Постановления

Постановление № 232 от 10.04.2020

об утверждении ветеринарно-санитарной нормы о требованиях к надзору и методам диагностики заболеваний у водных животных

Тип документа: Постановления
Дата принятия: 10.04.2020

ПРАВИТЕЛЬСТВО РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА

ПОСТАНОВЛЕНИЕ

об утверждении Ветеринарно-санитарной нормы

о требованиях к надзору и методам диагностики

заболеваний у водных животных

№ 232 от 10.04.2020

(в силу 15.08.2020)

Мониторул Офичиал ал Р. Молдова № 115-117 ст. 349 от 15.05.2020

* * *

На основании статьи 29 Закона № 221/2007 о ветеринарно-санитарной деятельности (повторное опубликование: Официальный монитор Республики Молдова, 2013 г., № 125-129, ст.396), с последующими изменениями, Правительство

ПОСТАНОВЛЯЕТ:

Настоящее постановление перелагает Решение Комиссии (ЕС) 2015/1554 от 11 сентября 2015 года, устанавливающее правила применения Директивы 2006/88/ЕС в отношении требований к надзору и проведению диагностики, опубликованное в Официальном журнале Европейского Союза L 247/1 от 23 сентября 2015 года.

1. Утвердить Ветеринарно-санитарную норму о требованиях к надзору и методам диагностики заболеваний у водных животных (прилагается).

2. Контроль за выполнением настоящего постановления возложить на Национальное агентство по безопасности пищевых продуктов.

3. Настоящее постановление вступает в силу по истечении 3 месяцев с даты опубликования.

ПРЕМЬЕР-МИНИСТР	Ион КИКУ
Контрасигнует:
министр сельского хозяйства,
регионального развития и
окружающей среды	Ион ПЕРЖУ
№ 232. Кишинэу, 10 апреля 2020 г.

Утверждена

Постановлением Правительства

№ 232/2020

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ НОРМА

о требованиях к надзору и методам диагностики

заболеваний у водных животных

Глава I

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. Ветеринарно-санитарная норма о требованиях к надзору и методам диагностики заболеваний у водных животных (в дальнейшем – Ветеринарно-санитарная норма) устанавливает требования, применимые к ветеринарно-санитарному надзору за болезнями у водных животных и диагностическим методам, которые необходимо использовать при определении присутствия или отсутствия таких болезней, как вирусная геморрагическая септицемия (SHV), инфекционный гематопоэтический некроз (NHI), герпетическая болезнь карпа кои (KHVD), инфекционная анемия лосося (AIS), инфекция с Marteilia refringens, инфекция с Bonamia ostreae, болезнь белых пятен (White Spot disease – WSD), у водных животных.

2. В целях настоящей Ветеринарно-санитарной нормы применяются определения, указанные в Ветеринарно-санитарной норме, касающейся требований к здоровью животных и продуктам рыбоводства и мер по предупреждению и борьбе с некоторыми болезнями у водных животных, утвержденной Постановлением Правительства № 239/2009.

3. Национальное агентство по безопасности пищевых продуктов (в дальнейшем – Агентство) обеспечивает соблюдение норм, касающихся программ по надзору и ликвидации, установленных методом выборки и диагностики, когда статус «благополучная по болезни» отозван или восстановлен для зоны или ее части по одному или нескольким болезням, указанным в пункте 1.

4. Агентство обеспечивает, чтобы методы контроля, а также установленные методы диагностики соблюдались в ходе проведения лабораторных исследований для подтверждения или исключения наличия болезни, указанной в пункте 1.

5. Агентство обеспечивает, чтобы минимальные меры по надзору и минимальные требования к устранению мер по ограничению распространения заболеваний соблюдались при применении мер по надзору и устранению мер по ограничению распространения одной или нескольких болезней, указанных в пункте 1, в зоне или ее части, которые не признаны благополучными по этим болезням.

Глава II

ТРЕБОВАНИЯ К НАДЗОРУ И МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ В ОТНОШЕНИИ

ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ СЕПТИЦЕМИИ (SHV) И

ИНФЕКЦИОННОГО ГЕМАТОПОЭТИЧЕСКОГО НЕКРОЗА (NHI)

Раздел 1

Требования к программам надзора и ликвидации SHV и NHI в целях

получения и сохранения санитарного статуса «благополучный

по болезни» и требования к мерам по предотвращению

распространения данных болезней

6. Ветеринарно-санитарный надзор и отбор проб для вирусной геморрагической септицемии (SHV) – болезни, вызванной вирусом вирусной геморрагической септицемии (VSHV), известного как вирус Egtved, относящимся к роду Novirhabdovirus семейства Rhabdoviridae, и инфекционного гемопоэтического некроза (NHI) – болезни, вызванной вирусом инфекционного гематопоэтического некроза (VNHI), относящимся к роду Novirhabdovirus семейства Rhabdoviridae, осуществляются в период года, когда температура воды составляет менее 14°C, или тогда, когда предполагается, что температура воды достигает минимальных годовых значений.

7. В случае, когда необходим индивидуальный надзор за дикими популяциями, число и географическое распределение пунктов отбора проб определяются таким образом, чтобы достичь разумного покрытия зоны или ее части. Пункты отбора проб являются репрезентативными для разных экосистем, в которых встречаются дикие популяции, относящиеся к восприимчивым видам.

8. Если фермы или дикие популяции являются объектом проверок или отбора проб чаще одного раза в год, интервал между санитарными проверками и между каждым отбором проб составляет, по крайней мере, четыре месяца и должны быть максимально длинными, учитывая требования по температуре, предусмотренные пунктом 6.

9. Все производственные единицы, такие как пруды, бассейны и сетчатые клетки, подвергаются санитарным проверкам для установления наличия мертвой, ослабленной рыбы или рыбы с аномальным поведением. Особое внимание следует обращать на пункты слива воды, где ослабленная рыба имеет тенденцию к скоплению из-за течения.

10. Рыба восприимчивых видов включается в выборку:

1) если присутствует радужная форель, для отбора проб выбирается только рыба этого вида, за исключением случая, когда присутствуют другие восприимчивые виды, у которых имеются типичные признаки SHV или NHI, если радужная форель не присутствует, выборка является репрезентативной для всех остальных восприимчивых видов, которые присутствуют;

2) если присутствует ослабленная рыба, рыба с аномальным поведением или рыба, которая недавно умерла, но не разложилась, отбирается эта рыба;

3) если для производства рыбы используется более одного источника водоснабжения, в выборку включается рыба из всех источников водоснабжения, отбор рыбы осуществляется таким образом, чтобы все части фермы и все возрастные классы, сгруппированные по годам, были пропорционально представлены в выборке.

11. Для получения санитарного статуса «благополучный по болезни» (I категория) в отношении SHV и NHI зона или ее часть с санитарным статусом III категории в отношении SHV или NHI или обеих болезней может получить санитарный статус I категории в отношении этих болезней при условии, что все фермы, содержащие восприимчивые виды в данной зоне или данной ее части, соблюдают требования, установленные в Ветеринарно-санитарной норме, касающейся требований к здоровью животных и продуктам рыбоводства и мер по предупреждению и борьбе с некоторыми болезнями у водных животных, утвержденной Постановлением Правительства № 239/2009. Пункты, в которых осуществляется отбор проб от диких популяций, отобранных согласно соответствующей главе, подвергаются одной из следующих программ надзора:

1) модель A – программа надзора на протяжении двух лет:

фермы или пункты отбора проб были объектом санитарных проверок и отбора проб в течение минимум двух лет подряд, как указано в таблице 1 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме.

В течение этого двухлетнего периода тестирование всех проб с использованием методов диагностики имеет отрицательный результат в отношении SHV, NHI или обеих болезней и исключено любое подозрение в отношении SHV, NHI или обеих болезней в соответствии с методами отбора и диагностики.

2) модель B – программа надзора в течение четырех лет, с образами небольших размеров:

фермы или пункты отбора проб были объектом контроля и отбора проб в течение минимум четырех лет подряд.

В течение этого четырехлетнего периода тестирование всех проб с использованием методов диагностики имеет отрицательный результат в отношении SHV, NHI или обеих болезней, и исключено любое подозрение в отношении SHV, NHI или обеих болезней, если во время выполнения программы надзора подтверждается инфекция по SHV, по NHI или по обеим болезням на ферме, включенной в соответствующую программу надзора, и, следовательно, был отозван санитарный статус II категории, эта ферма может немедленно восстановить свой санитарный статус II категории и продолжить выполнение программы надзора, чтобы получить статус «благополучная по болезни» без реализации программы ликвидации при условии, что ферма, санитарный статус которой по SHV, по NHI, либо по обеим не зависит от состояния здоровья популяций водных животных в соседних естественных водах в отношении этих болезней.

Ферма была опустошена, очищена, дезинфицирована и подвергалась периоду санитарного вакуума в течение не менее шести недель и повторно заселена рыбой, происходящей из зон или их частей, которые имеют санитарный статус I категории в отношении SHV, NHI или обеих.

12. Для получения санитарного статуса «благополучный по болезни» (I категория) в отношении SHV и NHI зона или ее части с санитарным статусом V категории в отношении SHV, NHI или обеих болезней может получить санитарный статус I категории в отношении этих болезней при условии, что все фермы, содержащие восприимчивые виды в данной зоне или в данной ее части, были объектом программы ликвидации.

13. Контрольные меры эффективно применяются в зоне изоляции, которая включает защитную зону и зону наблюдения. Она устанавливается вблизи фермы (ферм), официально объявленной инфицированной (инфицированными) по SHV, по NHI или по обеим указанным болезням.

Зона изоляции определяется в каждом конкретном случае с учетом факторов, влияющих на риск распространения указанной болезни среди фермерских и диких рыб, таких как: количество, смертность и распределение случаев смерти рыб на ферме, инфицированной SHV, NHI или обеими; расстояние, на котором находятся соседние фермы, и их плотность; близость к бойне; фермы, с которыми они контактируют; виды, присутствующие на фермах; методы рыбоводства, применяемые на зараженных фермах и соседствующих с ними фермах; гидродинамические условия и другие эпидемиологические значимые факторы, которые идентифицируются.

14. Защитная зона устанавливается в непосредственной близости от фермы, официально объявленной инфицированной по SHV, по NHI либо по обеим указанным болезням, во внутренних зонах: всего гидрографического бассейна фермы, официально объявленной инфицированной. Агентство может ограничить расширение зоны до определенных частей гидрографического бассейна или площади фермы при условии, что это не повредит предотвращению распространения указанной болезни за пределы защитной зоны. Агентство устанавливает зону наблюдения во внутренних зонах: зону, расположенную за пределами установленной защитной зоны.

15. Все фермы, в которых содержатся восприимчивые виды, установленные в приложении № 3 к Ветеринарно-санитарной норме, касающейся требований к здоровью животных и продуктам рыбоводства и мер по предупреждению и борьбе с некоторыми болезнями у водных животных, утвержденной Постановлением Правительства № 239/2009, которые находятся в защитной зоне и которые официально не объявлены инфицированными по SHV, по NHI или по обеим, являются объектом официального расследования, включающего отбор проб для тестирования 10 рыб в случае, когда наблюдаются клинические или посмертные признаки, соответствующие инфекции SHV, NHI или обеим, или для тестирования не менее 30 рыб, если клинические или посмертные признаки не наблюдаются, и ветеринарно-санитарную проверку на фермах, на которых тесты имели отрицательные результаты. Ветеринарно-санитарные проверки продолжаются один раз в месяц в течение периода, когда температура воды ниже 14°C, за исключением случая, когда пруды или сеточные клетки покрыты льдом, до отказа от защитной зоны.

16. Все фермы, официально объявленные инфицированными по SHV, по NHI или по обеим, опорожняются, очищаются, дезинфицируются и подвергаются периоду санитарного вакуума в течение не менее шести недель. После опорожнения всех ферм, официально объявленных инфицированными, которые находятся в той же защитной зоне, должен соблюдаться период синхронизированного санитарного вакуума в течение не менее трех недель. Данная мера применяется также к новым фермам, официально объявленным зараженными, во время выполнения программы ликвидации.

Когда наступает период санитарного вакуума для ферм, официально объявленных инфицированными, защитные зоны превращаются в зоны наблюдения.

Агентство, на основе оценки риска, решает потребовать опорожнения, очистки, дезинфекции и установления периода санитарного вакуума для других ферм, которые находятся внутри установленных защитных зон и зон наблюдения. В случае этих ферм продолжительность периода санитарного вакуума устанавливается Агентством на основе оценки рисков в каждом конкретном случае.

17. Все фермы, официально объявленные инфицированными по SHV, NHI или по обеим указанным болезням, и все остальные фермы, которые являются объектом санитарного вакуума, расположенные внутри установленных защитных зон и зон наблюдения, повторно заселяются рыбой, происходящей из зон или их частей с санитарным статусом «благополучные по болезни» (I категория).

Повторное заселение может осуществляться только после того, как все фермы, официально объявленные инфицированными, опустошены, очищены, дезинфицированы и подвергнуты санитарному вакууму.

18. Для всех ферм, содержащих восприимчивые виды из зон или их частей, которые являются объектом программы ликвидации, а также в случае, когда необходим надзор за дикими популяциями, выбранные пункты отбора проб становятся затем объектом программы наблюдения.

19. Для восстановления статуса «благополучный по болезни» части зон, охватывающие одну ферму, ранее объявленные благополучными по указанным болезням, санитарный статус которых в отношении этих болезней не зависит от статуса соседствующих природных вод и у которых санитарный статус I категории был отозван, могут восстановить статус I категории сразу же, как только Агентство подтверждает, что соблюдаются следующие условия:

1) ферма, для которой официально подтверждено инфицирование по SHV, по NHI или по обеим, была опорожнена, очищена, дезинфицирована и подвергнута периоду санитарного вакуума продолжительностью шесть недель и более;

2) ферма, для которой официально подтверждено инфицирование по SHV, по NHI, или по обеим, повторно заселена рыбой, происходящей из зон или их частей, имеющих санитарный статус I категории в отношении SHV, NHI или обеих.

20. Для сохранения санитарного статуса «благополучные по болезни» (I категория) в отношении SHV, NHI, или обеих, когда необходим индивидуальный надзор для сохранения санитарного статуса I категории, все фермы, в которых содержатся восприимчивые виды из данной зоны или данной ее части, подвергаются санитарной инспекции, а отбор проб рыбы осуществляется с учетом уровня риска заражения фермы указанными болезнями.

21. При определении частоты санитарных проверок для частей зон, имеющих санитарный статус I категории, санитарный статус которых зависит от состояния здоровья популяций водных животных в соседствующих естественных водоемах, риск заражения считается высоким.

22. Статус «благополучные по болезни» сохраняется только до тех пор, пока все тестированные пробы имеют отрицательные результаты по указанным болезням, и до тех пор, пока исключено любое подозрение на SHV, NHI или на обе болезни.

23. Для устранения мер по предотвращению распространения болезней зона или ее части со статусом V категории в отношении SHV, NHI или обеих болезней может получить статус III категории в отношении этих заболеваний при условии, что:

1) требования, предусмотренные в пунктах 12-16, выполнены. В случае, когда это невозможно с технической точки зрения, устанавливается санитарный вакуум, данные фермы становятся объектом альтернативной меры, предоставляющей почти идентичные гарантии в отношении ликвидации вируса VNHI, вируса VSHV или обоих вирусов в среде фермы;

2) все фермы, официально объявленные инфицированными, и все остальные фермы, которые являются объектом санитарного вакуума или альтернативных мер в соответствии с подпунктом 1), расположенные в установленных защитных зонах и зонах наблюдения, повторно заселены рыбой, происходящей из зон или их частей со статусом I, II или III категории по SHV, по NHI либо по обеим болезням;

3) повторное заселение происходит только после того, как все фермы, официально объявленные инфицированными, опустошены, очищены, дезинфицированы и являются объектом санитарного вакуума или альтернативных мер в соответствии с подпунктом 1).

24. Отбираются и исследуются следующие органы: селезенка, почка, сердце, мозг. В случае, когда отбор проб производится от родительского организма, могут также изучаться жидкость яичников или сперма. В случае мальков, целые рыбы длиной менее 4 см могут быть фрагментированы стерильными ножницами или скальпелем после удаления части тела, которая находится за анальным отверстием. Если проба состоит из целых рыб длиной от 4 до 6 см, собираются внутренности, в том числе почки. Допускается объединение фрагментов органов, происходящих от не более 10 рыб.

25. Для получения и сохранения статуса «благополучные по болезни» в отношении SHV, NHI либо обеих болезней установлены следующие методы:

1) изоляция вируса в клеточных культурах, а затем идентификация с использованием иммуноферментного теста (ELISA), теста непрямой иммунофлюоресценции (IFAT), теста нейтрализации вируса или теста RT-PCR в режиме реального времени (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией – RT-qPCR);

2) RT-qPCR.

26. В случае, когда необходимо подтвердить или исключить подозрение в отношении SHV, NHI либо обеих болезней, ферма, в связи с которой имеются подозрения, является объектом, по меньшей мере, одной проверки и одного отбора проб от 10 рыб в случае, когда наблюдаются клинические или посмертные признаки, соответствующие инфекции SHV, NHI или обеим инфекциям, или от не менее 30 рыб в случае, если клинические или посмертные признаки не наблюдаются. Образцы тестируются с использованием одного или нескольких методов диагностики: обычная изоляция вируса в клеточной культуре, за которой следует идентификация вируса иммунохимическим или молекулярным методом; обнаружение вируса при помощи RT-qPCR; другие методы диагностики с доказанной аналогичной эффективностью, такие как непрямой иммунофлюоресцентный тест (IFAT), иммуноферментный тест (ELISA), RT-PCR и иммуногистохимия (IHC).

27. Присутствие SHV считается подтвержденным, если один или несколько таких методов диагностики имели положительные результаты по вирусу SHV (VSHV). Присутствие NHI считается подтвержденным, если один или несколько таких методов диагностики имели положительные результаты по вирусу NHI (VNHI). Подтверждение первого случая SHV или NHI в зонах или их частях, которые ранее не были заражены, основано на обычной изоляции вируса в клеточной культуре или тесте RT-qPCR.

28. Разрешается исключение подозрения на SHV, NHI или на обе болезни в случае, когда результаты клеточных культур или теста RT-qPCR не дают никаких других доказательств, относящихся к присутствию SHV, NHI или обоих.

Раздел 2

Диагностические методы и процедуры для

наблюдения и подтверждения NHI и SHV

29. В случае отбора проб и проведения лабораторных исследований с целью получения или сохранения статуса «благополучный по болезни» в отношении NHI или SHV, следует применять диагностические методы и процедуры, установленные в настоящем разделе.

30. Ткани, используемые для вирусологического исследования на клеточной культуре, перед отправкой или передачей в аккредитованную лабораторию, берутся с использованием стерильных инструментов для рассечения и помещаются в стерильные пластиковые пробирки, содержащие среду клеточной культуры, содержащую 10% сыворотки плода крупного рогатого скота, 200 МЕ пенициллина, 200 мкг стрептомицина и 200 мкг канамицина на миллилитр или другие антибиотики с доказанной эффективностью (в дальнейшем – транспортная среда).

31. Количество тканей рыбы, необходимое для вирусологического исследования клеточной культуры и для RT-qPCR, зависит от размеров рыбы. Так, тканями, из которых берутся пробы, является целый малек (если длина тела составляет менее 4 см), внутренности, включая почки (если длина тела составляет более 4 см и менее 6 см), или для рыбы большего размера – почки, селезенка, сердце и/или мозг, а также жидкость яичника репродуктивной рыбы в период нереста.

Жидкость яичника или семенная жидкость либо фрагменты органов от не более 10 рыб могут объединяться в стерильной пробирке, содержащей не менее 4 мл транспортной среды. Масса тканей в каждом образце составляет не менее 0,5 грамма (г).

32. Вирусологическое исследование на клеточной культуре должно начинаться не позднее, чем через 48 часов после отбора проб. В исключительных случаях вирусологическое исследование может начинаться не позднее 72 часов после отбора исследуемого материала при условии, что он защищен транспортной средой и во время транспортировки соблюдаются температурные условия.

33. Пробы для теста RT-PCR или RT-qPCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) отбираются у рыбы с помощью стерильного инструмента и переносятся в стерильную пластиковую пробирку, содержащую транспортную среду. В одну пробирку могут помещаться ткани от 10 рыб; они составляют общую пробу. При этом, если количество инокулята невелико, можно использовать ткани не более пяти рыб. В качестве альтернативы, образцы могут быть объединены в реагентах стабилизации РНК в соответствии с рекомендациями производителей, но каждую рыбу следует обрабатывать отдельно и не объединять с другими рыбами в пробах, учитывая уменьшенное количество материала, которое будет использоваться для экстракции. Целая рыба также может отправляться в аккредитованную лабораторию.

34. Пробирки, содержащие ткани рыб в транспортной среде и предназначенные для клеточной культуры или анализа RT-PCR/RT-qPCR, помещаются в изолированные контейнеры, таких как толстостенные коробки из полистирола, с достаточным количеством льда или другого аналогичного охлаждающего агента для обеспечения охлаждения проб во время транспортировки в аккредитованную лабораторию. Следует избегать замораживания проб. Температура пробы во время транспортировки не должна превышать 10°C, а транспортный контейнер во время приемки должен еще содержать лед или один либо несколько охлаждающих блоков должны быть частично или полностью заморожены.

35. Можно отправлять в аккредитованную лабораторию целую рыбу при соблюдении во время транспортировки температурных условий, не превышающих 10°C. Целая рыба упаковывается в абсорбирующую бумагу и отправляется в пластиковом пакете. Можно также отправлять живую рыбу.

36. Допускается сбор дополнительного диагностического материала в случае, если аккредитованная диагностическая лаборатория согласна, в целях дополнительного исследования.

37. В случае, когда встречаются трудности практического порядка, препятствующие обработке тестов в течение 48 часов после сбора тканей рыб, допускается их замораживание в транспортной среде при –20°C или при более низкой температуре и проведение вирусологического исследования в течение 14 дней. При этом ткани рыб могут быть заморожены и разморожены только один раз перед исследованием. Следует хранить записи, предоставляющие подробную информацию о каждом замораживании проб тканей рыб.

В аккредитованной лаборатории ткани рыб, содержащиеся в пробирках, полностью гомогенизируются с помощью миксера, блендера или ступки с пестиком и стерильным песком, а затем в суспензии помещаются в транспортную среду происхождения.

38. В случае, если проба состоит из целой рыбы длиной менее 4 см, ее следует фрагментировать с помощью стерильных ножниц или скальпеля после удаления части тела, которая находится за анальным отверстием. Если проба состоит из целой рыбы длиной от 4 до 6 см, собираются внутренности, включая почки. Если проба состоит из целой рыбы длиной более 6 см, пробы тканей собираются в соответствии с пунктами 30-33. Пробы тканей фрагментируются с помощью стерильных ножниц или скальпеля, гомогенизируются и помещаются в суспензии в транспортную среду. Конечное соотношение между тканями и транспортной средой корректируется в аккредитованной лаборатории 1:10.

39. Гомогенат центрифугируют в охлаждающей центрифуге при температуре от 2 до 5°C, при 2000-4000 × г в течение 15 минут, а супернатант должен быть собран и обработан либо в течение 4 часов при 15°C, либо в течение ночи при температуре 4-8°C с антибиотиками. Если перевозка пробы осуществлялась в транспортной среде, обработка супернатанта антибиотиком не требуется.

40. В случае, если возникают трудности, такие как дефектный инкубатор, или проблемы с клеточными культурами, которые препятствуют прививке клеток в течение 48 часов после сбора проб тканей рыб, супернатант можно заморозить при –80°C и вирусологическое исследование провести в течение 14 дней.

41. Если собранный супернатант хранится при –80°C в течение 48 часов после отбора проб, он используется повторно только один раз для вирусологического исследования.

42. Перед инокуляцией клеток супернатант смешивают в количестве, равном смеси антисывороток против нативных серотипов вируса инфекционного панкреатического некроза (NPI), соответствующим образом разбавляют и инкубируют таким образом в течение не менее одного часа при 15°C, или не более 18 часов при 4°C. Титр антисыворотки составляет не менее 1:2000 в тесте нейтрализации налета с 50% сокращением налета.

43. Обработка всех прививок антисывороткой против вируса NPI направлена на предотвращение возникновения цитопатического эффекта (ECP), вызванного вирусом NPI, в инокулированных клеточных культурах. Этот подход позволяет сократить продолжительность вирусных исследований, а также число случаев, в которых возникновение ECP следует рассматривать как потенциальный показатель вируса SHV или NHI.

44. Если тесты поступают из производственных подразделений, считающихся благоприятными по NPI, обработку прививок против вируса NPI можно исключить.

45. Подготовка тестов для программ надзора, использующих тест RT-PCR, RT-qPCR, которые были помещены в транспортную среду, осуществляется согласно процедурам, предусмотренным в пунктах 37-44.

46. После центрифугирования собирают супернатант и извлекают РНК. Если дополнительное исследование не должно проводиться сразу после центрифугирования, тесты немедленно замораживаются при –20°C или при более низкой температуре.

47. Для анализа тканей рыбы, хранящихся в реагенте, стабилизирующем РНК, другие операции на пробах, хранящихся при различных температурах, выполняются в следующие сроки:

пробы, хранящиеся при 37°C: один день;

пробы, хранящиеся при 25°C: одна неделя;

пробы, хранящиеся при 4°C: один месяц;

пробы, хранящиеся при –20°C: неограниченный срок.

48. Общие пробы, хранящиеся в реагенте, стабилизирующем РНК, обрабатываются так же, как отдельные пробы в реагенте, стабилизирующем РНК. В случае общих проб, хранящихся в реагенте, стабилизирующем РНК, объем пробы не должен превышать объем, рекомендуемый производителем для извлечения РНК при помощи наборов. Если объединяются более крупные пробы, наборы или методы экстракции адаптируются соответствующим образом. Пробы, отобранные в реагентах, стабилизирующих РНК, не используются для клеточных культур.

49. При объединении проб, поскольку протоколы RT-qPCR обладают такой же или более высокой чувствительностью, что и методы клеточной культуры, приемлемо использование для PCR супернатанта, полученного из гомогенизированных тканей рыб, происходящих от органов, отобранных от максимум 10 рыб, и объединенных в среде клеточной культуры. При этом, из-за гораздо меньшего количества инокулята, используемого для PCR, по сравнению с клеточной культурой, все ткани рыб тщательно гомогенизируются перед группированием материала для экстракции. Этот же принцип применяется и в случае, если пробы взяты в реагентах, стабилизирующих РНК. Но в таком случае часто бывает трудно собрать в одну пробирку репрезентативный материал от не более 10 рыб, поэтому число рыб в общей пробе должно быть уменьшено до 2-5.

50. При вирусологическом исследовании на клеточной культуре и культурных средах культивируются клетки из клеточной линии 2 из мальков вида Lepomis macrochirus (BF-2) или из клеточной линии 2 из мальков радужной форели (RTG-2) и клеток Epithelioma papulosum cyprini (EPC) или Pimephales promelas (FHM) при температуре от 20 до 30°C в соответствующей среде, а именно среде Eagle (Eagle′S minim essential Medium – MEM) или ее варианте, к которой добавлены 10% сыворотка плода крупного рогатого скота и антибиотики в стандартных концентрациях.

51. Когда клетки выращиваются в закрытых флаконах, рекомендуется буферизировать среду двууглекислым натрием. Среда, используемая для культуры клеток в открытых единицах, может буферизоваться tris(hidroximetil)aminometan-HCl (Tris-HCl) (23 mM) и двууглекислым натрием (6 mM). РН должен быть 7,6 ± 0,2.

52. Клеточные культуры, которые используются для прививки тканевым материалом от рыбы, являются молодыми, однодневными клеточными культурами в монослоях, могут применяться культуры в возрасте от 4 до 48 часов. Клетки находятся в стадии активного роста в момент прививки.

53. При вирусологическом исследовании на клеточной культуре инокулируется суспензия органов, обработанная антибиотиками в клеточных культурах в двух разведениях, а именно начальное разведение и, кроме того, разведение 1:10, что приводит к окончательным разведениям тканевого материала в среде клеточной культуры 1:100 и 1:1000, чтобы избежать интерференции аналогов. Необходимо привить, по меньшей мере, две клеточные линии, как указано в пунктах 50-52. Соотношение количества инокулята и объема среды клеточной культуры составляет приблизительно 1:10.

54. Для каждого разведения и каждой клеточной линии используется площадь не менее 2 см², что соответствует одной лунке на 24-луночной пластине с клеточной культурой. Пластины с клеточной культурой используются, где это возможно.

55. Привитые клеточные культуры инкубируются при 15°C в течение от 7 до 10 дней. В случае, когда цвет среды клеточной культуры меняется и из красного переходит в желтый, что указывает на подкисление среды, рН корректируется при помощи стерильного раствора бикарбоната или при помощи эквивалентных веществ, чтобы гарантировать чувствительность клеточной культуры к вирусной инфекции.

56. По меньшей мере каждые шесть месяцев или в случае, когда подозревается снижение клеточной чувствительности, осуществляется титрование запасов замороженных вирусов SHV и NHI, чтобы проверить чувствительность клеточных культур к инфекции.

57. Привитые клеточные культуры с помощью микроскопии проверяются регулярно, не менее трех раз в неделю, чтобы увидеть появление ECP, с увеличением между 40 × и 150 ×. Если ECP очевидны, немедленно приступают к процедурам идентификации вируса в соответствии с пунктом 64.

58. Если после первой инкубации в течение семи–десяти дней ECP не образуется, субкультивирование проводят на свежих клеточных культурах с использованием клеточной поверхности, аналогичной поверхности первичной культуры.

59. Аликвотные части среды (супернатанта), происходящие от всех культур или лунок, которые составляют первичную культуру, объединяют для каждой клеточной линии через 7-10 дней после инокуляции. Затем соответствующие пулы инокулируют на гомологичные клеточные культуры, не разбавляют и разводят 1:10 (в конечном итоге это приводит к разведениям супернатанта соответственно 1:10 и 1:100), как описано в пункте 53. Также инокулируются аликвоты 10% среды, которая составляет первичную культуру непосредственно в лунке со свежими клеточными культурами (субкультивирование лунка к лунке). Инокуляции может предшествовать преинкубация разведений антисывороткой против вируса NPI в соответствующем разведении, как описано в пунктах 39-44.

60. Инкубируются привитые культуры в течение 7-10 дней при 15°C и рассматриваются с учетом положений пункта 57.

61. В случае, когда появляется токсичный ECP в течение первых трех дней инкубации, на данном этапе выполняется субкультивация, но в этом случае клетки инкубируются в течение семи дней и подвергаются новой субкультивации с продолжительностью инкубации также семь дней. Если токсичный ECP происходит через три дня, клетки перемещаются один раз и инкубируются, чтобы достичь общего числа в 14 дней после первой прививки. Не должно быть признаков токсичности в течение последних семи дней инкубации.

62. Если бактериальное загрязнение происходит, несмотря на лечение антибиотиками, субкультивации предшествует центрифугирование при 2000-4000× г в течение 15-30 минут при температуре 2-5°C или фильтрация супернатанта через фильтр (мембрана с низким процентом абсорбции белка) 0,45 мкм или оба. Кроме того, субкультивация должна следовать тем же процедурам, что и процедуры, описанные для производства токсического ECP в настоящем пункте.

63. В случае, когда ECP не происходит, тест может быть объявлен отрицательным.

64. Если наблюдается появление ECP в клеточной культуре, среда (супернатант) собирается и исследуется одним или несколькими из следующих методов: иммуноферментный тест (ELISA), иммунофлюоресцентный тест (IF), нейтрализация, RT-PCR или RT-qPCR. В случае если эти тесты не позволили окончательно идентифицировать вирус в течение недели, супернатант отправляется в аккредитованную национальную лабораторию или аккредитованную международную лабораторию по заболеваниям рыб для немедленной идентификации.

65. Тест ELISA сэндвич с двумя антителами проводится для идентификации изолята вируса. Пластины с микролунками наполняют 50 мкл/лунку (0,9 pg) раствора иммуноглобулинов (Ig) из кроличьей антисыворотки против вируса IHNV или вируса VSHV, очищенных протеином А, разведенных в карбонатном буфере (рН 9,6), содержащем 15 мМ азида натрия, подтвержденного качества, инкубируют при 4°C в течение периода от 18 часов до 2 недель.

66. На разбавляющей пластине каждый образец, содержащий 1% Triton X-100, и положительные контроли разбавляются буферным раствором, а именно, салинфосфатным буфером (PBS)-t-BSA, 1% BSA в четырех пропорциях разведения и соответственно неразбавленные, 1:4, 1:16 и 1:64. Пластины ELISA моются в PBS, содержащем 0,05% Tween-20 (PBS-T), и 50 мкл каждого разведения переносятся с разбавляющей пластины на вымытую и заполненную пластину ELISA.

67. Пластины ELISA инкубируют в течение 30 минут при 37°C, затем промывают и оставляют на инкубацию в течение 30 минут при 37°C в присутствии специфических моноклональных антител (а именно: MAb IP5B11 для идентификации VHSV и Hyb 136-3 для идентификации VNHI). Переносят на пластину ELISA 50 μl противомышиных антител кролика, соединенных с пероксидазой из хрена (HRP), разбавляют 1:1000 в PBS-t-BSA. После новой промывки запускают реакции, с добавлением в каждую лунку 50 мкл ортофенилендиамина (OPD). Пластины ELISA инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте, а реакцию прекращают путем добавления 100 мкл 0,5 м H₂SO₄ в каждую лунку.

68. Поглощение контролируется на длине волны 492 и 620 нм в считывателе ELISA. Пробы объявляются положительными или отрицательными после сравнения результатов теста со значениями поглощений для положительного и отрицательного контроля. Как правило, пробы с общим поглощением (A)<0,5 для неразбавленного материала считаются отрицательными, пробы со значениями A от 0,5 до 1,0 считаются подозрительными, а пробы со значениями A>1,0 считаются положительными.

69. Могут использоваться и другие варианты ELISA с аналогичной доказанной эффективностью вместо вариантов, указанных в настоящем разделе.

70. Иммунофлюоресценция (IF) применяется для идентификации перечисленных патогенных агентов VSHV и VNHI и осуществляется путем заражения клеток на пластинах с 96 лунками “Black”, классических пластинах с 24 лунками или на предметных стеклах в пластинах с 24 лунками. При обнаружении VNHI или VSHV или обоих вирусов путем заражения клеток на предметных стеклах применяется следующий протокол:

1) предметные стекла высевают клетками с плотностью, которая обеспечивает слияние между 60 и 90 % через 24 часа после выращивания. Для этой цели можно использовать ячейки ECP из-за их высокой адгезии к стеклянным поверхностям, но могут использоваться и другие клеточные линии, например, BF-2, RTG-2 или FHM. Прививают 150 мкл супернатанта клеточной культуры в двух разных разведениях (1:10 и 1:1000) в двух экземплярах на однослойных культурах в течение одного дня и инкубируют при 15°C в течение 24 часов;

2) в последующем удаляют клеточную среду культуры, а инфицированные монослои клеток фиксируют 0,5 мл водного раствора холодного ацетона (80% об./об.). Закрепление происходит под вытяжкой в течение 15 минут при комнатной температуре, затем удаляют раствор ацетона и высушивают предметные стекла на воздухе в течение не менее 30 минут. На этом этапе пластины обрабатывают немедленно или хранятся при температуре –20°C для последующего использования;

3) специфические моноклональные антитела (а именно: MAb IP5B11 для идентификации VSHV и Hyb 136-3 для идентификации VNHI) разбавляют в PBST 0,01 м, с pH 7,2 при разбавлении, рекомендованном поставщиком моноклональных антител. Затем добавляют к фиксированным моноклональным поверхностям, используя 50-100 мкл для каждой лунки, и пластины инкубируют в течение часа при 37°C во влажной печи;

4) предметные стекла трижды слегка промывают PBS, содержащим 0,05% Tween-20 (PBS-T), а буфер полностью удаляют после последнего полоскания. Затем клетки инкубируют в течение одного часа при 37°С с антителами против мышиных иммуноглобулинов, соединенными с изотиоцианатом флуоресцеина (FITC) или тетраметилродамин-5 (и 6)-изотиоцианатом (TRITC), используемыми в качестве первичных антител, разбавленными в соответствии с инструкциями поставщика. Снова промывают PBS-T и высушивают. Окрашенные культуры закрепляют на предметных стеклах с помощью солевого раствора глицерина и исследуют в падающем ультрафиолетовом свете. Используют окуляры 10 × или 12 × и объективы × 25 или × 40, числовая апертура которых составляет > 0,7 соответственно и > 1,3.

71. В качестве альтернативы могут применяться другие методы IF в отношении клеточных культур, фиксации и эталонных антител с аналогичной доказанной эффективностью.

72. В процессе нейтрализации удаляют клетки из собранного супернатанта путем центрифугирования (2000 – 4000 × г) или мембранной фильтрации (0,45 мкм) с низким процентом абсорбции белка, затем в среде клеточной культуры разбавляют супернатант 1:100 и 1:10000.

73. Смешивают аликвотные части по меньшей мере двух разведений супернатанта и инкубируют отдельно в течение 60 минут при 15°C в равных частях со следующими реагентами:

1) сыворотка, содержащая антитела против VSHV в разведении 1:50 (об.:об.);

2) сыворотка, содержащая антитела против VNHI в разведении 1:50 (об.:об.);

3) смесь антисыворотки против местных серотипов VNPI в разведении 1:50 (об.:об.);

4) только среда (положительный контроль).

50 мкл каждой смеси, состоящей из супернатанта с определяемым вирусом и сыворотки, инокулируют по меньшей мере на две клеточные культуры и инкубируют при 15°C. Отслеживают появление ECP, как описано в пункте 57.

74. Штаммы VSHV и изоляты, которые не реагируют на тесты нейтрализации, идентифицируют с помощью IF или ELISA.

75. Могут применяться другие тесты нейтрализации с аналогичной доказанной эффективностью.

76. Все манипуляции РНК выполняются на льду, используя перчатки.

77. Извлекают РНК методом фенола-хлороформа или хроматографией сходства по столбцам в соответствии с инструкциями производителя. Могут использоваться имеющиеся на рынке комплекты для извлечения РНК, позволяющие получить высококачественную РНК, которая может использоваться в протоколах RT-PCR, детально представленных в нижеприведенных пунктах.

78. РНК ресуспендируют в дистиллированной воде без РНК-азы (а именно: в воде, обработанной 0,1% диэтилпирокарбонатом) или в подходящем элюирующем буфере.

79. Следующие праймеры используются для обнаружения VNHI:

праймер сенсорный: 5 ‘- AGA-GAT-JRC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

праймер антисенсорный: 5 ‘- GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Применяются следующие циклы (RT-PCR в один этап): один цикл: при 50°C в течение 30 минут; один цикл: при 95°C в течение 2 минут; 30 циклов: при 95°C в течение 30 секунд, при 50°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 60 секунд; один цикл: при 72°C в течение 7 минут и погружение в воду при температуре 4°C.

80. Следующие праймеры используются для обнаружения VSHV:

VN For 5 ‘-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN Rev 5 ‘- GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Применяются следующие циклы (RT-PCR в один этап): при 50°C в течение 30 минут, при 95°C в течение 15 мин; 35 циклов: при 94°C в течение 30 секунд, 55°C в течение 30 секунд и 68°C в течение 60 секунд. Впоследствии реакция сохраняется при температуре 68°C в течение 7 минут.

Количество и специфика реакций RT-PCR оцениваются электрофорезом в 1,5% агарозном геле с бромидом этидиума, а реакционные продукты исследуются ультрафиолетовой транслюминацией. Для VNHI можно наблюдать продукт усиления через PCR 693 pb. Что касается VSHV, размер усилительного продукта составляет 505 pb.

Результаты ПЦР могут варьировать в зависимости от условий, в которых реализован метод, и разрешается оптимизировать термические протоколы в зависимости от используемого теплового цикла. Ложноположительные результаты могут быть получены из-за ошибок в отношении прикрепления праймеров или из-за загрязнения в аккредитованной лаборатории. В связи с этим, во избежание каких-либо сомнений, включены соответствующие положительные и отрицательные контроли и продукты усиления секвенции. Что касается праймеров VSHV, использование клеток BF-2 требует особого внимания, поскольку праймеры могут реагировать с ДНК/РНК клеточной линией, что приводит к ложноположительным результатам сходных размеров. Если тест выполняется на супернатанте, поступающем из клеток BF-2, все фрагменты, усиленные PCR, секвенируются.

81. Усиление VSHV осуществляется с использованием следующих праймера и зонда:

праймер сенсорный: 5 ‘- AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

зонд: 5 ‘- FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

RT-qPCR в один этап: для каждой серии пластин включаются положительные и отрицательные контроли.

Последовательность циклов: до 50°C в течение 30 минут, при 95°C в течение 15 мин, 40 циклов при 94°C в течение 15 секунд, и 60°C в течение 40 секунд и 72°C в течение 20 секунд, и корректировать, если это необходимо.

В качестве альтернативы могут применяться и другие версии RT-PCR или RT-qPCR с аналогичной доказанной эффективностью.

82. Усиление VNHI осуществляется с использованием следующих праймеров и зонда:

праймер сенсорный: 5 ‘- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

праймер антисенсорный: 5 ‘- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA-3′;

зонд: 5′ 6fam-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

RT-qPCR в два этапа: большое внимание уделяется обработке пробирок между реакциями, чтобы предотвратить заражение.

Последовательность циклов (после этапа в режиме реального времени): 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 40 циклов при 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 минуты; производятся корректировки, если это необходимо.

В качестве альтернативы могут применяться другие версии RT-PCR или RT-qPCR с доказанной эффективностью.

83. В случае, когда необходимо лабораторное исследование для подтверждения или опровержения присутствия NHI или SHV или обоих болезней, используются следующие методы диагностики:

1) обычная изоляция вируса, затем идентификация его серонейтрализацией или иммунохимическими или молекулярными методами;

2) обнаружение вируса через RT-PCR или RT-qPCR;

3) другие диагностические методы, такие как IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.

84. Для условной изоляции вируса, за которой следуют его идентификация и выбор образцов, необходимо выбрать для изучения не менее 10 рыб, представляющих типичные признаки NHI или SHV.

85. Тканевый материал может подвергаться и другим диагностическим методам, таким как IFAT на замороженных участках или иммуногистохимия на тканевом материале, закрепленном формалином, а также вирусологическому исследованию в соответствии с подпунктом 1) или 2) пункта 83 менее чем через 48 часов после отбора проб, если достигнут отрицательный результат или положительный результат с материалом, представляющим первый случай NHI или SHV.

86. При проведении титрования с целью проверки чувствительности клеточных культур к инфекции используются, как минимум, два изолята VSHV и один изолят VNHI. Эти изоляты являются репрезентативными для основных групп вирусов. Используются четко определенные изоляты. Партии вирусов, имеющих низкое количество проходов на клеточных культурах, выращиваются во флаконах клеточных культур на клетках BF-2 или RTG-2 для VSHV и на клетках EPC или FHM для VNHI. Используется среда клеточной культуры, к которой добавляется не менее 10% сыворотки. Для прививки используется мягкий индикатор низкого значения (<1). Когда ECP является общим, вирус собирается путем центрифугирования супернатанта клеточных культур до 2000 × г в течение 15 минут, стерилизованного путем фильтрации через мембрану 0,45 мкм, и распределяется в маркированные криотубы. Вирус хранится при –80°C. Через неделю после замораживания три ампулы каждого вируса размораживаются в холодной воде и титруются на соответствующих клеточных линиях. Каждый изолят вируса размораживается и титруется, по меньшей, мере один раз в шесть месяцев или если подозревается снижение чувствительности клеточной линии. Процедуры титрования описываются в деталях и каждый раз применяется та же процедура. Титрование с помощью предельного разведения включает, по меньшей мере, шесть репликаций из каждой серии разведений. Титры сравниваются с титрами, полученными ранее. Если титр одного из трех изолированных вирусов уменьшается в 2 раза или более по сравнению с первоначальным титром, клеточная линия больше не используется для наблюдения.

В случае, когда в аккредитованной лаборатории хранятся разные клеточные линии, каждая линия исследуется отдельно. Лабораторные записи хранятся не менее 10 лет.

Глава III

МЕТОДЫ НАБЛЮДЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ ПРИ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ

БОЛЕЗНИ КАРПА КОИ (KOI HERPESVIRUS DISEASE-KHVD)

Раздел 1

Требования к программам надзора и ликвидации с целью получения

и поддержания статуса «благополучный по болезни» в отношении

герпесвирусной болезни карпа кои (KHVD)

87. Герпесвирусная болезнь карпа кои (KHVD) является болезнью, вызываемой вирусом герпеса карпа кои (koi herpesvirus – KHV), который относится к семейству Alloherpesviridae. Научное название – герпесвирус 3 ципринида (cyprinid herpesvirus 3 – CyHV-3) В случае, когда необходимо индивидуальное наблюдение за дикими популяциями, а также предотвращение распространения герпесной инфекции карпа кои (KHV), число и географическое распределение пунктов отбора проб определяются таким образом, чтобы получалось разумное покрытие зоны или ее части. Пункты отбора проб являются также репрезентативными для различных экосистем, в которых встречаются восприимчивые дикие популяции, а именно рек и озер.

88. Индивидуальный надзор основан на регулярном мониторинге водоемов, которые содержат чувствительные виды. Мониторинг осуществляется, когда температура воды достигает уровней, способствующих возникновению заболевания (> 15°C), и не ранее, чем через две недели после даты достижения этих температур. Вся обнаруженная больная рыба или рыба, проявляющая аномальное поведение, является объектом отбора и тестов.

89. В выборку включается рыба, которая длительное время хранится при температурах, способствующих развитию вируса, а именно: в течение от двух до трех недель, при температуре от 15 до 26°C.

Может использоваться метод, описанный ниже:

1) отбор субпопуляции во время переноса из зимнего пруда в летний пруд и хранение рыбы в той же воде, что и в летнем пруду, до достижения требуемой минимальной температуры; или

2) отбор проб во время вылова рыбы или во время других операций по обработке рыбы, которые являются частью обычной деятельности. Пробы отбирают от 24 до 72 часов после такой практики управления, чтобы увеличить шансы обнаружения KHV.

90. Когда фермы или дикие популяции подвергаются проверке или выборке несколько раз в год, диапазон между проверками или между выборками должен быть как можно больше в сезон, когда существует вероятность, что температура воды достигнет максимальных годовых значений, не превышая 28°C.

91. Все производственные единицы, такие как пруды и бассейны, подлежат контролю с целью установления наличия мертвой, ослабленной рыбы или рыбы с аномальным поведением.

Вид Cyprinus carpio и его гибриды, такие как Cyprinus carpio × Carassius auratus отбираются тогда, когда они присутствуют на ферме.

92. Рыба, которая будет отобрана в качестве проб, отбирается следующим образом:

1) если присутствует ослабленная рыба, рыба с аномальным поведением или рыба, которая недавно умерла, но еще не разложилась, эта рыба должна быть отобрана;

2) если для производства рыбы используется более одного источника водоснабжения, необходимо включить в образец рыбу, представляющую все источники водоснабжения;

3) рыбу отбирают таким образом, чтобы все части фермы и все возрастные классы, сгруппированные по годам, были пропорционально представлены в пробе.

93. Для получения статуса «благополучный по болезни» (I категория) в отношении KHV предусмотрено, что зона или ее часть со статусом III категории в отношении KHV может получить статус I категории, когда все фермы, содержащие восприимчивые виды в данной зоне или в данной ее части, соблюдают требования, связанные с данным статусом.

Пункты, в которых отбираются пробы от диких популяций, отобранных в соответствии с соответствующей частью, подлежат одной из следующих программ надзора:

1) модель A – программа надзора в течение двух лет.

Фермы или пункты отбора проб были объектом контроля и отбора проб в течение не менее двух лет подряд, имеют отрицательные результаты в отношении KHV и исключено любое подозрение на KHVD;

2) модель B – программа надзора в течение четырех лет, с образами небольших размеров. Фермы или пункты отбора проб были объектом контроля и отбора проб в течение минимум четырех лет подряд.

В течение этого четырехлетнего периода тестирование всех образцов с использованием диагностических методов, установленных в пунктах 122-123, дало отрицательные результаты в отношении KHV и исключено любое подозрение на KHVD.

94. В случае, если во время выполнения четырехлетней программы по надзору подтверждена инфекция KHV на ферме, включенной в соответствующую программу надзора, и, следовательно, был отозван санитарный статус фермы II категории, эта ферма может немедленно восстановить свой статус II категории и продолжить реализацию программы по наблюдению, чтобы получить статус «благополучный по здоровью» без реализации программы по ликвидации, как описано в настоящем разделе, если ферма выполняет следующие условия:

1) статус фермы в отношении KHVD не зависит от состояния здоровья популяций водных животных в соседствующих естественных водоемах в отношении этой болезни;

2) ферма была опустошена, очищена, дезинфицирована и подвергнута периоду санитарного вакуума продолжительностью не менее шести недель;

3) ферма повторно заселена рыбой из зон или их частей, которые имеют санитарный статус I категории в отношении KHVD.

95. Программа ликвидации предусматривает, что зона или ее часть с санитарным статусом V категории относительно KHVD может получить санитарный статус I категории относительно этой болезни тогда, когда все фермы, содержащие восприимчивые виды из данной зоны или данной ее части, являются объектом, по меньшей мере, одной программы ликвидации.

Меры контроля применяются эффективно и в зоне изоляции, которая включает защитную зону и зону наблюдения, расположена в непосредственной близости от фермы (ферм), официально объявленной зараженной (зараженными) KHV.

Зона изоляции определяется в каждом конкретном случае с учетом факторов, влияющих на риски распространения KHVD на разводимую и дикую рыбу, такие как: количество, уровень смертности и распространения случаев гибели рыб на ферме, зараженной KHV; расстояние, на котором расположены соседние фермы, и их плотность; удаленность от бойни; фермы, с которыми они вступают в контакт; виды, присутствующие на фермах; методы рыбопроизводства, применяемые на инфицированных фермах и на соседствующих с ними фермах; гидродинамические условия и другие идентифицированные факторы, подходящие с эпидемиологической точки зрения.

96. Для установления зоны защиты и наблюдения устанавливается защитная зона в непосредственной близости от фермы, официально объявленной инфицированной KHV, и эта зона должна соответствовать всему гидрографическому бассейну фермы, официально объявленной инфицированной по KHV.

97. Агентство может ограничить расширение зоны до определенной части гидрографического бассейна при условии, что это не создаст препятствий предотвращению распространения KHVD. Агентство устанавливает зону наблюдения за пределами защитной зоны, при этом зона наблюдения должна соответствовать зоне, расположенной вокруг установленной защитной зоны.

98. Все фермы, в которых содержатся восприимчивые виды, находящиеся в защитной зоне и официально не объявленные зараженными KHV, являются объектом официального расследования, включающего, по меньшей мере, следующие элементы:

1) отбор проб для тестирования 10 рыб в случае, если наблюдаются клинические или посмертные признаки, соответствующие KHVD, или для тестирования 30 рыб в случае, если клинические или посмертные признаки не наблюдаются;

2) на фермах, в которых тесты имели отрицательные результаты, ветеринарно-санитарный контроль продолжает проводиться один раз в месяц в течение сезона, когда температура воды предположительно превысит 15°C, пока не будет отменена защитная зона.

99. Все фермы, официально объявленные зараженными KHV, опорожняются, очищаются, дезинфицируются и подвергаются периоду санитарного вакуума продолжительностью не менее шести недель. После опорожнения всех ферм, официально объявленных инфицированными, которые находятся в одной и той же защитной зоне, должен соблюдаться период синхронизированного санитарного вакуума в течение не менее трех недель.

Положения настоящего пункта относятся и к новым фермам, официально объявленным зараженными в ходе выполнения программы ликвидации.

100. Когда наступает период санитарного вакуума для ферм, официально объявленных инфицированными, защитные зоны превращаются в зоны наблюдения.

101. Агентство на основании оценки риска принимает решение о необходимости требовать опорожнения, очистки, дезинфекции и установления периода санитарного вакуума для других ферм, которые находятся внутри установленных защитных зон и зон наблюдения. Продолжительность периода санитарного вакуума устанавливается Агентством на основании оценки рисков в каждом конкретном случае.

102. Все фермы, официально объявленные зараженными KHV, и все остальные фермы, которые были объектом санитарного вакуума, расположенные внутри установленных защитных зон и зон наблюдения, повторно заселяются рыбой, происходящей из зон и их частей с санитарным статусом I категории относительно KHVD, или на переходный период – рыбой, происходящей из зон и их частей с утвержденной программой надзора за KHVD.

103. Повторное заселение осуществляется только после того, как все фермы, официально объявленные зараженными KHV, опустошены, очищены, дезинфицированы и подвергнуты санитарному вакууму в соответствии с пунктами 99-101.

104. Все фермы, которые содержат восприимчивые виды из зон или их частей, являющихся объектом программы ликвидации, а также в случае, когда необходим надзор за дикими популяциями, выбранные пункты отбора проб становятся затем объектом программы наблюдения, предусмотренной в пункте 93.

105. Часть зоны, включающая одну ферму, имеющую санитарный статус I категории относительно KHVD, данный санитарный статус которой не зависит от соседних природных вод, и санитарный статус I категории которой был отозван, может восстановить статус I категории в отношении KHVD, как только Агентство подтвердило, что соблюдаются следующие условия:

1) ферма была опустошена, очищена, дезинфицирована и подвергнута периоду санитарного вакуума продолжительностью не менее шести недель;

2) ферма была повторно заселена рыбой из зон или их частей, имеющих санитарный статус I категории, или из части зоны с утвержденной программой надзора за KHVD (санитарный статус II категории).

106. В случае, когда необходим индивидуальный надзор за сохранением санитарного статуса I категории, все фермы, содержащие восприимчивые виды, указанные в приложении № 3 к Ветеринарно-санитарной норме, касающейся требований к здоровью животных и продуктам рыбоводства и мер по предупреждению и борьбе с некоторыми болезнями у водных животных, утвержденной Постановлением Правительства № 239/2009, из зоны или ее части подвергаются санитарной проверке и отбору проб в соответствии с таблицей 5 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме с учетом уровня риска заражения фермы KHV.

107. В частях зоны с санитарным статусом I категории в отношении KHVD, включающих одну или несколько ферм, санитарный статус которых в отношении KHVD зависит от санитарного статуса соседних природных вод по этой болезни, частота санитарных проверок должна соответствовать числу с высоким риском, предусмотренному в таблице 6 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме.

108. В зонах или их частях, в которых существует ограниченное число ферм, а индивидуальный надзор за этими фермами не обеспечивает достаточно эпидемиологических данных, программы надзора для сохранения санитарного статуса «благополучный по болезни» включают пункты отбора проб, выбранные в соответствии с требованиями, предусмотренными в пунктах 128-131.

109. Из этих пунктов отбора проб 50% являются объектом инспекции и отбора проб ежегодно путем ротации. Выборка должна проводиться в соответствии с таблицей 6 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме. Пробы отбираются, готовятся и исследуются как описано в разделе 2, а лабораторные исследования должны иметь отрицательные результаты в отношении присутствия агента KHVD.

110. Статус «благополучный по болезни» сохраняется только до тех пор, пока все проверенные пробы имеют отрицательные результаты по KHVD и любые подозрения на KHVD исключены.

111. Конкретные требования по устранению мер по предотвращению распространения болезней, предусмотренных в Ветеринарно-санитарной норме, касающейся требований к здоровью животных и продуктам рыбоводства и мер по предупреждению и борьбе с некоторыми болезнями у водных животных, утвержденной Постановлением Правительства № 239/2009, с целью получения санитарного статуса III категории в отношении KHVD предусматривают, что зона или ее часть, имеющая санитарный статус V категории в отношении KHVD, может получить санитарный статус III категории в отношении этой болезни при условии, что:

1) требования, предусмотренные в пунктах 79-101, выполнены. В случае, если это невозможно с технической точки зрения, устанавливается санитарный вакуум, рассматриваемые фермы являются объектом альтернативной меры, которая предоставляет почти идентичные гарантии в отношении ликвидации вируса KHV в среде фермы;

2) все фермы, официально объявленные инфицированными, и все другие фермы, которые являются объектом санитарного вакуума или альтернативных мер в соответствии с подпунктом 1), расположенные в установленных защитных зонах и зонах наблюдения, повторно заселяются рыбой из зон и их частей с санитарным статусом I, II или III категории в отношении KHVD;

3) репопуляция осуществляется только после того, как все фермы, официально объявленные инфицированными, опустошены, очищены, дезинфицированы и подвергнуты санитарному вакууму или альтернативным мерам в соответствии с подпунктом 1).

112. Для получения и сохранения статуса «благополучный по болезни» в отношении KHVD необходимо изучить ткани, которые являются частями жабр и почек. Допускается объединение фрагментов органов от не более двух рыб. Метод диагностики PCR в режиме реального времени (qPCR) используется для получения и сохранения статуса «благополучный по болезни» в отношении KHVD в соответствии с методами и процедурами, установленными в разделе 2 настоящей главы.

113. Для официальных расследований, целью которых является подтверждение или исключение подозрений на KHVD, исследуются ткани, которые являются частями жабр и почек. Возможно объединение фрагментов органов от не более двух рыб.

В официальное расследование входят по меньшей мере одна ветеринарно-санитарная проверка и одна выборка образцов от 10 рыб, в случае, когда наблюдаются клинические или посмертные признаки, соответствующие инфекции KHV, или от 30 рыб, если клинические или посмертные признаки не наблюдаются.

114. Образцы тестируются с использованием диагностического метода, установленного в разделе 2 главы III. Наличие инфекции считается подтвержденным по KHV, если KHV обнаруживается с помощью PCR. Подозрение на KHVD может быть исключено, если этот тест не дает никаких других доказательств присутствия KHV.

Раздел 2

Подробные диагностические методы и процедуры для наблюдения

и подтверждения герпесвирусной болезни карпа кои (KHVD)

115. В случае, когда необходимо лабораторное исследование для подтверждения присутствия KHVD, в целях диагностики может использоваться рыба (отправленная живой или умерщвленной и упакованной отдельно в запечатанные асептические контейнеры) или замороженные органы или фрагменты органов, консервированные в этаноле концентрации 80% – абсолютный этанол или в вирусной транспортной среде (для обработки в течение 48 часов после отбора) для тестирования методами, основанными на условной PCR или на qPCR.

116. Для обнаружения KHV отбираются жабры и почки. При этом, селезенка, мозг и кишечник также могут быть включены в отдельный дополнительный образец. В случаях острой инфекции могут быть объединены ткани, происходящие от не более пяти рыб.

В некоторых случаях могут использоваться и другие образцы, которые не предусматривают умерщвления, такие как кровь, мазки жабр, биопсия жабр и выборка слизи (используется у очень ценных рыб в случае подозрения на наличие KHV).

117. ДНК извлекается в соответствии со стандартными процедурами.

Могут использоваться и другие доступные на рынке наборы для извлечения ДНК, позволяющие получить высококачественную ДНК, которая может использоваться в протоколах PCR, указанных в пунктах 118-120.

118. Для обнаружения KHV выполняется следующий тест qPCR:

праймер сенсорный (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

праймер антисенсорный (KHV-163r): 5′-CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3;

зонд (KHV-109p): 5‘- FAM-CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Последовательность циклов: один цикл при 95°C в течение 15 минут, затем 40 циклов при 94°C в течение 15 секунд и при 60°C в течение 60 секунд. Для каждой серии пластин должны включаться положительные и отрицательные контроли. Вместе с тем, в качестве альтернативы могут применяться другие версии qPCR с доказанной аналогичной эффективностью.

Используется тест, описанный в настоящем разделе, касающийся гена тиминкиназы (TK) KHV. При этом вместо него могут использоваться другие тесты PCR с доказанными аналогичными чувствительностью и специфичностью:

праймер сенсорный (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;

праймер антисенсорный (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Последовательность циклов: один цикл при 95°C в течение 5 минут, затем 35 циклов при 95°C в течение 30 секунд, при 52°C в течение 30 секунд, при 72°C в течение одной минуты и один цикл при 72°C в течение 10 минут. Размер продукта должен быть 409 pb.

119. Результаты PCR могут варьировать в зависимости от условий, в которых реализован метод, а именно, может понадобиться оптимизация тепловых протоколов в зависимости от используемого теплового цикла. Ложноположительные результаты могут получаться из-за ошибок в присоединении праймеров или из-за загрязнения. Для каждой серии пластин следует включать положительные и отрицательные контроли. При этом в качестве альтернативы могут применяться другие версии PCR с аналогичной доказанной эффективностью.

120. Первое обнаружение в определенной зоне подтверждается секвенированием или отправлением в национальную аккредитованную лабораторию или международную аккредитованную лабораторию по болезням рыб с целью немедленного обнаружения вируса.

121. В случае отбора проб и проведения лабораторных исследований с целью получения или сохранения определенного санитарного статуса в отношении KHVD, должны применяться подробные диагностические методы и процедуры, предусмотренные в настоящем разделе.

122. В выборку включают рыбу, которая хранится в течение длительного периода времени при температуре, способствующей развитию вируса (а именно: в течение двух-трех недель при температуре от 15 до 26°C). Пробы отбирают минимум через 24 часа, но не позднее, чем через 72 часа после вылова, что может дезактивировать вирус у векторных рыб, в целях увеличения вероятности обнаружения KHV.

123. В целях надзора за KHVD можно отправлять живую или умерщвленную рыбу, упакованную отдельно в герметичные асептические контейнеры или, альтернативно, замороженные органы или фрагменты органов, консервированные в 80-100%-ном спирте или в вирусной транспортной среде (для обработки в течение 48 часов после сбора) для тестирования с помощью методов, основанных на PCR. Для надзора за KHVD отбираются ткани из жабр и почек. По возможности, следует избегать объединения тканей от большого числа рыб и объединять ткани от не более двух рыб. Более крупные пробы для выделения ДНК гомогенизируют с использованием ступки и пестика или миксера, и отбирают субпробы до выяснения результатов. В качестве альтернативы, субпробы могут отбираться из каждой ткани, включенной в образец, и могут быть введены в лизисные колбы.

124. ДНК извлекают в соответствии со стандартными процедурами. Могут использоваться комплекты для выделения ДНК, доступные на рынке, применяемые в протоколах PCR, указанных в пункте 125.

Приемлемое соотношение между тканями и средой составляет 1:9 г/в. Тесты проводятся на 20-25 мг ткани.

125. Для контроля KHV следует использовать qPCR. В случае, если положительные пробы появляются в зоне, которая ранее не была подтверждена положительно, результаты испытаний подтверждаются:

1) либо путем секвенирования PCR или Nested PCR, полученного из проб. Полученная консенсусная секвенция должна совпадать (по меньшей мере, на 98%) с эталонными секвенциями;

2) либо, альтернативно, путем отправления проб в аккредитованную национальную справочную лабораторию для подтверждения.

126. Должен применяться протокол qPCR в следующем порядке:

праймер сенсорный (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

праймер антисенсорный (KHV-163r): 5‘- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

зонд (KHV-109p): 5′-FAM – CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Последовательность циклов: один цикл при 95°C в течение 15 минут, затем 50 циклов при 94°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 60 секунд. Результаты qPCR могут варьировать в зависимости от условий, в которых выполнен метод, а именно, возможно, потребуется оптимизация тепловых протоколов в зависимости от используемого теплового цикла. Ложноположительные результаты могут быть получены из-за ошибок в присоединении праймеров или из-за загрязнения в аккредитованной лаборатории. Положительный и отрицательный контроли должны включаться для каждой серии пластин. Вместе с тем в качестве альтернативы могут применяться другие версии qPCR с доказанной аналогичной эффективностью.

127. Для подтверждения наличия KHV-инфекции используется протокол Nested PCR, описанный в таблице 8 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме, с последующим секвенированием усилительного продукта.

Результаты PCR могут варьировать в зависимости от условий, в которых выполнен метод, а именно, может потребоваться оптимизация термических протоколов в зависимости от используемого термоцикла. Кроме того, ложноположительные результаты могут быть получены из-за ошибок в присоединении праймеров или из-за загрязнения в аккредитованной лаборатории. Для каждой серии пластин должны включаться положительная и отрицательная проверки. В качестве альтернативы могут применяться другие версии PCR с доказанной аналогичной эффективностью. Секвенирование может выполняться аккредитованной лабораторией или внешними компаниями, специализирующимися на секвенировании. Результаты секвенирования анализируются, сравниваются с эталонными секвенциями известных KHV (номера доступа к GenBank AP008984, DQ657948 и DQ177346). Полученная консенсусная секвенция должна совпадать, по меньшей мере, на 98% с этими эталонными секвенциями.

Глава IV

МЕТОДЫ НАБЛЮДЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ В ОТНОШЕНИИ

ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЛОСОСЯ (AIS)

Раздел 1

Требования, относящиеся к программам надзора и ликвидации в целях

получения и сохранения санитарного статуса «благополучный

по болезни» в отношении инфекционной анемии лосося (AIS)

128. В случае, если фермы являются объектом ветеринарно-санитарных проверок в отношении инфекционной анемии лосося (AIS) – болезни, вызванной вирусом инфекционной анемии лосося с делецией в регионе с высоким полиморфизмом (VAIS), вирусом, относящимся к роду Isavirus семейства Orthomyxoviridae, и выборки несколько раз в году, интервал между ветеринарно-санитарными проверками или между выборками как можно длиннее.

129. В случае, когда необходимо индивидуальное наблюдение за дикими популяциями, число и географическое распределение пунктов отбора проб определяются таким образом, чтобы получить разумное покрытие зоны или их части. Пункты отбора проб также являются репрезентативными для различных экосистем, в которых встречаются восприимчивые дикие популяции.

130. Ветеринарно-санитарные проверки проводятся во всех производственных единицах, таких как пруды, бассейны и клетки из сетки, для обнаружения мертвой, ослабленной рыбы или аномального ее поведения. Особое внимание уделяется пунктам слива вод, где ослабленная рыба, как правило, накапливается из-за течения.

131. Выборка заполняется умирающей рыбой или рыбой, недавно умершей, но еще не в состоянии гниения. В процессе отбора проб отдают предпочтение рыбе, которая проявляет признаки анемии, кровотечения или другие клинические признаки, обозначающие нарушение кровообращения. Если атлантический лосось является одним из восприимчивых видов, присутствующих на ферме, отбирать следует преимущественно пробы атлантического лосося. Если на рыбной ферме нет атлантического лосося, пробы отбираются от других восприимчивых видов. Если для производства рыбы используется более одного источника водоснабжения, необходимо включить в отбор рыбу, представляющую все источники водоснабжения. Рыба отбирается таким образом, чтобы все производственные мощности, такие как клетки из сетки, бассейны и пруды фермы, а также все возрастные классы, сгруппированные в течение многих лет, были представлены в пробе пропорционально.

132. Конкретные требования к получению санитарного статуса I категории в отношении AIS предусматривают, что зона или ее часть с санитарным статусом III категории в отношении AIS может получить санитарный статус I категории в отношении этой болезни, когда все фермы, содержащие восприимчивые виды из данной зоны или данной ее части, соблюдают релевантные требования, и когда все эти фермы, пункты отбора проб из отобранных диких популяций подлежат следующей программе надзора:

1) фермы или пункты отбора проб являются объектом санитарных проверок и отбора проб в течение минимум двух лет подряд, как указано в таблице 9 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме;

2) в течение этого двухлетнего периода тестирование всех проб с использованием методов диагностики, установленных в разделе 2 главы IV имело отрицательные результаты в отношении вируса инфекционной анемии лосося с делецией в области с большим полиморфизмом, и было исключено любое подозрение на AIS;

3) в случае, когда во время выполнения программы надзора подтверждается AIS на ферме, включенной в программу надзора, и, следовательно, санитарный статус II категории был отозван, должна проводиться программа ликвидации в соответствии с пунктами 133-141.

133. Зона или ее часть с санитарным статусом V категории в отношении AIS может получить санитарный статус I категории в отношении этой болезни, когда все фермы, содержащие восприимчивые виды, в данной зоне или данной ее части были объектом программы ликвидации.

Минимальные меры контроля, установленные Агентством, которые фактически применяются, и, в частности, зона изоляции, включающая защитную зону и зону наблюдения, установлена в окрестностях фермы (ферм), официально объявленной инфицированной (инфицированными) вирусом инфекционной анемии лосося с делецией в регионе с большим полиморфизмом или в которой было подтверждено присутствие AIS.

134. Изоляционная зона должна определяться в каждом конкретном случае с учетом факторов, влияющих на риск распространения AIS у фермерской или дикой рыбы, таких как: количество, смертность и распределение случаев смерти рыбы на ферме, инфицированной вирусом инфекционной анемии лосося с делецией в регионе с высоким полиморфизмом, или в которой было подтверждено наличие AIS; расстояние, на котором находятся соседние фермы и их плотность; близость к бойне; фермы, с которыми имеется контакт; виды, присутствующие на фермах; практики рыбоводства, применяемые на инфицированных фермах и соседствующих с ними фермах; гидродинамические условия и другие подходящие, с эпидемиологической точки зрения, факторы, которые идентифицируются.

Для установления защитной зоны и зоны наблюдения применяются минимальные требования в отношении географического разграничения этих зон, описанных в настоящем разделе.

135. Защитная зона устанавливается в непосредственной близости от фермы, официально объявленной инфицированной AIS, и эта зона должна соответствовать всему гидрографическому бассейну фермы, официально объявленной зараженной AIS. Агентство может ограничить расширение зоны до определенных частей гидрографического бассейна при условии, что это не будет препятствовать предотвращению распространения AIS.

136. Зона надзора устанавливается за пределами защитной зоны, она должна соответствовать зоне, расположенной вокруг защитной зоны, вписанной в круг с радиусом 10 км, рассчитанной от центра защитной зоны; или эквивалентной зоне, установленной на основе соответствующих гидродинамических или эпидемиологических данных; или во внутренних зонах: зоны, расположенной снаружи установленного защитного периметра.

137. Все фермы, в которых содержатся восприимчивые виды, находящиеся в защитной зоне и официально не объявленные инфицированными AIS, являются объектом официального расследования, включающего, по меньшей мере, следующие элементы:

1) выборки проб для тестирования от не менее 10 умирающих рыб, если наблюдаются клинические или посмертные признаки, соответствующие AIS, или для тестирования минимум 30 рыб, если клинические или посмертные признаки не наблюдаются;

2) ветеринарно-санитарная проверка. На фермах, для которых ветеринарно-санитарные тесты имеют отрицательные результаты, проверки должны продолжаться один раз в месяц до тех пор, пока защитная зона не будет отменена в соответствии с пунктом 138.

138. Все фермы, официально объявленные инфицированными вирусом инфекционной анемии лосося с делецией в регионе с большим полиморфизмом, или в которых было подтверждено наличие AIS, опорожняются, очищаются, дезинфицируются и подвергаются периоду санитарного вакуума в течение не менее трех месяцев. Можно отказаться от защитных зон и зон наблюдения, если все фермы, расположенные в защитной зоне, опустошены, очищены, дезинфицированы и в последующем соблюдался период синхронизированного санитарного вакуума в течение не менее шести недель. При установлении периода санитарного вакуума для ферм, официально объявленных инфицированными, защитные зоны превращаются в зоны наблюдения.

Агентство решает, на основе оценки риска, потребовать опорожнения, очистки, дезинфекции и установления периода санитарного вакуума для других ферм, которые находятся внутри установленных защитных зон и зон наблюдения. В случае этих ферм продолжительность периода санитарного вакуума определяется Агентством на основе оценки рисков в каждом конкретном случае.

139. Все фермы, официально объявленные инфицированными вирусом инфекционной анемии лосося с делецией в регионе с большим полиморфизмом, или в которых было подтверждено наличие AIS, и все остальные фермы, подвергшиеся периоду санитарного вакуума, расположенные внутри установленных защитных зон и зон наблюдения, повторно заселяются рыбой, происходящей из зон или их частей с санитарным статусом I категории в отношении АИС.

140. Повторное заселение осуществляют только после того, как все фермы, официально объявленные инфицированными, были опустошены, очищены, дезинфицированы и подвергнуты периоду санитарного вакуума в соответствии с пунктом 138.

141. Все фермы, содержащие восприимчивые виды из зоны или ее части, которая является объектом программы ликвидации, а также в случае, если необходим надзор за дикими популяциями, пункты отбора проб, установленные в соответствии с пунктами 128-131, становятся в последующем объектом программы надзора, предусмотренной в пункте 132.

142. Часть зоны, включающая только одну ферму, имеющую санитарный статус I категории в отношении AIS, санитарный статус которой не зависит от соседствующих природных вод, и санитарный статус I категории которого был отозван, может восстановить статус, как только Агентство подтверждает, что соблюдаются следующие условия:

2) ферма была повторно заселена рыбой, происходящей из зон и их частей, имеющих санитарный статус I категории в отношении AIS.

143. В случае, когда необходим индивидуальный надзор для сохранения санитарного статуса I категории, все фермы, содержащие восприимчивые виды, перечисленные в приложении № 3 к Ветеринарно-санитарной норме, касающейся требований к здоровью животных и продуктам рыбоводства и мер по предупреждению и борьбе с некоторыми болезнями у водных животных, утвержденной Постановлением Правительства № 239/2009, и данной зоны или данной ее части, подвергаются санитарным проверкам и отбору проб в соответствии с таблицей 10 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме с учетом уровня риска загрязнения фермы AIS.

144. При определении частоты санитарных проверок для частей зон, имеющих санитарный статус I категории в отношении AIS, и санитарный статус в отношении AIS которых зависит от санитарного статуса соседствующих природных вод, в которых есть атлантический лосось (Salmo salar), риск заражения AIS считается высоким.

145. Статус «благополучный по болезни» в отношении AIS сохраняется только до тех пор, пока все пробы, проверенные с использованием методов диагностики, предусмотренных в пункте 149, имеют отрицательные результаты по вирусу инфекционной анемии лосося с делецией в области с высоким полиморфизмом и исключены любые подозрения на AIS в соответствии с диагностическими методами, предусмотренными в разделе 2 главы IV.

146. Зона или ее часть, имеющая санитарный статус V категории в отношении вируса инфекционной анемии лосося с делецией в регионе с высоким полиморфизмом, может получить статус III категории при условии, что:

1) требования, предусмотренные в пунктах 133-138, выполнены. В случае, когда технически невозможно установить период санитарного вакуума, данные фермы становятся объектом альтернативной меры, которая обеспечивает почти идентичные гарантии в отношении ликвидации VAIS в среде фермы;

2) все фермы, официально объявленные инфицированными, и все остальные фермы, которые были объектом санитарного вакуума или альтернативных мер в соответствии с подпунктом 1), расположенные в установленных защитных зонах и зонах наблюдения, повторно заселяются рыбой, происходящей из зон и их частей с санитарным статусом I, II или III категории в отношении AIS;

3) повторное заселение осуществляется только после того, как все фермы, официально объявленные инфицированными, опустошены, очищены, дезинфицированы и подвергнуты периоду санитарного вакуума или альтернативным мерам в соответствии с подпунктом 1);

4) не подтверждалось заражение вирусом инфекционной анемии лосося с делецией в области с высоким полиморфизмом в течение двухлетнего периода, который следовал за внедрением мер, указанных в подпунктах 1), 2) и 3), и были исключены подозрения в течение этого периода в соответствии с процедурами, установленными в пункте 150.

147. Исследуются следующие ткани:

1) гистология: передний сегмент почки, печень, сердце, поджелудочная железа, кишечник, селезенка и жабры;

2) иммуногистохимия: медиальный сегмент почки и сердце, включая клапаны и bulbus arteriosus;

3) анализ RT-qPCR: медиальный сегмент почки и сердце;

4) культура вирусов: медиальный сегмент почки, сердце, печень и селезенка.

148. Возможно объединение фрагментов органов, происходящих от не более пяти рыб.

149. Диагностическим методом, который должен использоваться для получения или поддержания статуса «благополучный по болезни» в отношении AIS, является RT-qPCR, за ним следует секвенирование положительных проб в соответствии с методами и детализированными процедурами, установленными в разделе 2 главы IV.

В случае, когда результат RT-qPCR является положительным, дополнительные пробы тестируются до выполнения первых мер по пресечению. Эти пробы тестируются в соответствии с методами и подробными процедурами, установленными в разделе 2 главы IV.

Изучение проб осуществляется через RT-qPCR, включая секвенирование гена HE для проверки делеции в области с высоким полиморфизмом и исследование в препаратах тканей при помощи специфических антител против VAIS (а именно IHC на фиксированных срезах или IFAT на мазках ткани) или изоляция и идентификация VAIS в клеточной культуре по меньшей мере одной пробы, взятой от любой рыбы, которая происходит из фермы.

150. В случае, когда необходимо подтвердить или исключить подозрение на AIS, следует соблюдать следующую процедуру относительно проверки, отбора проб и тестирования:

1) официальное расследование включает, по меньшей мере, одну ветеринарно-санитарную проверку и один отбор проб от 10 умирающих рыб, у которых наблюдаются клинические или посмертные признаки, соответствующие AIS. В случае, когда клинические или посмертные признаки, соответствующие AIS, не наблюдаются, после санитарной инспекции отбираются конкретные пробы от не менее 30 умирающих рыб или рыб, которые недавно умерли, с нормальной конституцией. Пробы тестируются в соответствии с диагностическими методами, предусмотренными в подпункте 2);

2) в случае, если результат RT-qPCR является положительным для вируса инфекционной анемии лосося с делецией в области с высоким полиморфизмом, необходимо протестировать дополнительные образцы перед выполнением первых мер по предотвращению. Подозрение на инфекцию VAIS должно быть подтверждено в соответствии со следующими критериями, используя подробные методы и процедуры, установленные в разделе 2 главы IV: обнаружение VAIS через RT-qPCR, включая секвенирование гена HE для проверки делеции в области с высоким полиморфизмом, а также обнаружение VAIS в тканевых препаратах с помощью специфических антител к VAIS (а именно: IHC на фиксированных срезах или IFAT на мазках ткани); или обнаружение VAIS через RT-qPCR, включая секвенирование гена HE для проверки делеции в регионе с высоким полиморфизмом; и изоляция и идентификация VAIS в клеточной культуре от минимум одной пробы, взятой от любой рыбы, которая поступает из фермы;

3) в случае, когда присутствуют клинические признаки, макроскопические патологические изменения или существуют гистопатологические результаты, соответствующие AIS, результаты подтверждаются для обнаружения вируса с использованием двух методов диагностики, которые имеют независимые принципы обнаружения, такие как RT-qPCR и IHC.

Подозрение на AIS может быть исключено в случае, если тесты и проверки, проведенные в течение 12 месяцев с даты появления подозрений, не дают никаких других доказательств присутствия AIS.

Раздел 2

Детализированные диагностические методы и процедуры для

надзора и подтверждения инфекционной анемии лосося (AIS)

151. В случае отбора проб и проведения лабораторных исследований в целях программ надзора и ликвидации или для подтверждения либо исключения наличия AIS, должны применяться детальные методы и процедуры, предусмотренные в настоящем разделе.

152. В целях лабораторного исследования для выявления присутствия AIS пробы рыб не объединяются, насколько это возможно. В целях надзора за AIS допускается объединение 2-5 рыб.

153. Для анализа RT-PCR отбираются пробы от всех рыб, которые входят в выборку. Отбирают медиальный сегмент почки от рыбы с помощью стерильного инструмента, и переносят в микропробирку центрифугирования, содержащую 1 мл раствора для сохранения РНК с доказанной эффективностью.

В пробирке с транспортным раствором можно собирать ткани не более пяти рыб. Это представляет собой общую пробу. Вес ткани в пробе составляет 0,5 г. Если рыба слишком мелкая для отбора проб с требуемым весом, можно извлечь сегменты почек, сердца, селезенки, печени или пилорических клеток предпочтительно в таком порядке, чтобы получить вес 0,5 г.

154. Ткани, предназначенные для гистологического исследования, берут только от недавно убитой рыбы с нормальной конституцией, которая проявляет клинические признаки или была объектом посмертных выводов, сравнимых с наличием AIS. Берется любое наружное или внутреннее поражение и во всех случаях от каждой рыбы с помощью скальпеля берут пробы медиального сегмента почки, сердца, печени, поджелудочной железы, кишечника, жабр и селезенки, которые затем переносятся в буферный физиологический раствор формалина 8-10% (об/об). Соотношение фиксирующего агента и тканей составляет не менее 20:1, чтобы гарантировать удовлетворительное сохранение тканей. Для иммуногистохимии (IHC) берут пробы медиального сегмента почки и сердца.

155. Ткани, используемые для вирусологического исследования на клеточной культуре, берут от всех рыб в выборке. От рыбы стерильным инструментом берутся фрагменты печени, переднего или медиального сегмента почки, сердца и селезенки, которые переносят в пластиковые пробирки, содержащие 9 мл транспортной среды. В пробирке, содержащей транспортный раствор, можно собирать ткани, взятые от не более пяти рыб. Вес ткани в пробе составляет 1,0 ± 0,5 г.

156. Доставку целой рыбы в аккредитованную лабораторию осуществляют при соблюдении тепловых условий во время транспортировки. Целую рыбу заворачивают в абсорбирующую бумагу и помещают в полиэтиленовый пакет.

Можно транспортировать живую рыбу, но только под надзором национальной аккредитованной лаборатории по борьбе с заболеваниями рыбы и с учетом дополнительных аспектов, относящихся к дезинфекции и биобезопасности, связанных с транспортировкой живой рыбы.

157. Пробы крови и пробирки с тканями рыб, предназначенные для вирусологического исследования или анализа RT-PCR, помещают в изолированные контейнеры, такие как толстостенные полистирольные коробки с достаточным количеством льда или холодильных блоков для обеспечения охлаждения проб во время транспортировки в аккредитованную лабораторию. Следует избегать замораживания и транспортный контейнер во время приемки должен еще иметь лед или один либо несколько частично или полностью замороженных холодильных блоков. В порядке исключения, пробы, предназначенные для анализа RT-PCR, и пробы, предназначенные для вирусологического исследования, могут подвергаться быстрой заморозке и отправляться в аккредитованную лабораторию при температур –20°C или ниже.

158. Для анализа RT-PCR тканей, сохраненных в латеральной РНК, экстракцию РНК проводят в следующих условиях, которые варьируются в зависимости от температуры, при которой хранятся пробы:

пробы, хранящиеся при 37°C: один день;

пробы, хранящиеся при 25°C: одну неделю;

пробы, хранящиеся при 4°C: один месяц;

пробы, хранящиеся при –20°C: неограниченный срок.

159. В случае, когда ткани рыбы транспортируются в фиксирующем агенте для гистологического исследования, транспортировка осуществляется в герметичных пробирках, расположенных в ударопрочных контейнерах. Следует избегать замораживания этих проб.

160. Вирусологическое исследование на клеточной культуре начинается как можно скорее и не позднее, чем через 48 часов после сбора проб. В исключительных случаях вирусологическое исследование может начаться не позднее чем через 72 часа после сбора исследуемого материала при условии, что оно защищено транспортной средой и соблюдаются температурные условия во время транспортировки.

161. При условии утверждения аккредитованной диагностической лабораторией можно собирать и готовить другие ткани рыб, отличные от указанных в разделе 2 настоящей главы, для дополнительных исследований.

162. В случае проведения лабораторных исследований с целью получения или поддержания определенного санитарного статуса в отношении AIS либо в целях подтверждения наличия AIS или исключения подозрения на данное заболевание с использованием диагностических методов, следует применять детальные методы и процедуры, предусмотренные в разделе 2 настоящей главы.

163. Диагностическим методом, используемым для обнаружения VAIS, является RT-qPCR. Поскольку результаты RT-qPCR могут варьировать в зависимости от условий, при которых выполняется метод, включаются соответствующие положительные и отрицательные элементы усиления, чтобы избежать каких-либо сомнений.

164. Все манипуляции РНК выполняются на льду, используя перчатки. Извлекается общая РНК методом фенола-хлороформа или хроматографией в соответствии с инструкциями производителя.

Очищенная РНК растворяется в дистиллированной воде без РНК-азы (а именно: вода, обработанная 0,1% пирокарбоната диэтила).

Концентрация и чистота извлеченной РНК должны оцениваться путем измерения оптической плотности при 260 и 280 нм. Альтернативным подходом может быть включение внутреннего контроля, нацеленного на геном вируса, как указано в пункте 165.

165. Для усиления генома VAIS можно использовать несколько методов RT-PCR. Может выполнить RT-PCR в два этапа, реакции RT и PCR в двух отдельных пробирках. Вместе с тем возможна и одноэтапная реакция, при которой две реакции происходят в одной пробирке. Когда это возможно, используется одноэтапный метод, поскольку использование одной пробирки сводит к минимуму риск перекрестного загрязнения, так как содержимое не перекладывается. Считается, что этот метод имеет такую же чувствительность, что и двухэтапный метод.

166. Следует использовать праймеры и тест, описанные в настоящем пункте, а именно: пара праймеров ILA1 или ILA2, которые нацелены на сегмент 8, и которые оцениваются как пригодные для обнаружения VAIS в случае вспышек и в рыбе-векторе. Праймер антисенсорный ILA2 не соответствует изоляторам, которые происходят из Северной Америки. В таких случаях должен использоваться другой праймер:

праймер сенсорный (ILA1): 5‘- GGCTATCTACCATGAACGAATC-3′;

праймер антисенсорный (ILA2): 5′-GCCAAGTGTAAGTAGCACTCC-3′.

Последовательность циклов: один цикл при 50°C в течение 30 минут; один цикл при 94°C в течение 15 минут; 40 циклов при 94°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 60 секунд; один цикл при 72°C в течение 5 минут. Размер продукта: 155 pb.

167. Результаты PCR могут варьировать в зависимости от условий, в которых реализован метод, а именно, может потребоваться оптимизация тепловых протоколов в зависимости от используемого термоцикла. Кроме того, могут быть получены ложноположительные результаты из-за ошибок в присоединении праймеров или из-за загрязнения в аккредитованной лаборатории. Положительные и отрицательные контроли должны включаться для каждой серии пластин. Однако в качестве альтернативы могут применяться другие версии RT-PCR с аналогичной доказанной эффективностью.

168. Использование RT-qPCR может увеличить специфику и, возможно, чувствительность. Метод выполняется быстрее, так как не требуется этап электрофореза в геле, и снижает риск перекрестного загрязнения, так как можно оценить количество геномной вирусной РНК в пробирке с проверяемым материалом. Неудобством RT-qPCR является то, что часто невозможно секвенировать продукты усиления. Однако, если есть сомнения в специфике усилительного продукта, необходимо провести еще один конкретный тест VAIS для проверки результата.

Следует использовать тест, описанный в настоящем пункте, нацеленный на сегмент 8. Когда это возможно, используется одноэтапный метод, поскольку тест, проведенный в одной пробирке, минимизирует риск перекрестного загрязнения.

праймер сенсорный: 5‘- CTACACAGCAGGATGCAGATGT -3′;

праймер антисенсорный: 5′- CAGGATGCCGGAAGTCGAT -3′;

зонд: 5‘- FAM-CATCGTCGCTGCAGTTC-MGBNFQ-3′.

Положительные и отрицательные проверки должны включаться для каждой серии пластин. Последовательность циклов: один цикл при 50°C в течение 30 минут; один цикл при 95°C в течение 15 минут; 40 циклов при 94°C в течение 15 секунд, при 60°C в течение 60 секунд. Производится корректировка, если это необходимо. В качестве альтернативы могут применяться и другие версии RT-PCR или RT-qPCR с аналогичной доказанной эффективностью.

169. Секвенирование усиленных продуктов PCR:

праймер сенсорный (ILAs6-3F): 5‘- ATGAGGGAGGTAGCATTGCA -3′;

праймер антисенсорный (ILAs6-2R): 5′-CATGCTTTCCAACCTGCTAGGA-3′.

Положительные и отрицательные проверки включаются для каждой серии пластин. Последовательность циклов (RT-PCR в один этап): один цикл при 50°С в течение 30 минут; один цикл при 94°C в течение 15 минут; 40 циклов при 94°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд, при 72°C в течение 60 секунд; один цикл при 72°C в течение 5 минут. Производится корректировка, если это необходимо. В качестве альтернативы могут применяться и другие версии RT-PCR или RT-qPCR с аналогичной доказанной эффективностью.

В качестве альтернативы можно использовать следующий метод секвенирования HPR в сегменте 6:

праймер сенсорный: 5‘-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3′;

праймер антисенсорный: 5′-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3′.

Размер продукта: 304 нт если HPR0.

Могут использоваться тесты RT-PCR с такими же чувствительностью и специфичностью, что и тесты, описанные в настоящем пункте.

170. Чистота продукта усиления, полученного через RT-PCR, проверяется электрофорезом в геле перед секвенированием. Если появляется только один чистый фрагмент, он очищается непосредственно от реакции ПЦР. Если присутствует несколько усиленных фрагментов, интересующий фрагмент очищается электрофорезом в геле. Очищение фрагментов ПЦР от растворов или агарозного геля осуществляется с помощью столбцов сходства к фрагментам ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.

171. Секвенирование осуществляется с помощью амплифицируемых праймеров, внешними компаниями, специализирующимися на секвенировании. Результаты анализируются с помощью инструмента поиска BLAST, а секвенции сравниваются с другими известными секвенциями в базе данных нуклеотидов Национального центра биотехнологической информации США (National Centre for Biotechnical Information – NCBI).

172. Секвенирование устраняет любые сомнения в специфике продукта, усиленного RT-PCR.

173. Ткани могут храниться при –80°C. Ткани могут замораживаться и размораживаться только один раз перед их осмотром. Для целей надзора и контроля исследование проводится как можно быстрее.

Каждая проба (смесь тканей в транспортном растворе) полностью гомогенизируется проверенным гомогенизатором, центрифугируется при 2000-4000 × г в течение 15 минут при 0-6°C, затем супернатант фильтруется (0,45 мкм) и инкубируется равным объемом соответствующей разбавленной смеси антисывароткой против местных серотипов VNPI. Титр антисыворотки составляет не менее 1:2000 в реакции на нейтрализацию налета на 50% сокращение налета. Смесь инкубируется в течение часа при 15°C. Она представляет собой прививку.

174. Обработка всех прививок антисывороткой против вируса инфекционного некроза поджелудочной железы (вируса, который в некоторых регионах Европы присутствует в 50% проб рыб) направлено на предотвращение появления ECP из-за вируса NPI на привитых клеточных культурах. Это лечение может быть проведено для уменьшения продолжительности вирусологических осмотров, а также количества случаев, когда появление ECP следует рассматривать как потенциальный показатель VAIS. Когда пробы поступают из производственных единиц, считающихся благополучными по NPI, лечение прививок против вируса NPI может быть исключено.

175. Для первичной изоляции вируса AIS должны использоваться клетки почек атлантического лосося (ASK). Могут использоваться и другие клеточные линии с подтвержденными эффективностью и чувствительностью для выделения VAIS, принимая во внимание изменчивость штамма и способность различных штаммов размножаться в разных клеточных линиях. Клетки ASK, по-видимому, поддерживают выделение и рост изолятов вируса, известных на сегодняшний день, при условии, что число пассажей низкое. В клетках ASK может возникнуть цитопатический эффект (ECP) более четкий, чем в других чувствительных клеточных линиях, таких как SHK-1 (клетки переднего сегмента почки лосося-1).

176. Клетки ASK (максимум 65 пассажей) культивируются в среде L-15, содержащей 10% сыворотки плода крупного рогатого скота, 2% (об./об.) L-глутамина при 200 мм и 0,08% (об/об) 2-меркаптоэтанола до 50 мм в многоголовых пластинах. Им прививают суспензию органов, обработанную иммунной сывороткой, на молодых клеточных культурах в фазе активного роста с целью получения окончательного разведения тканевого материала в среде культуры клеток 1:1000. Для каждого органа добавляется 40 мкл суспензии инокулята в лунку, содержащую 2 мл среды культуры клеток. Чтобы свести к минимуму риск перекрестного загрязнения, используются отдельные пластины с 12 или 24 лунками, в случае проб, поступающих из разных мест аквакультуры.

177. Сохраняют неинокулированную пластину, которая служит отрицательным контролем. Прививают еще одну пластину с эталонным изолитом VAIS, который будет служить положительным контролем, и поступают следующим выловом: прививают 100 мкл из запасенного препарата VAIS [титр минимум 10⁷ инфицированная доза для 50% клеточных культур (TCID 50 ml^-1)] в первую лунку и перемешивают. Объем этого вещества переносят из первой лунки во вторую, чтобы получить разведение 1:10, и перемешивают. Операцию повторяют на всей доске, чтобы получить шесть разведений 1:10. Запас препарата VAIS можно хранить при –80°C в течение как минимум двух лет.

Однако после разморожения он используется в течение трех дней. Принимаются меры по предотвращению перекрестного загрязнения тестовых пластин материалом положительного контроля. Материал положительного контроля располагают отдельно и обрабатывают отдельно от тестовых пластин. В качестве альтернативы, при включении положительного контроля для каждой прививки каждые шесть месяцев можно проводить тест чувствительности клеток ASK к изолятам VAIS.

178. Пробы инкубируют при 15±2°C в течение не более 15 дней. Клеточные культуры изучают дважды под микроскопом для обнаружения ECP, сначала между пятым и седьмым днями, затем между двенадцатым и четырнадцатым днями после введения. Если смесь представляет ECP, немедленно инициируется процедура идентификации вируса в соответствии с пунктами 180-181. Если ECP не наблюдается до четырнадцатого дня, проводятся косвенный иммунофлюоресценционный тест (IFAT), тест на гемадсорбцию или RT-PCR.

179. Субкультивация проводится между тринадцатым и пятнадцатым днями. Добавляю супернатант культуры в лунки на многоплодных пластинах, содержащих свежие клетки в активной фазе роста, при правильном разведении (1/10), затем оставляют инкубироваться при 14±2°C в течение не более 18 дней. Клеточные культуры дважды изучают под микроскопом для обнаружения ECP, сначала между пятым и седьмым днями, затем между четырнадцатым и восемнадцатым днями после введения. Если смесь представляет ECP, немедленно инициируют процедуру идентификации вируса в соответствии с пунктами 180-181.

Если между четырнадцатым и восемнадцатым днями ECP не наблюдается, проводят тест на гемадсорбцию или RT-PCR. Если в течение семи дней после инкубации наблюдается цитотоксический эффект, на данном этапе выполняют субкультивацию и клетки оставляют инкубированными в течение 14-18 дней, затем клетки подвергают новой субкультивации с инкубационной продолжительностью от 14 до 18 дней. Если цитотоксический эффект наступает через семь дней, проводят только одну субкультивацию, а клетки оставляют инкубироваться, чтобы достичь в общей сложности 28-36 дней инкубации с момента первой прививки.

При бактериальном загрязнении первичной культуры тест возобновляют на однородной ткани, хранящейся при –80°C. Перед прививкой гомогенат тканей центрифугируют при 4000 × г в течение 15-30 минут при температуре от 0 до 6°С, а супернатант фильтруют при 0,22 мкм. Если бактериальное загрязнение происходит во время фазы субкультивации, супернатант фильтруют до 0,22 мкм, прививают свежие клетки и оставляют на инкубацию на новый период от 14 до 18 дней.

180. В случае обнаружения ECP, независимо от стадии, или в случае положительного теста на гемадсорбцию, проводится идентификация вируса. Методы пристрастия к идентификации VAIS являются RT-PCR в соответствии с пунктом 163 и иммунофлюоресценцией (IF) согласно пунктам 184-185.

181. При подозрении на наличие других вирусов проводятся дополнительные тесты идентификации вируса. В случае, если эти тесты не разрешили окончательную идентификацию вируса в течение недели, супернатант отправляется для немедленной идентификации:

1) в аккредитованную эталонную лабораторию Всемирной организации по охране здоровья животных (OIE) в отношении AIS; или

2) в аккредитованную национальную лабораторию или аккредитованную международную лабораторию по болезням рыб.

182. Репликация VAIS в клеточных культурах не всегда приводит к появлению ECP, каждую лунку подвергают тесту RT-PCR или тесту на гемадсорбцию в соответствии с настоящим пунктом, или тесту IF в соответствии с пунктами 184-185.

183. Пробу отбирают из среды для культивирования клеток каждой лунки, включая лунки с положительным и отрицательным контролем, и помещают в меченые стерильные пробирки. В каждую лунку добавляют 500 мкл 0,2% (об./об.) суспензии отмытых эритроцитов кролика или лошади или 0,05% (об./об.) взвесь отмытых эритроцитов радужной форели либо атлантического лосося и оставляют инкубироваться при комнатной температуре в течение 45 минут. Эритроциты удаляют и каждую лунку дважды промывают средой L-15. Каждую лунку исследуют под микроскопом.

Наличие скопления эритроцитов, прилипших к поверхности клеток ASK, указывает на вероятное присутствие ортомиксовирусной инфекции. Если тест на кровоизлияние является положительным, тест на выявление вируса должен быть проведен немедленно в соответствии с пунктами 180-181.

184. Культивируют клетки ASK (максимум 65 пассажей) в среде L-15, содержащей 10% сыворотки плода крупного рогатого скота, 2% (об./об.) L-глютамина до 200 мм и 0,08% (об./об.) от 2-меркаптоэтанола до 50 мм в многолуночных пластинах со слиянием более 50%. Можно также использовать другие клеточные линии или среду культуры с доказанной эффективностью. Добавляют 225 мкл культурного супернатанта, предположительно зараженного вирусом, в каждую из двух лунок, смешивают и переносят 225 мкл в две другие лунки, до разведения 1:5. Две другие лунки остаются неинокулированными, чтобы служить контролем. Пробы из разных рыбных ферм обрабатывают на отдельных пластинах так же, как и контроли. Вирус контролируют на проверочном изоляте VAIS.

Пластины инкубируют при 14±2°C и исследуют под микроскопом не более семи дней. Если ECP наблюдается на ранней стадии или если ECP не наблюдается в течение семи дней, следующим этапом является фиксация. Лунки промывают солевым фосфатным буфером (PBS) и закрепляют путем инкубации 80%-ным ацетоном в течение 20 минут при комнатной температуре. Пластины оставляют для высыхания на воздухе, а затем сразу же окрашивают или хранят при температуре 0–6°C в течение не более 24 часов до окрашивания.

185. Дублированные лунки окрашивают смесью моноклональных антител 3H6F8 и 1OC9F5 anti-VAIS или другим моноклональным антителом с доказанной эффективностью и специфичностью, разбавляют в PBS и оставляют для инкубации при температуре 37±4°C в течение 30 минут. Удаляют моноклональные антитела и промывают плитки три раза с Tween 20 0,05% в PBS. Конъюгат IgG, обозначенный FITC (флуоресцеин изотиоцианат), разбавленный в PBS, добавляют в каждую лунку и инкубируют при температуре 37±4°C в течение 30 минут. Разведение из разных партий моноклональных антител и конъюгата FITC необходимо оптимизировать в каждой аккредитованной лаборатории. Антитела удаляют и промывают плитки три раза с Tween 20 0,05% в PBS.

Немедленно осматриваются лунки на инвертированном микроскопе, оборудованном для изучения флуоресценции соответствующим фильтром для стимуляции FITC. Тест считается положительным, если наблюдаются флуоресцентные клетки. Для того, чтобы тест был действительным, положительный контроль должен дать положительный результат, а отрицательный – отрицательный результат.

186. Техника, указанная в пунктах 182-183, также может применяться и к другим тканям рыб, таким как печень, селезенка и сердце, при условии, что на лезвии может быть отложено достаточное количество эндотелиальных клеток, лейкоцитов или лимфоцитов. Процедура окрашивания идентична для всех тканей, даже если для некоторых из них предпочтительнее отказаться от окраски йодидом пропидия и использовать освещение для идентификации типов клеток, присутствующих на мазке.

187. Срезы, заключенные в парафин, разрезают на 5 мкм и окрашивают с использованием гематоксилина и эозина.

188. В случае атлантического лосося с клиническими признаками заболевания гистологические изменения являются переменными, но могут включать следующие элементы:

1) многочисленные эритроциты в центральном венозном синусе и лепестковых капиллярах жабр, где также могут образовываться тромбы эритроцитов;

2) мультифокальные или сливающиеся петеши или некроз гепатоцитов, или оба, на определенном расстоянии от крупных кровеносных сосудов в печени; мультифокальное накопление эритроцитов в расширенных синусоидах печени;

3) накопление эритроцитов в кровеносных сосудах в собственной пластинке кишечника и, наконец, кровоизлияние в собственной пластинке;

4) дистензия стромы селезенки из-за накопления эритроцитов;

5) легкое и мультифокальное интерстициальное кровоизлияние до обширного и диффузного, с тубулярным некрозом в областях, пораженных кровоизлиянием, накопление эритроцитов в почечной гломеруле;

6) эритрофагоцитоз в селезенке и вторичные кровоизлияния в печень и почки.

189. Наиболее сильные положительные реакции окрашивания обычно получают в эндотелиальных клетках сердца и почек. Окрашивание эндотелиальных клеток может быть слабым или отсутствовать на уровне очень обширных геморрагических поражений, возможно вследствие лизиса инфицированных эндотелиальных клеток.

190. Поликлональные антитела к нуклеопротеинам VAIS следует использовать на срезах тканей, закрепленных формалином и заключенных в парафин. Органами, подлежащими рассмотрению являются медиальный сегмент почки и сердце (включая переходную зону, все три камеры и клапаны). Случаи, подозрительные из-за патологических признаков, проверяются с помощью положительного теста IHC. Гистологические срезы готовят в соответствии со стандартными методами.

191. Ткани следует закреплять с помощью 10-процентного нейтрального раствора формалина, буферизованного фосфатом в течение не менее одного дня, затем обезвоживают через последовательные этанольные ванны, очищают в ксилене и включаются в парафин в соответствии со стандартными протоколами. Срезы толщиной около 5 мкм (для IHC на предметных стеклах, покрытых поли-L-лизином) нагревают до 56-58°C (не более 60°C) в течение 20 минут, депарафинируют в ксилене, регидратируют через последовательные и окрашенные гематоксилином и эозином ванны с целью патоморфологического анализа и иммуногистохимии.

192. Для IHC все инкубации выполняют при комнатной температуре на опрокидывающейся платформе, если иное не предусмотрено в настоящем решении:

1) извлечение антигена производят путем кипячения срезов в 0,1 м буферного раствора цитрата с рН 6,0 в течение 2 × 6 минут с последующей блокировкой 5%-ным сухим обезжиренным молоком и 2%-ным козьей сывороткой в 50 мм TBS (TBS; Tris/HCl 50 мм, NaCl 150 мм, pH 7,6) в течение 20 минут;

2) срезы инкубируют на ночь первичным антителом (моноспецифическое кроличье антитело против нуклеопротеинов VAIS), дублированным в TBS с 1%-ным сухим обезжиренным молоком, затем промывают три раза в TBS с Tween 20 0,1%;

3) для обнаружения связанных антител срезы инкубируют в течение 60 минут антителами anti-IgG кролика, конъюгированных щелочной фосфатазой. После последней промывки добавляется Fast Red (1 мг мл^–1) и нафтол AS-MX фосфат (0,2 мг мл^–1) с 1 мм левамизола в 0,1 м TBS (pH 8,2) и оставляется для развития в течение 20 минут. Затем срезы промывают водопроводной водой перед контрастированием гематоксилином Harris и фиксируют в водной среде. На каждом этапе включаются положительные и отрицательные срезы ткани в VAIS в качестве контроля.

193. Контрольные срезы считаются положительными, когда видно, что цитоплазма и внутренняя часть ядра эндотелиальных клеток в кровеносных сосудах эндокарда имеют четко видимый красный (красноватый) цвет. Срезы пробы, используемой для тестирования, считаются положительными только в случае, если четко наблюдается красновато-красная окраска внутренней части ядра эндотелиальных клеток.

Контрольные срезы считаются отрицательными, если они не имеют какой-либо значимой реакции по окраске. Учитывая, что локализация внутри ядра специфична для нуклеопротеина ортомиксовируса на стадии репликации вируса, однако часто преобладает сопутствующая цитоплазматическая окраска, цитоплазматические окрашивающие зоны и другие виды, не расположенные внутри ядра, считаются неспецифическими или неубедительными.

Глава V

МЕТОДЫ НАДЗОРА И ДИАГНОСТИКИ В ОТНОШЕНИИ

ИНФЕКЦИИ MARTEILIA REFRINGENS

Раздел 1

Требования к получению и поддержанию санитарного статуса

«свободной от болезни» в отношении инфекции

Marteilia refringens

194. Ветеринарно-санитарный контроль и при необходимости отбор проб для лабораторных исследований в отношении инфекции Marteilia refringens, болезни, вызванной простейшим Marteilia refringens, проводится в течение года, когда известно, что распространенность паразита является максимальной в этой зоне или в ее части. Если такие данные недоступны, отбор проб производится сразу после того, как температура воды превышает 17°C.

195. В случае отбора проб от моллюсков в соответствии с требованиями, установленными в соответствующей главе, применяются следующие критерии:

1) если Ostrea spp. и Mytilus spp. присутствуют в производственных единицах или в производственной зоне, оба рода одинаково представлены в пробах. Если присутствует только один из родов, этот род включен в отобранную пробу. Если нет ни рода Ostrea, ни рода Mytilus, отобранная проба является репрезентативной для всех других восприимчивых видов;

2) если в производственных единицах присутствуют рыхлые моллюски с открытой раковиной, или те, что недавно умерли, но еще не разлагаются, в основном отбираются они. При отсутствии таких моллюсков, отбираются моллюски здоровые и самого старшего возраста;

3) при проведении отбора в фермах моллюсков, где используется более одного источника воды для производства моллюсков, в пробу должны быть включены моллюски, представляющие все источники воды, таким образом, чтобы все части фермы были пропорционально представлены в пробе;

4) при проведении отбора проб в зонах по культивированию моллюсков необходимо включить в пробу моллюски из достаточного количества точек отбора проб таким образом, чтобы все зоны по культивированию моллюсков были пропорционально представлены в пробе. Основными факторами, которые следует учитывать при выборе этих точек отбора проб, являются предыдущие точки отбора проб, в которых была обнаружена Marteilia refringens, плотность запасов, течение, наличие восприимчивых видов, наличие видов-векторов, батиметрия и практики управления. Естественные станины должны быть включены в выборку.

196. Зона или ее часть с санитарным статусом III категории в отношении инфекции Marteilia refringens может получить санитарный статус I категории в отношении этой болезни, когда все фермы или зоны по культивированию моллюсков, содержащие восприимчивые виды в этой зоне или ее части, являются объектом двухлетней программы по надзору, включающей санитарные проверки и сбор проб для тестирования.

197. Двухлетняя программа по надзору включает фермы или зоны культивирования моллюсков, ставшие объектом санитарного контроля и отбора проб в течение, как минимум, двух лет подряд, как указано в таблице 11 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме. В течение этого двухлетнего периода тестирование всех отобранных проб давало отрицательные результаты в отношении Marteilia refringens, и было исключено любое подозрение в отношении Marteilia refringens.

В случае если Ostrea edulis, Mytilus edulis или Mytilus galloprovincialis, происходящие из зоны или ее части с санитарным статусом I категории, включены в пробу, они вводятся на ферму или в зону по культивированию моллюсков, по меньшей мере, весной, предшествующей периоду проведения программы по надзору.

198. Ликвидация болезни Marteilia refringens считается невозможной в большинстве случаев, однако, если Агентство считает это возможным, применяется программа по ликвидации.

Зона или ее часть с санитарным статусом V категории в отношении инфекции Marteilia refringens может получить санитарный статус I категории в отношении этой болезни тогда, когда все фермы или зоны по культивированию моллюсков, содержащие восприимчивые виды из соответствующей зоны или ее части, были объектом программы по ликвидации.

199. Устанавливается изоляционная зона, которая включает защитную зону и зону наблюдения по соседству с фермой (фермами) или зоной (зонами) по культивированию моллюсков, официально объявленной (объявленными) зараженной (зараженными) Marteilia refringens.

Изоляционная зона устанавливается от случая к случаю с учетом факторов, влияющих на риски распространения Marteilia refringens, таких как количество, возраст, уровень смертности и распределение случаев смертности моллюсков на ферме или в зоне по культивированию моллюсков, зараженных Marteilia refringens, в том числе диких моллюсков; расстояние, на котором находятся соседние фермы или зоны по культивированию моллюсков, а также их плотность, в том числе дикие моллюски; близость к перерабатывающим объектам, фермам, с которыми они контактируют, или зонам по культивированию моллюсков; виды, особенно восприимчивые виды и виды-вектора, присутствующие на фермах или в зонах по культивированию моллюсков; практика рыбоводства, применяемая на пострадавших фермах и в зонах по культивированию моллюсков, а также в тех, которые находятся по соседству; гидродинамические условия и другие приемлемые факторы с эпидемиологической точки зрения, которые были выявлены.

Для установления защитной зоны и зоны наблюдения применяются следующие минимальные требования:

1) защитная зона устанавливается в непосредственной близости от фермы или зоны по культивированию моллюсков, официально объявленных зараженными Marteilia refringens. Эта зона должна соответствовать зоне, установленной на основе соответствующих гидродинамических или эпидемиологических данных;

2) зона наблюдения устанавливается за пределами защитной зоны. Эта зона должна соответствовать зоне, расположенной вокруг защитной зоны, установленной на основании соответствующих гидродинамических или эпидемиологических данных.

200. Все фермы и зоны по культивированию моллюсков, содержащие восприимчивые виды из защитной зоны, которые официально не объявлены зараженными Marteilia refringens, подвергаются официальному расследованию, включающему, по меньшей мере, отбор проб для тестирования 150 моллюсков после начала периода распространения Marteilia refringens. В случае если период распространения не известен, отбор проб начинается после того, как температура воды превышает 17°C.

201. Все фермы и зоны по культивированию моллюсков, официально объявленные зараженными Marteilia refringens, после освобождения подлежат санитарному вакууму и, по необходимости, очистке и дезинфекции.

202. Продолжительность периода санитарного вакуума, по меньшей мере, должна быть:

1) два месяца в случае ферм и зон по культивированию моллюсков с ограниченными связями с окружающими водами, такими как инкубаторы и питомники;

2) два месяца в случае ферм и зон по культивированию моллюсков с ограниченными связями с окружающими водами, при условии, что зараженные моллюски, относящиеся к восприимчивым видам, и моллюски восприимчивых видов, которые имеют эпидемиологические связи с инфицированной фермой или зоной по культивированию зараженных моллюсков, собирают или исключают до того времени года, когда становится известно, что распространенность Marteilia refringens является максимальной, или, в случае если этот период не известен до момента, когда температура воды превышает 17°C;

3) четырнадцать месяцев в случае ферм и зон по культивированию моллюсков, которые имеют неограниченные связи с окружающими водами, при условии, что зараженные моллюски, относящиеся к восприимчивым видам, и моллюски из восприимчивых видов, которые имеют эпидемиологические связи с зараженной фермой или зоной по культивированию зараженных моллюсков, не были исключены до времени года, когда стало известно, что распространенность Marteilia refringens является максимальной, или, в случае если не известен период, когда моллюски из восприимчивых видов не были собраны или исключены до периода, в который температура воды превышает 17°C.

203. После освобождения всех ферм и зон по культивированию моллюсков, официально объявленных зараженными, соблюдается период синхронного санитарного вакуума не менее четырех недель.

204. Агентство, по необходимости, на основе оценок рисков может принять решение о требовании об освобождении, очистке, дезинфекции и установлении периода санитарного вакуума для других ферм или зон по культивированию моллюсков, которые находятся внутри установленных защитных зон и зон наблюдения. Продолжительность периода санитарного вакуума устанавливается Агентством на основе оценок рисков.

205. Все фермы или зоны по культивированию моллюсков, официально объявленные зараженными, и все другие фермы или зоны по культивированию моллюсков, которые стали объектом санитарного вакуума, расположенные внутри установленных защитных зон и зон наблюдения, пополняются моллюсками, происходящими из зон или их частей с санитарным статусом I категории в отношении инфекции Marteilia refringens. Пополнение происходит только после того, как все фермы, официально объявленные зараженными, освобождены, очищены, дезинфицированы и подвергнуты санитарному вакууму.

206. Все фермы и зоны по культивированию моллюсков, содержащие восприимчивые виды из зоны или ее части, являющейся объектом программы по ликвидации, являются объектом программы по надзору.

207. В случае необходимости индивидуального надзора за сохранением санитарного статуса I категории, все фермы или зоны по культивированию моллюсков, содержащие восприимчивые виды из зоны или ее части, подлежат санитарным осмотрам и отбору проб в соответствии с таблицей 12 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме, с учетом уровня риска заражения фермы или зоны по культивированию моллюсков Marteilia refringens.

208. Санитарный статус «благополучный по болезни» может сохраняться только до тех пор, пока все пробы, тестированные с использованием методов диагностики, предусмотренных пунктом 211, имеют отрицательные результаты для Marteilia refringens, и любые подозрения в отношении Marteilia refringens исключены.

209. Зона или ее часть, имеющая санитарный статус V категории в отношении инфекции Marteilia refringens, может получить санитарный статус III категории относительно этой болезни, при условии, что:

1) требования, предусмотренные пунктами 198-204, должны быть выполнены. В случае если это невозможно, с технической точки зрения, устанавливается санитарный вакуум. Соответствующие фермы предоставляют почти идентичные гарантии в отношении ликвидации Marteilia refringens в окружающей среде фермы;

2) все фермы или зоны по культивированию моллюсков, официально объявленные зараженными, и все другие фермы или зоны по культивированию моллюсков, которые являются объектом санитарного вакуума или альтернативных мер в соответствии с пунктом 1), расположенные внутри установленной защитной зоны и зоны наблюдения, пополняются моллюсками, происходящими из зон или их частей с санитарным статусом I, II или III категории в отношении инфекции Marteilia refringens;

3) пополнение происходит только после того, как все официально объявленные зараженными фермы или зоны по культивированию моллюсков освобождены, очищены, дезинфицированы и подвергнуты санитарному вакууму или альтернативным мерам в соответствии с подпунктом 1);

4) не было подтверждения инфекции Marteilia refringens в течение двухлетнего периода, который последовал после введения в действие мер, указанных в подпунктах 1), 2) и 3), и были исключены подозрения в течение этого периода в соответствии с процедурами, установленными в пункте 212.

210. Животное целиком передают в аккредитованную лабораторию для проведения диагностических тестов, предусмотренных в разделе 2 настоящей главы.

211. Диагностическими методами, которые необходимо использовать для получения или поддержания санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении инфекции Marteilia refringens в соответствии с методами и подробными диагностическими процедурами, установленными в разделе 2, являются гистопатологическое исследование, мазков ткани или PCR.

212. В случае если требуется подтверждение или исключение подозрения на инфекцию Marteilia refringens, необходимо соблюдать следующие процедуры инспекции, отбора проб и тестирования:

1) официальное расследование включает, по меньшей мере, отбор проб от 30 моллюсков из восприимчивых видов, если это подозрение основано на соотношении смертности, или, если нет, от 150 моллюсков восприимчивых видов, после начала периода распространения Marteilia refringens. Если период распространения не известен, отбор проб начинается после того, как температура воды превышает 17°C;

2) отобранные пробы тестируются с использованием диагностических методов, установленных в подпункте 1), в соответствии с методами и подробными диагностическими процедурами, установленными в разделе 2 главы V.

Наличие Marteilia refringens считается подтвержденным, если положительный результат, полученный путем гистопатологического исследования, мазков ткани или гибридизации in situ, связан с положительным результатом, полученным через PCR и дополненным секвенированием. Подозрение на инфекцию Marteilia refringens может быть исключено, если тесты не являются положительными в отношении наличия Marteilia refringens.

Раздел 2

Подробные диагностические методы и процедуры для наблюдения

и подтверждения инфекции Marteilia refringens

213. При отборе проб и проведении лабораторных исследований с целью получения или поддержания определенного санитарного статуса в отношении инфицирования Marteilia refringens или в целях подтверждения наличия данной болезни или исключения подозрения на эту болезнь, используются методы и подробные процедуры диагностики, предусмотренные в соответствующем разделе.

214. Моллюски с открытой оболочкой или недавно умершие отбираются в первую очередь, чтобы увеличить шансы найти зараженных животных.

Сразу же после отбора устрицы или мидии хранятся при температуре 4°C или охлаждаются на льду максимум в течение 24 часов, если отобранные пробы включают моллюски с открытой оболочкой, но не более 72 часов, в противном случае, в полиэтиленовом пакете с этикеткой, содержащей подробности, относящиеся к природе и происхождению устриц или мидий. Моллюски с открытой оболочкой или недавно умершие хранятся отдельно от других моллюсков.

Для диагностики Marteilia refringens путем гистологии используется срез ткани толщиной 3-5 мм, включая жабры и сердечную ткань. Часть пищеварительной железы используется для определенных тестов, включая мазки и полимеразную цепную реакцию (PCR).

215. Цитология (техника цитологического окрашивания) как техника микроскопии применяется следующим образом: после высыхания тканей пищеварительной железы на абсорбирующей бумаге делается несколько мазков на предметном стекле. Предметное стекло оставляют сушиться на воздухе, фиксируют в абсолютном метаноле или этаноле и окрашивают с помощью набора для окрашивания, имеющегося в продаже, такого как Diff-Quik®/Hemacolor®, в соответствии с инструкциями производителя. После промывки под водопроводной водой и сушки предметное стекло покрывают покровным стеклом с использованием соответствующей синтетической смолы. Предметные стекла сначала должны быть проанализированы при увеличении × 200, а затем погружаются в масло и проанализированы при увеличении × 1000.

216. Положительный результат заключается в наблюдении за клетками, размеры которых варьируются от 30-40 мкм. Цитоплазма является базофильной, а ядро – эозинофильным. Наблюдаются бледные ореолы вокруг крупных, сильно окрашенных (огнеупорных) гранул, а в случае клеток большего размера, наблюдается компоновка типа «клетка в клетке». Техника не специфична для этого вида паразита.

217. Гистология как метод микроскопии применяется следующим образом: фиксируются срезы ткани, включая жабры, пищеварительную железу, мантию и гонады в течение не менее 24 часов в фиксаторе Davidson, после нормальной обработки для гистологического исследования после погружения в парафин и окрашивания гематоксилином и эозином. Наблюдения должны проводиться при последовательной толщине максимум × 1000.

Положительный результат заключается в наблюдении за клетками, размеры которых варьируются от 4 до 40 мкм. Первые стадии состоят из многоядерных клеток сферической и продолговатой формы. Они встречаются, в основном, в эпителии пищевода и желудка, а иногда и в жаберных пазухах. Споруляция включает деление клеток внутри клеток и происходит в канальцах и протоках пищеварительной железы. Огнеупорные гранулы возникают в процессе споруляции, но не наблюдаются на ранних стадиях. На поздних стадиях инфекции в просвете пищеварительной трубки наблюдаются свободные спорангии. Цитоплазма является базофильной, а ядро – эозинофильным. Цвет гранул может варьировать от интенсивного оранжевого до интенсивного красного.

Техника не специфична для этого вида паразита.

218. ДНК извлекается в соответствии со стандартными процедурами.

Могут использоваться и другие наборы для извлечения ДНК, позволяющие получить высококачественную ДНК, которая может использоваться в протоколах PCR, указанных в пунктах 219-223.

219. Для полимеразной цепной реакции (PCR) следует использовать праймеры PCR, направленные на область внутреннего транскрибированного участка (ITS1), поскольку они могут усиливать только Marteilia refringens.

220. Реакция PCR проводится в объеме 50 мкл. Смеси для PCR содержат буфер [500 мМ KCl, 100 мМ Tris / HCl (pH 9,0 до 25°C) и 1% Triton®X-100)], 2,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ смеси dNTP, 1 мкм праймеры сенсорный и антисенсорный, 0,02 мкл^–1 единицы полимеразы ДНК Taq и 10-100 ng извлеченной ДНК. После денатурации ДНК в течение 5 минут при 94°C проводятся 30 следующих циклов: денатурирование при 94°C в течение одной минуты, прикрепление при 55°C в течение одной минуты, удлинение при 72°C в течение одной минуты на 1 000 пар баз. Должна быть проведена заключительная стадия удлинения в течение 10 минут при 72°C. Обнаружение Marteilia refringens PCR осуществляется праймерами, нацеленными на область ITS1 (5′-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3 ‘и 5′-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3′).

221. Положительные контроли состоят из геномной ДНК хозяина с выраженной инфекцией или плазмидной ДНК, включая целевую область.

222. Отрицательные контроли состоят из геномной ДНК неинфицированных хозяев и PCR-реагентов без целевой ДНК.

223. Положительный результат состоит из положительного продукта амплификации ожидаемого размера (412 pb), всех отрицательных контролей, имеющих отрицательные результаты, и всех положительных контролей, имеющих положительные результаты.

224. Для гибридизации на месте (IHS) следует использовать зонд, нацеленный на небольшую субъединицу генного комплекса ARNr, как это было подтверждено по отношению к гистологии.

225. Срезы тканей, включая жабры и пищеварительную железу, следует фиксировать, по меньшей мере, в течение 24 часов в фиксаторе Davidson, после обычной обработки для гистологического исследования после помещения в парафин. Вырезаются срезы 5 мкм и помещаются на предметные стекла, покрытые аминоалкилсиланом, затем следует инкубировать в течение ночи в печи при 40°C. Срезы депарафинируют путем погружения в ксилен в течение 10 минут. Этот этап повторяется один раз, а затем растворитель удаляют путем погружения в две последовательные ванны абсолютного этанола по 10 минут на каждую. Далее срезы обезвоживают путем погружения в последовательные ванны этанола. Срезы обрабатывают протеиназой К (100 мкг мл^–1) в TE-буфере [Tris (50 мм), EDTA (10 мМ)], при 37°C в течение 30 минут. Предметные стекла должны быть обезвожены путем погружения в последовательные ванны этанола, а затем высушены на воздухе. Срезы следует инкубировать с 100 мкл гибридизационного буфера (4 × SSC (цитратный солевой раствор), 50% формамида, 1 × раствор Денхардта, 250 мкг мл^–1 МРНК дрожжей, 10% декстрансульфата), содержащего 10 нг (1 мкл PCR-реакторов, подготовленный, как описано в настоящем разделе, с использованием праймеров CCG-GTG-CCA-GGT-TCT-CG и TTC-GGG-TCT-TGA-AAG-GC) из меченого дигоксигенином зонда. Секции покрыты пластиковыми предметными стеклами для гибридизации in situ и помещены на нагревательный блок при 95°C на пять минут. Затем предметные стекла должны охладиться на льду в течение одной минуты перед гибридизацией при 42°C в течение одной ночи во влажной печи. Секции промывают дважды в течение пяти минут в 2 × SSC при комнатной температуре и один раз в течение 10 минут в 0,4 × SSC при 42°C. Этапы обнаружения выполняются в соответствии с инструкциями производителя. Затем предметные стекла промывают в стерильной дистиллированной воде (dH2O). Секции окрашивают по Bismarck Brown в коричнево-желтый цвет и промывают в dH2O. Далее они покрываются покровными стеклами, используя водную среду монтажа. Положительный и отрицательный контроль – это участки образцов, которые, как известно, заражены и, соответственно, не заражены.

226. Положительный результат должен быть установлен путем окрашивания в черно-фиолетовый цвет клеток Marteilia refringens в известных тканях-мишенях, все отрицательные контроли имеют отрицательные результаты, все положительные контроли – положительные результаты.

227. Секвенирование – один из последних этапов, необходимых для подтверждения диагноза. Целевые регионы представляют собой небольшую субъединицу ADNr и ITS1.

228. В целях программ по надзору и для подтверждения наличия инфекции Marteilia refringens или исключения подозрений на указанную болезнь, диагностические методы и связанные с ними процедуры, должны соответствовать рекомендациям, изложенным в таблице 13 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме.

Глава VI

МЕТОДЫ НАБЛЮДЕНИЯ И КОНТРОЛЯ В ОТНОШЕНИИ

ИНФЕКЦИИ BONAMIA OSTREAE

Раздел 1

Требования к программам по надзору или ликвидации с целью

получения и поддержания санитарного статуса «благополучный

по болезни» в отношении инфекции Bonamia ostreae

229. Ветеринарно-санитарные проверки по необходимости, отбор производственных единиц в отношении инфекции Bonamia ostreae – болезни, вызванной простейшим Bonamia ostreae, проводятся в течение года, когда известно, что распространение Bonamia ostreae является максимальным в зоне или ее части. Тогда, когда такие данные недоступны, отбор проб проводится зимой или ранней весной.

230. Если моллюски являются объектом отбора проб, применяются следующие критерии:

1) при наличии Ostrea edulis, для отбора проб отбирают только устрицы этого вида. Если Ostrea edulis отсутствует, отбор проб является репрезентативным для всех других восприимчивых видов, которые присутствуют;

2) если присутствуют рыхлые моллюски с открытой оболочкой или те, которые недавно умерли, но еще не разлагаются, в основном отбираются они. В отсутствие таких моллюсков отобранные моллюски включают здоровые моллюски самого старшего возраста;

3) при проведении отбора проб на фермах, где используется более одного источника воды для производства моллюсков, в отобранные пробы должны быть включены моллюски, представляющие все источники воды, таким образом, чтобы все части фермы были пропорционально представлены в пробе;

4) при проведении отбора проб в зонах по культивированию моллюсков необходимо включить в пробу моллюски из достаточного количества пунктов отбора проб. Основными факторами, которые следует учитывать при отборе проб из этих пунктов, являются пункты, в которых в прошлом была обнаружена Bonamia ostreae, плотность запасов, течения, наличие восприимчивых видов, наличие видов-векторов, батиметрия и практики управления. Необходимо включить в отбор проб естественные станины, которые находятся в зонах по культивированию или прилегающих к ним зонах.

231. Зона или ее часть с санитарным статусом III категории в отношении инфекции Bonamia ostreae может снова получить санитарный статус I категории в отношении данной болезни, когда все фермы, содержащие восприимчивые виды этой зоны или ее части, являются объектом, по меньшей мере, следующей программы по надзору, которая включает в себя санитарные осмотры и сбор отобранных проб для тестирования.

232. Двухлетняя программа по надзору включает:

1) фермы и зоны по культивированию моллюсков, которые содержат восприимчивые виды и являются объектом санитарных проверок и отбора проб, минимум, в течение двух лет подряд, как указано в таблице 14 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме;

2) в течение этого двухлетнего периода тестирование всех отобранных проб имело отрицательные результаты в отношении Bonamia ostreae, и было исключено любое подозрение на Bonamia ostreae;

3) если Ostrea edulis, происходящая из зоны или ее части с санитарным статусом I категории, входит в отобранную пробу, они вводятся на ферму или в зону по культивированию моллюсков, по меньшей мере, осенью, непосредственно перед периодом, в который осуществляется программа по надзору.

233. Ликвидация Bonamia ostreae считается невозможной в большинстве случаев, но тогда, когда Агентство считает, что это можно осуществить, применяется программа по ликвидации.

234. Зона или ее часть с санитарным статусом V категории в отношении инфекции Bonamia ostreae может снова получить санитарный статус I категории в отношении этой болезни тогда, если все фермы или зоны по культивированию моллюсков, содержащие восприимчивые виды в этой зоне или ее части, где эффективно применяются минимальные меры контроля, и, в частности, установлена изолирующая зона, которая включает защитную зону и зону по наблюдению, по соседству с фермой (фермами) или зоной (зонами) по культивированию моллюсков, официально объявленной зараженной /объявленных зараженными Bonamia ostreae.

235. Изолирующая зона определяется от случая к случаю с учетом факторов, влияющих на риски распространения этой болезни, а именно: количество, возраст, уровень смертности и распределение случаев смертности моллюсков на ферме или в зоне по культивированию моллюсков, зараженных Bonamia ostreae, включая дикие моллюски; расстояние, на котором находятся соседние фермы или прилегающие зоны по культивированию моллюсков, а также их плотность, включая дикие моллюски; близость к перерабатывающим единицам, фермам, с которыми они контактируют, или зонам по культивированию моллюсков; виды, присутствующие на фермах или в зонах по культивированию моллюсков, в частности, восприимчивые виды и виды-вектора; практики рыбоводства, применяемые на пострадавших фермах или в зонах по культивированию моллюсков, а также в тех, которые находятся по соседству; гидродинамические условия и другие факторы, приемлемые с эпидемиологической точки зрения, которые идентифицированы.

236. Для установления защитной зоны и зоны наблюдения применяются:

1) защитная зона, которая устанавливается в непосредственной близости от фермы или зоны по культивированию моллюсков, официально объявленных зараженными Bonamia ostreae. Эта зона должна соответствовать зоне, установленной на основе соответствующих гидродинамических или эпидемиологических данных;

2) зона наблюдения, которая должна быть установлена за пределами защитной зоны. Эта зона должна соответствовать зоне, расположенной вокруг защитной зоны, установленной на основе соответствующих гидродинамических или эпидемиологических данных.

237. Все фермы и зоны по культивированию моллюсков, содержащие восприимчивые виды в защитной зоне и которые официально не объявлены зараженными Bonamia ostreae, подлежат официальному расследованию, которое включает, по меньшей мере, отбор проб для тестирования от 150 моллюсков восприимчивых видов после начала периода распространения Bonamia ostreae. Если период распространения не известен, отбор проб начинается зимой или ранней весной.

238. Все фермы и зоны по культивированию моллюсков, официально объявленные зараженными Bonamia ostreae, освобождаются, подвергаются санитарному вакууму и, по возможности, очищаются и дезинфицируются. Продолжительность периода санитарного вакуума составляет не менее шести месяцев.

239. После освобождения всех ферм или зон по культивированию моллюсков, официально объявленных зараженными, соблюдается период синхронного санитарного вакуума не менее четырех недель.

240. По необходимости Агентство принимает решение на основании оценок рисков о требовании по освобождению, очистке, дезинфекции и установлению периода санитарного вакуума для других ферм или зон по культивированию моллюсков, которые находятся внутри установленных защитных зон и зон наблюдения. Продолжительность периода санитарного вакуума устанавливается Агентством на основе оценок рисков в каждом случае.

241. Все фермы или зоны по культивированию моллюсков, официально объявленные зараженными, и все другие фермы или зоны по культивированию моллюсков, которые являются объектом санитарного вакуума, расположенные внутри установленных защитных зон и зон наблюдения, пополняются моллюсками, происходящими из зон или их частей с санитарным статусом I категории в отношении инфекции Bonamia ostreae. Пополнение происходит только после того, как все фермы, официально объявленные зараженными, освобождены, очищены, дезинфицированы и подвергнуты санитарному вакууму в соответствии с пунктами 238-240.

242. Все фермы и зоны по культивированию моллюсков, содержащие восприимчивые виды в зоне или ее части, которые являются объектом программы по ликвидации, становятся в дальнейшем объектом программы по надзору.

243. В случае необходимости индивидуального надзора для поддержания санитарного статуса I категории, все фермы или зоны по культивированию моллюсков, содержащие восприимчивые виды в этой зоне или в соответствующей ее части, подвергаются санитарным осмотрам и отбору проб в соответствии с таблицей 15 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме, учитывая уровень риска заражения фермы или зоны по культивированию моллюсков Bonamia ostreae.

244. Санитарный статус «благополучный по болезни» в отношении инфекции Bonamia ostreae поддерживается только до тех пор, когда все отобранные пробы, протестированные с использованием предусмотренных методов диагностики, имеют отрицательные результаты в отношении Bonamia ostreae, и исключено любое подозрение на Bonamia ostreae.

245. Зона или ее часть, которые имеют санитарный статус V категории в отношении инфекции Bonamia ostreae, могут получить санитарный статус III категории в отношении этой болезни, при условии, что:

1) требования, предусмотренные в пунктах 233-240, должны быть выполнены. В случае невозможности, с технической точки зрения, устанавливается санитарный вакуум. Соответствующие фермы становятся объектом альтернативных мер, которые предоставляют почти идентичные гарантии относительно ликвидации Bonamia ostreae из окружающей среды фермы;

2) все фермы или зоны по культивированию моллюсков, официально объявленные зараженными, и все другие фермы или зоны по культивированию моллюсков, которые являются объектом санитарного вакуума или альтернативных мер в соответствии с подпунктом 1), расположенные внутри установленных защитной зоны и зоны наблюдения, пополняются моллюсками, происходящими из зон или с санитарным статусом I, II или III категории в отношении инфекции Bonamia ostreae;

3) пополнение происходит только после того, как все фермы или зоны по культивированию моллюсков, официально объявленные зараженными, освобождены, очищены, дезинфицированы и подвергнуты санитарному вакууму или альтернативным мерам в соответствии с подпунктом 1);

4) не была подтверждена инфекция Bonamia ostreae в течение двухлетнего периода, который следует за введением в действие мер, указанных в подпунктах 1), 2) и 3), и были исключены подозрения в течение этого периода.

246. В аккредитованную лабораторию животное отправляют целиком для проведения диагностических тестов, предусмотренных в пунктах 247-249.

247. Методами диагностики, которые требуют использования для получения или поддержания статуса «благополучный по болезни» в отношении инфекции Bonamia ostreae, – являются гистопатологическое обследование, мазков ткани или PCR, установленные в разделе 2 главы VI.

248. Если необходимо подтвердить или исключить подозрение на инфекцию Bonamia ostreae, официальное расследование включает в себя, по меньшей мере, отбор проб от 30 моллюсков из восприимчивых видов, в случае если это подозрение основано на соотношении смертности, или, если нет, от 150 моллюсков восприимчивых видов, после начала периода распространения Bonamia ostreae. Если период распространения не известен, отбор проб начинается зимой или ранней весной.

249. Наличие Bonamia ostreae считается подтвержденным, когда положительный результат, полученный путем применения гистопатологического обследования, мазков ткани или гибридизации in situ, связан с положительным результатом, полученным через PCR и завершенное секвенирование в соответствии с утвержденными методами и процедурами. Подозрение на инфекцию Bonamia ostreae может быть исключено, если указанные тесты не представляют никаких других доказательств наличия указанной болезни.

Раздел 2

Подробные диагностические методы и процедуры для

наблюдения и подтверждения инфекции Bonamia ostreae

250. В случае отбора проб и проведения лабораторных исследований для получения или поддержания определенного санитарного статуса в отношении Bonamia ostreae или в целях подтверждения наличия этой болезни или исключения подозрения на данную болезнь, следует применять подробные диагностические методы и процедуры, предусмотренные в настоящем разделе.

251. Моллюски с открытой оболочкой или недавно умершие выбирают в первую очередь для увеличения шансов найти зараженных животных.

252. После отбора устриц хранят при температуре 4°C или охлаждают на льду максимум в течение 24 часов, если пробы включают моллюски с открытой оболочкой, и 72 часа, в противном случае, в полиэтиленовом пакете с этикеткой, содержащей детали, связанные с природой и происхождением устриц. Моллюски с открытой оболочкой или недавно умершие хранятся отдельно от других моллюсков.

253. Для диагностики Bonamia ostreae с помощью гистологии используются срезы тканей толщиной 3-5 мм, которые включают жабры и сердечную ткань. Часть пищеварительной железы используется для определенных тестов, включая мазки и полимеразную цепную реакцию (PCR).

254. Цитология (цитологическая техника окрашивания) выполняется следующим образом: после сушки жаберной и сердечной ткани на абсорбирующей бумаге на предметном стекле выполняется несколько мазков. Предметные стекла оставляют сушиться на воздухе, фиксируют в абсолютном метаноле или этаноле и окрашивают с помощью доступного в продаже набора для окрашивания (например, Diff-Quik®/Hemacolor®) в соответствии с инструкциями производителя. После промывания водопроводной водой и сушки, предметные стекла покрывают покровным стеклом с помощью соответствующей синтетической смолы. Лезвия сначала должны быть проанализированы при увеличении × 200, а после погружения в масло, при увеличении × 1000.

255. Положительный результат заключается в наличии мелких организмов сферической или овальной формы (2-5 мкм в ширину), внутри гемоцитов. Тем не менее паразит также может присутствовать и вне клеток. Эти организмы имеют базофильную цитоплазму и эозинофильное ядро (цвета могут варьироваться в зависимости от используемого красителя), и поскольку они распространяются на предметном стекле, они могут выглядеть больше на мазках, чем при гистологическом исследовании. Могут наблюдаться многоядерные клетки. Техника не специфична для этого вида паразита.

256. Гистология выполняется следующим образом: фиксируются срезы ткани, которые включают жабры и пищеварительную железу, по меньшей мере, в течение 24 часов в фиксаторе Дэвидсона, вследствие обычной обработки для гистологического исследования после помещения в парафин и окрашивания гематоксилином и эозином или другими красителями. Наблюдения должны проводиться при последовательной толщине до ×1000.

257. Положительный результат заключается в наличии паразитов в виде очень мелких клеток шириной 2-5 мкм, внутри гемоцитов, или свободных в соединительной ткани или в пазухах эпителия жабр, пищеварительного тракта и мантии, зачастую связанных с интенсивной воспалительной реакцией. Чтобы устранить любые сомнения, паразиты должны наблюдаться внутри гемоцитов с целью установления положительного диагноза. Техника не специфична для этого вида паразита.

258. ДНК извлекается в соответствии со стандартными процедурами.

Могут использоваться и другие доступные комплекты для извлечения ДНК, которые обычно позволяют получить ДНК высокого качества, которая может использоваться в протоколах PCR, как описано в настоящем разделе.

259. Могут быть использованы два протокола PCR, которые направлены на мелкую субъединицу ADNr:

1) классический протокол PCR, который позволяет амплифицировать несколько представителей таксона Haplosporidia, включая Bonamia spp. Праймеры, называемые Bo и Boas, представляют собой 5′-CAT-TTA-ATT-GGT-CGG-GCC-GC-3′ соответственно и 5′-CTG-ATC-GTC-TTC-GAT-JRC-CC-3′ и усиливают продукт в 300 pb. Смеси для PCR содержат буфер (500 мм KCl, 100 мМ Tris/HCl (pH 9,0 при 25°C) и 1% Triton®X-100)), 2,5 мМ MgCl₂, 0,2 мМ смесь dNTP, 1 мкМ праймер сенсорный и антисенсорный, 0,02 мкл^–1 единицы полимеразы ДНК Taq и 0,2 НГ мкл^–1 ДНК-матрица в общем объеме 50 мкл. Пробы искажаются в термоцикле в течение пяти минут при 94°C, затем проводят 30 циклов (94°C в течение одной минуты, 55°C в течение одной минуты, при 72°C в течение одной минуты) и окончательное удлинение в течение 10 минут при 72°C. Положительные контроли состоят из геномной ДНК хозяина с выраженной инфекцией или плазмидной ДНК, включая область-мишень. Отрицательные контроли состоят из геномной ДНК неинфицированных хозяев и неинфицированных реагентов для PCR, без целевой ДНК. Положительный результат состоит из положительного продукта амплификации ожидаемого размера (т.е. 300 п.н.), всех отрицательных контролей, имеющих отрицательные результаты, и всех положительных контролей, имеющих положительные результаты;

2) протокол PCR представляет собой PCR-тест в режиме реального времени с SYBR® Green. Это позволяет конкретно обнаруживать Bonamia ostreae (описанная ниже) и может быть объединено с PCR-анализом в режиме реального времени с SYBR® Green, позволяющим специфическое обнаружение Bonamia exitiosa (Ramilo et al., 2013).

Праймеры BOSTRE-F (5′-TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3′) и BOSTRE-R (5′-TCGCGGTTGAATTTTATCGT-3′) амплифицируют продукт 208 pb. Смеси для PCR содержат SYBR®Green Master Mix (1x), 0,3 мкм праймеры сенсорные и антисенсорные и 200 НГ извлеченной ДНК. Пробы искажаются в системе обнаружения в реальном времени в течение 10 минут при 95°C, после чего проводят 35 циклов (95°C в течение 30 секунд, 55°C в течение 45 секунд и 72°C в течение одной минуты). Анализ кривой плавления осуществляется путем увеличения температуры на 0,5°C/s, начиная с температуры 55°C и достигая 95°C, регистрируя интенсивность флуоресценции при каждом изменении температуры. Положительные контроли состоят из геномной ДНК хозяина с выраженной инфекцией или плазмидной ДНК, включая область-мишень. Отрицательные контроли состоят из геномной ДНК неинфицированных хозяев и PCR-реагентов без целевой ДНК. Положительный результат состоит из продукта положительного усиления с одной верхней температурой плавления (78,25 ± 0,25°C в опубликованных условиях Ramilo et al. 2013), все отрицательные контроли имеют отрицательные результаты и все положительные – положительные результаты.

260. Для гибридизации in situ (IHS) необходимо использовать зонд, который нацелен на небольшую субъединицу в генном комплексе ADNr, хотя было показано, что может произойти перекрестная реакция с другими членами семьи Haplosporidia.

261. Срезы ткани, включая жабры и пищеварительную железу, должны быть зафиксированы, по меньшей мере, в течение 24 часов в фиксаторе Дэвидсона, в результате обычной обработки для гистологического исследования после помещения в парафин. Далее вырезают 5 мкм срезы и помещают на предметные стекла, покрытые аминоалкилсиланом, затем инкубируют в течение ночи в печи при 40°C. Срезы депарафинируют путем погружения в ксилол в течение 10 минут. Этот этап повторяется один раз, а затем растворитель удаляется путем погружения в две последовательные ванны абсолютного этанола каждая по 10 минут. Затем срезы обезвоживаются путем погружения в последовательные ванны этанола. Срезы обрабатывают протеиназой К (100 мкг мл^–1) в TE-буфере (Tris (50 мм), EDTA (10 мм), при 37°C в течение 30 минут. Предметные стекла должны быть обезвожены путем погружения в последовательные ванны этанола, а затем высушивают на воздухе. Срезы следует инкубировать с 100 мкл гибридизационного буфера (4 × SSC (цитратный солевой раствор), 50% формамида, 1 × раствор Денхардта, 250 мкг мл^–1 МРНК дрожжей, 10% декстрансульфата), содержащего 20 нг (2 мкл реакции PCR подготовлены, как описано в пункте 259, с использованием Bo и Boas-праймеров) из меченного дигоксигениного зонда. Секции покрывают пластиковыми предметными стеклами для гибрида in situ и помещают на нагревательный блок при 95°C в течение пяти минут. Затем предметные стекла охлаждают на льду в течение одной минуты перед гибридизацией при 42° C в течение одной ночи во влажной печи. Срезы промывают дважды в течение пяти минут в 2 × SSC при комнатной температуре и один раз в течение 10 минут в 0,4 × SSC при 42°C. Этапы обнаружения выполняются в соответствии с инструкциями производителя. Далее предметные стекла промывают в стерильной дистиллированной воде (dH2O). Срезы окрашивают по Бисмарку в коричнево-желтый цвет и промывают в dH2O; накрывают покровными стеклами, используя водную среду монтажа.

262. Положительные и отрицательные контроли – это срезы образцов, которые, как известно, заражены и не заражены соответственно.

263. Положительный результат заключается в наличии отмеченных паразитов внутри гемоцитов, все отрицательные контроли имеют отрицательные результаты и все положительные контроли имеют положительные результаты.

264. Секвенирование – это один из последних этапов, необходимый для подтверждения диагностики. Соответствующие регионы – небольшая субъединица ADNr и ITS1.

265. В целях надзора и подтверждения наличия инфекции Bonamia ostreae или исключения подозрения на наличие этой болезни методы диагностики и сопутствующие процедуры, которые необходимо использовать, соответствуют рекомендациям, изложенным в таблице 16 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме.

Глава VII

МЕТОДЫ НАБЛЮДЕНИЯ И КОНТРОЛЯ В ОТНОШЕНИИ

БОЛЕЗНИ БЕЛЫХ ПЯТЕН (WHITE SPOT DISEASE-WSD)

Раздел 1

Требования к программам по надзору и ликвидации с целью получения

и поддержания санитарного статуса «благополучный по болезни»

в отношении болезни белых пятен (white spot disease – WSD)

266. Отбор проб моллюсков для проведения лабораторных исследований в отношении (WSD), а также предупреждение распространения вирусной инфекции синдрома белых пятен (WSSV) происходит, когда есть вероятность, что температура воды достигнет наивысшего годового значения. Это требование к температуре воды также применяется к контролю, в случае если он осуществим и целесообразен.

267. Если моллюски являются объектом отбора проб в соответствии с требованиями, установленными в настоящей части, применяются следующие критерии:

1) если в производственных единицах присутствуют рыхлые или умирающие моллюски, в основном отбираются они. В случае если таких ракообразных нет в наличии, то отбираются ракообразные из когорт разных размеров, а именно молодые и взрослые экземпляры из отобранных восприимчивых видов, представленные пропорционально в пробе;

2) если для производства моллюсков используется более одного источника воды, то в отобранную пробу должны быть включены восприимчивые моллюски, представляющие все источники воды.

268. Если требуется индивидуальное наблюдение за дикими популяциями, количество и географическое распределение точек отбора проб определяются таким образом, чтобы достичь разумного покрытия зоны или ее части. Пункты отбора проб также являются репрезентативными для различных экосистем, где обитают дикие популяции восприимчивых видов, а именно морские зоны, устья, реки и озера.

269. Если требуется индивидуальное наблюдение за дикими популяциями, моллюски, которые являются объектом отбора проб, отбираются следующим образом:

1) в эстуариях следует выбирать один или несколько из следующих видов: Carcinus maenas, Cancer pagurus, Eriocheir sinensis, Liocarcinus depurator, Liocarcinus puber, Crangon crangon, Homarus gammarus, Palaemon adspersus или видов креветок из семейства Penaeidae, а именно Penaeus japonicus, Penaeus kerathurus, Penaeus semisulcatus. Если этих видов нет, отобранная проба является репрезентативной для других восприимчивых видов декаподов, имеющихся в наличии. Учитывая большое разнообразие восприимчивых хозяев, хозяева могут быть отобраны из родов или семей отряда Decapoda, восприимчивость которых была продемонстрирована экспериментально или естественным путем;

2) в реках и озерах следует выбирать один или несколько из следующих видов: Pacifastacus leniusculus, Astacus leptodactylus, Austropotamobius pallipes или Orconectes limosus. Если эти виды не присутствуют, отобранная проба является репрезентативной для других восприимчивых видов декаподов, которые имеются в наличии. Учитывая большое разнообразие восприимчивых хозяев, хозяева могут быть отобраны из родов или семей отряда Decapoda, восприимчивость которых была продемонстрирована экспериментально или естественным путем;

3) если присутствуют рыхлые или умирающие моллюски, в основном отбираются они. В случае, если таких ракообразных нет в наличии, тогда отбираются ракообразные из когорт разных размеров, а именно молодые и взрослые экземпляры из отобранных восприимчивых видов, представленных пропорционально в пробе.

270. В соответствии с конкретными требованиями для получения санитарного статуса I категории в отношении WSD предусмотрена программа по надзору:

1) зона или ее часть с санитарным статусом III категории в отношении WSD может получить санитарный статус I категории относительно указанной болезни, когда все фермы, содержащие восприимчивые виды в этой зоне или ее части, соблюдают соответствующие требования. Пункты, в которых отбираются пробы от диких популяций, подлежат следующей двухлетней программе по надзору, включающей санитарный контроль и сбор проб для тестирования.

Фермы или пункты отбора проб являются объектом контроля и отбора проб, по меньшей мере, в течение двух лет подряд, как это предусмотрено в таблице 17 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме.

В течение этого двухлетнего периода тестирование всех отобранных проб с использованием установленных методов диагностики имело отрицательные результаты в отношении инфекции WSD, и было исключено любое подозрение на WSD;

2) если во время введения в действие программы по надзору, отмеченной в подпункте 1), инфекция WSD подтверждается на ферме, включенной в соответствующую программу по надзору, вследствие чего у фермы был отозван статус II категории, эта ферма может быстро восстановить свой статус II категории и продолжить введение в действие программы по надзору для получения санитарного статуса «благополучный по болезни», без введения в действие программы по ликвидации, при условии, что статус этой фермы в отношении WSD не зависит от статуса природной воды из соседней местности с указанной болезнью.

Ферма была освобождена, очищена, продезинфицирована и подвергнута периоду санитарного вакуума, продолжительность которого составляет не менее шести недель. Ферма была пополнена моллюсками, происходящими из зоны или ее части, которые имеют статус I категории в отношении WSD.

271. Зона или ее часть со статусом V категории в отношении WSD может получить статус I категории в отношении этой болезни, если все фермы, содержащие восприимчивые виды в данной зоне или данной ее части, были объектом программы по ликвидации.

272. Минимальные меры контроля применяются эффективным образом. Изоляционная зона, которая включает в себя защитную зону и зону наблюдения, была установлена в соседней ферме (соседних фермах), официально объявленной/ объявленных зараженной (зараженными) WSD.

273. Изоляционная зона была определена в каждом конкретном случае с учетом факторов, влияющих на риски распространения WSD на культивируемые и дикие моллюски, такие как: количество, доля смертности и распределение случаев смертности ракообразных в фермах, зараженных WSD; расстояние, на котором расположены соседние фермы и их плотность; фермы, с которыми контактировали; виды, присутствующие на фермах; методы рыбоводства, применяемые на пострадавших фермах и соседних фермах; гидродинамические условия и другие приемлемые факторы с эпидемиологической точки зрения, которые идентифицируются.

274. Защитная зона устанавливается в непосредственной близости от фермы, официально объявленной зараженной WSD, и должна соответствовать в морских зонах и эстуариях: зоне, вписанной в круг с радиусом, по меньшей мере, равным смещению прилива или не менее 5 км, удерживая наибольшую величину из двух, имея в качестве центра ферму, официально объявленную зараженной WSD, или эквивалентную зону, установленную на основе соответствующих гидродинамических или эпидемиологических данных; или в пресных водах: весь гидрографический бассейн фермы официально объявлен зараженным WSD. Агентство может ограничить расширение защитной зоны на определенные части гидрографического бассейна, при условии, что не будет скомпрометировано предупреждение распространения WSD.

275. За пределами защитной зоны устанавливается зона наблюдения. В морских зонах она должна соответствовать: зоне, расположенной вокруг защитной зоны, зона по смещению прилива которой совмещается с зоной по смещению прилива соответствующей защитной зоны; или зоне, расположенной вокруг защитной зоны, вписанной в круг радиусом 10 км, рассчитанной от центра защитной зоны; или эквивалентной зоне, установленной на основе соответствующих гидродинамических или эпидемиологических данных; или в пресных водах: зоне, расположенной снаружи установленной защитной зоны.

276. Все фермы, содержащие восприимчивые виды, которые находятся в защитной зоне и официально не объявлены зараженными WSD, являются объектом официального расследования, которое включает отбор проб для тестирования от 10 моллюсков, в случае если наблюдаются клинические или посмертные признаки, совместимые с WSD, или для тестирования 150 моллюсков, если не наблюдаются клинические или посмертные признаки; и контроль. На фермах, в которых тесты имели отрицательные результаты, проверки продолжались один раз в месяц в течение сезона, когда температура воды, вероятно, достигала самых высоких годовых значений, до тех пор, пока не отменяется защитная зона в соответствии с пунктом 277.

277. Все фермы, официально объявленные зараженными WSD, освобождаются, очищаются, дезинфицируются и подвергаются периоду санитарного вакуума, который составляет не менее шести недель. После освобождения всех ферм, официально объявленных инфицированными, следует соблюдать период синхронного вакуума, по меньшей мере, в течение трех недель. Настоящий раздел также применяется к новым фермам, официально объявленным зараженными во время введения в действие программы по ликвидации.

В ходе применения периода санитарного вакуума для ферм, официально объявленных зараженными, защитные зоны преобразовываются в зоны наблюдения.

278. Агентство принимает решение на основе оценок рисков о требовании освобождения, очистки, дезинфекции и установления периода санитарного вакуума для других ферм, которые находятся внутри установленных защитных зон и зон наблюдения. Продолжительность периода санитарного вакуума устанавливается Агентством на основе оценок рисков в каждом конкретном случае.

279. Все фермы, официально объявленные зараженными, и все другие фермы, которые были объектом санитарного вакуума, расположенные внутри установленных защитных зон и зон наблюдения, пополняются: моллюсками, происходящими из зон или их частей, которые имеют санитарный статус I категории в отношении WSD; или в течение переходного периода моллюсками, происходящими из зон или их частей с утвержденной программой по надзору WSD.

280. Пополнение происходит только после того, как все фермы, официально объявленные зараженными WSD, освобождены, очищены, дезинфицированы и подвергнуты санитарному вакууму в соответствии с пунктом 277.

281. Все фермы, содержащие восприимчивые виды в зоне или ее части, являющиеся объектом программы по ликвидации, а также, если потребуется надзор за дикими популяциями, пункты по отбору проб становятся объектом программы по надзору, предусмотренной в пункте 270.

282. Часть зоны, включающий одну ферму, которая имеет статус I категории в отношении WSD, статус которой относительно указанной болезни не зависит от состояния природной воды в окрестностях, и у которого был отозван санитарный статус I категории, может восстановить санитарный статус I категории, как только Агентство подтвердит, что соблюдаются следующие условия:

1) ферма, зараженная WSD, была освобождена, очищена, дезинфицирована и подвергнута периоду санитарного вакуума; продолжительность санитарного вакуума составляет не менее шести недель;

2) ферма, зараженная WSD, пополняется моллюсками, происходящими из зон и их частей, которые имеют статус I категории в отношении WSD.

283. В случае необходимости индивидуального надзора для поддержания статуса I категории, все фермы, содержащие восприимчивые виды, перечисленные в главе VII, из соответствующей зоны или их части, подлежат проверке и отбору проб в соответствии с таблицей 18 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме, с учетом уровня риска заражения фермы WSD.

284. В зонах или их частях, где существует ограниченное количество ферм, а индивидуальный надзор за этими фермами не обеспечивает достаточных эпидемиологических данных, программы по надзору для поддержания статуса «благополучный по болезни» включают выбранные пункты отбора проб в соответствии с требованиями, предусмотренными пунктом 155. Из этих пунктов по отбору проб 50% являются объектом инспекции и ежегодного отбора проб путем ротации.

Отбор проб проводится в соответствии с таблицей 18 приложения к настоящей Ветеринарно-санитарной норме. Пробы отбираются, готовятся и исследуются в соответствии с методами диагностики и отбора проб, описанными в разделе 2, а лабораторные исследования должны иметь отрицательные результаты в отношении агента WSD.

285. Санитарный статус «благополучный по болезни» сохраняется только до тех пор, пока все пробы, протестированные с использованием методов диагностики и отбора проб, предусмотренных в пунктах 289-290, имеют отрицательные результаты для WSD, и любые подозрения относительно WSD были исключены согласно официальному расследованию и методам диагностики, предусмотренным пунктом 291.

286. Зона или ее часть, которая имеет статус V категории относительно WSD, может получить статус III категории при условии, что:

1) требования, предусмотренные в пунктах 271-277, выполнены. В случае, когда технически невозможно, устанавливается санитарный вакуум. Соответствующие фермы являются объектом альтернативных мер, которые представляют почти идентичные гарантии в отношении ликвидации WSSV из окружающей среды фермы;

2) все фермы, официально объявленные зараженными WSD, и все другие фермы, которые были объектом санитарного вакуума или альтернативных мер в соответствии с подпунктом 1), расположенные в установленных защитных зонах и зонах наблюдения, пополняются моллюсками, происходящими из зон или их частей со статусом I, II или III категории в отношении WSD;

3) пополнение происходит только после того, как все фермы официально объявленные зараженными WSD, освобождаются, очищаются, дезинфицируются и подвергаются санитарному вакууму или альтернативным мерам в соответствии с подпунктом 1);

4) не было обнаружено WSD в течение двухлетнего периода, следующего за завершением мер, указанных в подпунктах 1) и 2), и были исключены подозрения в течение этого периода в соответствии с процедурами, установленными в пункте 291.

287. Отобранные пробы кожного эпидермиса, рассеченные, либо присутствующие на стопах, которые служат для перемещения, на плеоподах, на щечных отверстиях или жабрах животного, подвергнутых тестированию, фиксируются в этаноле 95% перед подготовкой отбора проб для ПЦР в два этапа.

288. Другие пробы могут быть собраны, зафиксированы для гистологического обследования и электронной микроскопии путем передачи с целью поддержки данных, связанных с диагнозом, полученным через PCR.

289. Диагностическим методом, который должен использоваться для получения или поддержания статуса «благополучный по болезни» в отношении WSD, является двухэтапная PCR.

290. Если через двухэтапную PCR достигается положительный результат, он сочетается с секвенированием усилительного продукта до введения в действие первых мер борьбы, если это возможно, путем выделения патогномонических признаков WSD у отобранных восприимчивых хозяев с использованием гистологического исследования и электронной микроскопии с помощью передачи.

291. Если необходимо подтвердить или исключить наличие инфекции WSD, соблюдаются следующие процедуры в отношении инспекции, отбора проб и тестирования:

1) официальное расследование включает в себя, по меньшей мере, один контроль и отбор проб от 10 ракообразных, в случае если наблюдаются клинические или посмертные признаки, совместимые с инфекцией WSD, или от 150 ракообразных, если клинические или посмертные признаки не наблюдаются. Отобранные пробы тестируются с использованием диагностического метода, предусмотренного в пунктах 289-290 (PCR в два этапа);

2) наличие WSD считается подтвержденным, когда двухэтапный PCR с последующим секвенированием имеет положительные результаты для WSSV и когда присутствуют патогномонические признаки WSD у отобранных хозяев.

Подозрение на WSD может быть исключено, если тесты не предоставят никаких других доказательств относительно наличия WSD.

Раздел 2

Подробные диагностические методы и процедуры

для наблюдения и подтверждения болезни

белых пятен (white spot disease-WSD)

292. В случае проведения отбора проб и лабораторных обследований в целях программ по надзору, а также в целях подтверждения наличия инфекции WSSV или исключения подозрения на эту болезнь, следует применять подробные диагностические методы и процедуры, предусмотренные в соответствующем разделе.

Методы и процедуры, описанные в настоящем разделе, адаптированы после аккредитованного теста на болезни моллюсков. Могут применяться альтернативные подходы с использованием эквивалентных условий или комплектов, изготовленных разными производителями, но которые имеют восприимчивость и специфичность, эквивалентные тем, которые описаны в настоящем разделе. Во всех случаях продукт усиления PCR секвенирован, чтобы подтвердить, что речь идет о вирусе синдрома белых пятен (WSSV).

293. Ткани (плеоподы и жабры) от ракообразных, зараженных WSSV, могут храниться в этаноле, позже в RNA или могут быть быстро заморожены при 80°C. Этапы, необходимые для идентификации WSSV с использованием проб тканей, заключаются в следующем: гомогенизация тканей, экстракция ДНК, специфическое усиление ДНК WSSV с использованием PCR, визуализация усиленного продукта на геле, очистка ДНК и секвенирование для подтверждения идентичности патогенного агента.

294. Измельчение тканей и подготовка гомогената в подходящем буфере осуществляется с помощью гомогенизатора Fast Prep и пробирки Lysing Matrix A (MP Biomedicals). Ткани взвешиваются, помещаются в пробирки Lysing Matrix A, разбавляются в пропорции от 1 до 10 г/в или в соответствии с инструкциями производителя, в подходящем буфере [G2 и 10 мкл протеиназы K для использования с комплектом экстракции ДНК из тканей DNA Tissue kit (QIAGEN)] и гомогенизируются гомогенизатором Fast Prep 24 в течение двух минут. Гомогенизированные пробы инкубируют при 56°C, как минимум, в течение четырех часов или в течение ночи. Пробы встряхивают, центрифугируют при 9000 об/мин в течение двух минут, а 50 мкл супернатанта или объема, эквивалентного 5 мг ткани (вес ткани, оптимальный для экстракционного набора), добавляют в пробирку для экстракции ДНК, заполняя объем до 200 мкл с помощью буфера G2.

295. Общая ДНК извлекается с использованием набора для экстракции ДНК из тканей и EZ1 Advanced XL Biorobot (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Каждая партия отобранных проб сопровождается контролем экстракции (ДНК из тимуса теленка) и отрицательным контролем (буфер G2). ДНК выделяется в объеме 50 мкл.

296. Чтобы гарантировать, что экстракция успешно завершена, определяется концентрация ДНК для всех проб и проверок, используя Nano Drop. Извлеченная ДНК замораживается при –20°C, в случае если в ней нет острой необходимости.

297. Метод, который используется для обнаружения WSSV, представляет собой протокол для обнаружения WSSV через Nested PCR, предусмотренный в настоящем разделе, который позволяет на первом и втором этапах получить продукт амплификации PCR 1447 pb и 848 pb Гена ARNr 18S соответственно.

298. Первый этап PCR проводится в объеме 50 мкл, содержащий конечные концентрации 1 × GoTaq Buffer (Promega), 5 мМ MgCl₂, 1pmol/μl праймер WSSV 146 F1, 1pmol/μl праймер WSSV 146 R1 (таблица 1), 0,25 мМ dNTP, 1,25U полимеразы Taq и 2,5 мкл ДНК.

Каждый образец дублируется и связан с отрицательным контролем экстракции, отрицательным контролем PCR (вместо ДНК добавляется 2,5 мкл H₂O) и положительным контролем. Положительный контроль состоит из разбавленного плазмида WSSV, подготовленного и проверенного для использования в аккредитованной лаборатории (предоставленной в распоряжение международной референтной лабораторией).

299. Реакция на втором этапе PCR происходит таким же образом, как и на первом этапе, но с использованием набора праймеров WSSV 146 F2/R2 и второго положительного контроля на предмет проверки функционирования этого этапа PCR.

Праймер	Секвенция
WSSV 146 F1	ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG
WSSV 146 R1	TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA
WSSV 146 F2	GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA
WSSV 146 R2	TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT

300. Как первый, так и второй этап PCR достигается с использованием следующей последовательности циклов, используя термоцикл DNA Engine Tetrad 2 Peltier (или эквивалент): начальный этап искажения при 94°C в течение двух минут, затем этап при 94°C в течение 30 секунд, при 62°C в течение 30 секунд, при 72°C в течение 30 секунд, повторяется в течение 30 циклов, этап удлинения при 72°C в течение двух минут и удерживается при 4°C.

301. Усиленные продукты, возникающие как на первом этапе, так и на втором этапе PCR, визуализируются на 2% агарозном геле, приготовленном с помощью буфера ТАЭ. 15 мкл каждой пробы подвергаются напряжению 120 вольт в течение примерно 20 минут, а затем исследуются в ультрафиолетовом свете. Положительные пробы производят полосу 1447 pb на первом этапе PCR и 848 pb на втором этапе PCR. Пробы такого размера нужно разрезать и поместить в микротрубку центрифуги 1,5 мл. ДНК, содержащаяся в гелевых блоках, очищается с помощью комплекта Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System от Promega в соответствии с инструкциями производителей. Концентрация ДНК оценивается с использованием Nano Drop. Очищенная ДНК замораживается при –20°C, если она не используется немедленно.

302. ДНК секвенируется с использованием набора Big Dye Terminator v3,1 (Applied Biosystems). Общий объем каждой реакции составляет 20 мкл, конечные концентрации – 1 × Big Dye Terminator, 1 × буфер секвенирования, 10 pmol/μl праймера сенсорного или антисенсорного и 10 мкл очищенной ДНК (разбавленной примерно до 10 нг/мкл), применяя следующую последовательность циклов с помощью термоцикла DNA Engine Tetrad 2 Peltier (или эквивалента): 94°C в течение 30 секунд, затем 96°C в течение 10 секунд, 50°C в течение 10 секунд и 60°C в течение четырех минут, последние три этапа происходят 30 раз.

303. Продукты PCR осаждаются с использованием метода на основе ацетата натрия, в рамках которого добавляются 20 мкл ДНК к 10 мкл NaAc, 70 мкл H₂O и 250 мкл этанола. Необходимо встряхнуть и центрифугировать при 13000 об/мин в течение 20 минут, удалить супернатант и промыть осадок 200 мкл абсолютного этанола, центрифугированного при 13000 об/мин в течение пяти минут. Осаждение осадка происходит в течение пяти минут при температуре 37°C. В осадок добавляют 25 мкл высоко деионизированного формамида, нагревают до 95°С в течение двух минут и хорошо встряхивают. Пробы секвенируются с помощью генетического анализатора ABI3130xl Avant в соответствии с инструкциями производителя. Результаты секвенирования анализируются с помощью программного обеспечения Sequencher, а секвенции совпадают с секвенциями, которые находятся в базе данных NCBI, используя функцию BLAST.

Приложение к Ветеринарно-санитарной норме о требованиях к надзору и методах диагностики заболеваний у водных животных Таблица 1 Программа по надзору за зонами и их частями в течение двухлетнего периода контроля, предшествующего получению статуса «благополучный по болезни» в отношении SHV или NHI
Тип фермы	Количество санитарных осмотров в год (2 года)	Количество проб в год (2 года)	Количество рыбы на отобранную пробу ⁽¹⁾
Тип фермы	Количество санитарных осмотров в год (2 года)	Количество проб в год (2 года)	Количество рыбы в развитии	Количество родителей ⁽²⁾
Фермы, содержащие родителей	2	2	50 (первая инспекция) 75 (вторая инспекция)	30 (первая или вторая инспекция) 0 (первая или вторая инспекция)
Фермы, содержащие только родителей	2	1	0	75 (первая или вторая инспекция)
Фермы, которые не содержат родителей	2	2	75 ⁽³⁾ (первая и вторая инспекции)	0
Максимальное количество рыбы на общую выборку: 10
⁽¹⁾ Пробы отобраны не ранее, чем через три недели после перемещения рыбы из пресной воды в соленую воду. ⁽²⁾ Яичниковая или семенная жидкость от производителей собирается во время созревания, в период искусственной кладки (stripping). ⁽³⁾ Пробы должны быть отобраны от количества рыбы, которое гарантирует обнаружение VSHV или VNHI с уровнем достоверности 95%, если предполагаемая распространенность составляет 5%.

Таблица 2 Программа по надзору, с пониженным отбором проб, в течение четырехлетнего периода контроля, предшествующего получению санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении SHV или NHI
Тип фермы	Количество санитарных осмотров в год	Количество отобранных проб в год	Количество рыбы на отобранную пробу ⁽⁴⁾
Тип фермы	Количество санитарных осмотров в год	Количество отобранных проб в год	Количество рыбы в развитии	Количество родителей ⁽⁵⁾
Первые два года периода надзора
Фермы, содержащие родителей	2	1	0 (первая инспекция) 30 (вторая инспекция)	0 (первая инспекция) 0 (вторая инспекция)
Фермы, содержащие только родителей	2	1	0	30 (первая или вторая инспекция)
Фермы, не содержащие родителей	2	1	30 ⁽⁶⁾ (первая или вторая инспекция)	0
Последние два года периода надзора
Фермы, содержащие родителей	2	2	30 (первая инспекция) 0 (вторая инспекция)	0 (первая инспекция) 30 (вторая инспекция)
Фермы, содержащие только родителей	2	2		30 (первая и вторая инспекция)
Фермы, не содержащие родителей	2	2	30 ⁽⁶⁾ (первая и вторая инспекция)
Максимальное количество рыбы на общую выборку: 10
⁽⁴⁾ Образцы взяты не ранее, чем через три недели после перемещения рыбы из пресной воды в соленую воду. ⁽⁵⁾ Яичниковая или семенная жидкость от производителей собирается во время созревания, в период искусственной кладки (stripping). ⁽⁶⁾ Пробы должны быть отобраны от количества рыбы, которое гарантирует обнаружение VSHV или VNHI с уровнем достоверности 95%, если предполагаемая распространенность составляет 10%.

Таблица 3 Программы по надзору за зонами и их частями для поддержания санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении SHV или NHI
Уровень риска	Количество санитарных осмотров	Количество рыбы на отобранную пробу ⁽⁹⁾
Высокий	2 в год	30 ^{(7) (8)}
Средний	1 в год	30 ⁽⁷⁾
Низкий	1 в 2 года	30 ⁽⁷⁾
Максимальное количество рыбы в общей пробе: 10
⁽⁷⁾ Пробы отобраны не ранее, чем через три недели после перемещения рыбы из пресной воды в соленую воду. ⁽⁸⁾ Пробы должны быть отобраны от количества рыбы, которое гарантирует обнаружение VSHV или VNHI с уровнем достоверности 95%, если предполагаемая распространенность составляет 10%. ⁽⁹⁾ Для каждой санитарной инспекции отбирается хотя бы одна проба.

Таблица 4 Программа по надзору за зонами и их частями в течение двухлетнего периода контроля, предшествующего получению санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении KHVD
		Количество клинических осмотров в год (два года)	Количество лабораторных исследований в год (два года)	Количество рыбы на отобранную пробу
Фермы/места отбора проб	Первые два года периода надзора	2	2	75 ⁽¹⁰⁾
	Максимальное количество рыбы на общую выборку: 2
⁽¹⁰⁾ Пробы должны быть отобраны от количества рыбы, которое гарантирует обнаружение KHV с уровнем достоверности 95%, если предполагаемая распространенность составляет 5%.

Таблица 5 Программа по надзору за зонами и их частями в течение четырехлетнего периода контроля, предшествующего получению санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении KHVD
		Количество клинических проверок в год	Количество лабораторных исследований в год	Количество рыбы на отобранную пробу
Фермы/места отбора проб	Первые два года периода надзора	1	1	30
Фермы/места отбора проб	Последние два года периода надзора	2	2	30
	Максимальное количество рыбы на общую выборку: 2.

Таблица 6 Программы по надзору за зонами и их частями с целью сохранения санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении KHVD
Уровень риска	Количество санитарных осмотров	Количество рыбы на отобранную пробу
Высокий	2 в год	30
Средний	1 в год	30
Низкий	1 в 2 года	30
Максимальное количество рыбы на общую выборку: 2.

Таблица 7 Программа по надзору для поддержания санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении KHVD в зонах и их частях, где существует ограниченное количество ферм, а индивидуальный надзор за этими фермами не представляет достаточных эпидемиологических данных
	Количество клинических осмотров в год	Количество лабораторных исследований в год	Количество рыбы на отобранную пробу
Пункт отбора	1 в 2 года	1 в 2 года	30
Максимальное количество рыбы на общую выборку: 2.

Таблица 8 Праймеры и условия для протокола Nested PCR, направленные на все герпесные вирусы ципринидов (CyHV-1, CyHV-2 и CyHV-3)
Название праймера	Секвенция	Последовательность циклов	Размер продукта
CyHVpol-смысловой	5′-CCAGCAACATGTGCGACGG-3′	Первая фаза PCR 1 цикл: 95°C в течение 2 минут; 40 циклов: 95°C в течение 30 секунд, 55°C в течение 30 секунд, 72°C в течение 45 секунд; 1 цикл: 72°C в течение 10 минут	362 pb
CyHVpol-антисмысловой	5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′		362 pb
CyHVpol-внутренний смысловой	5′-CGACGGVGGYATCAGCCC-3′	Вторая фаза PCR 1 цикл: 95°C в течение 2 минут; 40 циклов: 95°C в течение 30 секунд, 55°C в течение 30 секунд, 72°C в течение 45 секунд; 1 цикл: 72°C в течение 10 минут	339 pb
CyHVpol-внутренний антисмысловой	5′-GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′		339 pb

Таблица 9 Программа по надзору за зонами и их частями в течение двухлетнего периода контроля, предшествующего получению санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении AIS
Год надзора	Количество санитарных осмотров в год (два года)	Количество лабораторных исследований в год (два года)	Количество рыбы, от которого необходимо отобрать пробы, за год
Год 1	6	2 ⁽¹¹⁾	2 × 75 ⁽¹²⁾
Год 2	6	2 ⁽¹¹⁾	2 × 75 ⁽¹²⁾
⁽¹¹⁾ Пробы должны быть отобраны, сохранены и рассмотрены в течение двух периодов тестирования в год, каждый период продолжительностью один месяц (весна и осень), или, где это уместно, в зависимости от практических соображений. ⁽¹²⁾ Максимальное количество рыбы на общую выборку: 5.

Таблица 10 Программы по надзору за зонами или их частями с целью поддержания санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении AIS ⁽¹⁴⁾
Уровень риска	Количество санитарных осмотров в год	Количество лабораторных исследований в год	Количество рыбы, от которого необходимо отобрать пробы, за год
Высокий	2	2 ⁽¹³⁾	2 × 30
Средний	1	1 ⁽¹³⁾	30
Низкий	1 в 2 года	1 в 2 года	30 в 2 года
⁽¹³⁾ Пробы должны быть отобраны и рассмотрены в течение двух периодов тестирования в год, каждый период продолжительностью один месяц (весна и осень), или, где это уместно, в зависимости от практических соображений. ⁽¹⁴⁾ Не применяется к фермам, в которых выращивается только радужная форель (Oncorhynchus mykiss) или только обыкновенная форель (Salmo trutta) или оба вида, и водоснабжение которых основано исключительно на пресноводных источниках, где нет атлантического лосося (Salmo salar).

Таблица 11

Программа

по надзору за зонами или их частями в течение периода контроля,

предшествующего получению санитарного статуса

«благополучный по болезни» в отношении

инфекции Marteilia refringens

Количество
санитарных осмотров в год

Количество
лабораторных исследований в год

Количество
моллюсков на отобранную пробу

Фермы/зоны по культивированию моллюсков

150

Таблица 12 Программы по надзору за зонами или их частями для поддержания санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении инфекции Marteilia refringens
Уровень риска	Количество санитарных осмотров	Количество лабораторных исследований	Количество моллюсков на отобранную пробу
Высокий	1 в год	1 в 2 года	150
Средний	1 в 2 года	1 в 2 года	150
Низкий	1 в 2 года	1 в 4 года	150

Таблица 13 Рекомендации по использованию диагностических методов для программ по надзору и для подтверждения инфекции Marteilia refringens или для исключения подозрений в отношении этой болезни
Метод	Индивидуальный надзор	Предполагаемый диагноз	Подтверждение диагноза
Мазки пищеварительной железы	X	X	X или
Гистопатология	X		X или
Гибридизация in situ			X и
PCR	X	X	X и
Секвенирование			X

Таблица 14

Программа

по надзору за зонами или их частями в течение периода контроля,

предшествующего получению санитарного статуса

«благополучный по болезни» в отношении

инфекции Bonamia ostreae

Количество
санитарных осмотров в год

Количество
лабораторных исследований в год

Количество
моллюсков на отобранную пробу

Фермы/зоны по культивированию моллюсков

150

Таблица 15 Программы по надзору за зонами и их частями для поддержания санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении инфекции Bonamia ostreae
Уровень риска	Количество санитарных осмотров	Количество лабораторных исследований	Количество моллюсков на отобранную пробу
Высокий	1 в год	1 в 2 года	150
Средний	1 в 2 года	1 в 2 года	150
Низкий	1 в 2 года	1 в 4 года	150

Таблица 16 Рекомендации по использованию диагностических методов для программ по надзору и для подтверждения инфекции Bonamia ostreae или для исключения подозрений в отношении этой болезни
Метод	Индивидуальный надзор	Предполагаемый диагноз	Подтверждение диагноза
Мазки сердца или жабр	X	X	X или
Гистопатология	X		X или
Гибридизация in situ			X и
PCR	X	X	X и
Секвенирование			X

Таблица 17

Программа

по надзору за зонами и их частями в течение двухлетнего периода

контроля, предшествующего получению санитарного статуса

«благополучный по болезни» в отношении WSD

Количество
клинических осмотров
в год

Количество
лабораторных исследований
в год

Количество
ракообразных на отобранную пробу

Фермы/места отбора проб

150

Таблица 18 Программы по надзору за зонами или их частями для поддержания санитарного статуса «благополучный по болезни» в отношении WSD
Уровень риска	Количество санитарных осмотров	Количество лабораторных исследований	Количество ракообразных на отобранную пробу
Высокий	1 в год	1 в 2 года	150
Средний	1 в 2 года	1 в 2 года	150
Низкий	1 в 2 года	1 в 4 года	150