (IF) conform punctelor 184-185.

181. Dacă se suspectează prezenţa altor virusuri, să se efectueze teste suplimentare de identificare a virusului. În cazul în care testele respective nu au permis identificarea definitivă a virusului într-o săptămână, supernatantul se trimite pentru identificare imediată:

1) laboratorului acreditat de referinţă al Organizaţiei Mondiale pentru Sănătatea Animalelor (OIE) în ceea ce priveşte AIS; sau

2) unui laborator acreditat naţional de referinţă sau unui laborator acreditat de referinţă internaţional pentru bolile peştilor.

182. Replicarea VAIS în culturile celulare nu are întotdeauna drept rezultat apariţia ECP, fiecare godeu este supus unui test RT-PCR sau unui test de hemadsorbţie în conformitate cu prezentul punct sau unui test IF în conformitate cu punctele 184-185.

183. Se efectuează o prelevare din mediul de cultură celulară din fiecare godeu, inclusiv din godeurile controalelor pozitive şi negative, şi se introduce în tuburi sterile etichetate. La fiecare godeu se adaugă 500 μl de suspensie 0,2% (vol/vol) de globule roşii de iepure sau de cal spălate sau de suspensie 0,05% (vol/vol) de globule roşii de păstrăv-curcubeu sau de somon de Atlantic spălate şi se lasă să incubeze la temperatura camerei timp de 45 de minute. Se îndepărtează globulele roşii şi se spală fiecare godeu de două ori cu mediul L-15. Fiecare godeu este examinat la microscop.

Prezenţa ciorchinelui de globule roşii aderând la suprafaţa celulelor ASK indică prezenţa probabilă a infecţiei cu un ortomixovirus. Dacă testul de hemadsorbţie este pozitiv, se efectuează imediat un test de identificare a virusului în conformitate cu punctele 180-181.

184. Se cultivă celule ASK (maximum 65 de pasaje) într-un mediu L-15 care conţine 10% ser fetal bovin, 2% (vol/vol) de L-glutamină la 200 mM şi 0,08% (vol/vol) de 2-mercaptoetanol la 50 mM în plăci multigodeu, cu o confluenţă mai mare de 50%. Se pot utiliza şi alte linii celulare sau un mediu de cultură cu o eficacitate dovedită. Se adaugă 225 μl de supernatant de cultură presupusă a fi infectată de virus în fiecare din cele două godeuri, se amestecă şi se transferă 225 μl în alte două godeuri, la o diluţie de 1:5. Alte două godeuri se lasă neinoculate, pentru a servi drept controale. Eşantioanele de la diferite ferme piscicole se tratează pe plăci separate, la fel ca şi controalele. Virusul se controlează pe un izolat de referinţă al VAIS.

Plăcile se incubează la 14 ± 2 °C şi sunt examinate la microscop timp de cel mult şapte zile. Dacă se observă ECP într-un stadiu incipient sau dacă nu se observă ECP în termen de şapte zile, etapa următoare este fixarea. Se spală godeurile cu tampon fosfat salin (PBS) şi se fixează prin incubare cu acetonă 80%, timp de 20 de minute, la temperatura camerei. Plăcile sunt lăsate să se usuce la aer şi apoi se colorează imediat sau sunt depozitate la o temperatură de 0-6 °C timp de cel mult 24 de ore înainte de colorare.

185. Godeurile duplicate se colorează cu un amestec de anticorpi monoclonali 3H6F8 şi 1OC9F5 anti-VAIS sau cu un alt anticorp monoclonal cu o eficacitate şi o specificitate dovedite, se diluează în PBS şi se lasă la incubat la o temperatură de 37 ± 4 °C, timp de 30 de minute. Se îndepărtează anticorpii monoclonali şi se spală plăcile de trei ori cu Tween 20 0,05% în PBS. Conjugatul IgG marcat cu FITC (izotiocianat de fluoresceină) antişoarece diluat în PBS, trebuie adăugat în fiecare godeu şi incubat la temperatura de 37 ± 4 °C timp de 30 de minute. Diluţiile de la loturi diferite de anticorpi monoclonali şi conjugatul FITC trebuie optimizate în fiecare laborator acreditat. Se îndepărtează anticorpul şi se spală plăcile de trei ori cu Tween 20 0,05% în PBS.

Se examinează imediat godeurile la un microscop inversat, echipat pentru examinarea fluorescenţei cu un filtru corespunzător pentru stimularea FITC. Un test este considerat pozitiv, dacă se observă celule fluorescente. Pentru ca un test să fie valabil, controalele pozitive trebuie să dea un rezultat pozitiv, iar cele negative un rezultat negativ.

186. Tehnica, menţionată la punctele 182-183, poate fi aplicată şi altor ţesuturi de peşte, precum ficatul, splina şi inima, cu condiţia ca pe lamă să se poată depune o cantitate suficientă de celule endoteliale, de leucocite sau de limfocite. Procedura de colorare este identică pentru toate ţesuturile, chiar dacă pentru unele dintre acestea este preferabil să se renunţe la colorarea cu iodură de propidiu şi să se utilizeze iluminarea în faze pentru identificarea tipurilor de celule, prezente pe amprentă.

187. Secţiunile, incluse în parafină, sunt tăiate la 5 μm şi colorate folosindu-se hematoxilină şi eozină.

188. În cazul somonului de Atlantic care prezintă semne clinice ale bolii, modificările histologice sunt variabile, dar pot include următoarele elemente:

1) numeroase eritrocite în sinusul venos central şi în capilarele lamelare ale branhiilor, unde se pot forma şi trombi de eritrocite;

2) peteşii multifocale sau confluente sau necroza hepatocitelor, sau ambele, la o anumită distanţă de vasele de sânge mai mari din ficat; acumulare multifocală de eritrocite în sinusoidele hepatice dilatate;

3) acumulare de eritrocite în vasele de sânge din lamina propria intestinală şi, în cele din urmă, hemoragie în lamina propria;

4) distensia stromei splinei, din cauza acumulării de eritrocite;

5) hemoragie interstiţială uşoară şi multifocală până la extinsă şi difuză, cu necroză tubulară în zonele afectate de hemoragie, acumulare de eritrocite în glomerulii renali;

6) eritrofagocitoză în splină şi hemoragii secundare în ficat şi rinichi.

189. Cele mai puternice reacţii de colorare pozitive sunt obţinute, în mod obişnuit, în celulele endoteliale din inimă şi din rinichi. Colorarea celulelor endoteliale poate fi slabă sau inexistentă la nivelul leziunilor hemoragice foarte extinse, eventual din cauza lizei celulelor endoteliale infectate.

190. Anticorpii policlonali împotriva nucleoproteinelor VAIS trebuie utilizaţi pe secţiuni de ţesuturi fixate cu formol şi incluse în parafină. Organele care urmează a fi examinate sunt rinichiul median şi inima (inclusiv zona de tranziţie, toate cele trei camere şi valvele). Cazurile suspecte din cauza semnelor patologice se verifică prin intermediul unui test IHC pozitiv. Secţiunile histologice se pregătesc în conformitate cu metodele standard.

191. Ţesuturile trebuie fixate cu ajutorul unei soluţii neutre de formol 10% tamponate cu fosfat timp de cel puţin o zi, apoi sunt deshidratate prin băi de etanol succesive, clarificate în xilen şi incluse în parafină, în conformitate cu protocoalele standard. Secţiunile de aproximativ 5 μm grosime (pentru IHC pe lame acoperite cu poli-L-lizină) sunt încălzite la 56 °C-58 °C (maximum 60 °C) timp de 20 minute, deparafinate în xilen, rehidratate prin intermediul unor băi de etanol succesive şi colorate cu hematoxilină şi eozină, în vederea analizei patomorfologice şi a imunohistochimiei.

192. Pentru IHC, toate incubaţiile se efectuează la temperatura camerei pe platforma de basculare, cu excepţia cazului în care se prevede altfel în prezenta decizie:

1) extragerea antigenului se face prin fierberea secţiunilor în 0,1 M de soluţie tampon de citrat cu pH 6,0 timp de 2 × 6 minute, urmată de blocare cu 5% lapte degresat uscat şi 2% ser de capră în 50 mM TBS (TBS; Tris/HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,6), timp de 20 de minute;

2) secţiunile se incubează peste noapte cu anticorp primar (anticorp monospecific de iepure împotriva nucleoproteinelor VAIS) diluat în TBS cu 1% lapte degresat uscat, apoi se spală de trei ori în TBS cu Tween 20 0,1%;

3) pentru detectarea anticorpilor legaţi, secţiunile se incubează timp de 60 de minute cu anticorpi anti-IgG de iepure conjugaţi cu fosfatază alcalină. După o ultimă spălare, se adaugă Fast Red (1 mg ml^{– 1}) şi naftol AS-MX fosfat (0,2 mg ml^{– 1}) cu 1 mM levamisol în 0,1 M TBS (pH 8,2) şi se lasă să se dezvolte timp de 20 de minute. Secţiunile sunt apoi spălate cu apă de la robinet, înainte de contracolorarea cu hematoxilină Harris şi montarea într-un mediu apos. La fiecare etapă trebuie incluse secţiuni de ţesuturi pozitive şi negative la VAIS, drept controale.

193. Secţiunile de control sunt considerate pozitive atunci când se observă că citoplasma şi interiorul nucleului celulelor endoteliale din vasele de sânge ale endocardului au o culoare roşie (roşiatică), vizibilă în mod clar. O secţiune dintr-un eşantion utilizat pentru testare este considerată pozitivă numai dacă se observă în mod clar o colorare în roşu a interiorului nucleului celulelor endoteliale.

Secţiunile de control sunt considerate negative dacă nu au nicio reacţie de colorare semnificativă. Având în vedere că localizarea în interiorul nucleului este specifică nucleoproteinei ortomixovirusului într-o etapă de replicare a virusului, însă predomină adesea o colorare citoplasmatică concomitentă, zonele de colorare citoplasmatice şi de alte tipuri care nu sunt localizate în interiorul nucleului sunt considerate nespecifice sau neconcludente.

Capitolul V

METODE DE SUPRAVEGHERE ŞI DE DIAGNOSTICĂ ÎN CEEA

CE PRIVEŞTE INFECŢIA CU MARTEILIA REFRINGENS

Secţiunea 1

Cerinţe referitoare la obţinerea şi menţinerea statutului sanitar

“indemn de boală” în ceea ce priveşte infecţia cu Marteilia refringens

194. Controalele sanitar-veterinare şi, după caz, prelevarea de eşantioane pentru examenele de laborator în ceea ce priveşte infecţia cu Marteilia refringens, boală cauzată de protozoarul Marteilia refringens, se efectuează în perioada din an în care se ştie că prevalenţa parazitului este maximă în zonă sau în compartiment. Atunci când astfel de date nu sunt disponibile, prelevarea de eşantioane se efectuează imediat după ce temperatura apei a depăşit 17 °C.

195. În cazul în care se prelevează eşantioane de la moluşte în conformitate cu cerinţele stabilite în capitolul respectiv, se aplică următoarele criterii:

1) dacă Ostrea spp. şi Mytilus spp. sunt prezente în unităţile de producţie sau în aria de producţie, ambele genuri sunt reprezentate în mod egal în eşantioane. În cazul în care este prezent doar unul dintre genuri, genul respectiv este inclus în eşantion. În cazul în care nu este prezent nici genul Ostrea, nici genul Mytilus, eşantionul este reprezentativ pentru toate celelalte specii sensibile prezente;

2) dacă în unităţile de producţie sunt prezente moluşte slăbite, cu cochilia deschisă sau care au murit recent, dar care nu sunt încă descompuse, sunt selectate, în principal, acestea. În absenţa unor astfel de moluşte, moluştele selectate includ moluştele sănătoase cu vârsta cea mai mare;

3) atunci când se efectuează eşantionarea în cadrul fermelor de moluşte, în care se utilizează mai mult de o sursă de apă pentru producţia de moluşte, trebuie incluse în eşantion moluşte care reprezintă toate sursele de apă, în aşa fel încât toate părţile fermei să fie reprezentate proporţional în eşantion;

4) atunci când se efectuează eşantionarea în zone de cultivare a moluştelor, trebuie incluse în eşantion moluşte dintr-un număr suficient de puncte de prelevare, în aşa fel încât toate părţile zonei de cultivare a moluştelor să fie reprezentate proporţional în eşantion. Principalii factori care trebuie avuţi în vedere pentru selectarea acestor puncte de prelevare sunt punctele de prelevare anterioare, în care a fost detectat Marteilia refringens, densitatea stocurilor, curenţii, prezenţa speciilor sensibile, prezenţa speciilor-vector, batimetria şi practicile de gestionare. Bancurile naturale trebuie incluse în eşantionare.

196. O zonă sau un compartiment cu statut sanitar de categoria a III-a în ceea ce priveşte infecţia cu Marteilia refringens poate obţine statutul sanitar de categoria I cu privire la această boală, atunci când toate fermele sau zonele de cultivare a moluştelor care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză au făcut obiectul programului de supraveghere de doi ani, care include controale sanitare şi colectarea de eşantioane în vederea testării.

197. Programul de supraveghere de doi ani include fermele sau zonele de cultivare a moluştelor care au făcut obiectul controalelor sanitare şi al eşantionării timp de o perioadă minimă de doi ani consecutivi, astfel cum se prevede în tabelul nr.11 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară. În această perioadă de doi ani, testarea tuturor eşantioanelor a avut rezultate negative în ceea ce priveşte Marteilia refringens şi a fost exclusă orice suspiciune privind Marteilia refringens.

Atunci când Ostrea edulis, Mytilus edulis sau Mytilus galloprovincialis provenind dintr-o zonă sau dintr-un compartiment cu statut sanitar de categoria I sunt incluse în eşantion, acestea sunt introduse în fermă sau în zona de cultivare a moluştelor cel puţin în primăvara imediat precedentă perioadei în care se desfăşoară programul de supraveghere.

198. Eradicarea bolii Marteilia refringens este considerată imposibilă în cea mai mare parte a cazurilor, însă atunci când Agenţia consideră că acest lucru este fezabil, se aplică un program de eradicare.

O zonă sau un compartiment cu statut sanitar de categoria a V-a în ceea ce priveşte infecţia cu Marteilia refringens poate obţine statutul sanitar de categoria I în ceea ce priveşte această boală, atunci când toate fermele sau zonele de cultivare a moluştelor care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză au făcut obiectul programului de eradicare.

199. Este instaurată o zonă de izolare, care include un perimetru de protecţie şi un perimetru de supraveghere, în vecinătatea fermei (fermelor) sau a zonei (zonelor) de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectată (infectate) cu Marteilia refringens.

Zona de izolare este definită de la caz la caz, luând în considerare factorii care influenţează riscurile de răspândire a Marteilia refringens, cum ar fi: numărul, vârsta, rata mortalităţii şi distribuţia cazurilor de mortalitate a moluştelor în ferma sau în zona de cultivare a moluştelor infectată cu Marteilia refringens, incluzând moluştele sălbatice; distanţa la care se găsesc fermele învecinate sau zonele de cultivare a moluştelor învecinate, precum şi densitatea acestora, incluzând moluştele sălbatice; proximitatea faţă de unităţile de prelucrare, fermele cu care se intră în contact sau zonele de cultivare a moluştelor; speciile, în special speciile sensibile şi speciile-vector prezente în ferme sau în zonele de cultivare a moluştelor; practicile de acvacultură aplicate în fermele şi în zonele de cultivare a moluştelor afectate, precum şi în cele aflate în vecinătate; condiţiile hidrodinamice şi alţi factori pertinenţi din punct de vedere epidemiologic care sunt identificaţi.

Pentru stabilirea perimetrului de protecţie şi a celui de supraveghere se aplică următoarele cerinţe minime:

1) un perimetru de protecţie este stabilit în imediata vecinătate a fermei sau a zonei de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectată cu Marteilia refringens. Acesta trebuie să corespundă unei zone stabilite în baza unor date hidrodinamice sau epidemiologice corespunzătoare;

2) un perimetru de supraveghere este stabilit în afara perimetrului de protecţie. Acesta trebuie să corespundă unei zone situate în jurul perimetrului de protecţie, stabilită în baza unor date hidrodinamice sau epidemiologice corespunzătoare.

200. Toate fermele şi zonele de cultivare a moluştelor care deţin speciile sensibile din perimetrul de protecţie şi care nu sunt în mod oficial declarate ca infectate cu Marteilia refringens sunt supuse unei anchete oficiale care cuprinde cel puţin colectarea de eşantioane pentru testarea a 150 de moluşte după începutul perioadei de transmitere a Marteilia refringens. În cazul în care nu se cunoaşte perioada de transmitere, eşantionarea se începe după ce temperatura apei depăşeşte 17 °C.

201. Toate fermele şi zonele de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectate cu Marteilia refringens sunt golite şi supuse unui vid sanitar şi, dacă este posibil, sunt curăţate şi dezinfectate.

202. Durata perioadei de vid sanitar este de cel puţin:

1) două luni în cazul fermelor şi al zonelor de cultivare a moluştelor cu legături limitate cu apele înconjurătoare, precum cele ale incubatoarelor şi ale pepinierelor;

2) două luni în cazul fermelor şi al zonelor de cultivare a moluştelor care au legături nelimitate cu apele înconjurătoare, cu condiţia că moluştele infectate care aparţin speciilor sensibile şi moluştele din speciile sensibile care au legături epidemiologice cu ferma infectată sau cu zona de cultivare a moluştelor infectată sunt recoltate sau eliminate înainte de perioada din an în care se ştie că prevalenţa Marteilia refringens este maximă sau în cazul în care nu se cunoaşte această perioadă, înainte de perioada în care temperatura apei depăşeşte 17 °C;

3) 14 luni în cazul fermelor şi al zonelor de cultivare a moluştelor care au legături nelimitate cu apele înconjurătoare, cu condiţia că moluştele infectate care aparţin speciilor sensibile şi moluştele din speciile sensibile care au legături epidemiologice cu ferma infectată sau cu zona de cultivare a moluştelor infectată nu sunt eliminate înainte de perioada din an în care se ştie că prevalenţa Marteilia refringens este maximă sau în cazul în care nu se cunoaşte această perioadă, atunci când moluştele din speciile sensibile nu sunt recoltate sau eliminate înainte de perioada în care temperatura apei depăşeşte 17 °C.

203. După golirea tuturor fermelor şi a zonelor de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectate, se respectă o perioadă de vid sanitar sincronizat de cel puţin patru săptămâni.

204. Agenţia, după caz, în baza unei evaluări a riscurilor, poate decide să solicite golirea, curăţarea, dezinfecţia şi o perioadă de vid sanitar pentru alte ferme sau zone de cultivare a moluştelor, care se află în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite. Durata perioadei de vid sanitar este stabilită de către Agenţie, în baza unei evaluări a riscurilor.

205. Toate fermele sau zonele de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectate şi toate celelalte ferme sau zone de cultivare a moluştelor care au făcut obiectul unui vid sanitar, situate în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite, sunt repopulate cu moluşte care provin din zone sau din compartimente cu un statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte infecţia cu Marteilia refringens. Repopularea are loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial infectate sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar.

206. Toate fermele şi zonele de cultivare a moluştelor care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul care fac obiectul programului de eradicare sunt obiectul programului de supraveghere.

207. În cazul în care este necesară o supraveghere individualizată pentru menţinerea statutului sanitar de categoria I, toate fermele sau zonele de cultivare a moluştelor care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză sunt supuse controalelor sanitare şi eşantionării, în conformitate cu tabelul nr.12 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară, ţinând cont de nivelul riscului de contaminare a fermei sau a zonei de cultivare a moluştelor cu Marteilia refringens.

208. Statutul sanitar “indemn de boală” se poate menţine doar atât timp cât toate eşantioanele testate utilizând metodele de diagnostic prevăzute la punctul 211 au rezultate negative pentru Marteilia refringens şi orice suspiciune privind Marteilia refringens este exclusă.

209. O zonă sau un compartiment care are statutul sanitar de categoria a V-a în ceea ce priveşte infecţia cu Marteilia refringens poate obţine statutul sanitar de categoria a III-a cu privire la această boală, cu condiţia că:

1) cerinţele prevăzute la punctele 198-204 sunt îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, să se instaureze vidul sanitar. Fermele în cauză să ofere garanţii aproape identice în ceea ce priveşte eradicarea Marteilia refringens din mediul fermei;

2) toate fermele sau zonele de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectate şi toate celelalte ferme sau zone de cultivare a moluştelor care au făcut obiectul unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu punctul 1), situate în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite, sunt repopulate cu moluşte care provin din zone sau din compartimente cu un statut sanitar de categoria I, a II-a sau a III-a în ceea ce priveşte infecţia cu Marteilia refringens;

3) repopularea are loc numai după ce toate fermele sau zonele de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectate sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu subpunctul 1);

4) nu a fost confirmată infecţia cu Marteilia refringens în cursul perioadei de doi ani care a urmat punerii în aplicare a măsurilor menţionate la subpunctele 1), 2) şi 3) şi au fost excluse suspiciunile în cursul acestei perioade în conformitate cu procedurile stabilite la punctul 212.

210. Animalul întreg se trimite la laboratorul acreditat pentru efectuarea testelor de diagnostic prevăzute la secţiunea a 2-a din prezentul capitol.

211. Metodele de diagnostic care trebuie utilizate pentru obţinerea sau menţinerea statutului sanitar “indemn de boală” în ceea ce priveşte infecţia cu Marteilia refringens în conformitate cu metodele şi cu procedurile de diagnostic detaliate stabilite în secţiunea a 2-a, sunt examenul histopatologic, amprentele tisulare sau PCR.

212. În cazul în care este necesară confirmarea sau excluderea suspiciunii privind infecţia cu Marteilia refringens, trebuie respectate următoarele proceduri cu privire la inspecţia, prelevarea de eşantioane şi testarea:

1) ancheta oficială cuprinde cel puţin o prelevare de eşantioane de la 30 de moluşte din speciile sensibile, în cazul în care suspiciunea respectivă se bazează pe un raport de mortalitate, sau, dacă nu, de la 150 de moluşte din speciile sensibile, după începutul perioadei de transmitere a Marteilia refringens. În cazul în care nu se cunoaşte perioada de transmitere, eşantionarea se începe după ce temperatura apei depăşeşte 17 °C;

2) eşantioanele se testează folosind metodele de diagnostic stabilite la subpunctul 1) în conformitate cu metodele şi cu procedurile de diagnostic detaliate stabilite în capitolului V, secţiunea a 2-a.

Prezenţa Marteilia refringens este considerată confirmată atunci când un rezultat pozitiv obţinut prin examen histopatologic, amprente tisulare sau hibridare in situ este asociat unui rezultat pozitiv obţinut prin PCR şi completat prin secvenţiere. Suspiciunea de infecţie cu Marteilia refringens poate fi exclusă în cazul în care testele nu sunt pozitive la prezenţa Marteilia refringens.

Secţiunea a 2-a

Metode şi proceduri de diagnostic detaliate pentru supravegherea

şi confirmarea infecţiei cu Marteilia refringens

213. În cazul în care sunt prelevate eşantioane şi sunt realizate examene de laborator în scopul obţinerii sau al menţinerii unui anumit statut sanitar în ceea ce priveşte infecţia cu Marteilia refringens sau în scopul confirmării prezenţei acestei boli sau al excluderii suspiciunii privind aceasta, se folosesc metodele şi procedurile de diagnostic detaliate prevăzute în secţiunea respectivă.

214. Moluştele cu cochilia deschisă sau care au murit recent sunt selectate cu prioritate, pentru a spori şansele de a găsi animale infectate.

Odată selecţionate, stridiile sau midiile se păstrează la 4 °C sau refrigerate pe gheaţă, timp de maximum 24 de ore dacă eşantioanele includ moluşte cu cochilia deschisă şi timp de maximum 72 de ore în caz contrar, într-o pungă de plastic, cu o etichetă care cuprinde detaliile referitoare la natura şi originea stridiilor sau a midiilor. Moluştele cu cochilia deschisă sau care au murit recent sunt păstrate separat de alte moluşte.

Pentru diagnosticarea Marteilia refringens, prin histologie, se utilizează o secţiune de ţesuturi cu o grosime de 3-5 mm, care include branhii şi ţesut cardiac. O porţiune de glandă digestivă este utilizată pentru anumite teste, inclusiv pentru amprente şi pentru reacţia în lanţ a polimerazei (PCR).

215. Citologia (tehnica citologică de colorare) ca tehnică de microscopie se aplică în modul următor: după uscarea ţesuturilor de glandă digestivă pe o hârtie absorbantă, se realizează mai multe amprente pe o lamă din sticlă. Lamele sunt lăsate să se usuce la aer, se fixează în metanol sau în etanol absolut şi se colorează cu ajutorul unui kit de colorare disponibil în comerţ, precum Diff-Quik®/Hemacolor®, în conformitate cu instrucţiunile producătorului. După spălare cu apă de la robinet şi uscare, lamele se acoperă cu o lamelă cu ajutorul unei răşini sintetice adecvate. Lamele sunt analizate mai întâi la un grosisment de × 200 şi apoi în imersiune în ulei, la un grosisment de × 1 000.

216. Un rezultat pozitiv constă în observarea unor celule ale căror dimensiuni variază între 30-40 μm. Citoplasma este bazofilă, iar nucleul este eozinofil. Se observă halouri pale în jurul granulelor mari, puternic colorate (refringente), iar în cazul celulelor de dimensiuni mai mari se observă o dispunere de tip “celulă în celulă”.

Tehnica nu este specifică acestei specii de parazit.

217. Histologia ca tehnica de microscopie se aplică în modul următor: se fixează secţiuni de ţesut care includ branhii, glanda digestivă, mantaua şi gonadele timp de cel puţin 24 de ore în fixator Davidson, urmând o prelucrare normală pentru examenul histologic după includerea în parafină şi colorare, cu hematoxilină şi eozină. Observaţiile trebuie efectuate la grosismente succesive, de maximum × 1 000.

Un rezultat pozitiv constă în observarea unor celule ale căror dimensiuni variază între 4 şi 40 μm. Primele etape constau în celule multinucleate, de formă sferică până la alungită. Acestea se găsesc, în special, în epiteliul esofagului şi al stomacului şi uneori în palpii labiali. Sporulaţia implică diviziunea de celule în interiorul celulelor şi are loc în tubulii şi în conductele glandei digestive. Granulele refringente apar în cursul sporulaţiei, dar nu se observă în stadiile incipiente. În fazele tardive ale infecţiei, se observă sporangi liberi în lumenul tubului digestiv. Citoplasma este bazofilă, iar nucleul este eozinofil. Culoarea granulelor poate varia de la portocaliu intens la roşu intens.

Tehnica nu este specifică acestei specii de parazit.

218. ADN-ul este extras în conformitate cu procedurile standard. Pot fi utilizate şi alte kituri de extracţie a ADN-ului, care permit, de obicei, obţinerea unui ADN de înaltă calitate, ce poate fi utilizat în protocoalele PCR menţionate la punctele 219-223.

219. Pentru reacţia în lanţ a polimerazei (PCR), trebuie utilizaţi primeri PCR care vizează regiunea spaţierii transcrise intern (ITS1), deoarece aceştia pot amplifica numai Marteilia refringens.

220. Reacţia PCR se efectuează într-un volum de 50 μl. Amestecurile pentru PCR trebuie să conţină tampon (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl (pH 9,0 la 25 °C) şi 1% Triton® X-100), 2,5 mM MgCl2, 0,2 mM amestec dNTP, 1 μM primer sens şi antisens, 0,02 unităţi μl^{– 1} polimerază ADN Taq şi 10-100 ng de ADN extras. După denaturarea ADN-ului timp de cinci minute la 94 °C, se efectuează 30 de cicluri după cum urmează: denaturare la 94 °C timp de un minut, ataşare la 55 °C timp de un minut, elongaţia la 72 °C timp de un minut per 1 000 de perechi de baze. Trebuie efectuată o etapă de elongaţie finală de 10 minute la 72 °C. Pentru detectarea Marteilia refringens, PCR se efectuează cu primeri care vizează regiunea ITS1 (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3′ şi 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).

221. Controalele pozitive constau în ADN-ul genomic al unei gazde cu o infecţie pronunţată sau în ADN plasmidic, care include regiunea vizată.

222. Controalele negative constau în ADN-ul genomic al unor gazde neinfectate şi în reactivi PCR fără ADN ţintă.

223. Un rezultat pozitiv constă într-un produs de amplificare pozitiv de mărimea preconizată (412 pb), toate controalele negative având rezultate negative şi toate controalele pozitive având rezultate pozitive.

224. Pentru hibridare in situ (IHS), trebuie utilizată o sondă care vizează subunitatea mică din complexul de gene al ARNr, deoarece aceasta a fost validată în raport cu histologia.

225. Trebuie fixate secţiuni de ţesut care includ branhii şi glanda digestivă timp de cel puţin 24 de ore în fixator Davidson, urmând o prelucrare normală pentru examenul histologic, după includerea în parafină. Se decupează secţiuni de 5 μm şi se aşază pe lame acoperite cu aminoalchilsilan, apoi se incubează în timpul nopţii într-o etuvă la 40 °C. Secţiunile sunt deparafinate prin scufundarea în xilen timp de 10 minute. Această etapă va fi repetată o singură dată şi apoi solventul se elimină prin scufundare în două băi succesive de etanol absolut de 10 minute fiecare. Secţiunile sunt apoi deshidratate prin imersie în băi succesive de etanol. Secţiunile sunt tratate cu proteinaza K (100 μg ml^{– 1}) într-un tampon TE (Tris (50 mm), EDTA (10 mm)), la 37 °C timp de 30 de minute. Lamelele sunt deshidratate prin imersie în băi succesive de etanol şi apoi uscate la aer. Secţiunile sunt incubate cu 100 μl de tampon de hibridare (4 × SSC (soluţie salină de citrat), formamidă 50%, 1 × soluţie Denhardt, 250 μg ml^{– 1} ARNt din drojdie, sulfat de dextran 10%) conţinând 10 ng (1 μl din reactanţii PCR, pregătiţi astfel cum se descrie în prezenta secţiune, utilizând Primerii CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG şi TTC-GGG-TGG-TCT-TGA-AAG-GC) din sonda marcată cu digoxigenină. Secţiunile sunt acoperite cu lamele de plastic pentru hibridare in situ şi sunt aşezate pe un bloc de încălzire la 95 °C timp de cinci minute. Lamele trebuie apoi răcite pe gheaţă timp de un minut înainte de hibridarea la 42 °C timp de o noapte într-o etuvă umedă. Secţiunile se spală de două ori timp de cinci minute în 2 × SSC la temperatura camerei şi o dată timp de 10 minute în 0,4 × SSC la 42 °C. Etapele de detectare se efectuează în conformitate cu instrucţiunile producătorului. Lamele sunt apoi clătite în apă distilată sterilă (dH2O). Secţiunile sunt contracolorate cu Bismarck Brown Yellow şi clătite în dH2O. Acestea se acoperă cu lamele, utilizând un mediu de montare apos. Controalele pozitive şi negative sunt secţiuni de la gazde despre care se ştie că sunt infectate şi, respectiv, neinfectate.

226. Rezultatul pozitiv trebuie stabilit prin colorarea în violet-negru a celulelor Marteilia refringens în ţesuturile-ţintă cunoscute, toate controalele negative având rezultate negative şi toate controalele pozitive având rezultate pozitive.

227. Secvenţierea este una dintre ultimele etape necesare pentru confirmarea diagnosticului. Regiunile vizate sunt subunitatea mică a ADNr şi ITS1.

228. În scopul programelor de supraveghere şi pentru a confirma prezenţa unei infecţii cu Marteilia refringens sau pentru a exclude suspiciunea privind această boală, metodele de diagnosticare şi procedurile aferente sunt în conformitate cu orientările stabilite în tabelul nr.13 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară.

Capitolul VI

METODE DE SUPRAVEGHERE ŞI DE CONTROL ÎN CEEA

CE PRIVEŞTE INFECŢIA CU BONAMIA OSTREAE

Secţiunea 1

Cerinţe referitoare la programele de supraveghere sau de eradicare

 în vederea obţinerii şi menţinerii statutului sanitar “indemn de boală”

 în ceea ce priveşte infecţia cu Bonamia ostreae

229. Controalele sanitar-veterinare şi, după caz, eşantionarea unităţilor de producţie în ceea ce priveşte infecţia cu Bonamia ostreae, boală cauzată de protozoarul Bonamia ostreae, se efectuează în perioada din an în care se ştie că prevalenţa Bonamia ostreae este maximă în zonă sau în compartiment. Atunci când astfel de date nu sunt disponibile, eşantionarea se efectuează iarna sau la începutul primăverii.

230. În cazul în care moluştele fac obiectul eşantionării, se aplică următoarele criterii:

1) în prezenţa Ostrea edulis, numai stridiile din această specie sunt selecţionate pentru eşantionare. Dacă Ostrea edulis nu sunt prezente, eşantionul este reprezentativ pentru toate celelalte specii sensibile care sunt prezente;

2) dacă sunt prezente moluşte slăbite, cu cochilia deschisă sau care au murit recent, dar care nu sunt încă descompuse, sunt selectate, în principal, acestea. În absenţa unor astfel de moluşte, moluştele selectate includ moluştele sănătoase cu vârsta cea mai mare;

3) atunci când se efectuează eşantionarea în cadrul fermelor în care se utilizează mai mult de o sursă de apă pentru producţia de moluşte, trebuie incluse în eşantion moluşte care reprezintă toate sursele de apă, în aşa fel încât toate părţile fermei să fie reprezentate proporţional în eşantion;

4) atunci când se efectuează eşantionarea în zone de cultivare a moluştelor, trebuie incluse în eşantion moluşte dintr-un număr suficient de puncte de prelevare. Principalii factori care trebuie avuţi în vedere pentru selectarea acestor puncte de prelevare sunt punctele în care a fost detectat Bonamia ostreae în trecut, densitatea stocurilor, curenţii, prezenţa speciilor sensibile, prezenţa speciilor-vector, batimetria şi practicile de gestionare. Trebuie incluse în eşantionare bancurile naturale care se găsesc în zonele de cultivare sau care sunt adiacente acestora.

231. O zonă sau un compartiment cu statut sanitar de categoria a III-a în ceea ce priveşte infecţia cu Bonamia ostreae poate obţine din nou statutul sanitar de categoria I cu privire la această boală, atunci când toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză au făcut obiectul cel puţin al programului de supraveghere următor, care include controale sanitare şi colectarea de eşantioane în vederea testării.

232. Programul de supraveghere de doi ani include:

1) fermele şi zonele de cultivare a moluştelor care deţin specii sensibile au făcut obiectul controalelor sanitare şi al eşantionării timp de o perioadă minimă de doi ani consecutivi, astfel cum se prevede în tabelul nr.14 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară;

2) în această perioadă de doi ani, testarea tuturor eşantioanelor a avut rezultate negative în ceea ce priveşte Bonamia ostreae şi a fost exclusă orice suspiciune privind Bonamia ostreae;

3) atunci când Ostrea edulis provenind dintr-o zonă sau dintr-un compartiment cu statut sanitar de categoria I sunt incluse în eşantion, acestea sunt introduse în fermă sau în zona de cultivare a moluştelor cel puţin în toamna imediat precedentă perioadei în care se desfăşoară programul de supraveghere.

233. Eradicarea bolii Bonamia ostreae este considerată imposibilă în cea mai mare parte a cazurilor, însă atunci când Agenţia consideră că acest lucru este fezabil, se aplică un program de eradicare.

234. O zonă sau un compartiment cu statut sanitar de categoria a V-a în ceea ce priveşte infecţia cu Bonamia ostreae poate obţine din nou statutul sanitar de categoria I cu privire la această boală, atunci când toate fermele sau zonele de cultivare a moluştelor care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză, unde sunt aplicate măsurile minime de control în mod efectiv şi, în special, a fost instaurată o zonă de izolare, care include un perimetru de protecţie şi un perimetru de supraveghere, în vecinătatea fermei (fermelor) sau a zonei (zonelor) de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectată (infectate) cu Bonamia ostreae.

235. Zona de izolare este definită de la caz la caz, luând în considerare factorii care influenţează riscurile de răspândire a acestei boli, cum ar fi: numărul, vârsta, rata mortalităţii şi distribuţia cazurilor de mortalitate a moluştelor în ferma sau în zona de cultivare a moluştelor infectată cu Bonamia ostreae, incluzând moluştele sălbatice; distanţa la care se găsesc fermele învecinate sau zonele de cultivare a moluştelor învecinate, precum şi densitatea acestora, incluzând moluştele sălbatice; proximitatea faţă de unităţile de prelucrare, fermele cu care se intră în contact sau zonele de cultivare a moluştelor; speciile prezente în ferme sau în zonele de cultivare a moluştelor, în special speciile sensibile şi speciile-vector; practicile de acvacultură aplicate în fermele sau în zonele de cultivare a moluştelor afectate, precum şi în cele aflate în vecinătate; condiţiile hidrodinamice şi alţi factori pertinenţi din punct de vedere epidemiologic care sunt identificaţi.

236. Pentru stabilirea perimetrului de protecţie şi a celui de supraveghere se aplică:

1) perimetru de protecţie, acesta se stabileşte în imediata vecinătate a fermei sau a zonei de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectată cu Bonamia ostreae. Acest perimetru trebuie să corespundă unei zone stabilite în baza unor date hidrodinamice sau epidemiologice corespunzătoare;

2) perimetru de supraveghere, acesta trebuie să fie stabilit în afara perimetrului de protecţie. Acest perimetru trebuie să corespundă unei zone situate în jurul perimetrului de protecţie, stabilită în baza unor date hidrodinamice sau epidemiologice corespunzătoare.

237. Toate fermele şi zonele de cultivare a moluştelor care deţin speciile sensibile din perimetrul de protecţie şi care nu sunt în mod oficial declarate ca infectate cu Bonamia ostreae, sunt supuse unei anchete oficiale care cuprinde cel puţin colectarea de eşantioane pentru testarea a 150 de moluşte din speciile sensibile, după începutul perioadei de transmitere a Bonamia ostreae. În cazul în care nu se cunoaşte perioada de transmitere, eşantionarea se începe iarna sau la începutul primăverii.

238. Toate fermele şi zonele de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectate cu Bonamia ostreae sunt golite, supuse unui vid sanitar şi, dacă este posibil, sunt curăţate şi dezinfectate. Durata perioadei de vid sanitar este de cel puţin şase luni.

239. După golirea tuturor fermelor sau a zonelor de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectate, se respectă o perioadă de vid sanitar sincronizat de cel puţin patru săptămâni.

240. După caz, Agenţia decide, în baza unei evaluări a riscurilor, să solicite golirea, curăţarea, dezinfecţia şi o perioadă de vid sanitar pentru alte ferme sau zone de cultivare a moluştelor, care se află în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite. Durata perioadei de vid sanitar este stabilită de către Agenţie, în baza unei evaluări a riscurilor de la caz la caz.

241. Toate fermele sau zonele de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectate şi toate celelalte ferme sau zone de cultivare a moluştelor care au făcut obiectul unui vid sanitar, situate în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite, sunt repopulate cu moluşte care provin din zone sau din compartimente cu un statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte infecţia cu Bonamia ostreae. Repopularea are loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial infectate sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar în conformitate cu punctele 238-240.

242. Toate fermele şi zonele de cultivare a moluştelor care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul care fac obiectul programului de eradicare sunt apoi obiectul programului de supraveghere.

243. În cazul în care este necesară o supraveghere individualizată pentru menţinerea statutului sanitar de categoria I, toate fermele sau zonele de cultivare a moluştelor care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză sunt supuse controalelor sanitare şi eşantionării, în conformitate cu tabelul nr.15 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară, ţinând cont de nivelul riscului de contaminare a fermei sau a zonei de cultivare a moluştelor cu Bonamia ostreae.

244. Statutul sanitar “indemn de boală” în ceea ce priveşte infecţia cu Bonamia ostreae se menţine doar atât timp cât toate eşantioanele testate utilizând metodele de diagnostic prevăzute au rezultate negative pentru Bonamia ostreae şi este exclusă orice suspiciune privind Bonamia ostreae.

245. O zonă sau un compartiment care au statutul sanitar de categoria a V-a în ceea ce priveşte infecţia cu Bonamia ostreae pot obţine statutul sanitar de categoria a III-a cu privire la această boală, cu condiţia ca:

1) cerinţele prevăzute la punctele 233-240 sunt îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, să se instaureze vidul sanitar. Fermele în cauză sunt obiectul unei măsuri alternative care să ofere garanţii aproape identice privind eradicarea Bonamia ostreae din mediul fermei;

2) toate fermele sau zonele de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectate şi toate celelalte ferme sau zone de cultivare a moluştelor care au făcut obiectul unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu subpunctul 1), situate în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite, sunt repopulate cu moluşte care provin din zone sau din compartimente cu un statut sanitar de categoria I, a II-a sau a III-a în ceea ce priveşte infecţia cu Bonamia ostreae;

3) repopularea are loc numai după ce toate fermele sau zonele de cultivare a moluştelor declarate în mod oficial infectate sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu subpunctul 1);

4) nu a fost confirmată infecţia cu Bonamia ostreae în cursul perioadei de doi ani care a urmat punerii în aplicare a măsurilor menţionate la subpunctele 1), 2) şi 3) şi au fost excluse suspiciunile în cursul acestei perioade.

246. Animalul întreg este trimis la un laborator acreditat pentru efectuarea testelor de diagnostic prevăzute la punctele 247-249.

247. Metodele de diagnostic care trebuie utilizate pentru a obţine sau a menţine statutul sanitar “indemn de boală” în ceea ce priveşte infecţia cu Bonamia ostreae sunt examenul histopatologic, amprentele tisulare sau PCR, stabilite în capitolul VI, secţiunea a 2-a.

248. În cazul în care trebuie confirmată sau exclusă suspiciunea privind infecţia cu Bonamia ostreae, ancheta oficială cuprinde cel puţin o prelevare de eşantioane de la 30 de moluşte din speciile sensibile, în cazul în care suspiciunea respectivă se bazează pe un raport de mortalitate, sau, dacă nu, de la 150 de moluşte din speciile sensibile, după începutul perioadei de transmitere a Bonamia ostreae. În cazul în care nu se cunoaşte perioada de transmitere, eşantionarea se începe iarna sau la începutul primăverii.

249. Prezenţa Bonamia ostreae este considerată confirmată atunci când un rezultat pozitiv obţinut prin examen histopatologic, amprente tisulare sau hibridare in situ este asociat unui rezultat pozitiv obţinut prin PCR şi completat prin secvenţiere în conformitate cu metodele şi cu procedurile aprobate. Suspiciunea de infecţie cu Bonamia ostreae poate fi exclusă în cazul în care testele menţionate nu furnizează nicio altă dovadă a prezenţei bolii menţionate.

Secţiunea a 2-a

Metode şi proceduri de diagnostic detaliate pentru supravegherea

 şi confirmarea infecţiei cu Bonamia ostreae

250. În cazul în care sunt prelevate eşantioane şi sunt realizate examene de laborator în scopul obţinerii sau al menţinerii unui anumit statut sanitar în ceea ce priveşte Bonamia ostreae sau în scopul confirmării prezenţei acestei boli sau al excluderii suspiciunii privind această boală, trebuie aplicate metodele şi procedurile de diagnostic detaliate prevăzute în prezenta secţiune.

251. Moluştele cu cochilia deschisă sau care au murit recent sunt selectate cu prioritate, pentru a spori şansele de a găsi animale infectate.

252. Odată selecţionate, stridiile se păstrează la 4 °C sau refrigerate pe gheaţă timp de maximum 24 de ore dacă eşantioanele includ moluşte cu cochilia deschisă şi 72 de ore în caz contrar, într-o pungă de plastic, cu o etichetă care cuprinde detaliile referitoare la natura şi originea stridiilor. Moluştele cu cochilia deschisă sau care au murit recent sunt păstrate separat de alte moluşte.

253. Pentru diagnosticarea Bonamia ostreae, prin histologie, se utilizează o secţiune de ţesuturi cu grosime de 3-5 mm, care include branhii şi ţesut cardiac. O porţiune de glandă digestivă este utilizată pentru anumite teste, inclusiv pentru amprente şi pentru reacţia în lanţ a polimerazei (PCR).

254. Citologia (tehnica citologică de colorare) se efectuează în mod următor: după uscarea ţesutului branhial şi a celui cardiac pe o hârtie absorbantă se realizează mai multe amprente pe o lamă din sticlă. Lamele sunt lăsate să se usuce la aer, se fixează în metanol sau etanol absolut şi se colorează cu ajutorul unui kit de colorare disponibil în comerţ (precum, Diff-Quik®/Hemacolor®), în conformitate cu instrucţiunile producătorului. După spălare cu apă de la robinet şi uscare, lamele se acoperă cu o lamelă cu ajutorul unei răşini sintetice adecvate. Lamelele sunt analizate mai întâi la un grosisment de × 200 şi apoi în imersiune în ulei, la un grosisment de × 1 000.

255. Rezultatul pozitiv constă în prezenţa unor organisme mici, de formă sferică sau ovală (2-5 μm lăţime), în interiorul hemocitelor. Cu toate acestea, parazitul ar putea fi prezent şi în afara celulelor. Aceste organisme au o citoplasmă bazofilă şi un nucleu eozinofil (culorile pot varia în funcţie de colorantul utilizat) şi, deoarece se răspândesc pe lamă, pot părea mai mari pe amprente decât la examinarea histologică. Pot fi observate celule multinucleate. Tehnica nu este specifică acestei specii de parazit.

256. Histologia se efectuează în modul următor: se fixează secţiunile de ţesut, care includ branhii şi glanda digestivă, timp de cel puţin 24 de ore în fixator Davidson, urmând o prelucrare normală pentru examenul histologic după includerea în parafină şi colorare, cu hematoxilină şi eozină sau alţi coloranţi. Observaţiile trebuie efectuate la grosismente succesive, de maximum × 1 000.

257. Rezultatul pozitiv constă în prezenţa unor paraziţi sub formă de celule foarte mici, cu lăţimea de 2-5 μm, în interiorul hemocitelor sau libere în ţesutul conjunctiv sau în sinusurile epiteliului branhiilor, tubului digestiv şi mantalei, deseori asociaţi unei reacţii inflamatorii intense. Pentru a se înlătura orice îndoială, paraziţii sunt observaţi în interiorul hemocitelor, în vederea stabilirii unui diagnostic pozitiv. Tehnica nu este specifică acestei specii de parazit.

258. ADN-ul este extras în conformitate cu procedurile standard. Pot fi utilizate şi alte kituri disponibile, de extracţie a ADN-ului, care permit, de obicei, obţinerea unui ADN de înaltă calitate, ce poate fi utilizat în protocoalele PCR, după cum este descris în prezenta secţiune.

259. Pot fi utilizate două protocoale PCR, care vizează subunitatea mică a ADNr:

1) protocolul PCR clasic, care permite amplificarea mai multor membri din taxonul Haplosporidia, inclusiv Bonamia spp. Primerii, denumiţi Bo şi Boas, sunt 5′-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3′ şi, respectiv, 5′-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-JRC-CC-3′ şi amplifică un produs de 300 pb. Amestecurile pentru PCR conţin tampon (500 mM KCl, 100 mM Tris/HCl (pH 9,0 la 25 °C) şi 1 % Triton® X-100), 2,5 mM MgCl₂, 0,2 mM amestec dNTP, 1 μM primer sens şi antisens, 0,02 unităţi μl^{– 1} polimerază ADN Taq şi 0,2 ng μl^{– 1} de matrice ADN într-un volum total de 50 μl. Eşantioanele sunt denaturate într-un termociclu timp de cinci minute la 94 °C, urmând 30 de cicluri (94 °C timp de un minut, 55 °C timp de un minut, la 72 °C timp de un minut) şi o elongaţie finală timp de 10 minute la 72 °C. Controalele pozitive constau în ADN-ul genomic al unei gazde cu o infecţie pronunţată sau în ADN plasmidic, care include regiunea vizată. Controalele negative constau în ADN-ul genomic al unor gazde neinfectate şi în reactivi PCR fără ADN ţintă. Un rezultat pozitiv constă într-un produs de amplificare pozitiv de mărimea preconizată (şi anume, 300 pb), toate controalele negative având rezultate negative şi toate controalele pozitive având rezultate pozitive;

2) protocol PCR este un test PCR în timp real cu SYBR^® Green. Acesta permite detectarea specifică a Bonamia Ostreae (descrisă în cele ce urmează) şi poate fi combinat cu un test PCR în timp real cu SYBR^® Green, care să permită detectarea specifică a Bonamia exitiosa (Ramilo et al., 2013).

Primerii BOSTRE-F (5′- TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) şi BOSTRE-R (5′- TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) amplifică un produs de 208 pb. Amestecurile pentru PCR conţin SYBR^® Green Master Mix (1X), 0,3 μM primeri sens şi antisens şi 200 ng de ADN extras. Eşantioanele sunt denaturate într-un sistem de detectare în timp real timp de 10 minute la 95 °C, urmând 35 de cicluri (95 °C timp de 30 de secunde, 55 °C timp de 45 de secunde şi 72 °C timp de un minut). Analiza curbei de topire se efectuează crescând temperatura cu câte 0,5 °C/s, pornind de la o temperatură de 55 °C şi ajungând la 95 °C, înregistrând intensitatea fluorescenţei la fiecare schimbare de temperatură. Controalele pozitive constau în ADN-ul genomic al unei gazde cu o infecţie pronunţată sau în ADN-ul plasmidic, care include regiunea vizată.

Controalele negative constau în ADN-ul genomic al unor gazde neinfectate şi în reactivi PCR fără ADN ţintă. Un rezultat pozitiv constă într-un produs de amplificare pozitiv cu un singur vârf al temperaturii de topire (78,25 ± 0,25 °C, în condiţiile publicate de Ramilo et al., 2013), toate controalele negative având rezultate negative şi toate controalele pozitive având rezultate pozitive.

260. Pentru hibridare in situ (IHS), trebuie utilizată o sondă care vizează subunitatea mică din complexul de gene al ADNr, cu toate că s-a demonstrat că poate apărea o reacţie încrucişată cu alţi membri ai familiei Haplosporidia.

261. Trebuie fixate secţiuni de ţesut care includ branhii şi glanda digestivă, timp de cel puţin 24 de ore în fixator Davidson, urmând o prelucrare normală pentru examenul histologic, după includerea în parafină. Se decupează secţiuni de 5 μm şi se aşează pe lame acoperite cu aminoalchilsilan, apoi se incubează în timpul nopţii, într-o etuvă la 40 °C. Secţiunile sunt deparafinate prin scufundarea în xilen timp de 10 minute. Această etapă se repetă o singură dată şi apoi solventul se elimină prin scufundare în două băi succesive de etanol absolut de 10 minute fiecare. Secţiunile sunt apoi deshidratate prin imersie în băi succesive de etanol. Secţiunile sunt tratate cu proteinaza K (100 μg ml^{– 1}) într-un tampon TE (Tris (50 mm), EDTA (10 mm)), la 37 °C timp de 30 de minute. Lamelele sunt deshidratate prin imersie în băi succesive de etanol şi apoi uscate la aer. Secţiunile sunt incubate cu 100 μl de tampon de hibridare (4 × SSC (soluţie salină de citrat), formamidă 50%, 1 × soluţie Denhardt, 250 μg ml^{– 1} ARNt din drojdie, sulfat de dextran 10%) conţinând 20 ng (2 μl din reacţia PCR, pregătiţi astfel cum se descrie la punctul 259, utilizând Primerii Bo şi Boas) din sonda marcată cu digoxigenină. Secţiunile sunt acoperite cu lamele de plastic pentru hibridare in situ şi sunt aşezate pe un bloc de încălzire la 95 °C timp de cinci minute. Lamele trebuie apoi răcite pe gheaţă timp de un minut înainte de hibridizarea la 42 °C timp de o noapte într-o etuvă umedă. Secţiunile se spală de două ori timp de cinci minute în 2 × SSC la temperatura camerei şi o dată timp de 10 minute în 0,4 × SSC la 42 °C. Etapele de detectare se efectuează în conformitate cu instrucţiunile producătorului. Lamele sunt apoi clătite în apă distilată sterilă (dH2O). Secţiunile sunt contracolorate cu Bismarck Brown Yellow şi clătite în dH2O. Acestea se acoperă cu lamele, utilizând un mediu de montare apos.

262. Controalele pozitive şi negative sunt secţiuni de la gazde despre care se ştie că sunt infectate şi, respectiv, neinfectate.

263. Un rezultat pozitiv constă în existenţa unor paraziţi marcaţi în interiorul hemocitelor, toate controalele negative având rezultate negative şi toate controalele pozitive având rezultate pozitive.

264. Secvenţierea este una dintre ultimele etape necesare pentru confirmarea diagnosticului. Regiunile vizate sunt subunitatea mică a ADNr şi ITS1.

265. În scopul supravegherii şi confirmării prezenţei infecţiei cu Bonamia ostreae sau al excluderii suspiciunii privind această boală, metodele de diagnostic şi procedurile aferente care trebuie utilizate, respectă orientările stabilite în tabelul nr.16 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară.

Capitolul VII

METODE DE SUPRAVEGHERE ŞI DE CONTROL ÎN CEEA CE PRIVEŞTE

BOALA PETELOR ALBE (WHITE SPOT DISEASE – WSD)

Secţiunea 1

Cerinţe referitoare la programele de supraveghere şi de eradicare

 în vederea obţinerii şi menţinerii statutului sanitar “indemn de boală”

în ceea ce priveşte boala petelor albe (white spot disease – WSD)

266. Eşantionarea crustaceelor în vederea efectuării examenelor de laborator în ceea ce priveşte (WSD), precum şi a prevenirii răspândirii infecţiei cu virusul sindromului petelor albe (WSSV), are loc atunci când este probabil ca temperatura apei să atingă cea mai înaltă valoare anuală. Această cerinţă privind temperatura apei se aplică, de asemenea, controlului, în cazul în care acestea sunt fezabile şi oportune.

267. În cazul în care crustaceele fac obiectul eşantionării în conformitate cu cerinţele stabilite în prezenta parte, se aplică următoarele criterii:

1) dacă în unităţile de producţie sunt prezente crustacee slăbite sau muribunde, sunt selectate, în principal, acestea. În cazul în care astfel de crustacee nu sunt prezente, cele selectate includ crustacee din cohorte de mărime diferită, şi anume exemplare tinere şi adulţi din speciile sensibile selectate, reprezentate proporţional în eşantion;

2) dacă se utilizează mai mult de o sursă de apă pentru producţia de crustacee, trebuie incluse în eşantion crustacee sensibile care reprezintă toate sursele de apă.

268. Dacă este necesară supravegherea individualizată a populaţiilor sălbatice, numărul şi distribuţia geografică a punctelor de prelevare sunt determinate astfel încât să se obţină o acoperire rezonabilă a zonei sau a compartimentului. Punctele de prelevare sunt, de asemenea, reprezentative pentru ecosisteme diferite în care se găsesc populaţiile sălbatice din speciile sensibile, şi anume zonele marine, estuarele, râurile şi lacurile.

269. În cazul în care este necesară supravegherea individualizată a populaţiilor sălbatice, crustaceele care fac obiectul eşantionării sunt selecţionate după cum urmează:

1) trebuie selectate una sau mai multe dintre următoarele specii în estuare: Carcinus maenas, Cancer pagurus, Eriocheir sinensis, Liocarcinus depurator, Liocarcinus puber, Crangon crangon, Homarus gammarus, Palaemon adspersus sau specii de creveţi din familia Penaeidae, şi anume Penaeus japonicus, Penaeus kerathurus, Penaeus semisulcatus. Dacă aceste specii nu sunt prezente, eşantionul este reprezentativ pentru alte specii decapode sensibile care sunt prezente. Având în vedere varietatea mare a gazdelor sensibile, gazdele pot fi selectate din genuri sau din familii din ordinul Decapoda, a căror sensibilitate a fost demonstrată în mod experimental sau în natură;

2) trebuie selectate una sau mai multe dintre următoarele specii în râuri şi în lacuri: Pacifastacus leniusculus, Astacus leptodactylus, Austropotamobius pallipes sau Orconectes limosus. În cazul în care aceste specii nu sunt prezente, eşantionul este reprezentativ pentru alte specii decapode sensibile care sunt prezente. Având în vedere varietatea mare a gazdelor sensibile, gazdele pot fi selectate din genuri sau familii din ordinul Decapoda, a căror sensibilitate a fost demonstrată în mod experimental sau în natură;

3) dacă sunt prezente crustacee slăbite sau muribunde, sunt selectate, în principal, acestea. În cazul în care astfel de crustacee nu sunt prezente, cele selectate includ crustacee din cohorte de mărime diferită, şi anume exemplare tinere şi adulţi din speciile sensibile selectate, reprezentate proporţional în eşantion.

270. Conform cerinţelor specifice pentru obţinerea statutului sanitar de categoria I în ceea ce priveşte WSD se prevede un program de supraveghere:

1) o zonă sau un compartiment cu statut sanitar de categoria a III-a în ceea ce priveşte WSD poate obţine statutul sanitar de categoria I în cu privire la această boală, atunci când toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză respectă cerinţele relevante. Punctele în care se prelevează eşantioane de la populaţiile sălbatice sunt supuse următorului program de supraveghere cu durata de doi ani, care cuprinde controale sanitare şi colectarea de eşantioane în vederea testării.

Fermele sau punctele de prelevare au făcut obiectul controlului şi al eşantionării timp de o perioadă minimă de doi ani consecutivi, astfel cum se prevede în tabelul nr.17 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară.

În această perioadă de doi ani, testarea tuturor eşantioanelor prin utilizarea metodelor de diagnostic stabilite a avut rezultate negative în ceea ce priveşte infecţia cu WSD şi a fost exclusă orice suspiciune privind WSD;

2) în cazul în care, în timpul punerii în aplicare a programului de supraveghere menţionat la subpunctul 1), a fost confirmată o infecţie cu WSD într-o fermă inclusă în programul de supraveghere respectiv şi, prin urmare, a fost retras statutul de categoria a II-a al fermei, ferma respectivă poate să îşi recâştige imediat statutul de categoria a II-a şi să continue punerea în aplicare a programului de supraveghere pentru a obţine statutul sanitar “indemn de boală” fără să pună în aplicare un program de eradicare, cu condiţia că este o fermă al cărei statut în ceea ce priveşte WSD este independent de statutul al apelor naturale din vecinătate privind această boală.

Ferma a fost golită, curăţată, dezinfectată şi supusă unei perioade de vid sanitar, care este de cel puţin şase săptămâni. Aceasta a fost repopulată cu crustacee provenind din zone sau din compartimente care au un statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte WSD.

271. O zonă sau un compartiment cu statut sanitar de categoria a V-a în ceea ce priveşte WSD poate obţine statutul de categoria I cu privire la această boală, atunci când toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul în cauză au făcut obiectul unui program de eradicare.

272. Măsurile minime de control sunt aplicate în mod efectiv. O zonă de izolare, care include un perimetru de protecţie şi un perimetru de supraveghere, a fost instaurată în vecinătatea fermei (fermelor) declarate în mod oficial infectată (infectate) cu WSD.

273. Zona de izolare a fost definită de la caz la caz, luând în considerare factorii care influenţează riscurile de răspândire a WSD la crustaceele de crescătorie şi la cele sălbatice, cum ar fi: numărul, rata mortalităţii şi distribuţia cazurilor de mortalitate a crustaceelor în cadrul fermei infectate cu WSD; distanţa la care se găsesc fermele învecinate şi densitatea acestora; fermele cu care se intră în contact; speciile prezente la ferme; practicile de acvacultură aplicate în fermele afectate şi în fermele învecinate acestora; condiţiile hidrodinamice şi alţi factori pertinenţi din punct de vedere epidemiologic care sunt identificaţi.

274. Un perimetru de protecţie este stabilit în imediata vecinătate a fermei declarate în mod oficial infectată cu WSD şi acesta trebuie să corespundă în zone marine şi în estuare: unei zone înscrise într-un cerc cu raza cel puţin egală cu o deplasare a mareei sau de cel puţin 5 km, reţinându-se valoarea cea mai mare dintre cele două, având ca centru ferma declarată în mod oficial infectată cu WSD, sau unei zone echivalente stabilite în baza unor date hidrodinamice sau epidemiologice corespunzătoare; sau în apele dulci: întregului bazin hidrografic al fermei declarate în mod oficial infectată cu WSD. Agenţia poate limita extinderea perimetrului de protecţie la anumite părţi ale bazinului hidrografic, cu condiţia să nu se compromită prevenirea răspândirii WSD.

275. În afara perimetrului de protecţie este stabilit un perimetru de supraveghere. Acesta trebuie să corespundă în zone marine: unei zone situate în jurul perimetrului de protecţie, a cărei zonă de deplasare a mareei se suprapune cu zona de deplasare a mareei corespunzătoare perimetrului de protecţie; sau unei zone situate în jurul perimetrului de protecţie, înscrisă într-un cerc cu raza de 10 km, calculată din centrul perimetrului de protecţie; sau unei zone echivalente stabilite în baza unor date hidrodinamice sau epidemiologice corespunzătoare; sau în apele dulci: unei zone situate în exteriorul perimetrului de protecţie stabilit.

276. Toate fermele în care sunt ţinute specii sensibile, care se află în perimetrul de protecţie şi care nu sunt declarate în mod oficial infectate cu WSD, sunt obiectul unei anchete oficiale care include prelevarea de eşantioane pentru testarea a 10 crustacee, în cazul în care se observă semne clinice sau post-mortem compatibile cu WSD, sau pentru testarea a 150 de crustacee, în cazul în care nu se observă semne clinice sau post-mortem; şi un control. În fermele în care testele au avut rezultate negative, controalele să continue o dată pe lună, în timpul sezonului în care este probabil ca temperatura apei să atingă cele mai mari valori anuale, până când se renunţă la perimetrul de protecţie, în conformitate cu punctul 277.

277. Toate fermele declarate în mod oficial infectate cu WSD sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unei perioade de vid sanitar, care este de cel puţin şase săptămâni. După golirea tuturor fermelor declarate în mod oficial infectate, să se respecte o perioadă de vid sanitar sincronizat de cel puţin trei săptămâni. Prezenta secţiune se aplică, de asemenea, noilor ferme declarate în mod oficial infectate în timpul punerii în aplicare a programului de eradicare.

Atunci când se aplică o perioadă de vid sanitar pentru fermele declarate în mod oficial infectate, perimetrele de protecţie sunt transformate în perimetre de supraveghere.

278. Agenţia decide, în baza unei evaluări a riscurilor, să solicite golirea, curăţarea, dezinfecţia şi o perioadă de vid sanitar pentru alte ferme care se află în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite. Durata perioadei de vid sanitar este stabilită de către Agenţie, în baza unei evaluări a riscurilor de la caz la caz.

279. Toate fermele declarate în mod oficial infectate şi toate celelalte ferme care au făcut obiectul unui vid sanitar, situate în interiorul perimetrelor de protecţie şi de supraveghere stabilite, sunt repopulate cu: crustacee provenind din zone sau din compartimente care au un statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte WSD; sau pentru o perioadă de tranziţie, cu crustacee provenind din zone sau din compartimente cu un program de supraveghere a WSD aprobat.

280. Repopularea poate să aibă loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial infectate cu WSD sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar în conformitate punctul 277.

281. Toate fermele care deţin specii sensibile din zona sau din compartimentul care fac obiectul programului de eradicare precum şi, în cazul în care este necesară supravegherea populaţiilor sălbatice, punctele de prelevare sunt apoi obiectul programului de supraveghere prevăzut la punctul 270.

282. Un compartiment care cuprinde o singură fermă, care are statut sanitar de categoria I în ceea ce priveşte WSD, al cărui statut cu privire la această boală este independent de cel al apelor naturale din vecinătate şi al cărui statut sanitar de categoria I a fost retras, poate redobândi statutul sanitar de categoria I imediat ce Agenţia a confirmat că sunt respectate următoarele condiţii:

1) ferma infectată cu WSD a fost golită, curăţată, dezinfectată şi supusă unei perioade de vid sanitar, care este de cel puţin şase săptămâni;

2) ferma infectată cu WSD a fost repopulată cu crustacee provenind din zone sau din compartimente care au un statut de categoria I în ceea ce priveşte WSD.

283. În cazul în care este necesară o supraveghere individualizată pentru menţinerea statutului de categoria I, toate fermele care deţin specii sensibile enumerate în capitolul VII din zona sau din compartimentul în cauză şi sunt supuse unui control şi eşantionării în conformitate cu tabelul nr.18 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară, ţinând cont de nivelul riscului de contaminare a fermei cu WSD.

284. În zonele sau în compartimentele în care există un număr limitat de ferme, iar supravegherea individualizată a acestor ferme nu furnizează date epidemiologice suficiente, programele de supraveghere în vederea menţinerii statutului sanitar “indemn de boală” includ puncte de prelevare, selecţionate în conformitate cu cerinţele prevăzute la punctul 155. Dintre aceste punctele de prelevare, 50% sunt obiectul inspecţiei şi al prelevării de eşantioane în fiecare an, prin rotaţie.

Eşantionarea se realizează în conformitate cu tabelul nr.18 din anexă la prezenta Normă sanitar-veterinară. Eşantioanele sunt selectate, pregătite şi examinate în conformitate cu metodele de diagnostic şi de eşantionare descrise în secţiunea a 2-a, iar examenele de laborator trebuie să aibă rezultate negative în ceea ce priveşte agentul WSD.

285. Statutul sanitar “indemn de boală” se menţine doar atât timp cât toate eşantioanele testate utilizând metodele de diagnostic şi de eşantionare prevăzute la punctele 289-290 au rezultate negative pentru WSD şi orice suspiciune privind WSD este exclusă în conformitate cu ancheta oficială şi cu metodele de diagnostic prevăzute la punctul 291.

286. O zonă sau un compartiment care are statutul sanitar de categoria a V-a în ceea ce priveşte WSD poate obţine statutul de categoria a III-a, cu condiţia că:

1) cerinţele prevăzute la punctele 271-277 sunt îndeplinite. În cazul în care nu este posibil, din punct de vedere tehnic, să se instaureze vidul sanitar. Fermele în cauză sunt obiectul unei măsuri alternative, care să ofere garanţii aproape identice în ceea ce priveşte eradicarea WSSV din mediul fermei;

2) toate fermele declarate în mod oficial infectate cu WSD şi toate celelalte ferme care au făcut obiectul unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu subpunctul 1), situate în perimetrele de protecţie şi de supraveghere stabilite, sunt repopulate cu crustacee provenind din zone sau din compartimente cu statut sanitar de categoria I, a-II-a sau a III-a în ceea ce priveşte WSD;

3) repopularea are loc numai după ce toate fermele declarate în mod oficial infectate cu WSD sunt golite, curăţate, dezinfectate şi supuse unui vid sanitar sau al unor măsuri alternative în conformitate cu subpunctul 1);

4) nu a fost detectată WSD în cursul perioadei de doi ani, care a urmat finalizării măsurilor menţionate la subpunctul 1) şi 2) şi au fost excluse suspiciunile în cursul acestei perioade în conformitate cu procedurile stabilite la punctul 291.

287. Eşantioanele de epidermă tegumentară, fie disecate, fie prezente pe picioarele care servesc la deplasare, pe pleopode, pe orificiile bucale sau pe branhiile animalului supus testelor, sunt fixate în etanol 95% înainte de pregătirea eşantioanelor pentru PCR, în două etape.

288. Pot fi colectate alte eşantioane, fixate pentru examenul histologic şi pentru microscopia electronică prin transmisie, cu scopul de a susţine datele referitoare la diagnostic, obţinute prin PCR.

289. Metoda de diagnostic care trebuie utilizată pentru obţinerea sau menţinerea statutului sanitar “indemn de boală” în ceea ce priveşte WSD este PCR, în două etape.

290. În cazul în care prin PCR, în două etape, se obţine un rezultat pozitiv, acesta este coroborat prin secvenţierea produsului de amplificare, înainte de punerea în aplicare a primelor măsuri de combatere, dacă este posibil prin evidenţierea semnelor patognomonice de WSD la gazdele sensibile selectate, utilizând examenul histologic şi microscopia electronică prin transmisie.

291. În cazul în care trebuie confirmată sau exclusă prezenţa infecţiei cu WSD, sunt respectate următoarele proceduri în ceea ce priveşte inspecţia, prelevarea de eşantioane şi testarea:

1) ancheta oficială include cel puţin un control şi o prelevare de eşantioane de la 10 crustacee, în cazul în care se observă semne clinice sau post-mortem compatibile cu infecţia cu WSD, sau de la 150 de crustacee, în cazul în care nu se observă semne clinice sau post-mortem. Eşantioanele sunt testate utilizând metoda de diagnostic prevăzută la punctele 289-290 (PCR, în două etape);

2) prezenţa WSD este considerată confirmată atunci când PCR, în două etape, urmată de secvenţiere, are rezultate pozitive pentru WSSV şi atunci când sunt prezente semne patognomonice de WSD la gazdele selectate.

Suspiciunea privind WSD poate fi exclusă în cazul în care testele nu furnizează nicio altă dovadă referitoare la prezenţa WSD.

Secţiunea a 2-a

Metode şi proceduri de diagnostic detaliate pentru supravegherea

şi confirmarea bolii petelor albe (white spot disease – WSD)

292. În cazul în care se efectuează prelevări de eşantioane şi examene de laborator în scopul programelor de supraveghere, precum şi în scopul confirmării prezenţei infecţiei cu WSSV sau al excluderii suspiciunii privind această boală, trebuie aplicate metodele şi procedurile de diagnostic detaliate prevăzute la secţiunea respectivă.

Metodele şi procedurile descrise în prezenta secţiune sunt adaptate după testul acreditat pentru bolile crustaceelor. Pot fi folosite abordări alternative, utilizând condiţii echivalente sau kituri fabricate de producători diferiţi, dar care au o sensibilitate şi o specificitate echivalente celor descrise în prezenta secţiune. În toate cazurile, produsul PCR de amplificare este secvenţiat, pentru a confirma că este vorba despre virusul sindromului petelor albe (WSSV).

293. Ţesuturile (pleopode şi branhii) de la crustacee infectate cu WSSV pot fi păstrate în etanol, în RNAlater sau pot fi congelate rapid la – 80 °C. Etapele necesare pentru identificarea WSSV utilizând eşantioane de ţesuturi sunt următoarele: omogenizarea ţesuturilor, extracţia ADN-ului, amplificarea specifică a ADN-ului WSSV utilizând PCR, vizualizarea produsului amplificat pe un gel, purificarea ADN-ului şi secvenţierea pentru confirmarea identităţii agentului patogen.

294. Mărunţirea ţesuturilor şi pregătirea unui omogenat într-un tampon adecvat se efectuează utilizând un mixer Fast Prep şi tuburi Lysing Matrix A (MP Biomedicals). Ţesuturile sunt cântărite, plasate în tuburi Lysing Matrix A, diluate într-o proporţie de 1 la 10 g/v sau în conformitate cu instrucţiunile producătorului, într-un tampon adecvat (G2 şi 10 μl de proteinază K de utilizat cu kitul de extracţie a ADN-ului din ţesuturi DNA Tissue kit (QIAGEN)) şi omogenizate cu un omogenizator Fast Prep 24 timp de două minute. Eşantioanele omogenizate se incubează la 56 °C timp de minimum patru ore sau timp de o noapte. Eşantioanele se agită, se centrifughează la 9 000 rpm timp de două minute, iar 50 μl de supernatant sau un volum echivalent cu 5 mg de ţesut (greutatea ţesutului optimă pentru kitul de extracţie) se adaugă într-un tub-eşantion pentru extracţia ADN-ului, completându-se volumul până la 200 μl cu ajutorul unui tampon G2.

295. ADN-ul total este extras utilizând un set pentru extracţia ADN-ului din ţesuturi şi EZ1 Advanced XL Biorobot (Qiagen), conform instrucţiunilor producătorului. Fiecare lot de eşantioane este însoţit de un control al extracţiei (ADN din timus de viţel) şi de un control negativ (tampon G2). ADN-ul este eluat într-un volum de 50 μl.

296. Pentru a se asigura că extracţia s-a finalizat cu succes, se determină concentraţia ADN-ului pentru toate eşantioanele şi controalele, folosind un Nano Drop. ADN-ul extras este congelat la – 20 °C în cazul în care nu este necesar imediat.

297. Metoda folosită pentru detectarea WSSV este protocolul pentru detectarea WSSV prin Nested PCR, prevăzut în secţiunea respectivă, care permite obţinerea, în prima şi în a doua etapă a PCR, a unui produs de amplificare de 1 447 pb şi, respectiv, de 848 pb al genei ARNr 18S.

298. Prima etapă a PCR se realizează într-un volum de 50 μl, care conţine concentraţii finale de 1 × GoTaq Buffer (Promega), 5mM MgCl₂, 1pmol/μl primer WSSV 146 F1, 1pmol/μl primer WSSV 146 R1 (tabelul nr.1), 0,25 mM dNTP, 1,25U polimerază Taq şi 2,5μl ADN.

Fiecare eşantion este duplicat şi asociat unui control de extracţie negativ, unui control PCR negativ (se adaugă 2,5μl H₂O în loc de ADN) şi unui control pozitiv. Controlul pozitiv constă în plasmidă de WSSV diluată, pregătită şi validată pentru utilizare în laborator acreditat (pusă la dispoziţie de către laboratorul de referinţă internaţional).

299. Reacţia din cea de-a doua etapă a PCR are loc în acelaşi mod ca şi prima etapă, dar utilizând setul de primeri WSSV 146 F2/R2 şi un al doilea control pozitiv, pentru a verifica dacă această etapă a PCR a funcţionat.

300. Atât prima, cât şi a doua etapă a PCR se realizează folosind următoarea succesiune a ciclurilor, utilizând un termociclu DNA Engine Tetrad 2 Peltier (sau un echivalent): o etapă iniţială de denaturare la 94 °C timp de două minute, apoi o etapă la 94 °C timp de 30 de secunde, la 62 °C timp de 30 de secunde, la 72 °C timp de 30 de secunde, repetată pe parcursul a 30 de cicluri, o etapă de elongaţie la 72 °C timp de două minute şi menţinere la 4 °C.

301. Produsele amplificate care rezultă atât din prima etapă, cât şi din cea de a doua etapă a PCR, se vizualizează pe gel de agaroză 2% preparat cu ajutorul unui tampon TAE. 15 μl din fiecare eşantion sunt supuşi unei tensiuni de 120 de volţi timp de aproximativ 20 de minute şi sunt apoi examinaţi în lumină ultravioletă. Eşantioanele pozitive vor produce o bandă de 1 447 pb în prima etapă a PCR şi de 848 pb în a doua etapă a PCR. Eşantioanele de această mărime trebuie decupate şi plasate într-un microtub de centrifugare de 1,5 ml. ADN-ul conţinut în blocurile de gel se purifică cu ajutorul kitului Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System de la Promega, în conformitate cu instrucţiunile producătorilor. Concentraţia ADN-ului se estimează folosind un Nano Drop. ADN-ul purificat este congelat la – 20 °C, dacă nu este utilizat imediat.

302. ADN-ul este secvenţiat utilizând kitul BigDye Terminator v3,1 (Applied Biosystems). Volumul total al fiecărei reacţii este de 20 μl, concentraţiile finale fiind 1 × BigDye Terminator, 1 × tampon de secvenţiere, 10pmol/μl primer sens sau antisens şi 10 μl de ADN purificat (diluat la aproximativ 10 ng/μl), aplicându-se următoarea succesiune a ciclurilor cu ajutorul unui termociclu DNA Engine Tetrad 2 Peltier (sau un echivalent): 94 °C timp de 30 de secunde, apoi 96 °C timp de 10 secunde, 50 °C timp de 10 secunde şi 60 °C timp de patru minute, ultimele trei etape producându-se de 30 de ori.

303. Produsele PCR se precipită utilizând o metodă pe bază de acetat de sodiu, în cadrul căreia adăugăm 20 μl ADN la 10 μl NaAc, 70 μl H₂O şi 250 μl etanol. Se agită şi se centrifughează la 13 000 rpm timp de 20 de minute, se îndepărtează supernatantul şi se spală precipitatul cu 200 μl de etanol absolut, centrifugat la 13 000 rpm timp de cinci minute. Precipitatul se usucă timp de cinci minute la 37 °C. Se adaugă la precipitat 25 μl de formamidă înalt deionizată, se încălzeşte la 95 °C timp de două minute şi se agită bine. Eşantioanele sunt secvenţiate cu analizorul ABI3130xl Avant Genetic, conform instrucţiunilor producătorului. Rezultatele secvenţierii se analizează cu ajutorul software-ului Sequencher, iar secvenţele se aliniază cu secvenţele care se găsesc în baza de date NCBI, folosind funcţia BLAST.