686/13.09.2012 Hotărîre cu privire la aprobarea unor metode de analiză pentru controlul nutreţurilor
GUVERNUL REPUBLICII MOLDOVA
H O T Ă R Î R E
cu privire la aprobarea unor metode de analiză
pentru controlul nutreţurilor
nr. 686 din 13.09.2012
(în vigoare 21.12.2012)
Monitorul Oficial nr.198-204 art.741 din 21.09.2012
* * *
În conformitate cu prevederile art.36 din Legea 221-XVI din 19 octombrie 2007 privind activitatea sanitar-veterinară (republicată în Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2013, nr.125-129, art.396), cu modificările şi completările ulterioare, precum şi în vederea transpunerii prevederilor Regulamentului nr.152/2009/CE din 27 ianuarie 2009 de stabilire a metodelor de eşantionare şi analiză pentru controlul oficial al nutreţurilor, publicat în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene seria L nr.54 din 26 februarie 2009, p. 1, în baza normativă naţională, Guvernul
[Preambulul modificat prin Hot.Guv. nr.844 din 25.10.2017, în vigoare 03.11.2017]
HOTĂRĂŞTE:
1. Se aprobă:
Metodele de eşantionare pentru controlul oficial al nutreţurilor, în vederea determinării constituenţilor, inclusiv materialelor care conţin, constau sau sînt produse din organisme modificate genetic, a aditivilor pentru hrana animalelor, substanţelor nedorite şi a reziduurilor de pesticide, conform anexei nr.1;
Metodele de preparare a eşantioanelor pentru analiză şi exprimarea rezultatelor, conform anexei nr.2;
Metodele de analiză privind controlul compoziţiei materiilor prime pentru nutreţuri şi a nutreţurilor combinate, conform anexei nr.3;
Metodele de analiză pentru controlul nivelului admisibil de aditivi în nutreţuri, conform anexei nr.4;
Metodele de analiză pentru controlul substanţelor nedorite în nutreţuri, conform anexei nr.5;
Metodele de analiză privind determinarea constituenţilor de origine animală pentru controlul oficial al nutreţurilor, conform anexei nr.6;
Metodele de determinare a valorii energetice a nutreţurilor combinate pentru păsările de crescătorie, conform anexei nr.7.
[Pct.1 modificat prin Hot.Guv. nr.844 din 25.10.2017, în vigoare 03.11.2017]
2. Prezenta hotărîre intră în vigoare la 3 luni de la data publicării în Monitorul Oficial al Republicii Moldova.
3. Controlul asupra executării prezentei hotărîri se pune în sarcina Agenţiei Naţionale pentru Siguranţa Alimentelor.
[Pct.3 modificat prin Hot.Guv. nr.513 din 02.07.2014, în vigoare 04.07.2014]
| PRIM-MINISTRU | Vladimir FILAT |
| Contrasemnează: | |
| Ministrul agriculturii şi industriei alimentare | Vasile Bumacov |
Chişinău, 13 septembrie 2012. |
|
| Nr.686. |
Anexa nr.1
la Hotărîrea Guvernului
nr.686 din 13 septembrie 2012
[Anexa nr.1 în redacţia Hot.Guv. nr.844 din 25.10.2017, în vigoare 03.11.2017]
METODELE DE EŞANTIONARE
pentru controlul oficial al nutreţurilor, în vederea determinării constituenţilor,
inclusiv materialelor care conţin, constau sau sînt produse din organisme modificate
genetic, a aditivilor pentru hrana animalelor, substanţelor
nedorite şi a reziduurilor de pesticide
1. DEFINIŢII
În sensul prezentului act normativ, noţiunile utilizate au următoarele semnificaţii:
lot – cantitate identificabilă de nutreţ care are anumite caracteristici comune confirmate, precum originea, varietatea, tipul ambalajului, ambalatorul, expeditorul sau etichetarea şi, în cazul unui proces de producţie, o unitate de producţie provenind dintr-o singură instalaţie care utilizează parametri de producţie uniformi sau mai multe astfel de unităţi, dacă sînt produse în mod continuu şi depozitate împreună;
lot eşantionat – cantitate de produs care constituie o unitate şi care are caracteristici presupuse a fi uniforme;
eşantion sigilat – eşantion sigilat astfel încît să împiedice orice acces la eşantion fără a distruge sau a elimina sigiliul;
eşantion agregat – combinaţie de eşantioane elementare prelevate din acelaşi lot eşantionat;
eşantion de laborator – eşantion destinat laboratorului, astfel cum este primit de laborator, şi care poate fi final, redus sau agregat;
eşantion elementar – cantitate prelevată dintr-un punct al lotului eşantionat;
eşantion colectiv – colecţie de eşantioane elementare prelevate din acelaşi lot uniform;
eşantion redus – parte reprezentativă a eşantionului colectiv, obţinută din acesta printr-un proces de reducere;
eşantion final – parte din eşantionul redus sau din eşantionul colectiv omogenizat.
2. METODE DE EŞANTIONARE
Eşantioanele destinate controlului oficial al nutreţurilor se prelevează oficial de către medicul veterinar care are experienţă practică dobîndită pe parcursul a cel puţin 2 ani.
Eşantionul trebuie să fie sigilat astfel încît să împiedice orice acces la eşantion fără a distruge sau a elimina sigiliul. Marcajul sigiliului trebuie identificat în mod clar şi vizibil. În mod alternativ, eşantionul poate fi pus într-un recipient care trebuie închis încît să nu poată fi deschis fără a deteriora în mod ireversibil recipientul, evitînd reutilizarea recipientului.
Pentru identificarea eşantionului cercetat, fiecare eşantion trebuie să poarte un marcaj de neşters şi trebuie să fie identificat încît să existe o legătură lipsită de ambiguitate cu raportul de eşantionare.
Din fiecare eşantion agregat sînt prelevate două eşantioane finale: unul pentru control şi unul pentru operatorul din domeniul hranei pentru animale. În final, poate fi prelevat un eşantion final pentru referinţă. În cazul în care eşantionul agregat complet se omogenizează, eşantioanele finale sînt prelevate din eşantionul agregat omogenizat, cu excepţia cazului în care această procedură este contrară reglementărilor în ceea ce priveşte dreptul operatorului din domeniul hranei pentru animale.
2.1. Dispozitive
Aparatura de prelevare de eşantioane trebuie să fie realizată din materiale care nu contaminează produsele de eşantionat.
Aparatura care este destinată pentru a fi utilizată de mai multe ori, trebuie să fie uşor de curăţat pentru a evita contaminarea încrucişată.
Această aparatură, cu excepţia celei descrise în punctul 2.2.1. trebuie verificată de către Institutul Naţional de Metrologie.
2.2. Aparatură recomandată pentru prelevarea eşantioanelor din nutreţuri solide
2.2.1. Prelevarea manuală
Pentru prelevarea manuală se folosesc lopata plată cu margini verticale şi sonda de eşantionare cu o fantă lungă sau compartimentată.
Dimensiunile sondei de eşantionare trebuie să fie caracteristice lotului eşantionat, ţinîndu-se cont de adîncimea recipientului, dimensiunile sacului, şi dimensiunilor particulelor nutreţului.
În cazul în care sonda de eşantionare are mai multe orificii, pentru a asigura faptul că eşantionul este prelevat în diferite locuri de-a lungul sondei, orificiile trebuie să fie separate prin compartimente sau orificii eşalonate secvenţial.
2.2.2. Prelevarea mecanică
Pentru prelevarea de eşantioane din nutreţurile în mişcare poate fi utilizată aparatură mecanică verificată.
Prelevarea de eşantioane din nutreţurile în mişcare, la rate de debit ridicat, poate fi efectuată de aparatură automată.
2.2.3. Separatorul
Aparatura destinată divizării eşantionului în părţi aproximativ egale poate fi folosită pentru prelevări de eşantioane elementare şi pentru prepararea eşantioanelor reduse şi finale.
3. CERINŢE CANTITATIVE PRIVIND
NUMĂRUL DE EŞANTIOANE ELEMENTARE
3.1. Generalităţi privind prelevarea
Mărimea lotului eşantionat trebuie să permită eşantionarea fiecărei părţi constituente. În cadrul unui sistem de monitorizare obligatorie, se admit anumite derogări, doar cu acordul Agenţiei Naţionale pentru Siguranţa Alimentelor, de la cerinţele cantitative prevăzute în prezentul capitol, impuse pentru a lua în considerare caracteristicile operaţionale, cu condiţia că operatorul din domeniul hranei pentru animale poate demonstra într-un mod cert, echivalenţa procedurii de eşantionare în ceea ce priveşte reprezentativitatea acesteia.
3.2. Cerinţe cantitative în ceea ce priveşte eşantioanele elementare legate de controlul substanţelor sau al produselor uniform distribuite în nutreţuri
3.2.1. Nutreţuri în vrac şi numărul minim de eşantioane elementare:
1) pentru loturile eşantionate care nu depăşesc 2,5 tone metrice – cel puţin şapte eşantioane elementare;
2) pentru loturile eşantionate care depăşesc 2,5 tone metrice – 20 înmulţit cu numărul de tone metrice care compune lotul eşantionat. În cazul în care numărul obţinut este o fracţie, acesta se rotunjeşte la numărul întreg imediat superior pînă la maximum 40 de eşantioane elementare.
3.2.2. Nutreţuri în vrac lichide şi numărul minim de eşantioane elementare:
1) pentru loturile eşantionate care nu depăşesc 2,5 tone metrice sau 2 500 litri – cel puţin patru eşantioane elementare;
2) pentru loturile eşantionate care depăşesc 2,5 tone metrice sau 2 500 litri – cel puţin şapte eşantioane elementare.
În cazul în care nu este posibil să se obţină omogenizarea lichidului, numărul de eşantioane elementare trebuie să crească.
3.2.3. Nutreţuri ambalate şi numărul minim de eşantioane elementare:
1) pentru loturile eşantionate de la 1 pînă la 20 de unităţi – cel puţin un eşantion elementar;
2) pentru loturile eşantionate de la 21 pînă la 150 de unităţi – cel puţin trei eşantioane elementare;
3) pentru loturile eşantionate de la 151 pînă la 400 de unităţi – cel puţin cinci eşantioane elementare;
4) pentru loturile ce depăşesc 400 de unităţi – 1/4 din numărul de unităţi care compun lotul eşantionat, pînă la 40 de unităţi elementare.
Nutreţurile solide şi lichide pot fi ambalate în pungi, saci, cutii de metal, cuve care sînt menţionate în tabel ca unităţi. Unităţile mari (≥ 500 kg sau litri) trebuie să fie eşantionate în conformitate cu dispoziţiile prevăzute pentru nutreţuri în vrac, conform punctelor 3.2.1. şi 3.2.2. din prezenta anexă.
3.2.4. Blocuri de nutreţuri şi brichete minerale cu numărul minim de blocuri sau brichete de eşantionat.
Minimum un bloc sau о brichetă trebuie eşantionat(ă) per lot eşantionat de 25 de unităţi, pînă la un maxim de patru blocuri sau brichete.
În cazul blocurilor sau brichetelor care nu cîntăresc mai mult de 1 kg fiecare, un eşantion elementar este reprezentat de conţinutul unui bloc sau al unei brichete.
3.2.5. Nutreţuri grosiere/nutreţ:
1) pentru loturile eşantionate mai mici de 5 tone – cel puţin cinci eşantioane elementare;
2) pentru loturile eşantionate mai mari de 5 tone – 5 înmulţit cu numărul de tone care compun lotul eşantionat, dar pînă la 40 de eşantioane elementare.
3.2.6. Cerinţe cantitative în ceea ce priveşte eşantioanele elementare legate de controlul substanţelor care pot fi distribuite neuniform în masa de nutreţuri.
Cerinţele cantitative în ceea ce priveşte eşantioanele elementare trebuie utilizate în următoarele situaţii:
1) controlul alfatoxinelor, al cornului-secarei, al altor micotoxine şi impurităţi botanice dăunătoare în materiile prime pentru nutreţuri;
2) controlul contaminării încrucişate printr-un constituent, inclusiv material MG, sau substanţă pentru care este preconizată o distribuţie neuniformă în materiile prime pentru nutreţuri.
În cazul în care Agenţia Naţională pentru Siguranţa Alimentelor are suspiciuni privind apariţia unei astfel de distribuţii neuniforme şi în cazul unei contaminări încrucişate printr-un constituent sau printr-o substanţă într-un nutreţ combinat, se pot aplica următoarele cerinţe cantitative:
a) pentru lotul eşantionat mai mic de 5 tone – cel puţin 12 eşantioane elementare;
b) pentru loturile eşantionate de la 5 pînă la 80 de tone – 5 înmulţit cu numărul de tone care compun lotul eşantionat, dar pînă la 80 de eşantioane elementare;
c) pentru lotul eşantionat mai mare de 80 de tone – 100 eşantioane elementare.
3.2.7. Cerinţe cantitative în ceea ce priveşte eşantionul agregat
Un eşantion agregat reprezintă un lot eşantionat, iar volumul minim al acestora este:
1) nutreţuri în vrac – 4 kg;
2) nutreţuri ambalate – 4 kg;
3) nutreţuri lichide sau semilichide – 4 litri;
4) blocuri de nutreţuri sau brichete minerale cîntărind mai puţin de 1 kg fiecare – greutatea a patru blocuri sau brichete originare;
5) blocuri de nutreţuri sau brichete minerale cîntărind mai mult de 1 kg fiecare – 4 kg;
6) nutreţuri grosiere/nutreţ – 4 kg.
3.2.8. Cerinţe cantitative în ceea ce priveşte eşantioanele finale.
Trebuie efectuată analiza a cel puţin unui eşantion final. Cantitatea din eşantionul final de analizat nu poate fi mai mica decît cantiăţile de mai jos:
1) nutreţuri solide – 500 g;
2) nutreţuri lichide sau semilichide – 500 ml.
Pentru controlul prezenţei materialului modificat genetic, eşantionul final trebuie să conţină cel puţin 10 000 de seminţe/boabe. Pentru porumb dimensiunea eşantionului final trebuie să fie de cel puţin 3 000 g şi pentru soia de 2 000 g. Pentru alte seminţe şi boabe, precum orzul, meiul, ovăzul, orezul, secara, grîul şi seminţele de rapiţă, dimensiunea eşantionului final de 500 g corespunde unui număr de peste 10 000 de seminţe.
3.2.9. Metoda de eşantionare pentru loturi foarte mari (> 500 tone) sau loturi transportate sau depozitate în antrepozite, într-un mod care nu permite eşantionarea întregului lot.
În cazul în care modul de transportare sau de depozitare a unui lot nu permite prelevarea de eşantioane elementare din întregul lot, eşantionarea unor astfel de loturi trebuie să fie efectuată atunci cînd lotul se află în flux.
Eşantionarea trebuie să fie efectuată pe partea accesibilă a lotului. Numărul de eşantioane elementare este stabilit de dimensiunea lotului eşantionat. În cazul eşantionării unei părţi dintr-un lot de nutreţuri din aceeaşi clasă sau care au aceeaşi descriere, se presupune сă rezultatele sînt valabile pentru toate nutreţurile din acel lot.
3.2.10. Prelevarea de eşantioane din spaţii de depozitare accesibile din partea de sus (pentru silozuri deschise)
Eşantionarea trebuie să fie efectuată pe partea accesibilă a lotului. Numărul de eşantioane elementare este stabilit de dimensiunea lotului eşantionat. În cazul eşantionării unei părţi dintr-un lot de nutreţuri din aceeaşi clasă sau care are aceeaşi descriere, se presupune că rezultatele sînt valabile pentru toate nutreţurile din acel lot.
3.2.11. Prelevarea de eşantioane din silozuri care nu sînt accesibile din partea de sus (pentru silozuri închise)
Nutreţurile depozitate în silozuri de peste 100 tone nu pot fi eşantionate în mod static. În cazul în care nutreţul din siloz trebuie să fie eşantionat şi nu există niciо posibilitate de a deplasa lotul, trebuie să se ajungă la un acord cu operatorul conform căruia aceasta trebuie să informeze inspectorul cu privire la momentul în care silozul va fi descărcat pentru a permite eşantionarea atunci cînd nutreţul este în flux. Procedura de eşantionare a nutreţurilor depozitate în silozuri cu volum mai mic de 100 tone implică introducerea într-un recipient a unei cantităţi de 50-100 kg şi prelevarea eşantionului din aceasta. Dimensiunea eşantionului agregat corespunde cu întregul lot, iar numărul de eşantioane elementare este legat de cantitatea din siloz introdusă într-un recipient pentru eşantionare. În cazul eşantionării unei părţi dintr-un lot de nutreţ din aceeaşi clasă sau care are aceeaşi descriere se presupune că rezultatele sînt valabile pentru toate nutreţurile din acel lot.
4. INSTRUCŢIUNI PENTRU PRELEVAREA,
PREPARAREA ŞI AMBALAREA EŞANTIOANELOR
4.1. Cerinţe generale
Eşantioanele se prelevează şi se prepară, evitîndu-se posibilitatea ca produsul să fie modificat sau contaminat.
Instrumentele, suprafeţele de lucru şi recipientele destinate eşantionării trebuie să fie curate şi uscate.
4.2. Eşantioane elementare
4.2.1. În relaţie cu controlul substanţelor sau produselor uniform distribuite în nutreţuri
Eşantioanele elementare trebuie să fie prelevate în mod aleatoriu din întregul lot eşantionat, iar dimensiunile lor trebuie să fie aproximativ egale.
Dimensiunea eşantionului elementar este de cel puţin 100 g sau 25 g în cazul nutreţurilor grosiere sau al nutreţului cu o greutate specifică redusă.
În cazul eşantionării loturilor de dimensiuni reduse de nutreţuri ambalate, conform cerinţelor cantitative, trebuie să fie prelevat un număr limitat de eşantioane elementare. Un eşantion elementar este reprezentat de conţinutul unei unităţi originare al cărei conţinut nu depăşeşte 1 kg sau un litru.
4.2.2. Nutreţuri în vrac
Dacă este cazul, eşantionarea poate fi efectuată atunci cînd lotul este în mişcare prin încărcare sau descărcare.
4.2.3. Nutreţuri ambalate
După selectarea pentru eşantionare a numărului necesar de ambalaje, conform indicaţiilor de la capitolul 3 din prezenta anexă, o parte a conţinutului fiecărui ambalaj se scoate folosind o sondă sau o lopată. Dacă este cazul, eşantioanele se prelevează după ce ambalajele au fost golite separat.
4.2.4. Nutreţuri lichide sau semilichide, omogene sau omogenizabile
După selectarea pentru eşantionare a numărului necesar de recipiente, în conformitate cu indicaţiile de la capitolul 3 din prezenta anexă, conţinutul lor se omogenizează, dacă este necesar, şi se prelevează o cantitate din fiecare recipient.
Eşantioanele elementare pot fi prelevate la descărcarea conţinutului.
4.2.5. Nutreţuri lichide sau semilichide, neomogenizabile
După selectarea pentru eşantionare a numărului necesar de containere, în conformitate cu indicaţiile de la capitolul 3 din prezenta anexă, eşantioanele se prelevează de la diferite niveluri.
Eşantioanele se pot preleva şi în timpul descărcării conţinutului, dar primele fracţiuni se îndepărtează.
În oricare dintre cazuri, volumul total prelevat nu trebuie să fie mai mic de 10 litri.
4.2.6. Blocuri de nutreţuri şi brichete minerale
După selectarea pentru eşantionare a numărului necesar de blocuri sau brichete, conform indicaţiilor de la capitolul 3 din prezenta anexă, se prelevează o parte din fiecare bloc sau brichetă.
În cazul blocurilor sau brichetelor care nu cîntăresc mai mult de 1 kg fiecare, un eşantion elementar este reprezentat de conţinutul unui bloc sau al unei brichete.
4.2.7. În relaţie cu controlul substanţelor sau al produselor nedorite care ar putea fi distribuite neuniform în masa de nutreţuri, cum ar fi alfatoxinele, cornul-secarei, ricinul şi crotalaria din materiile prime pentru nutreţuri
Se prelevează eşantioane cu mărimi aproximativ egale, iar pentru nutreţurile ambalate o parte a conţinutului ambalajelor de eşantionat se prelevează prin utilizarea unei sonde sau a unei lopeţi, după golirea separată a ambalajelor, dacă este cazul, astfel încît cantitatea totală a eşantioanelor provenite din fiecare parte să nu fie mai mică decît cantitatea minimă de 4 kg necesară pentru fiecare eşantion colectiv.
Eşantioanele elementare prelevate din diferite părţi nu se consideră colective.
4.2.8. Prepararea eşantioanelor agregate
Eşantioanele elementare se amestecă pentru a forma un singur eşantion agregat.
4.3. Prepararea eşantioanelor colective
4.3.1. În relaţie cu controlul substanţelor sau al produselor cu distribuţie uniformă în masa de nutreţuri
Eşantioanele elementare se amestecă pentru a forma un singur eşantion colectiv.
4.3.2. În relaţie cu controlul substanţelor sau al produselor nedorite care ar putea fi distribuite neuniform în masa de nutreţuri, cum ar fi alfatoxinele, cornul-secarei, ricinul şi crotalaria din materii prime pentru nutreţuri
Eşantioanele elementare prelevate din fiecare parte a lotului eşantionat se amestecă şi se constituie numărul de eşantioane colective din prezenta anexă, notînd provenienţa fiecărui eşantion colectiv.
4.4. Prepararea eşantioanelor finale
Materialul din eşantionul agregat se amestecă cu grijă. Fiecare eşantion este introdus într-un recipient. Se iau toate precauţiile necesare pentru evitarea oricărei modificări de compoziţie a eşantionului, a contaminării sau falsificării, care ar putea avea loc în timpul transportării sau depozitării. În cazul controlului constituenţilor sau substanţelor uniform distribuite în întregul nutreţ, eşantionul agregat poate fi redus în mod reprezentativ la cel puţin 2 kg sau 2 litri.
Pentru controlul prezenţei de reziduuri de pesticide în leguminoase, boabe de cereale şi fructe nucifere, dimensiunea minimă a eşantionului redus este de 3 kg. În cazul în care natura nutreţului nu permite utilizarea unui separator sau separatorul nu este disponibil, eşantionul poate fi redus prin metoda sferturilor.
Din eşantioanele reduse se prepară eşantioanele finale, pentru control apărare şi referinţă, de о dimensiune aproximativ egală, în conformitate cu cerinţele de la punctul 3.2.8. din prezenta anexă.
În cazul controlului constituenţilor, inclusiv materialul modificat genetic sau substanţele care ar putea fi distribuite neuniform în materiile prime pentru nutreţuri, eşantionul agregat trebuie să fie complet omogenizat şi împărţit ulterior în eşantioane finale sau redus la cel puţin 2 kg sau 2 litri prin utilizarea unui separator mecanic sau automat.
În cazul în care natura nutreţului nu permite utilizarea unui separator, eşantionul poate, dacă este necesar, să fie redus prin metoda sferturilor. Pentru controlul prezenţei materialului modificat genetic, eşantionul redus trebuie să conţină cel puţin 35 000 de seminţe/boabe pentru a permite obţinerea eşantioanelor finale de cel puţin 10 000 de seminţe.
4.5. Ambalarea eşantioanelor
Recipientele sau ambalajele se sigilează şi se etichetează, astfel încît acestea să nu poată fi deschise fără a deteriora sigiliul. Eticheta completă se încorporează în sigiliu.
4.6. Expedierea eşantioanelor la laborator
Eşantionul trebuie să fie expediat la laboratorul naţional de referinţă împreună cu informaţiile necesare laborantului. Conform prevederilor art.3 pct.(2) lit.b) din Legea nr.221-XVI din 19 octombrie 2007 privind activitatea sanitar-veterinară, în calitate de laborator de referinţă este desemnată Instituţia publică “Centrul Republican de Diagnostică Veterinară”.
5. PROCESUL-VERBAL DE PRELEVARE
ŞI DESTINAŢIA EŞANTIOANELOR
Pentru fiecare eşantion se întocmeşte un proces-verbal, care permite identificarea fără ambiguităţi a lotului eşantionat şi a dimensiunii acestuia.
În procesul-verbal trebuie să fie menţionată, de asemenea, orice abatere de la procedura de eşantionare, astfel cum se prevede în prezenta hotărîre.
Procesul-verbal trebuie să fie pus atît la dispoziţia laboratorului naţional de referinţă, cît şi la dispoziţia operatorului din domeniul hranei pentru animale.
[Anexa nr.1 în redacţia Hot.Guv. nr.844 din 25.10.2017, în vigoare 03.11.2017]
Anexa nr.2
la Hotărîrea Guvernului
nr.686 din 13 septembrie 2012
[Anexa nr.2 în redacţia Hot.Guv. nr.844 din 25.10.2017, în vigoare 03.11.2017]
METODELE DE PREPARARE
a eşantioanelor pentru analiză şi exprimarea rezultatelor
1. PREPARAREA EŞANTIOANELOR PENTRU ANALIZĂ
1.1. Cerinţe generale
Procedurile descrise se referă la prepararea pentru examinarea eşantioanelor finale, trimise laboratorului naţional de referinţă, după eşantionare, conform indicaţiilor din anexa nr.1 la prezenta hotărîre.
Prepararea acestor eşantioane trebuie efectuată astfel încît cantităţile prelevate, în conformitate cu dispoziţiile din metoda de analiză, să fie omogene şi reprezentative pentru eşantioanele finale.
1.2. Măsuri de precauţie
Procedura de preparare a eşantioanelor care trebuie urmată este dependentă de metodele de analiză utilizată şi este de importanţă majoră pentru a se asigura ca procedura de preparare a eşantioanelor urmată trebuie să fie adecvată metodei de analiză utilizate.
Toate operaţiunile necesare se efectuează pentru a se evita contaminarea eşantionului şi modificarea compoziţiei acestuia.
Măcinarea, amestecarea şi cernerea se efectuează în condiţiile unei expuneri minime a eşantionului la aer şi la lumină. Nu se utilizează rîşniţe sau aparate de măcinat care ar putea cauza încălzirea semnificativă a eşantionului.
Se recomandă ca nutreţurile foarte sensibile la căldură să fie măcinate manual. De asemenea, aparatura folosită nu trebuie să constituie o sursă de contaminare cu oligoelemente.
Dacă prepararea nu poate fi efectuată fără modificări semnificative ale conţinutului umed al eşantionului, se determină conţinutul umed înainte şi după pregătire, în conformitate cu metoda menţionată în capitolul I din anexa nr.3 la prezenta hotărîre.
1.3. Procedura de preparare
Se divizează eşantionul în subeşantioane, în vederea analizării şi trimiterii, prin utilizarea unor tehnici de separare, cum ar fi eşantionarea alternativă cu ajutorul lopeţii sau eşantionarea în condiţii staţionare sau rotative.
Formarea unui con şi selectarea de sferturi nu este recomandată deoarece ar putea să se formeze subeşantioane care să dea naştere la erori de separare mari.
Eşantionul de trimis se păstrează într-un recipient adecvat, curat şi uscat, prevăzut cu un capac ermetic, iar subeşantioanele de analizat, cu greutate de cel puţin 100 g se prepară în modul indicat în punctele 1.3.1.-1.3.4. din prezenta anexă.
1.3.1. Nutreţuri care pot fi măcinate ca atare
Se amestecă eşantionul final trecut prin sită şi se introduce într-un recipient adecvat, curat şi uscat, dotat cu un capac ermetic. Se amestecă din nou pentru a asigura o omogenizare completă, imediat înainte de prelevarea cantităţii pentru analiză.
1.3.2. Nutreţuri care pot fi măcinate după uscare
Dacă nu se specifică altfel în metodele de analiză, eşantionul se deshidratează astfel încît umiditatea sa să fie redusă la 8-12%, în conformitate cu procedura de preuscare descrisă la punctul 1.4.3. din metoda de determinare a umidităţii, menţionată în capitolul I din anexa nr.3 la prezenta hotărîre.
În continuare se procedează astfel cum se indică în punctul 1.3.1. din prezenta anexă.
1.3.3. Nutreţuri lichide sau semilichide
Eşantioanele se recoltează într-un recipient adecvat, curat şi uscat, dotat cu un capac ermetic. Se amestecă minuţios pentru a se asigura o omogenizare completă, imediat înainte de prelevarea eşantionului de analizat.
1.3.4. Alte nutreţuri
Eşantioanele care nu pot fi preparate conform unei proceduri indicate anterior se tratează prin orice altă procedură prin care se asigură că eşantioanele prelevate în vederea analizării sînt omogene şi reprezentative pentru eşantioanele finale.
1.3.5. Proceduri specifice în cazul examinării vizuale sau la microscop dacă întregul eşantion se omogenizează
În cazul unei examinări prin inspecţie vizuală, fără a recurge la microscop, întregul eşantion de laborator se utilizează pentru examinare.
În cazul unei examinări microscopice, laboratorul poate reduce eşantionul agregat sau poate efectua o reducere ulterioară a eşantionului redus. Eşantioanele finale pentru apărare şi, în cele din urmă, pentru referinţă sînt prelevate în urma unei proceduri echivalente cu procedura urmată pentru eşantionul final.
Atunci cînd întregul eşantion agregat este omogenizat, eşantioanele finale sînt prelevate din eşantionul agregat omogenizat.
1.4. Depozitarea eşantioanelor
Eşantioanele trebuie păstrate în condiţii care nu afectează negativ caracteristicile fizico-chimice şi siguranţa produsului, astfel încît după prelevare eşantioanele sînt expediate la laborator, al cărora timp al expedierii nu va depăşi 48 de ore din momentul prelevării. Acestea fiind conservate prin refrigerare la temperatura de +2…+4ºC, în recipiente sterile din plastic. Eşantioanele destinate analizării prezenţei vitaminelor sau substanţelor foarte sensibile la lumină sînt păstrează în recipiente de sticlă brună. Toate eşantioanele trimise la laborator trebuie păstrate pînă la obţinerea rezultatelor finale.
2. CERINŢELE FAŢĂ DE REACTIVI ŞI
APARATURA UTILIZATĂ ÎN METODELE
DE ANALIZĂ
2.1. Dacă nu se specifică altfel în metodele de analiză, toţi reactivii destinaţi analizelor trebuie să fie puri din punct de vedere analitic. Pentru analiza prezenţei oligoelementelor, puritatea reactivilor se controlează printr-un test martor. În funcţie de rezultatele obţinute, poate fi necesară o purificare suplimentară a reactivilor.
2.2. Pentru orice operaţie care implică prepararea soluţiilor, diluţia, clătirea sau spălarea, menţionate în metodele de analiză şi pentru care nu există indicaţii referitoare la natura solventului sau diluantului, se utilizează apa. Ca regulă generală, se utilizează apă demineralizată sau distilată. În cazuri speciale, care sînt indicate în metodele de analiză, apa trebuie supusă unor proceduri de purificare speciale.
Avînd în vedere dotarea uzuală a laboratoarelor de control, în metodele de analiză se menţionează doar instrumentele şi aparatura destinată pentru acest scop. Ele trebuie să fie curate.
3. APLICAREA METODELOR DE ANALIZĂ
ŞI EXPRIMAREA REZULTATELOR
3.1. Procedura de extracţie
O serie de metode determină o procedură de extracţie specifică. Ca regulă generală, se pot aplica alte proceduri de extracţie decît cea la care se face referire în metodă, dacă s-a dovedit că procedura de extracţie utilizată are pentru matricea analizată, o eficienţă de extracţie echivalentă cu procedura menţionată în metodă.
3.2. Procedura de purificare
O serie de metode determină o procedură de purificare specifică. Ca regulă generală, se pot aplica alte proceduri de purificare decît cea la care se face referire în metodă, dacă s-a dovedit că procedura de purificare utilizată determină, pentru matricea analizată, rezultate analitice echivalente cu procedura menţionată în metodă.
3.3. Raportarea metodei de analiză utilizate
În general, pentru determinarea fiecărei substanţe în nutreţuri se stabileşte o singură metodă de analiză. În cazul în care sînt indicate mai multe metode, în buletinul de analiză se specifică metoda aplicată de laboratorul naţional de referinţă.
3.4. Numărul determinărilor
Rezultatul indicat în buletinul de analiză reprezintă valoarea medie obţinută în urma a cel puţin două determinări efectuate pe porţiuni distincte ale eşantionului.
În cazul analizelor de detectare a substanţelor indezirabile, dacă rezultatul primei determinări este semnificativ (>50%) mai mic decît specificaţia de control, nu sînt necesare alte determinări, cu condiţia să fie aplicate proceduri calitative.
În cazul controlului privind conţinutul declarat pentru o anumită substanţă sau un anumit ingredient, dacă rezultatul primei determinări confirmă conţinutul declarat, adică rezultatul analizei se situează în interiorul intervalului de variaţie acceptat, nu sînt necesare alte determinări, cu condiţia să fie aplicate proceduri calitative.
3.5. Raportarea rezultatului analitic
Rezultatul analitic se exprimă în modul indicat în metoda de analiză, printr-un număr adecvat de cifre semnificative şi se ajustează, dacă este cazul, la conţinutul de umiditate al eşantionului final înainte de preparare.
3.6. Incertitudinea de măsurare şi rata de recuperare în cazul analizelor de detectare a substanţelor nedorite
În ceea ce priveşte substanţele nedorite, prevăzute în anexa nr.5 la prezenta hotărîre, inclusiv dioxina şi policlorobifenil (în continuare – PCB) asemănători dioxinei, un produs destinat utilizării în nutreţuri se consideră neconform privind conţinutul maxim acceptat, referitor la un nutreţ cu un conţinut de umiditate de 12%, dacă rezultatul analitic este considerat că depăşeşte conţinutul maxim, ţinînd cont de incertitudinea de măsurare extinsă şi ajustarea pentru recuperare. Pentru a evalua conformitatea, concentraţia analizată se utilizează după ce a fost corectată pentru recuperare şi după deducerea incertitudinii de măsurare extinse. Această procedură este aplicabilă doar în cazurile în care metoda de analiză permite estimarea incertitudinii de măsurare şi ajustarea pentru recuperare, procedură care este imposibilă în cazul analizelor la microscop.
În măsura în care metoda de analiză utilizată permite estimarea incertitudinii de măsurare şi a ratei de recuperare, rezultatul analitic se raportează în modul următor:
1) ajustat pentru recuperare, nivelul de recuperare fiind indicat. Ajustarea pentru recuperare nu este necesară în cazul în care rata de recuperare este între 90 şi 110%;
2) ca indicele x+/–U, unde x este rezultatul analitic şi U este incertitudinea de măsurare extinsă, folosind un factor de acoperire 2, care dă un nivel de încredere de aproximativ 95%.
Dacă rezultatul analizei este semnificativ (>50%) mai mic decît specificaţia de control şi cu condiţia ca procedurile calitative corespunzătoare să fie aplicate şi analiza să servească doar verificării conformităţii cu prevederile legale, rezultatul analitic ar putea fi raportat fără ajustare pentru recuperare, iar raportarea ratei de recuperare şi a incertitudinii de măsurare ar putea fi omisă în aceste cazuri.
[Anexa nr.2 în redacţia Hot.Guv. nr.844 din 25.10.2017, în vigoare 03.11.2017]
Anexa nr.3
la Hotărîrea Guvernului
nr.686 din 13 septembrie 2012
METODELE DE ANALIZĂ
privind controlul compoziţiei materiilor prime
pentru nutreţuri şi a nutreţurilor combinate
I. DETERMINAREA UMIDITĂŢII
1.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea conţinutului de umiditate al nutreţurilor. În cazul nutreţurilor care conţin substanţe volatile, cum sînt acizii organici, este de notat că o dată cu determinarea conţinutului de umiditate se determină şi cantităţi semnificative de substanţe volatile.
Metoda nu se aplică în cazul analizei produselor lactate utilizate ca materii prime pentru nutreţuri, analizei substanţelor minerale şi a mixturilor compuse în principal din substanţe minerale, analizei grăsimilor şi uleiurilor de origine animală şi vegetală sau analizei seminţelor şi a fructelor oleaginoase.
1.2. Principiul de aplicare
Eşantionul se deshidratează în condiţii specificate, care variază în funcţie de natura nutreţurilor. Scăderea greutăţii se determină prin cîntărire. Este necesar să se efectueze o uscare prealabilă atunci cînd se analizează nutreţuri solide cu conţinut ridicat de umiditate.
1.3. Dispozitive
1.3.1. Moară construită dintr-un material care nu absoarbe umiditatea, uşor de curăţat, care permite o zdrobire rapidă şi uniformă, fără a provoca o încălzire semnificativă, care evită pe cît este posibil contactul cu aerul exterior şi care corespunde cerinţelor menţionate la subpunctele 1.4.1.1. şi 1.4.1.2. din prezenta anexă (de exemplu, micromori cu ciocane sau răcite cu apă, mori conice pliabile sau mori cu mecanism lent sau cu discuri dinţate).
1.3.2. Balanţă analitică, cu toleranţă de 1 mg.
1.3.3. Recipiente uscate din metal care nu se corodează sau din sticlă cu capace ermetice; suprafaţa de lucru permite împrăştierea eşantionului pînă la aproximativ 0,3 g/cm2.
1.3.4. Cuptor izoterm cu încălzire electrică (± 2°C), ventilat corespunzător şi care asigură o reglare rapidă a temperaturii (1).
1.3.5. Cuptor vidat cu încălzire electrică, reglabil, dotat cu o pompă de ulei şi cu:
a) fie un mecanism de introducere a aerului fierbinte uscat;
b) fie un agent de desicare (de exemplu, oxid de calciu).
1.3.6. Desicator cu o placă din metal sau porţelan, groasă, perforată, conţinînd un agent de desicare eficient.
1.4. Procedura de analiză
Operaţiile descrise în această secţiune se efectuează imediat după deschiderea ambalajelor care conţin eşantioanele. Analizele trebuie să fie efectuate cel puţin în duplicat.
Pentru uscarea cerealelor, a făinii fine, a tărîţelor şi a făinii grunjoase, cuptorul trebuie să aibă o capacitate termică astfel încît, atunci cînd temperatura este prestabilită la 131°C, va reveni la temperatura respectivă în mai puţin de 45 de minute după ce în interior a fost plasat un număr maxim de eşantioane de testat, în vederea uscării simultane. Ventilaţia trebuie să fie astfel încît, atunci cînd un număr cît mai mare de eşantioane de grîu comun pe care le poate conţine sînt supuse uscării timp de două ore, rezultatele diferă de cele obţinute după patru ore de uscare cu mai puţin de 0,15%.
1.4.1. Metodele de preparare
1.4.1.1. Nutreţuri care nu sînt menţionate la subpunctele 1.4.1.2. şi 1.4.1.3.
Se prelevează cel puţin 50 g de eşantion. Dacă este necesar, se zdrobeşte sau se divizează astfel încît să se evite orice variaţie a conţinutului de umiditate.
1.4.1.2. Cereale şi tărîţe
Se prelevează cel puţin 50 g de eşantion. Se macină în particule din care cel puţin 50% trec printr-o sită cu orificii de 0,5 mm şi care nu determină un reziduu mai mare de 10% în cazul folosirii unei site cu orificii rotunde cu diametru de 1 mm.
1.4.1.3. Nutreţuri lichide sau păstoase, nutreţuri constituite în mod predominant din uleiuri şi grăsimi
Se prelevează aproximativ 25 g din eşantion, se cîntăreşte cu o abatere de 10 mg, se adaugă o cantitate adecvată de nisip anhidru cîntărită cu o abatere de 10 mg şi se amestecă pînă la obţinerea unui produs omogen.
1.4.2. Procedura de uscare
1.4.2.1. Nutreţuri care nu sînt menţionate la subpunctele 1.4.1.2. şi 1.4.1.3.
Se cîntăreşte un recipient, conform descrierii de la subpunctul 1.3.3., împreună cu capacul său, cu o abatere de 1 mg. În recipientul respectiv se cîntăreşte, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de 5 g de eşantion şi se împrăştie uniform. Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul încălzit în prealabil la 103°C. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cît mai rapid posibil. Se lasă la uscat timp de patru ore, calculate din momentul în care temperatura din cuptor revine la 103°C. Se pune capacul pe recipient, acesta din urmă se scoate din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator, conform descrierii de la subpunctul 1.3.6. şi se cîntăreşte cu o abatere de 1 mg.
În cazul nutreţurilor constituite în mod predominant din uleiuri şi grăsimi, uscarea în cuptor se prelungeşte cu 30 de minute, la 103°C. Diferenţa între cele două cîntăriri nu trebuie să depăşească 0,1% în umiditate.
1.4.2.2. Cereale, făină fină, tărîţe şi făină grunjoasă
Se cîntăreşte un recipient, conform descrierii de la subpunctul 1.3.3., împreună cu capacul său, cu o abatere de 0,5 mg. În recipientul respectiv se cîntăreşte, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eşantion măcinat şi se împrăştie uniform.
Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul încălzit în prealabil la 130°C. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cît mai rapid posibil. Se lasă la uscat timp de două ore, considerate din momentul în care temperatura din cuptor revine la 130°C. Se pune capacul pe recipient, acesta din urmă se scoate din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator, conform descrierii de la subpunctul 1.3.6. şi se cîntăreşte cu o abatere de 1 mg.
1.4.2.3. Nutreţuri combinate care conţin peste 4% zaharoză sau lactoză: materii prime pentru nutreţuri precum seminţele de roşcove, produsele cerealiere hidrolizate, seminţele de malţ, bucăţi de sfeclă uscată, solubilizate de peşte şi zaharuri, nutreţuri combinate care conţin peste 25% săruri minerale care înglobează apă de cristalizare.
Se cîntăreşte un recipient, conform descrierii de la subpunctul 1.3.3., împreună cu capacul său, cu o abatere de 0,5 mg. În recipientul respectiv se cîntăreşte, cu o abatere de 1 mg, o cantitate de aproximativ 5 g de eşantion şi se împrăştie uniform. Recipientul se introduce, fără capac, în cuptorul vidat, conform descrierii de la subpunctul 1.3.5., încălzit în prealabil la o temperatură cuprinsă între 80 şi 85°C. Pentru a împiedica scăderea inadecvată a temperaturii din cuptor, recipientul se introduce cît mai rapid posibil.
Se aduce presiunea la 100 Torr şi se lasă la uscat, la această presiune, timp de patru ore, fie într-un curent de aer uscat şi cald, fie cu ajutorul unui agent de desicare (aproximativ 300 g pentru 20 de eşantioane). În al doilea caz, pompa de vid se deconectează după ce se obţine presiunea recomandată. Durata de uscare se calculează din momentul în care temperatura în cuptor revine la o valoare cuprinsă între 80 şi 85°C. Presiunea cuptorului se readuce cu grijă pînă la nivelul presiunii atmosferice. Se deschide cuptorul, se aşează imediat capacul pe recipient, se scoate recipientul din cuptor, se lasă să se răcească timp de 30-45 de minute în desicator, conform descrierii de la subpunctul 1.3.6. şi se cîntăreşte cu o abatere de 1 mg. Uscarea în cuptorul vidat se prelungeşte cu încă 30 de minute la o temperatură cuprinsă între 80 şi 85°C şi se recîntăreşte. Diferenţa între cele două cîntăriri nu trebuie să depăşească 0,1% în umiditate.
1.4.3. Uscarea prealabilă
1.4.3.1. Nutreţuri care nu sînt menţionate în subpunctul 1.4.3.2.
Nutreţuri solide al căror conţinut de umiditate este ridicat, făcînd dificilă zdrobirea, trebuie să fie supuse uscării prealabile, după cum urmează:
se cîntăresc, cu o abatere de 10 mg, 50 g de eşantion nemăcinat (dacă este cazul, nutreţurile comprimate sau aglomerate pot fi divizate cu aproximaţie) într-un recipient corespunzător (de exemplu, un taler de aluminiu de 20 × 12 cm cu bordură de 0,5 cm). Se lasă la uscat într-un cuptor la o temperatură cuprinsă între 60 şi 70°C, pînă ce conţinutul de umiditate s-a redus la o valoare cuprinsă între 8 şi 12%. Se scoate din cuptor, se lasă să se răcească, neacoperit, în laborator, timp de o oră şi se cîntăreşte cu o abatere de 10 mg. Se zdrobeşte imediat conform indicaţiilor de la subpunctul 1.4.1.1. şi se usucă conform indicaţiilor de la subpunctul 1.4.2.1. sau subpunctul 1.4.2.3, în funcţie de natura nutreţului.
1.4.3.2. Cereale
Grăunţele cu un conţinut de umiditate mai mare de 17% trebuie să fie supuse uscării prealabile, după cum urmează:
se cîntăresc, cu o abatere de 10 mg, 50 g de grăunţe nemăcinate într-un recipient corespunzător (de exemplu, un taler de aluminiu de 20 × 12 cm cu bordură de 0,5 cm). Se lasă la uscat într-un cuptor, timp de 5-7 minute, la o temperatură de 130°C. Se scot din cuptor, se lasă să se răcească, neacoperit, în laborator, timp de două ore şi se cîntăresc cu o abatere de 10 mg. Se macină imediat conform indicaţiilor de la subpunctul 1.4.1.2. şi se usucă conform indicaţiilor de la subpunctul 1.4.2.2.
1.5. Calcularea rezultatelor
Conţinutul de umiditate (X) al eşantionului, în procente, se calculează prin utilizarea formulelor următoare:
1.5.1. Uscare fără uscare prealabilă
X = (m - m0)/m × 100,
unde:
m = greutatea iniţială, în grame, a eşantionului de testat;
m0 = greutatea, în grame, a eşantionului de testat uscat.
1.5.2. Uscare cu uscare prealabilă
Xp = [(m2 - m0) × m1/m2 + m - m1] × 100/m = 100 × (1 - m1 × m0/m × m2),
unde:
m = greutatea iniţială, în grame, a eşantionului de testat;
m1 = greutatea, în grame, a eşantionului de testat după uscare prealabilă;
m2 = greutatea, în grame, a eşantionului de testat după zdrobire sau măcinare;
m0 = greutatea, în grame, a eşantionului de testat uscat.
1.5.3. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele obţinute în două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu depăşeşte 0,2% din valoarea absolută pentru umiditate.
1.6. Observaţii
Dacă zdrobirea se dovedeşte a fi necesară şi dacă această acţiune poate modifica conţinutul de umiditate al produsului, rezultatele analizei referitoare la componentele nutreţurilor trebuie ajustate în funcţie de conţinutul de umiditate al eşantionului în starea lui iniţială.
II. DETERMINAREA UMIDITĂŢII DIN GRĂSIMILE
ŞI ULEIURILE ANIMALE ŞI VEGETALE
2.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea conţinutului în apă şi substanţe volatile din grăsimile şi uleiurile animale şi vegetale.
2.2. Principiul de aplicare
Eşantionul se usucă pînă la atingerea greutăţii constante (pierderea de greutate între două cîntăriri succesive este mai mică sau egală cu 1 mg) la 103°C. Pierderea de greutate se determină prin cîntărire.
2.3. Dispozitive
2.3.1. Vas cu fund plat, din material rezistent la coroziune, cu diametru de 8-9 cm şi adîncime de aproximativ 3 cm.
2.3.2. Termometru cu bulb întărit şi cu tub de expansiune la capătul superior, gradat de la aproximativ 80°C pînă la cel puţin 110°C şi lung de aproximativ 10 cm.
2.3.3. Cuvă cu nisip sau plită.
2.3.4. Desicator, care conţine un agent de uscare eficient.
2.3.5. Balanţă analitică.
2.4. Procedura de preparare
Se cîntăresc, cu o abatere de 1 mg, aproximativ 20 g din eşantionul omogenizat, în recipientul uscat şi cîntărit, conform descrierii de la subpunctul 2.3.1., care conţine un termometru, conform descrierii de la subpunctul 2.3.2. Se încălzeşte pe cuva cu nisip sau pe plită, conform descrierii de la subpunctul 2.3.3., se amestecă continuu cu termometrul, astfel încît temperatura să ajungă la 90°C în aproximativ 7 minute.
Se reduce intensitatea căldurii, urmărind frecvenţa cu care bulele se ridică de pe fundul vasului. Temperatura nu trebuie să depăşească 105°C. Se continuă amestecarea, răzuind fundul vasului, pînă cînd bulele încetează să se mai formeze.
Pentru a asigura eliminarea completă a umidităţii, se reîncălzeşte de cîteva ori la 103 ± 2°C, răcind la 93°C între încălziri succesive. În continuare se lasă să se răcească la temperatura camerei în desicator, conform descrierii de la subpunctul 1.3.4. şi se cîntăreşte. Se repetă această operaţie pînă cînd pierderea de greutate dintre două încălziri succesive nu depăşeşte 2 mg.
O creştere a greutăţii eşantionului după încălzire repetată indică oxidarea grăsimilor, caz în care rezultatul se calculează prin cîntărirea imediat înainte ca greutatea să înceapă să crească.
2.5. Calcularea rezultatelor
Conţinutul de umiditate (X), ca procentaj din eşantion, este dat de următoarea formulă:
X = (m1 - m2) × 100/m,
unde:
m = greutatea, în grame, a eşantionului de testat;
m1 = greutatea, în grame, a vasului împreună cu conţinutul său înainte de încălzire;
m2 = greutatea, în grame, a vasului împreună cu conţinutul său după încălzire.
Rezultatele mai mici de 0,05% se înregistrează ca fiind “sub 0,05%”.
Repetabilitatea
Diferenţa de umiditate dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 0,05%, în valoare absolută.
III. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE PROTEINE BRUTE
3.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea conţinutului de proteine brute din nutreţuri pe baza conţinutului de azot, determinat conform metodei Kjeldahl.
3.2. Principiul de aplicare
Eşantionul se dizolvă cu acid sulfuric în prezenţa unui catalizator. Soluţia acidă se alcalinizează cu soluţie de hidroxid de sodiu. Amoniacul se distilează şi se colectează într-o cantitate măsurată de acid sulfuric, al cărei exces se titrează cu o soluţie etalon de hidroxid de sodiu.
Ca alternativă, amoniacul eliberat se distilează într-o soluţie de acid boric în exces, urmat de titrare cu o soluţie de acid clorhidric sau acid sulfuric.
3.3. Reactivi utilizaţi
3.3.1. Sulfat de potasiu.
3.3.2. Catalizator: oxid de cupru (II) CuO sau sulfat de cupru (II) pentahidrat, CuSO4 5H2O.
3.3.3. Zinc granulat.
3.3.4. Acid sulfuric, ρ20 = 1,84 g/ml.
3.3.5. Acid sulfuric, soluţie volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.
3.3.6. Acid sulfuric, soluţie volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,1 mol/l.
3.3.7. Acid sulfuric, soluţie volumetrică standard, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.
3.3.8. Indicator roşu de metil; se dizolvă 300 mg de roşu de metil în 100 ml de etanol, σ = 95-96% (v/v).
3.3.9. Soluţie de hidroxid de sodiu (se poate utiliza soluţie de calitate tehnică)
β = 40 g/100 ml (m/v: 40%).
3.3.10. Hidroxid de sodiu, soluţie volumetrică standard, c(NaOH) = 0,25 mol/l.
3.3.11. Hidroxid de sodiu, soluţie volumetrică standard, c(NaOH) = 0,1 mol/l.
3.3.12. Piatră ponce granulată, spălată în acid clorhidric şi calcinată.
3.3.13. Acetanilidă (m.p. = 114°C, conţinutul în N = 10,36%).
3.3.14. Zaharoză (fără azot).
3.3.15. Acid boric (H3BO3).
3.3.16. Soluţie indicator de roşu de metil: se dizolvă 100 mg de roşu de metil în 100 ml de etanol sau metanol.
3.3.17. Soluţie de verde de bromocrezol: se dizolvă 100 mg de verde de bromocrezol în 100 ml de etanol sau metanol.
3.3.18. Soluţie de acid boric (10-40 g/l, în funcţie de aparatura utilizată).
Cînd se aplică detectarea prin colorimetrie a punctului final, indicatorii roşu de metil şi bromocrezol trebuie adăugaţi la soluţiile de acid boric. Dacă se prepară 1 litru de soluţie de acid boric, înainte de ajustarea de volum, se adaugă 7 ml de soluţie de indicator roşu de metil, conform descrierii de la subpunctul 3.3.16. şi 10 ml de soluţie verde de bromocrezol, conform descrierii de la subpunctul 3.3.17.
În funcţie de apa utilizată, pH-ul soluţiei de acid boric diferă de la lot la lot. Adesea este necesară o ajustare cu ajutorul unui mic volum de substanţă alcalină pentru a obţine un martor pozitiv.
Adăugarea a aproximativ 3-4 ml de NaOH, conform descrierii de la subpunctul 3.3.11. în 1 litru de acid boric 10 g/l boric oferă, de obicei, ajustări bune. Soluţia se păstrează la temperatura camerei şi, pe durata păstrării, se protejează de lumină şi de surse de vapori de amoniac.
3.3.19. Acid clorhidric, soluţie volumetrică standard, c(HCl) = 0,1 mol/l.
Dacă în calcule se fac ajustările necesare, se pot folosi alte concentraţii de soluţii volumetrice, conform descrierii de la subpunctele 3.3.5., 3.3.6., 3.3.7., 3.3.10., 3.3.11. şi 3.3.19. Concentraţiile se exprimă întotdeauna cu patru zecimale.
3.4. Dispozitive
Aparatură adecvată pentru efectuarea dizolvării, distilării şi titrării conform procedurii Kjeldahl.
3.5. Procedura de preparare
3.5.1. Dizolvarea
Se cîntăreşte 1 g de eşantion cu o abatere de 0,001 g şi se transferă eşantionul în vasul aparatului de dizolvare. Se adaugă 15 g de sulfat de potasiu, conform descrierii de la subpunctul 3.3.1., o cantitate adecvată de catalizator, conform descrierii de la subpunctul 3.3.2. [0,3-0,4 g oxid de cupru (II) sau 0,9-1,2 g sulfat de cupru (II) pentahidrat], 25 ml de acid sulfuric, conform descrierii de la subpunctul 3.3.4. şi, dacă este necesar, cîteva granule de piatră ponce, conform descrierii de la subpunctul 3.3.12., apoi se amestecă.
Se încălzeşte vasul, la început moderat, agitînd circular din cînd în cînd, dacă este cazul, pînă ce materia s-a carbonizat şi spuma a dispărut; apoi se încălzeşte mai intens, pînă cînd lichidul fierbe constant. Încălzirea este adecvată dacă acidul aflat în fierbere se condensează pe peretele vasului. Se previne supraîncălzirea marginilor şi lipirea particulelor organice de acestea.
Cînd soluţia devine limpede şi de culoare verde deschis, se continuă fierberea timp de încă două ore, apoi se lasă să se răcească.
3.5.2. Distilarea
Se adaugă cu atenţie apă suficientă pentru a asigura dizolvarea completă a sulfaţilor. Se lasă la răcit şi apoi se adaugă, dacă este cazul, cîteva granule de zinc, conform descrierii de la subpunctul 3.3.3. Se procedează în conformitate cu cele descrise la subpunctul 3.5.2.1. sau 3.5.2.2.
3.5.2.1. Distilarea în acid sulfuric
În vasul de colectare al aparatului de distilare se introduce o cantitate de 25 ml de acid sulfuric, conform descrierii de la subpunctul 3.3.5. sau 3.3.7., măsurată cu exactitate, în funcţie de conţinutul estimat de azot. Se adăugă cîteva picături de indicator roşu de metil, conform descrierii de la subpunctul 3.3.8.
Se conectează vasul de dizolvare la condensatorul aparatului de distilare şi se scufundă capătul condensatorului în lichidul din vasul de colectare pînă la o adîncime de cel puţin 1 cm (a se vedea observaţia de la subpunctul 3.8.3.). Se toarnă încet 100 ml de soluţie de hidroxid de sodiu, conform descrierii de la subpunctul 3.3.9. în vasul de dizolvare, fără pierderi de amoniac (a se vedea observaţia de la subpunctul 3.8.1.). Se încălzeşte vasul pînă la distilarea completă a amoniacului.
3.5.2.2. Distilarea în acid boric
În cazul în care titrarea amoniacului conţinut în distilat se face manual, se aplică procedura indicată în continuare.
În cazul în care unitatea de distilare este complet automatizată, inclusiv titrarea amoniacului conţinut în distilat, se urmează instrucţiunile de operare a unităţii de distilare puse la dispoziţie de producător.
În cazul unei unităţi de distilare semiautomate, adăugarea hidroxidului de sodiu în exces şi distilarea în vapori se efectuează automat.
Sub orificiul de evacuare al condensatorului se aşează un vas de colectare care conţine 25-30 ml de soluţie de acid boric, conform descrierii de la subpunctul 3.3.18., astfel încît tubul de evacuare se află sub nivelul suprafeţei soluţiei de acid boric în exces. Se reglează unitatea de distilare astfel încît să elibereze 50 ml de soluţie de hidroxid de sodiu, conform descrierii de la subpunctul 3.3.9. Unitatea de distilare se operează în conformitate cu instrucţiunile producătorului, distilîndu-se complet amoniacul eliberat prin adăugarea de soluţie de hidroxid de sodiu. Distilatul se colectează în soluţia de acid boric receptoare. Cantitatea de distilat (timpul de distilare în vapori) depinde de cantitatea de azot din eşantion. Se urmează instrucţiunile producătorului.
3.5.3. Titrarea
Se procedează ca în cazul descrierilor de la subpunctul 3.5.3.1. sau 3.5.3.2.
3.5.3.1. Acid sulfuric
Se titrează excesul de acid sulfuric în vasul de colectare cu soluţie de hidroxid de sodiu, conform descrierii de la subpunctul 3.3.10. sau 3.3.11., în funcţie de concentraţia acidului sulfuric utilizat, pînă se atinge punctul final.
3.5.3.2. Acid boric
Cu ajutorul unei biurete se titrează conţinutul vasului de colectare cu soluţie volumetrică standard de acid clorhidric, conform descrierii de la subpunctul 3.3.19. sau cu soluţie volumetrică standard de acid sulfuric, conform descrierii de la subpunctul 3.3.6. şi se citeşte cantitatea de soluţie de titrare utilizată.
Cînd se aplică detectarea colorimetrică a punctului final, acesta este atins la prima apariţie în conţinut a culorii roz. Citirea biuretei se estimează cu o abatere de 0,05 ml. Vizualizarea punctului final poate fi facilitată de o placă de agitator magnetic iluminat sau de un detector fotometric.
Aceasta poate fi efectuată automat prin utilizarea unui aparat de distilare cu vapori cu titrare automată.
În cazul în care se utilizează un sistem automat de titrare, aceasta începe imediat după începerea distilării şi se utilizează soluţia de acid boric 1%, conform descrierii de la subpunctul 3.3.18.
Operarea specifică a aparatului de distilare sau a celui de distilare/titrare se face conform instrucţiunilor producătorului.
În cazul în care se utilizează o unitate de distilare complet automată, titrarea automată a amoniacului poate fi efectuată, de asemenea, prin detectarea punctului final cu ajutorul unui sistem pH potenţiometric.
În acest caz, se utilizează un aparat de titrare automat, cu pH-metru. pH-metrul se calibrează corespunzător în intervalul de pH 4-7, folosindu-se proceduri de laborator normale de calibrare a pH-ului.
Punctul final al titrării exprimat în pH este atins la valoarea de 4,6, reprezentînd punctul cel mai de jos al curbei de titrare (punctul de inflexiune).
3.5.4. Testul martor
Pentru a confirma faptul că reactivii nu conţin azot, se efectuează un test martor (dizolvare, distilare şi titrare), folosind 1 g de zaharoză, în locul eşantionului.
3.6. Calcularea rezultatelor
Calcularea se efectuează în conformitate cu prevederile subpunctului 3.6.1. sau 3.6.2.
3.6.1. Calcularea titrării în conformitate cu subpunctul 3.5.3.1.
Conţinutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:
(V0 - V1) × c × 0,014 × 100 × 6,25/m,
unde:
V0 = volumul (ml) de NaOH (conform indicaţiilor de la subpunctul 3.3.10. sau 3.3.11.) folosit în testul martor;
V1 = volumul (ml) de NaOH (conform indicaţiilor de la subpunctul 3.3.10. sau 3.3.11.) folosit în titrarea eşantionului;
c = concentraţia (mol/l) a hidroxidului de sodiu (conform indicaţiilor de la subpunctul 3.3.10. sau 3.3.11.);
m = greutatea (g) a eşantionului.
3.6.2. Calcularea titrării în conformitate cu subpunctul 3.5.3.2.
3.6.2.1. Titrare cu acid clorhidric
Conţinutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:
(V1 - V0) × c × 1,4 × 6,25/m,
unde:
m = greutatea (g) a părţii de testat;
c = concentraţia (mol/l) a soluţiei volumetrice standard de acid clorhidric, conform indicaţiilor de la subpunctul 3.3.19.;
V0 = volumul (în ml) de acid clorhidric utilizat în testul martor;
V1 = volumul (în ml) de acid clorhidric utilizat în partea de testat.
3.6.2.2. Titrare cu acid sulfuric
Conţinutul de proteine brute, exprimat ca procent din greutate, se calculează conform următoarei formule:
(V1 - V0) × c × 2,8 × 6,25/m,
unde:
m = greutatea (g) a părţii de testat;
c = concentraţia (mol/l) a soluţiei volumetrice standard de acid sulfuric, conform indicaţiilor de la subpunctul 3.3.6.;
V0 = volumul (în ml) de acid sulfuric, conform indicaţiilor de la subpunctul 3.3.6. utilizat în testul martor;
V1 = volumul (în ml) de acid sulfuric, conform indicaţiilor de la subpunctul 3.3.6. utilizat în testul martor.
3.7. Verificarea metodei
3.7.1. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească:
a) 0,2% în valoare absolută, pentru un conţinut de proteine brute mai mic de 20%;
b) 1% relativ la valoarea mai mare, pentru un conţinut de proteine brute cuprins între 20 şi 40%;
c) 0,4% în valoare absolută, pentru un conţinut de proteine brute mai mare de 40%.
3.7.2. Acurateţea
Analiza (dizolvare, distilare şi titrare) se efectuează pe 1,5-2 g acetanilidă, conform indicaţiilor de la subpunctul 3.3.13., în prezenţa a 1 g zaharoză, conform indicaţiilor de la subpunctul 3.3.14.; 1 g de acetanilidă consumă 14,8 ml de acid sulfuric. Recuperarea trebuie să fie de cel puţin 99%.
3.8. Observaţii
3.8.1. Aparatura poate fi de tip manual, semiautomat sau automat. Dacă aparatura necesită un transfer între etapele de dizolvare şi distilare, acest transfer trebuie realizat fără pierderi. Dacă vasul aparatului de distilare nu este prevăzut cu o pîlnie de picurare, se adaugă hidroxidul de sodiu imediat înainte de conectarea vasului la condensator, turnînd încet lichidul pe marginea vasului.
3.8.2. Dacă produsul de dizolvare se solidifică, se reîncepe determinarea folosind o cantitate mai mare de acid sulfuric, decît cele descrise în subpunctul 3.3.4., menţionată anterior.
3.8.3. Pentru produsele cu conţinut scăzut de azot, volumul de acidul sulfuric, descris în subpunctul 3.3.7. care trebuie introdus în vasul de colectare poate fi redus, dacă este cazul, la 10 sau 15 ml şi completat pînă la 25 ml cu apă.
3.8.4. Pentru analizele curente, în vederea determinării conţinutului de proteine brute se pot aplica metode alternative de analiză, dar metoda Kjeldahl descrisă în capitolul III al prezentei anexe este metoda de referinţă. Echivalenţa dintre rezultatele obţinute cu metoda alternativă şi cele obţinute prin metoda de referinţă trebuie demonstrată pentru fiecare matrice în mod individual. Întrucît rezultatele obţinute cu o metodă alternativă, chiar şi după verificarea echivalenţei, pot devia uşor faţă de rezultatele obţinute cu metoda de referinţă, este necesar de a menţiona în raportul analitic metoda de analiză utilizată pentru determinarea conţinutului de proteine brute.
IV. DETERMINAREA UREEI
4.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea conţinutului de uree din nutreţuri.
4.2. Principiul de aplicare
Eşantionul este pus în suspensie în apă, în care s-a adăugat un produs de limpezire. Suspensia se filtrează.
Conţinutul în uree al filtratului este determinat după adăugarea de 4-dimetilaminobenzaldehidă (4-DMAB), prin măsurarea densităţii optice la o lungime de undă de 420 nm.
4.3. Reactivi utilizaţi
4.3.1. Soluţie de 4-dimetilaminobenzaldehidă: se dizolvă 1,6 g de 4-DMAB în 100 ml de etanol 96% şi se adaugă 10 ml de acid clorhidric (ρ20 1,19 g/ml). Acest reactiv se conservă timp de maximum două săptămîni.
4.3.2. Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH3COO)22H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă pînă la 100 ml.
4.3.3. Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu, K4Fe(CN)63H2O în apă. Se completează cu apă pînă la 100 ml.
4.3.4. Cărbune activ care nu absoarbe ureea (de controlat).
4.3.5. Uree, soluţie 0,1% (greutate/volum).
4.4. Dispozitive
4.4.1. Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.
4.4.2. Eprubete: 160 × 16 mm cu dopuri de sticlă şlefuită.
4.4.3. Spectrofotometru.
4.5. Procedura de preparare
4.5.1. Analiza eşantionului
Se cîntăresc 2 g de eşantion cu abatere de 1 mg şi se introduc împreună cu 1 g de cărbune activ, în conformitate cu specificaţiile de la subpunctul 4.3.4., într-un balon gradat de 500 ml. Se adaugă 400 ml de apă şi 5 ml de soluţie Carrez I, în conformitate cu specificaţiile de la subpunctul 4.3.2., se amestecă timp de aproximativ 30 secunde şi se adaugă 5 ml de soluţie Carrez II, în conformitate cu specificaţiile de la subpunctul 4.3.3. Se amestecă timp de treizeci de minute în agitator. Se completează volumul cu apă, se agită şi se filtrează.
Se îndepărtează 5 ml de filtrat transparent şi incolor, se introduc în eprubete cu dop de sticlă şlefuită, se adaugă 5 ml de soluţie de 4-DMAB, în conformitate cu descrierile de la subpunctul 4.3.1. şi se amestecă. Se introduc eprubetele într-o baie de apă la 20°C (± 4°C). După cincisprezece minute se măsoară densitatea optică a soluţiei de eşantion cu spectrofotometrul la 420 nm. Se compară cu soluţia de reactivi pentru testul martor.
4.5.2. Curba de calibrare
Se îndepărtează volume de 1, 2, 4, 5 şi 10 ml din soluţia de uree, în conformitate cu descrierile de la subpunctul 4.3.5., se introduc în baloanele gradate de 100 ml şi se completează volumul cu apă. Se îndepărtează 5 ml din fiecare soluţie, se adaugă în fiecare 5 ml de soluţie 4-DMAB, în conformitate cu descrierile de la subpunctul 4.3.1., se omogenizează şi se măsoară densitatea optică la 420 nm cu o soluţie martor care conţine 5 ml de 4-DMAB şi 5 ml de apă în care nu există uree. Se trasează curba de calibrare.
4.6. Calcularea rezultatelor
Se determină cantitatea de uree din eşantion cu ajutorul curbei de calibrare.
Se exprimă rezultatul ca procent din eşantion.
4.7. Observaţii
4.7.1. În cazul unui conţinut de uree care depăşeşte 3%, se reduce greutatea eşantionului la 1 g sau se diluează soluţia iniţială astfel încît să nu fie mai mult de 50 mg de uree în 500 ml.
4.7.2. În cazul unui conţinut mic în uree, se creşte greutatea eşantionului atît timp pînă cînd filtratul rămîne transparent şi incolor.
4.7.3. Dacă eşantionul conţine compuşi de azot simpli, cum ar fi aminoacizii, densitatea optică se măsoară la 435 nm.
V. DETERMINAREA BAZELOR AZOTATE VOLATILE
A. Prin microdifuzie
5.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea conţinutului de baze azotate volatile, exprimate ca amoniac, din nutreţ.
5.2. Principiul de aplicare
Eşantionul este supus extracţiei cu apă, iar soluţia este limpezită şi filtrată. Bazele azotate volatile sînt dislocate prin microdifuzie cu ajutorul unei soluţii de carbonat de potasiu, colectate într-o soluţie de acid boric şi titrate cu acid sulfuric.
5.3. Reactivi utilizaţi
5.3.1. Acid tricloracetic, soluţie 20% (greutate/volum).
5.3.2. Indicator: se dizolvă 33 mg de verde de bromocrezol şi 65 mg de roşu de metil în 100 ml de alcool etilic 95-96% (v/v).
5.3.3. Soluţie de acid boric: într-un balon gradat de 1 l se dizolvă 10 g de acid boric în 200 ml de alcool etilic 95-96% (v/v) şi 700 ml de apă. Se adaugă 10 ml de indicator, conform descrierii de la subpunctul 5.3.2. Se amestecă şi, dacă este necesar, se ajustează coloraţia soluţiei la roşu deschis prin adăugarea unei soluţii de hidroxid de sodiu. 1 ml din această soluţie permite fixarea a maximum 300 μg de NH3.
5.3.4. Soluţie saturată de carbonat de potasiu: se dizolvă 100 g de carbonat de sodiu în 100 ml de apă la temperatura de fierbere. Se lasă să se răcească şi se filtrează.
5.3.5. Acid sulfuric 0,01 mol/litru.
5.4. Dispozitive
5.4.1. Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.
5.4.2. Celule Conway, din sticlă sau din material plastic.
5.4.3. Microbiurete gradate la 1/100 ml.
5.5. Procedura de preparare
Se cîntăresc 10 g de eşantion cu abatere de 1 mg şi se introduc împreună cu 100 ml de apă într-un balon gradat de 200 ml. Se amestecă sau se agită în agitator timp de 30 de minute. Se adaugă 50 ml de soluţie de acid tricloracetic, conform specificaţiilor de la subpunctul 5.3.1., se completează volumul cu apă, se agită cu putere şi se filtrează printr-un filtru cutat.
Cu ajutorul unei pipete se introduce 1 ml de soluţie de acid boric, conform descrierii de la subpunctul 5.3.3., în partea centrală a celulei Conway şi 1 ml de filtrat de eşantion în coroana celulei. Se acoperă parţial cu ajutorul unui capac lubrifiat. Se picură cu rapiditate 1 ml de soluţie saturată de carbonat de potasiu, conform descrierii de la subpunctul 5.3.4., în coroană şi se închide capacul astfel încît celula este ermetizată. Se întoarce celula cu precauţie, rotind-o în plan orizontal, astfel încît cei doi reactivi se amestecă. Se lasă la incubat fie timp de cel puţin patru ore la temperatura camerei, fie timp de o oră la 40°C.
Cu ajutorul unei microbiurete, conform specificaţiilor de la subpunctul 5.4.3., se titrează bazele volatile din soluţia de acid boric cu acid sulfuric, conform indicaţiilor de la subpunctul 5.3.5.
Se efectuează un test martor aplicînd aceeaşi procedură, dar fără a analiza un eşantion.
5.6. Calcularea rezultatelor
1 ml de H2SO4 0,01 mol/litru corespunde la 0,34 mg de amoniac.
Se exprimă rezultatul ca procent din eşantion.
Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele obţinute în două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu depăşeşte:
a) 10%, în valoare relativă, pentru un conţinut în amoniac mai mic de 1%;
b) 0,1%, în valoare absolută, pentru un conţinut în amoniac de 1% sau mai mare.
5.7. Observaţii
Dacă conţinutul în amoniac al eşantionului depăşeşte 0,6%, se diluează filtratul iniţial.
B. Prin distilare
5.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea conţinutului de baze azotate volatile, exprimate ca amoniac, a făinii din peşte care practic nu conţine deloc uree. Ea este aplicabilă doar în cazul unui conţinut în amoniac mai mic de 0,25%.
5.2. Principiul de aplicare
Eşantionul este supus extracţiei cu apă, iar soluţia este limpezită şi filtrată. Bazele azotate volatile sînt dislocate la punctul de fierbere prin adăugare de oxid de magneziu şi colectate într-o cantitate determinată de acid sulfuric, al cărui exces este retitrat cu o soluţie de hidroxid de sodiu.
5.3. Reactivi utilizaţi
5.3.1. Acid tricloracetic, soluţie 20% (greutate/volum).
5.3.2. Oxid de magneziu.
5.3.3. Emulsie antispumantă (de exemplu, silicon).
5.3.4. Acid sulfuric 0,05 mol/litru.
5.3.5. Soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru.
5.3.6. Soluţie de roşu de metil 0,3% în etanol 95-96% (v/v).
5.4. Dispozitive
5.4.1. Mixer (agitator): aproximativ 35-40 de rpm.
5.4.2. Aparat de distilat de tip Kjeldahl.
5.5. Procedura de preparare
Se cîntăresc 10 g de eşantion cu abatere de 1 mg şi se introduc împreună cu 100 ml de apă într-un balon gradat de 200 ml. Se amestecă sau se agită în agitator timp de 30 de minute. Se adaugă 50 ml de soluţie de acid tricloracetic, conform indicaţiilor de la subpunctul 5.3.1., se completează volumul cu apă, se agită cu putere şi se filtrează printr-un un filtru cutat.
Se prelevează o cantitate de filtrat limpede adecvată pentru conţinutul în baze azotate volatile presupus (100 ml este de obicei suficient). Se diluează la 200 ml şi se adaugă 2 g de oxid de magneziu, precum şi cîteva picături de emulsie antispumantă. Soluţia trebuie să fie alcalină la testul cu turnesol; dacă nu este, se adaugă oxid de magneziu. Se continuă ca la subpunctul 5.5.2. şi 5.5.3. al metodei de analiză pentru determinarea conţinutului de proteine brute, descrisă în capitolul III al prezentei anexe.
Se efectuează un test martor aplicînd aceeaşi procedură, dar fără a analiza un eşantion.
5.6. Calcularea rezultatelor
1 ml de H2SO4 0,05 mol/litru corespunde la 1,7 mg de amoniac.
Se exprimă rezultatul ca procent din eşantion.
Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele obţinute în două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu depăşeşte, în valoare relativă, 10% amoniac.
VI. DETERMINAREA AMINOACIZILOR (CU EXCEPŢIA TRIPTOFANULUI)
6.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea aminoacizilor liberi (sintetici şi naturali) şi totali (legaţi în peptide şi liberi) din nutreţuri, folosind un analizator de aminoacizi. Ea este aplicabilă următorilor aminoacizi: cist(e)ină, metionină, lizină, treonină, alanină, arginină, acid aspartic, acid glutamic, glicină, histidină, izoleucină, leucină, fenilalanină, prolină, serină, tirozină şi valină.
Metoda nu deosebeşte sărurile aminoacizilor şi nu permite diferenţierea între formele D şi L ale aminoacizilor. Ea nu este valabilă pentru determinarea triptofanului sau a analogilor hidroxilaţi ai aminoacizilor.
6.2. Principiul de aplicare
6.2.1. Aminoacizi liberi
Aminoacizii liberi se extrag cu acid clorhidric diluat. Macromoleculele azotate coextrase se precipită cu acid sulfosalicilic şi se îndepărtează prin filtrare. Soluţia filtrată se ajustează la pH-ul de 2,2. Aminoacizii se separă prin cromatografie cu schimb de ioni şi se determină prin reacţie cu ninhidrină cu detecţie fotometrică la 570 nm.
6.2.2. Aminoacizi totali
Procedura aleasă depinde de aminoacizii care sînt analizaţi. Cist(e)ina şi metionina trebuie oxidate la acid cisteic şi, respectiv, metionin sulfonă înainte de hidroliză. Tirozina trebuie determinată în hidrolizate de eşantioane neoxidate. Toţi ceilalţi aminoacizi enumeraţi la punctul 6.1. se pot determina fie în eşantionul oxidat, fie în eşantionul neoxidat.
Oxidarea se realizează la 0°C cu ajutorul unui amestec de acid performic şi fenol. Reactivul de oxidare în exces se descompune cu disulfit de sodiu. Eşantionul oxidat sau neoxidat se hidrolizează cu acid clorhidric, conform specificaţiilor de la subpunctul 6.3.20., timp de 23 de ore. Hidrolizatul se ajustează la pH-ul de 2,2. Aminoacizii se separă prin cromatografie cu schimb de ioni şi se determină prin reacţie cu ninhidrină folosind detecţia fotometrică la 570 nm (440 nm pentru prolină).
6.3. Reactivi utilizaţi
Trebuie utilizată apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 μS).
6.3.1. Peroxid de hidrogen, g (g/g) = 30%.
6.3.2. Acid formic, g (g/g) = 98-100%.
6.3.3. Fenol.
6.3.4. Disulfit de sodiu.
6.3.5. Hidroxid de sodiu.
6.3.6. Acid 5-sulfosalicilic dihidrat.
6.3.7. Acid clorhidric, cu densitate de aproximativ 1,18 g/ml.
6.3.8. Citrat trisodic dihidrat.
6.3.9. 2,2′-tiodietanol (tiodiglicol).
6.3.10. Clorură de sodiu.
6.3.11. Ninhidrină.
6.3.12. Eter de petrol, interval de fierbere 40-60°C.
6.3.13. Norleucină sau alt compus adecvat pentru a fi utilizat ca etalon intern.
6.3.14. Azot, gaz (< 10 ppm oxigen).
6.3.15. 1-octanol.
6.3.16. Aminoacizi.
6.3.16.1. Substanţe standard enumerate la punctul 6.1. Compuşi puri care nu conţin deloc apă de cristalizare. Înainte de utilizare, se usucă în vid cu ajutorul P2O5 sau al H2SO4, timp de 1 săptămînă.
6.3.16.2. Acid cisteic.
6.3.16.3. Metionin sulfonă.
6.3.17. Soluţie de hidroxid de sodiu, c = 7,5 mol/l.
Se dizolvă 300 g de NaOH în apă şi se completează pînă la 1 litru.
6.3.18. Soluţie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l
Se dizolvă 40 g de NaOH în apă şi se completează pînă la 1 litru.
6.3.19. Soluţie de acid formic-fenol:
Se amestecă 889 g de acid formic cu 111 g de apă şi se adaugă 4,73 g de fenol.
6.3.20. Mixtură de hidroliză, c = 6 mol HCl/l conţinînd 1 g de fenol/l:
Se adaugă 1 g de fenol la 492 ml de HCl şi se completează cu apă pînă la 1 litru.
6.3.21. Mixtură de extracţie, c = 0,1 mol HCl/l conţinînd 2% tiodiglicol: se iau 8,2 ml de HCl, se diluează cu aproximativ 900 ml de apă, se adaugă 20 ml de tiodiglicol şi se completează cu apă pînă la 1 litru (nu se amestecă direct acidul clorhidric şi tiodiglicolul).
6.3.22. Acid 5-sulfosalicilic dihidrat, β = 6%:
se dizolvă 60 g de acid 5-sulfosalicilic în apă şi se completează cu apă pînă la 1 litru.
6.3.23. Mixtură de oxidare (acid performic-fenol):
Se amestecă 0,5 ml de peroxid de hidrogen cu 4,5 ml soluţie de acid formic-fenol într-un mic pahar de laborator. Se incubează la 20-30°C timp de 1 oră pentru a se forma acid performic, apoi se răceşte în baie de apă cu gheaţă (15 minute) înainte de a se adăuga la eşantion.
Atenţie: a se evita contactul cu pielea şi a se purta îmbrăcăminte protectoare.
6.3.24. Soluţie tampon de citrat, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,2:
Se dizolvă 19,61 g de citrat de sodiu, 5 ml de tiodiglicol, 1 g de fenol şi 16,5 ml de HCl, cu densitate de aproximativ 1,18 g/ml în aproximativ 800 ml de apă. Se ajustează pH-ul la 2,2. Se completează cu apă pînă la 1 litru.
6.3.25. Soluţii tampon de eluţie, preparate în conformitate cu condiţiile pentru analizorul utilizat în subpunctul 6.4.9.
6.3.26. Reactiv ninhidrină, preparat în conformitate cu condiţiile pentru analizorul utilizat în subpunctul 6.4.9.
6.3.27. Soluţii etalon de aminoacizi. Aceste soluţii se păstrează la o temperatură sub 5°C.
6.3.27.1. Soluţie etalon stoc de aminoacizi, conform indicaţiilor de la subpunctul 6.3.16.1.
c = 2,5 μmol/ml pentru fiecare, în acid clorhidric.
Se pot obţine din surse comerciale.
6.3.27.2. Soluţie etalon stoc de acid cisteic şi metionin sulfonă, c = 1,25 μmol/ml.
Se dizolvă 0,2115 g de acid cisteic şi 0,2265 g de metionin sulfonă în soluţie tampon de citrat, conform specificaţiilor de la subpunctul 6.3.24., într-un balon gradat de 1 litru şi se completează pînă la semn cu soluţie tampon de citrat. Se păstrează la o temperatură sub 5°C, nu mai mult de 12 luni. Această soluţie nu se utilizează dacă soluţia etalon stoc conţine acid cisteic şi metionin sulfonă.
6.3.27.3. Soluţie etalon stoc de etalon intern, de exemplu, norleucină, c = 20 μmol/ml.
Se dizolvă 0,656 g de norleucină în soluţie tampon de citrat într-un balon gradat şi se completează cu soluţie tampon de citrat pînă la 250 ml. Se păstrează la o temperatură sub 5°C, nu mai mult de 6 luni.
6.3.27.4. Soluţie de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate, c = 5 nmol/50 μl de acid cisteic şi metionin sulfonă şi c = 10 nmol/50 μl din ceilalţi aminoacizi. Se dizolvă 2,2 g de clorură de sodiu într-un pahar de laborator de 100 ml care conţine 30 ml soluţie tampon de citrat. Se adaugă 4 ml de soluţie etalon stoc de aminoacizi, 4 ml soluţie etalon stoc de acid cisteic şi metionin sulfonă şi 0,5 ml soluţie etalon stoc de etalon intern, dacă este cazul. Se ajustează pH-ul la valoarea 2,2 cu hidroxid de sodiu.
Se transferă cantitativ într-un balon gradat de 50 ml, se completează pînă la semn cu soluţie tampon de citrat şi se amestecă.
Se păstrează la o temperatură sub 5°C, nu mai mult de 3 luni.
6.3.27.5. Soluţie de calibrare a aminoacizilor standard pentru utilizare cu hidrolizate preparată în conformitate cu subpunctul 6.5.3.3.1. şi pentru utilizare cu extracte, conform descrierilor de la subpunctul 6.5.2. Soluţia de calibrare se prepară în conformitate cu prevederile subpunctului 6.3.27.4. dar omiţînd clorura de sodiu.
Se păstrează la o temperatură sub 5°C, nu mai mult de 3 luni.
6.4. Dispozitive
6.4.1. Balon cu fund rotund de 100 sau 250 ml dotat cu un condensator cu reflux.
6.4.2. Sticlă din borosilicat, de 100 ml, cu un dop filetat cu căptuşeală de cauciuc/teflon pentru utilizare în cuptor.
6.4.3. Cuptor cu ventilaţie forţată şi un regulator de temperatură cu precizie mai mare de ± 2°C.
6.4.4. pH-metru (cu trei zecimale).
6.4.5. Filtru cu membrană (0,22 μm).
6.4.6. Centrifugă.
6.4.7. Evaporator rotativ cu vid.
6.4.8. Agitator mecanic sau magnetic.
6.4.9. Analizor de aminoacizi sau echipament HPLC cu coloană schimbătoare de ioni, dispozitiv pentru ninhidrină, derivare post-coloană şi detector fotometric.
Coloana este umplută cu răşini de polistiren sulfonat capabile să separe aminoacizii unul de altul, precum şi de materiale care conţin ninhidrină. Fluxul din liniile cu soluţie tampon şi ninhidrină este asigurat de pompe care au o stabilitate a fluxului de ± 0,5% în perioada care include atît funcţionarea în vederea calibrării standardului, cît şi analiza eşantionului.
În cazul unor analizori de aminoacizi se pot utiliza proceduri de hidrolizare în care hidrolizatul are o concentraţie de sodiu de c = 0,8 mol/l şi conţine întreaga cantitate de acid formic rezidual din etapa de oxidare.
Alţi analizori nu oferă o separare satisfăcătoare a anumitor aminoacizi dacă hidrolizatul conţine exces de acid formic şi/sau concentraţii mari de ioni de sodiu. În acest caz, volumul de acid se reduce prin evaporare la aproximativ 5 ml după hidroliză şi înainte de ajustarea pH-ului. Evaporarea se face sub vid, la o temperatură maximă de 40°C.
6.5. Procedura de preparare
6.5.1. Prepararea eşantionului
Se macină eşantionul astfel încît poate trece printr-o sită cu ochiuri de 0,5 mm. Eşantioanele cu un conţinut ridicat de umiditate trebuie fie uscate la aer, la o temperatură de maximum 50°C, fie liofilizate înainte de măcinare. Eşantioanele cu un conţinut ridicat de substanţe grase se extrag cu eter de petrol înainte de măcinare.
6.5.2. Determinarea aminoacizilor liberi în nutreţuri şi în premixuri
Se cîntăreşte cu o abatere de 0,2 mg o cantitate adecvată (1-5 g) din eşantionul preparat, conform prevederilor subpunctului 6.5.1., într-un flacon tip Erlenmeyer şi se adaugă 100 ml de extract de mixtură. Se agită mixtura timp de 60 minute cu ajutorul agitatorului mecanic sau magnetic. Se lasă să se decanteze sedimentul şi se pipetează 10 ml din soluţia supernatantă într-un pahar de laborator de 100 ml.
Se adaugă 5 ml de soluţie de acid sulfosalicilic în cursul agitării şi se continuă agitarea cu ajutorul agitatorului magnetic timp de 5 minute. Se filtrează sau se centrifughează supernatantul pentru a se îndepărta orice precipitat. Se introduc 10 ml din soluţia rezultată într-un pahar de laborator de 100 ml şi se ajustează pH-ul la valoarea de 2,2 cu ajutorul soluţiei de hidroxid de sodiu, se transferă într-un balon gradat de volum adecvat utilizîndu-se soluţie tampon de citrat şi se completează pînă la semn cu soluţia tampon.
Dacă se utilizează etalon intern, se adaugă 1 ml de etalon intern pentru fiecare 100 ml de soluţie finală şi se completează pînă la semn cu soluţie tampon.
Se trece la etapa de cromatografie conform prevederilor subpunctului 6.5.4.
Dacă extractele nu se examinează în aceeaşi zi, trebuie păstrate la o temperatură sub 5°C.
6.5.3. Determinarea conţinutului total în aminoacizi
6.5.3.1. Oxidare
Se cîntăresc cu o abatere de 0,2 mg între 0,1 şi 1 g de eşantion preparat, conform prevederilor subpunctului 6.5.1. într-un (într-o):
a) balon cu fund rotund de 100 ml, conform specificaţiilor de la subpunctul 6.4.1., pentru hidroliză în mediu deschis, potrivit descrierilor de la subpunctul 6.5.3.2.3.; sau
b) balon cu fund rotund de 250 ml, conform specificaţiilor de la subpunctul 1.4.1., dacă este necesară o concentraţie mică de sodiu, conform prevederilor subpunctului 6.5.3.3.1.; sau
c) sticlă de 100 ml dotată cu un dop filetat, potrivit prevederilor subpunctului 6.4.2. pentru hidroliză în mediu închis, conform descrierilor de la subpunctul 6.5.3.2.4.
Porţia de eşantion cîntărită are un conţinut de azot de aproximativ 10 mg şi un conţinut de umiditate de maximum 100 mg.
Se introduce balonul/sticla într-o baie de apă cu gheaţă şi se răceşte la 0°C, se adaugă 5 ml de mixtură de oxidare şi se amestecă cu ajutorul unei spatule de sticlă cu vîrf încovoiat. Se etanşeizează balonul/sticla conţinînd spatula cu ajutorul unei pelicule ermetizante, se introduce baia de apă cu gheaţă conţinînd recipientul etanşeizat într-un frigider la 0°C şi se lasă timp de 16 ore. După 16 ore, se scoate din frigider, iar excesul de reactiv de oxidare se descompune prin adăugarea a 0,84 g de disulfit de sodiu.
Se trece la procedura specificată în subpunctul 6.5.3.2.1.
6.5.3.2. Hidroliza
6.5.3.2.1. Hidroliza eşantioanelor oxidate
La eşantioanele oxidate preparate în conformitate cu subpunctul 6.5.3.1. se adaugă 25 ml de mixtură hidrolizată avînd grijă să se spele orice reziduu de eşantion de pe pereţii vasului şi de pe spatulă.
În funcţie de procedura de hidrolizare utilizată, se trece la metoda descrisă în subpunctul 6.5.3.2.3. sau 6.5.3.2.4.
6.5.3.2.2. Hidroliza eşantioanelor neoxidate
Se cîntăresc 0,1-1 g de eşantion preparat, cu o abatere de 0,2 mg, fie într-un balon cu fund rotund de 100 ml sau 250 ml, fie într-o sticlă de 100 ml dotată cu dop filetat. Porţia de eşantion cîntărit trebuie să aibă un conţinut de azot de aproximativ 10 mg. Se adaugă cu grijă 25 ml de mixtură hidrolizată şi se amestecă cu eşantionul. Se procedează conform descrierilor de la subpunctul 6.5.3.2.3. sau 6.5.3.2.4.
6.5.3.2.3. Hidroliza în mediu deschis
Se adaugă 3 mărgele de sticlă în mixtura din balon (preparată conform menţiunilor de la subpunctul 6.5.3.2.1. sau 6.5.3.2.2.) şi se fierbe în clocot continuu sub reflux timp de 23 de ore. La încheierea hidrolizei, se spală condensatorul cu 5 ml de soluţie tampon de citrat. Se deconectează balonul şi se răceşte într-o baie de apă cu gheaţă.
Se procedează conform prevederilor descrise în subpunctul 6.5.3.3.
6.5.3.2.4. Hidroliza în mediu închis
Sticla conţinînd mixtura preparată conform prevederilor subpunctului 6.5.3.2.1. sau 6.5.3.2.2. se introduce în cuptor, conform specificaţiilor de la subpunctul 6.4.3., la 110°C.
În timpul primei ore, pentru a se preveni o creştere progresivă a presiunii (datorată expansiunii substanţelor gazoase) şi pentru a se evita o explozie, se plasează dopul filetat la nivelul extremităţii superioare a vasului. A nu se închide vasul cu dopul respectiv. După o oră, se închide vasul cu dopul respectiv şi se lasă în cuptor, conform specificaţiilor de la subpunctul 6.4.3, timp de 23 de ore. La încheierea hidrolizei, se îndepărtează sticla din cuptor, se scoate cu grijă dopul de la nivelul sticlei, iar aceasta se introduce într-o baie de apă cu gheaţă. Se lasă să se răcească.
În funcţie de procedura de ajustare a pH-ului, se transferă cantitativ conţinutul sticlei într-un pahar de laborator de 250 de ml sau într-un balon cu fund rotund, utilizînd soluţie tampon de citrat.
Se procedează conform prevederilor descrise în subpunctul 6.5.3.3.
6.5.3.3. Ajustarea pH-ului
În funcţie de toleranţa la sodiu a analizorului de aminoacizi, pentru ajustarea pH-ului se procedează conform metodei descrise în subpunctul 6.5.3.3.1. sau 6.5.3.3.2.
6.5.3.3.1. Pentru sistemele cromatografice analizorul de aminoacizi necesitînd o concentraţie de sodiu mică
Este recomandabil să se utilizeze o soluţie etalon stoc internă în cazul în care se folosesc analizori de aminoacizi necesitînd o concentraţie mică de sodiu (în cazul în care volumul de acid trebuie redus).
În acest caz, la hidrolizat se adaugă 2 ml de soluţie etalon stoc internă înainte de evaporare.
La hidrolizatul obţinut conform prevederilor subpunctului 6.5.3.2.3. sau 6.5.2.3.4. se adaugă 2 picături de 1-octanol.
Utilizînd un evaporator rotativ se reduce volumul la 5-10 ml în condiţii de vid la 40°C. Dacă volumul este redus accidental la mai puţin de 5 ml, hidrolizatul trebuie aruncat, iar analiza trebuie repetată.
Se ajustează pH-ul la 2,2 cu ajutorul soluţiei de hidroxid de sodiu şi se procedează în conformitate cu descrierea de la subpunctul 6.5.3.4.
6.5.3.3.2. Pentru toţi ceilalţi analizori de aminoacizi
Hidrolizatele obţinute ca la subpunctul 6.5.3.2.3. sau 6.5.3.2.4. se neutralizează parţial prin adăugarea cu grijă, în condiţii de agitare continuă, a 17 ml de soluţie de hidroxid de sodiu, asigurîndu-se că temperatura este menţinută sub 40°C.
Se ajustează pH-ul la valoarea de 2,2 la temperatura camerei prin utilizarea soluţiei de hidroxid de sodiu, potrivit prevederilor subpunctului 6.3.17. şi în cele din urmă a soluţiei de hidroxid de sodiu, potrivit prevederilor subpunctului 6.3.18. Se trece la subpunctul 6.5.3.4.
6.5.3.4. Soluţia de eşantion pentru cromatografie
Se transferă cantitativ hidrolizatul cu pH ajustat, potrivit prevederilor subpunctului 6.5.3.3.1. sau 6.5.3.3.2., cu soluţie tampon de citrat într-un balon gradat de 200 ml şi se completează pînă la semn cu soluţie tampon.
Dacă nu s-a utilizat deja un etalon intern, se adaugă 2 ml de etalon intern şi se completează pînă la semn cu soluţie tampon de citrat. Se amestecă minuţios.
Se trece la etapa cromatografică, conform prevederilor descrise în subpunctul 6.5.4.
Dacă soluţiile de eşantion nu se examinează în aceeaşi zi, ele se păstrează la o temperatură sub 5°C.
6.5.4. Cromatografia
Înainte de cromatografie se aduce extractul, descris în subpunctul 6.5.2. sau hidrolizatul, specificat în subpunctul 6.5.3.4. la temperatura camerei. Se agită mixtura şi se filtrează o cantitate potrivită printr-un filtru cu membrană cu orificii de 0,22 μm. Soluţia limpede rezultată se supune cromatografiei prin schimb ionic, utilizînd un analizor de aminoacizi.
Injectarea poate fi efectuată manual sau automat. Este important ca aceeaşi cantitate de soluţie ± 0,5% să fie adăugată în coloană pentru analizarea etaloanelor şi a eşantioanelor cu excepţia situaţiilor în care se utilizează un etalon intern şi ca raporturile sodiu:aminoacizi în soluţiile de etalon şi în cele de eşantion să fie cît mai similare posibil.
În general, frecvenţa manevrelor de calibrare depinde de stabilitatea reactivului ninhidrină şi a sistemului analitic.
Etalonul sau eşantionul se diluează cu soluţie tampon de citrat pentru a genera o arie a vîrfului pentru etalon de 30-200% din aria vîrfului pentru eşantionul de aminoacid.
Cromatografia aminoacizilor va varia uşor în funcţie de tipul analizorului şi de răşina utilizate. Sistemul ales trebuie să fie capabil să separe aminoacizii unul de altul, precum şi de materiale care conţin ninhidrină. În cursul operaţiilor, sistemul cromatografic generează un răspuns linear la modificările cantităţilor de aminoacizi adăugaţi la coloană.
În cursul etapei cromatografice se aplică rapoartele înălţimii corespunzătoare punctului minim: vîrfului, menţionate în continuare, în cazul în care se analizează o soluţie echimolară (de aminoacizi analizaţi). Această soluţie echimolară trebuie să conţină cel puţin 30% din cantitatea maximă de aminoacizi care poate fi măsurată cu precizie cu ajutorul sistemului analizor de aminoacizi.
Pentru separarea treoninei-serinei, în cazul suprapunerii a doi aminoacizi, raportul punct minim/vîrf corespunzător aminoacidului situat mai jos pe cromatogramă nu trebuie să depăşească 2:10.
Dacă se determină doar cist(e)ina, metionina, treonina şi lizina, separarea insuficientă a vîrfurilor învecinate va influenţa în mod negativ determinarea.
Pentru toţi ceilalţi aminoacizi, separarea trebuie să fie mai bună de 1:10.
Sistemul trebuie să asigure că lizina se separă de “artefactele de lizină” şi de ornitină.
6.6. Calcularea rezultatelor
Aria vîrfului pentru eşantion şi etalon se măsoară pentru fiecare aminoacid în parte, iar cantitatea (X) se măsoară în g de aminoacid per kg de eşantion.
X = A × c × M × V/B × m × 1000,
Dacă se utilizează un etalon intern se multiplică cu: D/C
A = aria vîrfului, hidrolizat sau extract;
B = aria vîrfului, soluţia etalon de calibrare;
C = aria vîrfului, etalon intern în hidrolizat sau extract;
D = aria vîrfului, etalon intern, soluţia etalon de calibrare;
M = greutatea molară a aminoacidului determinat;
c = concentraţia de standard în μmol/ml;
m = greutatea eşantionului (g) (corectată pentru a obţine greutatea originală dacă produsul este uscat sau degresat);
V = total hidrolizat în ml, potrivit prevederilor specificate în subpunctul 6.5.3.4.
sau volumul de diluţie total calculat pentru extract, în ml, potrivit prevederilor specificate în subpunctul 6.6.1.
Cistina şi cisteina se determină amîndouă ca acid cisteic în hidrolizate de eşantion oxidat, dar se calculează ca cistină (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol) folosind M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol).
Metionina se determină ca metionin sulfonă în hidrolizate de eşantion oxidat, dar se calculează ca metionină folosind M pentru metionină: 149,21 g/mol.
Metionina liberă adăugată se determină după extracţie ca metionină, pentru calculare folosindu-se aceeaşi M.
6.6.1. Volumul total de diluţie al extractelor (F) pentru determinarea aminoacizilor liberi, potrivit prevederilor subpunctului 6.5.2., se calculează după cum urmează:
F = 100 ml × (10 ml + 5 ml)/10 ml × V/10,
unde:
V = volumul extractului final.
6.7. Observaţii
6.7.1. Din cauza diferenţelor dintre analizorii de aminoacizi, concentraţiile finale ale soluţiilor de calibrare pentru aminoacizii standard, menţionate în subpunctele 6.3.27.4. şi 6.3.27.5. şi pentru hidrolizat, descris în subpunctul 6.5.3.4., se consideră orientative.
Intervalul răspunsului liniar al aparatului trebuie verificat pentru toţi aminoacizii.
Soluţia etalon se diluează cu soluţie tampon de citrat pentru a genera arii de vîrf situate la mijlocul intervalului.
6.7.2. În cazul în care pentru analizarea hidrolizatelor se foloseşte aparatură de cromatografie lichidă de înaltă performanţă, condiţiile experimentale trebuie optimizate în conformitate cu recomandările producătorului.
6.7.3. Prin aplicarea metodei la nutreţurile care conţin peste 1% clorură (concentrat, nutreţuri minerale, nutreţuri suplimentare) poate apărea o subestimare a metioninei, ceea ce necesită un tratament special.
VII. DETERMINAREA TRIPTOFANULUI
7.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Metoda permite determinarea în nutreţuri a triptofanului total şi liber. Ea nu face distincţie între formele D şi L.
7.2. Principiul de aplicare
Pentru determinarea triptofanului total, eşantionul se hidrolizează în mediu bazic cu o soluţie de hidroxid de bariu saturată şi se încălzeşte la 110°C timp de 20 de ore. După hidroliză, se adaugă etalon intern.
Pentru determinarea triptofanului liber, eşantionul se extrage în mediu uşor acid în prezenţa etalonului intern.
Triptofanul şi etalonul intern din hidrolizat sau din extract se determină prin HPLC prin detectarea fluorescenţei.
7.3. Reactivi utilizaţi
7.3.1. Se utilizează apă dublu distilată sau apă de calitate echivalentă (conductivitate < 10 μS/cm).
7.3.2. Substanţă etalon: triptofan (puritate/conţinut ≥ 99%), uscat sub vid pe pentoxid fosforic.
7.3.3. Substanţă etalon intern: α-metil-triptofan (puritate/conţinut ≥ 99%), uscat sub vid pe pentoxid fosforic.
7.3.4. Hidroxid de bariu octahidratat (se evită expunerea excesivă la aer a Ba(OH)2 × 8 H2O pentru a se evita formarea de BaCO3, care ar putea perturba determinarea) (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.8.3.).
7.3.5. Hidroxid de sodiu.
7.3.6. Acid ortofosforic, g (g/g) = 85%.
7.3.7. Acid clorhidric, ρ20 1,19 g/ml.
7.3.8. Metanol, de calitate HPLC.
7.3.9. Eter de petrol, interval de fierbere 40-60°C.
7.3.10. Soluţie de hidroxid de sodiu, c = 1 mol/l:
Se dizolvă 40 g de NaOH în apă şi se completează pînă la 1 litru cu apă, conform descrierii de la subpunctul 7.3.1.
7.3.11. Acid clorhidric, c = 6 mol/l:
Se iau 492 ml HCl, menţionat în subpunctul 7.3.7. şi se completează pînă la 1 litru cu apă.
7.3.12. Acid clorhidric, c = 1 mol/l:
Se iau 82 ml HCl, menţionat în subpunctul 7.3.7. şi se completează pînă la 1 litru cu apă.
7.3.13. Acid clorhidric, c = 0,1 mol/l:
Se iau 8,2 ml HCl, menţionat în subpunctul 7.3.7. şi se completează pînă la 1 litru cu apă.
7.3.14. Acid ortofosforic, c = 0,5 mol/l:
Se iau 34 ml de acid ortofosforic, specificat în subpunctul 7.3.6. şi se completează pînă la 1 litru cu apă, conform descrierii de la subpunctul 7.3.1.
7.3.15. Soluţie concentrată de triptofan, menţionat în subpunctul 1.3.2., c = 2,50 μmol/ml:
Într-un balon gradat de 500 ml se dizolvă 0,2553 g de triptofan (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.3.2) în acid clorhidric, descris în subpunctul 7.3.13. şi se completează pînă la semn cu acid clorhidric (se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.13.). Se păstrează la – 18°C timp de maximum 4 săptămîni.
7.3.16. Soluţie de etalon intern concentrată, c = 2,50 μmol/ml:
Într-un balon gradat de 500 ml se dizolvă 0,2728 g de α-metil-triptofan (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.3) în acid clorhidric, descris în subpunctul 7.3.13. şi se completează pînă la semn cu acid clorhidric (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.13.). Se păstrează la – 18°C timp de maximum 4 săptămîni.
7.3.17. Soluţie etalon de calibrare pentru triptofan şi etalon intern:
Se iau 2 ml din soluţia concentrată de triptofan, descris în subpunctul 7.3.15., şi 2 ml din soluţia concentrată de etalon intern (α-metil-triptofan), indicat în subpunctul 1.3.16. Se diluează cu apă, conform descrierii de la subpunctul 7.3.1. şi metanol (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.8.) pînă se ajunge la un volum aproximativ egal şi la aproximativ aceeaşi concentraţie de metanol (10-30%) ca şi hidrolizatul final.
Această soluţie trebuie proaspăt preparată înainte de fiecare utilizare.
În timpul preparării se protejează de lumina solară directă.
7.3.18. Acid acetic.
7.3.19. 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol.
7.3.20. Etanolamină g (g/g) > 98%.
7.3.21. 1 g de soluţie de 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol în 100 ml de metanol.
7.3.22. Fază mobilă pentru HPLC: 3 g de acid acetic + 900 ml apă, conform descrierii de la subpunctul 1.3.1. + 50 ml soluţie (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.3.21.) de 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol în metanol (1 g/100 ml). Se ajustează pH-ul la valoarea 5 cu ajutorul etanolaminei, indicată în subpunctul 7.3.20. Se completează pînă la 1000 ml cu apă, conform descrierii de la subpunctul 7.3.1.
7.4. Dispozitive
7.4.1. Echipament de HPLC cu detector spectrofluorometric.
7.4.2. Coloană pentru cromatografie lichidă, 125 mm × 4 mm, C18, particule de 3 μm sau echivalent.
7.4.3. pH-metru.
7.4.4. Vas de polipropilenă, cu capacitate de 125 ml, cu gît larg şi dop filetat.
7.4.5. Filtru cu membrană, 0,45 μm.
7.4.6. Autoclavă, 110 (± 2)°C, 1,4 (± 0,1) bar.
7.4.7. Agitator mecanic sau amestecător magnetic.
7.4.8. Mixer Vortex.
7.5. Procedura de preparare
7.5.1. Prepararea eşantioanelor
Eşantionul se macină astfel încît acesta poate trece printr-o sită cu ochiuri de 0,5 mm. Înainte de măcinare, eşantioanele cu un conţinut ridicat de umiditate trebuie să fie uscate la aer la o temperatură de maximum 50°C, fie liofilizate.
Înainte de măcinare, eşantioanele cu un conţinut ridicat de substanţe grase se extrag cu eter de petrol, conform indicaţiilor de la subpunctul 7.3.9.
7.5.2. Determinarea triptofanului liber (extract)
Se cîntăreşte cu o abatere de 1 mg o cantitate adecvată (1-5 g) din eşantionul preparat, conform descrierii de la subpunctul 7.5.1., într-un flacon tip Erlenmeyer. Se adaugă 100 ml de acid clorhidric (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.13.) şi 5 ml din soluţia etalon intern concentrată. Se agită sau se amestecă timp de 60 minute cu ajutorul unui agitator mecanic sau al unui amestecător magnetic. Se lasă să se decanteze sedimentul şi se pipetează 10 ml din soluţia supernatantă într-un pahar de laborator. Se adaugă 5 ml de acid ortofosforic. Se ajustează pH-ul la valoarea 3 utilizînd hidroxid de sodiu. Se adaugă suficient metanol pentru a obţine o concentraţie de metanol în volumul final de 10-30%. Se transferă într-un balon gradat de volum corespunzător şi se diluează cu apă pînă la un volum necesar pentru cromatografie (aproximativ acelaşi volum ca şi soluţia etalon de calibrare, conform indicaţiilor de la subpunctul 7.3.17.).
Se filtrează cîteva ml de soluţie printr-un filtru cu membrană cu orificii de 0,45 μm înainte de a se injecta în coloana de HPLC. Se trece la etapa de cromatografie conform descrierilor de la subpunctul 7.5.4.
Soluţia etalon şi extractele se protejează de lumina solară directă. Dacă analizarea extractelor nu este posibilă în aceeaşi zi, ele pot fi depozitate la 5°C, cel mult 3 zile.
7.5.3. Determinarea triptofanului total (hidrolizat)
Se cîntăresc cu o abatere de 0,2 mg între 0,1 şi 1 g din eşantionul preparat, conform prevederilor subpunctului 7.5.1., într-un vas de polipropilenă (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.4.4.). Porţia de eşantion cîntărit are un conţinut de azot de aproximativ 10 mg. Se adaugă 8,4 g de hidroxid de bariu octahidrat şi 10 ml de apă. Se amestecă într-un mixer Vortex sau într-un amestecător magnetic. Magnetul învelit în teflon se lasă în amestec. Se spală pereţii vasului cu 4 ml de apă. Se pune dopul filetat şi se închide vasul neermetic. Se transferă într-o autoclavă (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.4.6.) cu apă clocotită şi se expun la vapori de apă timp de 30-60 minute. Se închide autoclava şi se autoclavează la 110 (± 2)°C timp de 20 de ore.
Înainte de a deschide autoclava se reduce temperatura la o valoare imediat sub 100°C. Pentru a se evita cristalizarea Ba(OH)2·8H2O, se adaugă la amestecul cald 30 ml apă la temperatura camerei. Se agită sau se amestecă uşor. Se adaugă 2 ml din soluţia concentrată de etalon intern (α-metil-triptofan), conform specificaţiilor de la subpunctul 7.3.16. Se răcesc vasele într-o baie de apă/gheaţă timp de 15 minute.
Apoi, se adaugă 5 ml de acid ortofosforic. Se menţine vasul în baia de răcire şi se neutralizează cu HCl (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.11.) amestecînd continuu, apoi se ajustează pH-ul la valoarea 3 utilizînd HCl, conform prevederilor subpunctului 7.3.12. Se adaugă suficient metanol pentru a obţine o concentraţie de metanol în volumul final de 10-30%. Se transferă într-un balon gradat de volum corespunzător şi se diluează cu apă pînă la volumul definit necesar pentru cromatografie (de exemplu 100 ml). Adăugarea de metanol nu provoacă precipitare.
Se filtrează cîţiva ml de soluţie printr-un filtru cu membrană cu orificii de 0,45 μm înainte de a se injecta în coloana HPLC. Se trece la etapa de cromatografie, conform prevederilor descrise în subpunctul 7.5.4.
Soluţia etalon şi hidrolizatele se protejează de lumina solară directă. Dacă analizarea hidrolizatelor nu este posibilă în aceeaşi zi, ele pot fi depozitate la 5°C, cel mult 3 zile.
7.5.4. Determinarea prin HPLC
Următoarele condiţii pentru eluţia izocratică sînt oferite în scop orientativ; se pot aplica alte condiţii cu condiţia ca acestea să determine rezultate echivalente (a se vedea, de asemenea, observaţiile de la subpunctele 7.8.1. şi 7.8.2.), conform indicaţiilor din tabelul nr.1.
|
Tabelul nr.1 Condiţiile pentru obţinerea eluţiei izocratice |
|
| Tehnica de măsurare | Valorile indicate |
| Coloana pentru cromatografie lichidă, conform specificaţiilor de la subpunctul 7.4.2. | 125 mm × 4 mm, C18, particule de 3 μm sau echivalent |
| Temperatura coloanei | temperatura camerei |
| Faza mobilă (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.22.) | 3 g acetic acid (7.3.18.) + 900 ml apă (7.3.1.) + 50 ml soluţie (7.3.21.) de 1,1,1-triclor-2-metil-2-propanol în metanol (1 g/100 ml).
Se ajustează pH-ul la valoarea 5 utilizînd etanolamină. Se completează pînă la 1000 ml cu apă, conform descrierii de la subpunctul 7.3.1 |
| Rata fluxului | 1 ml/minut |
| Timpul total de desfăşurare | aproximativ 34 min |
| Lungimea undei de detecţie | excitare: 280 nm, emisie: 356 nm |
| Volumul de injectare | 20 μl |
7.6. Calcularea rezultatelor
Se calculează cantitatea de triptofan (X), în g per 100 g de eşantion.
X = A × B × V1 × c × V2 × M/C × D × V3 × 10000 × m,
unde:
A = aria vîrfului etalonului intern, soluţia etalon de calibrare (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.17.);
B = suprafaţa vîrfului pentru triptofan, extract, conform prevederilor subpunctului 7.5.2. sau hidrolizat, conform prevederilor subpunctului 7.5.3.;
V1 = volumul în ml (2 ml) al soluţiei concentrate de triptofan adăugată la soluţia de calibrare (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.17.);
c = concentraţia în μmol/ml (= 2,50) a soluţiei concentrate de triptofan adăugată la soluţia de calibrare;
V2 = volumul în ml al soluţiei etalon intern concentrate adăugată la extract, conform prevederilor subpunctului 7.5.2. (= 5 ml) sau la hidrolizat, conform prevederilor subpunctului 7.5.3. (= 2 ml);
C = aria vîrfului etalonului intern, extract, conform prevederilor subpunctului 7.5.2 sau hidrolizat, conform prevederilor subpunctului 7.5.3.;
D = aria vîrfului pentru triptofan, soluţia etalon de calibrare (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.17.);
V3 = volumul în ml (= 2 ml) al soluţiei de etalon intern concentrate adăugată la soluţia etalon de calibrare (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.17.);
m = greutatea eşantionului în g (corectată pentru a obţine greutatea originală dacă produsul este uscat şi/sau degresat);
M = masa molară a triptofanului (= 204,23 g/mol).
7.7. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 10% din rezultatul cel mai mare.
7.8. Observaţii
7.8.1. Respectarea următoarelor condiţii speciale de cromatografie, conform prevederilor tabelului nr.2, poate conduce la o mai bună separare a triptofanului de α-metil-triptofan.
Eluţia izocratică este urmată de curăţarea coloanei prin gradient.
|
Tabelul nr.2 Condiţiile speciale pentru cromatografie |
|||
| Tehnica de măsurare | Valorile indicate | ||
| Coloana pentru cromatografie lichidă | 125 mm × 4 mm, C18, particule de 5 μm sau echivalent | ||
| Temperatura coloanei | 32°C | ||
| Faza mobilă | A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95 + 5 (V + V).
B: Metanol |
||
| Programul gradientului | 0 minute | 100% A | 0% B |
| 15 minute | 100% A | 0% B | |
| 17 minute | 60% A | 40% B | |
| 19 minute | 60% A | 40% B | |
| 21 minute | 100% A | 0% B | |
| 33 minute | 100% A | 0% B | |
| Rata fluxului | 1,2 ml/minut | ||
| Timpul total de desfăşurare | aproximativ 33 min | ||
7.8.2. Cromatografia variază în funcţie de tipul de HPLC şi de materialul utilizat la umplerea coloanei. Sistemul ales trebuie să fie capabil să stabilească o separare iniţială de referinţă între triptofan şi etalonul intern. În plus, este important ca produşii de degradare să fie bine separaţi de triptofan şi de etalonul intern. Se efectuează o operaţie de probă pe hidrolizate fără etalon intern pentru a verifica prezenţa impurităţilor la nivelul liniei de bază corespunzătoare etalonului intern. Este important ca durata eluţiei pentru toţi produşii de degradare să fie suficient de lungă, altfel prezenţa unor vîrfuri de eluţie întîrziate poate interfera cu operaţiile ulterioare de cromatografie.
În cursul operaţiilor, sistemul cromatografic oferă un răspuns linear. Acest răspuns linear se măsoară în condiţii de concentraţie constantă (normală) a etalonului intern şi de concentraţii variabile a triptofanului. Este important că înălţimea vîrfurilor pentru triptofan şi pentru etalonul intern să se situeze în gama lineară a sistemului HPLC/fluorescenţă. Dacă vîrfurile pentru triptofan şi/sau pentru etalonul intern sînt prea joase sau prea înalte, analiza se repetă cu un eşantion de o altă dimensiune şi/sau un volum final modificat.
7.8.3. Hidroxid de bariu
Cu timpul, hidroxidul de bariu devine mai dificil de dizolvat. Aceasta generează o soluţie lipsită de limpezime pentru determinarea HPLC, ceea ce poate conduce la rezultate slabe pentru triptofan.
VIII. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE ULEIURI ŞI GRĂSIMI BRUTE
8.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă este destinată determinării în nutreţuri a conţinutului de uleiuri şi grăsimi brute. Ea nu este aplicabilă analizării seminţelor şi fructelor oleaginoase.
Utilizarea procedurilor descrise în subpunctele 8.1.1. şi 8.1.2. depinde de natura şi compoziţia nutreţului şi de motivul efectuării analizei.
8.1.1. Procedura A – Uleiuri şi grăsimi brute care pot fi extrase direct
Această metodă este aplicabilă materiilor prime pentru nutreţuri de origine vegetală, cu excepţia celor descrise în subpunctul 8.1.2.
8.1.2. Procedura B – Uleiuri şi grăsimi brute totale
Această metodă este aplicabilă materiilor prime pentru nutreţuri de origine animală şi tuturor nutreţurilor combinate. Ea trebuie folosită pentru toate materiile din care uleiurile şi grăsimile nu pot fi extrase complet fără hidroliză prealabilă (de exemplu, gluten, drojdie, proteine din cartofi şi produse supuse unor procese cum ar fi extrudarea, transformarea în fulgi şi încălzirea).
8.1.3. Interpretarea rezultatelor
În toate cazurile în care se obţine un rezultat superior folosind procedura menţionată în subpunctul 8.1.2. comparativ cu cel obţinut prin folosirea procedurii indicate în subpunctul 8.1.1., rezultatul obţinut prin procedura descrisă în subpunctul 8.1.2. se acceptă ca valoarea reală.
8.2. Principiul de aplicare
8.2.1. Procedura A
Eşantionul se extrage cu eter de petrol. Solventul se îndepărtează prin distilare, iar reziduul se usucă şi se cîntăreşte.
8.2.2. Procedura B
Eşantionul se tratează la cald cu acid clorhidric. Amestecul se răceşte şi se filtrează. Reziduul se spală şi se usucă, apoi se supune determinării în conformitate cu procedura A.
8.3. Reactivi utilizaţi
8.3.1. Eter de petrol, interval de fierbere: 40-60°C. Indicele de brom trebuie să fie mai mic de 1, iar reziduul după evaporare sub 2 mg/100 ml.
8.3.2. Sulfat de sodiu, anhidru.
8.3.3. Acid clorhidric, c = 3 mol/l.
8.3.4. Agent de filtrare, de exemplu Kieselguhr, Hyflo-supercel.
8.4. Dispozitive
8.4.1. Aparat de extracţie. Dacă este dotat cu un sifon (aparat Soxhlet), rata refluxului este astfel încît să producă aproximativ 10 cicluri pe oră; dacă aparatul este de tip fără sifon, rata refluxului este de aproximativ 10 ml pe minut.
8.4.2. Cartuşe de extracţie, lipsite de materie solubilă în eter de petrol şi cu o porozitate compatibilă cu cerinţele menţionate la subpunctul 8.4.1.
8.4.3. Cuptor de uscare, fie cu vid reglat la 75 ± 3°C, fie cu aer reglat la 100 ± 3°C.
8.5. Procedura de aplicare
8.5.1. Procedura A (a se vedea specificaţia de la subpunctul 8.8.1.)
Se cîntăresc 5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg, se transferă într-un cartuş de extracţie şi se acoperă cu un tampon de vată lipsit de grăsimi.
Cartuşul se introduce într-un extractor şi se extrage timp de şase ore cu eter de petrol. Se colectează extractul de eter de petrol într-un vas uscat şi cîntărit, care conţine fragmente de piatră ponce.
În cazul în care uleiurile sau grăsimile trebuie supuse unor teste de calitate ulterioare, fragmentele de piatră ponce se înlocuiesc cu mărgele de sticlă.
Solventul se îndepărtează prin distilare. Se usucă reziduul, păstrînd vasul timp de o oră şi jumătate în cuptorul de uscare. Se lasă să se răcească într-un desicator şi se cîntăreşte. Se usucă din nou timp de 30 minute pentru a asigura că greutatea uleiurilor şi grăsimilor rămîne constantă (pierderea de greutate între două cîntăriri succesive trebuie să fie mai mică sau egală cu 1 mg).
8.5.2. Procedura B
Se cîntăresc 2,5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg (a se vedea menţiunea de la subpunctul 8.8.2.), se introduc într-un pahar de laborator de 400 ml sau într-un flacon tip Erlenmeyer de 300 ml şi se adaugă 100 ml de acid clorhidric şi fragmente de piatră ponce. Se acoperă paharul de laborator cu o sticlă de ceas sau se conectează un condensator cu reflux la flaconul tip Erlenmeyer. Se aduce amestecul la fierbere uşoară deasupra unei flăcări mici sau pe o plită şi se păstrează în această stare timp de o oră. Trebuie să se împiedice lipirea produsului de părţile laterale ale recipientului.
Se răceşte şi se adaugă o cantitate de adjuvant de filtrare suficientă pentru a evita orice pierdere de ulei şi grăsime în timpul filtrării. Se filtrează printr-un filtru de hîrtie dublă, umezită şi lipsită de grăsimi. Se spală reziduul în apă rece pînă se obţine un filtrat neutru. Se verifică filtratul ca să nu conţină deloc uleiuri şi grăsimi.
Prezenţa acestora indică faptul că eşantionul trebuie extras cu eter de petrol, folosind procedura A, înainte de hidroliză.
Se aşează filtrul de hîrtie dublă care conţine reziduul pe o sticlă de ceas şi se usucă timp de o oră şi jumătate în cuptorul cu aer la 100 ± 3°C.
Se aşează filtrul de hîrtie dublă care conţine reziduul uscat într-un cartuş de extracţie şi se acoperă cu un tampon de vată lipsit de grăsimi. Cartuşul se introduce într-un extractor şi se procedează astfel cum se menţionează în subpunctul 8.5.1.
8.6. Exprimarea rezultatului
Greutatea reziduului se exprimă ca procent din eşantion.
8.7. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion de acelaşi laborant nu depăşesc:
a) 0,2% în valoare absolută, pentru un conţinut în uleiuri şi grăsimi brute mai mic de 5%;
b) 4% relativ la rezultatul cel mai mare pentru un conţinut cuprins între 5 şi 10%;
c) 0,4% în valoare absolută, pentru un conţinut mai mare de 10%.
8.8. Observaţii
8.8.1. Pentru produse cu un conţinut mare de uleiuri şi grăsimi, care sînt dificil de măcinat sau care sînt improprii prelevării unui eşantion de testare redus omogen, se procedează după cum urmează.
Se cîntăresc 20 g de eşantion cu o abatere de 1 mg şi se amestecă cu o cantitate de 10 g sau mai mare de sulfat de sodiu anhidru. Se extrage cu eter de petrol astfel cum se indică în subpunctul 8.5.1. Se completează extractul obţinut pînă la 500 ml cu eter de petrol şi se amestecă. Se iau 50 ml de soluţie şi se introduc într-un vas mic, uscat şi cîntărit, care conţine fragmente de piatră ponce. Se elimină solventul prin distilare, se usucă şi se procedează astfel cum se indică în subpunctul 8.5.1.
Se elimină solventul din reziduul de extracţie rămas în cartuş, se macină reziduul pînă la o fineţe de 1 mm, se reintroduce în cartuşul de extracţie (nu se adaugă sulfat de sodiu) şi se procedează astfel cum se menţionează în subpunctul 8.5.1.
Conţinutul de uleiuri şi grăsimi se calculează ca procent din eşantion folosind următoarea formulă:
(10 m1 + m2) × 5,
unde:
m1 = greutatea în grame a reziduului după prima extracţie (parte alicotă din extract);
m2 = greutatea în grame a reziduului după a doua extracţie.
8.8.2. Pentru produsele cu conţinut mic de uleiuri şi grăsimi, masa eşantionului de testat se poate mări la 5 g.
8.8.3. Este posibil ca, înainte de hidroliză şi extracţie, hrana pentru animalele de companie cu conţinut mare de apă să fie amestecată cu sulfat de sodiu anhidru, conform procedurii B, descrise în subpunctul 8.5.2.
8.8.4. La subpunctul 8.5.2., poate fi mai eficientă folosirea apei calde în locul apei reci pentru spălarea reziduului după filtrare.
8.8.5. Este posibil ca timpul de uscare de 1,5 h să necesite a fi prelungit pentru unele nutreţuri. Uscarea excesivă se evită, întrucît acest fapt poate determina rezultate slabe. Se poate folosi, de asemenea, un cuptor cu microunde.
8.8.6. Preextracţia prin procedura A, descrisă în subpunctul 8.5.1. înainte de hidroliză şi de reextracţie prin procedura B, indicată în subpunctul 8.5.2., se recomandă, în cazul în care conţinutul de uleiuri/grăsimi brute este mai mare de 15%. Într-o anumită măsură, acest fapt depinde de natura nutreţului şi de natura uleiurilor/grăsimilor din nutreţ.
IX. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE FIBRE BRUTE
9.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea în nutreţuri a substanţelor organice lipsite de grăsimi care sînt insolubile în mediu acid şi alcalin şi care sînt descrise în mod convenţional ca fibre brute.
9.2. Principiul de aplicare
Eşantionul, degresat, se tratează succesiv cu soluţii de acid sulfuric şi hidroxid de potasiu, de concentraţii specifice, în stare de fierbere. Reziduul se separă prin filtrare printr-un filtru de sticlă sinterizată spălat, uscat, cîntărit şi calcinat la o temperatură cuprinsă între 475 şi 500°C. Pierderea de greutate rezultată prin calcinare corespunde fibrelor brute din eşantionul testat.
9.3. Reactivi utilizaţi
9.3.1. Acid sulfuric, c = 0,13 mol/l.
9.3.2. Agent antispumant (de exemplu n-octanol).
9.3.3. Agent de filtrare (Celite 545 sau echivalent), încălzit la 500°C timp de patru ore, conform descrierilor de la subpunctul 9.8.6.
9.3.4. Acetonă.
9.3.5. Eter de petrol cu interval de fierbere între 40 şi 60°C.
9.3.6. Acid clorhidric, c = 0,5 mol/l.
9.3.7. Soluţie de hidroxid de potasiu, c = 0,23 mol/l.
9.4. Dispozitive
9.4.1. Unitate de încălzire pentru dizolvare cu acid sulfuric şi soluţie de hidroxid de potasiu, echipată cu un suport pentru creuzetul filtrant (a se vedea menţiunea de la subpunctul 9.4.2.) şi dotată cu un tub de evacuare prevăzut cu un dop la orificiul de ieşire pentru lichide şi de creare de vid, posibil şi cu aer comprimat. Înainte de fiecare utilizare zilnică, unitatea se preîncălzeşte cu apă aflată în stare de fierbere, timp de 5 minute.
9.4.2. Creuzet filtrant de sticlă cu placă filtrantă de sticlă sinterizată fuzionată, cu pori de 40-90 μm. Înainte de prima utilizare se încălzeşte la 500°C timp de cîteva minute, iar apoi se răceşte, conform indicaţiilor de la subpunctul 9.8.6.
9.4.3. Cilindru de cel puţin 270 ml cu condensator cu reflux, care poate fi supus fierberii.
9.4.4. Cuptor de uscare, cu termostat
9.4.5. Cuptor cu muflă, cu termostat
9.4.6. Unitate de extracţie compusă dintr-o placă de sprijin pentru creuzetul filtrant, conform descrierii de la subpunctul 9.4.2. şi cu o ţeavă de evacuare prevăzută cu un dop la orificiul de creare de vid şi de ieşire a lichidelor.
9.4.7. Inele de conectare utilizate pentru a asambla unitatea de încălzire, creuzetul şi cilindrul, precum şi pentru a conecta unitatea de extracţie la rece cu creuzetul.
9.5. Procedura de preparare
Se cîntăreşte 1 g de eşantion preparat cu o abatere de 1 mg şi se introduce în creuzet, (a se vedea observaţiile indicate în subpunctele 9.8.1., 9.8.2. şi 9.8.3.) şi se adaugă 1 g de adjuvant de filtrare.
Se asamblează unitatea de încălzire şi creuzetul filtrant, apoi se ataşează cilindrul la creuzet. Se toarnă 150 ml de acid sulfuric aflat în stare de fierbere în ansamblul cilindru-creuzet şi, dacă este necesar, se adaugă cîteva picături de agent antispumant.
Se aduce lichidul la fierbere în decurs de 5 ± 2 minute şi se fierbe viguros exact 30 de minute.
Se deschide dopul ţevii de evacuare, indicat în subpunctul 9.4.1., şi, în condiţii de vid, se filtrează acidul sulfuric prin creuzetul filtrant, apoi se spală reziduul cu trei porţii consecutive de 30 ml de apă aflată în stare de fierbere, asigurîndu-se că reziduul se filtrează uscat după fiecare spălare.
Se închide dopul orificiului de evacuare şi se toarnă 150 ml de soluţie de hidroxid de potasiu aflată în stare de fierbere în ansamblul cilindru-creuzet, apoi se adaugă cîteva picături de agent antispumant. Se aduce lichidul la punctul de fierbere în decurs de 5 ± 2 minute şi se fierbe viguros exact 30 de minute. Se filtrează şi se repetă procedura de spălare utilizată în etapa cu acid sulfuric.
După spălarea şi uscarea finală, se deconectează creuzetul împreună cu conţinutul său şi se reconectează la unitatea de extracţie la rece. Se creează vidul, iar reziduul se spală în creuzet cu trei porţii consecutive de acetonă de 25 ml, asigurîndu-se că reziduul se filtrează în starea uscată după fiecare spălare.
Creuzetul se usucă în cuptor la 130°C pînă se ajunge la o greutate constantă. După fiecare uscare, se răceşte în desicator şi se cîntăreşte rapid. Se introduce creuzetul într-un cuptor cu muflă şi se calcinează pînă se atinge o greutate constantă (pierderea de greutate între două cîntăriri succesive trebuie să fie mai mică sau egală cu 2 mg) la o temperatură cuprinsă între 475°C şi 500°C timp de cel puţin 30 de minute.
După fiecare încălzire, înainte de cîntărire se răceşte mai întîi în cuptor, iar apoi în desicator.
Se efectuează un test martor fără eşantion. Pierderea de greutate rezultată din calcinare nu trebui să depăşească 4 mg.
9.6. Calcularea rezultatelor
Conţinutul de fibre brute exprimat ca procent din eşantion este dat de formula:
X = (m0 - m1) × 100/m,
unde:
m = greutatea eşantionului în g;
m0 = pierderea de greutate după calcinare în cursul determinării, în g;
m1 = pierderea de greutate după calcinare în cursul testului martor, în g.
9.7. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească:
a) 0,6% în valoare absolută pentru un conţinut de fibre brute mai mic de 10%;
b) 6% relativ la rezultatul mai mare, pentru un conţinut de fibre brute egal sau mai mare de 10%.
9.8. Observaţii
9.8.1. Nutreţurile care au conţinut de grăsimi brute mai mare de 10% trebuie să fie degresate înainte de a fi supuse analizei cu eter de petrol. Creuzetul filtrant (a se vedea menţiunea de la subpunctul 9.4.2.) împreună cu conţinutul său se conectează la unitatea de extracţie la rece, conform prevederilor subpunctului 9.4.6. şi se creează vidul, apoi se spală reziduul cu trei porţii consecutive de eter de petrol de 30 ml, asigurîndu-se că reziduul este uscat. Creuzetul împreună cu conţinutul său se conectează la unitatea de încălzire şi se continuă astfel cum se descrie la punctul 9.5.
9.8.2. Nutreţurile care conţin grăsimi care nu pot fi extrase direct cu eter de petrol trebuie degresate astfel cum se indică la subpunctul 9.8.1. şi degresate încă o dată după fierbere cu acid. După fierbere cu acid şi spălare consecutivă, creuzetul împreună cu conţinutul său se conectează la unitatea de extracţie la rece, apoi se spală de trei ori cu 30 ml acetonă, urmat de trei spălări suplimentare cu porţii de eter de petrol de 30 ml. Se filtrează sub vid pînă la uscare, iar analizarea se continuă astfel cum se descrie la punctul 9.5., începînd cu tratamentul cu hidroxid de potasiu.
9.8.3. Dacă nutreţul conţine mai mult de 5% carbonaţi, exprimaţi ca şi carbonat de calciu, se conectează creuzetul împreună cu eşantionul cîntărit la unitatea de încălzire. Eşantionul se spală de trei ori cu 30 ml acid clorhidric. După fiecare adăugare, se lasă eşantionul să stea timp de aproximativ 1 minut înainte de filtrare.
Se spală o singură dată cu 30 ml apă, iar apoi se continuă astfel cum se descrie la punctul 9.5.
9.8.4. Dacă se utilizează aparatură în formă de stativ (o serie de creuzete ataşate la aceeaşi unitate de încălzire) nu se efectuează două determinări individuale pe acelaşi eşantion de analizat în aceeaşi serie.
9.8.5. Dacă după fierbere este dificil să se filtreze soluţiile acide şi alcaline, se utilizează aer comprimat introdus prin ţeava de evacuare a unităţii de încălzire şi apoi se continuă filtrarea.
9.8.6. Temperatura de calcinare nu depăşeşte 500°C pentru a se putea prelungi timpul de utilizare a sticlei creuzetului filtrant. Trebuie acordată atenţie pentru a se evita şocurile termice excesive în cursul ciclurilor de încălzire şi răcire.
X. DETERMINAREA ZAHARURILOR
10.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea cantităţii de zaharuri reductoare şi a zaharurilor totale după inversie, exprimate ca glucoză sau, acolo unde este cazul, ca zaharoză, prin conversie cu factorul 0,95. Ea este aplicabilă nutreţurilor combinate. Pentru alte tipuri de nutreţuri există metode specifice. Dacă este necesar, lactoza se determină separat, ţinîndu-se cont de aceasta la calcularea rezultatelor.
10.2. Principiul de aplicare
Zaharurile se extrag în etanol diluat; soluţia se limpezeşte cu soluţii Carrez I şi II. După eliminarea etanolului, cantităţile pre- şi postinversie se determină prin metoda Luff-Schoorl.
10.3. Reactivi utilizaţi
10.3.1. Soluţie de etanol cu concentraţie de 40% (v/v): 0,948 g/ml la 20°C, neutralizată cu fenolftaleină.
10.3.2. Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH3COO)2 × 2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă pînă la 100 ml.
10.3.3. Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu, K4Fe(CN)6 × 3H2O în apă. Se completează cu apă pînă la 100 ml.
10.3.4. Metiloranj, soluţie 0,1% (greutate/volum).
10.3.5. Acid clorhidric 4 mol/litru.
10.3.6. Acid clorhidric 0,1 mol/litru.
10.3.7. Soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru.
10.3.8. Reactiv Luff-Schoorl:
Amestecînd cu grijă, se toarnă soluţia de acid citric (a se vedea menţiunea de la subpunctul 10.3.8.2.) în soluţia de carbonat de sodiu, descrisă la subpunctul 10.3.8.3. Se adaugă soluţia de sulfat de cupru, conform descrierilor de la subpunctul 10.3.8.1., şi se completează pînă la 1 litru cu apă. Se lasă la decantare peste noapte şi se filtrează.
Se verifică concentraţia reactivului obţinut (Cu 0,05 mol/litru; Na2CO3 1 mol/litru) × ph-ul soluţiei este aproximativ 9,4.
10.3.8.1. Soluţie de sulfat de cupru: se dizolvă 25 g de sulfat de cupru, CuSO4 × 5 H2O, lipsită de fier, în 100 ml de apă.
10.3.8.2. Soluţia de acid citric: se dizolvă 50 g de acid citric (C6H8O7 × H2O) în 50 ml de apă.
10.3.8.3. Soluţie de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,8 g de carbonat de sodiu anhidru în aproximativ 300 ml de apă caldă. Se lasă să se răcească.
10.3.9. Soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru.
10.3.10. Soluţie de amidon: se adaugă un amestec de 5 g de amidon solubil cu 30 ml de apă la un litru de apă în stare de fierbere. Se fierbe timp de 3 minute, se lasă să se răcească şi, dacă este necesar, se adaugă 10 mg de iodură de mercur ca agent de conservare.
10.3.11. Acid sulfuric 3 mol/litru.
10.3.12. Iodură de potasiu, soluţie 30% (greutate/volum).
10.3.13. Granule de piatră ponce fierte în acid clorhidric, spălate în apă şi uscate.
10.3.14. 3-metilbutan-l-ol.
10.4. Dispozitiv
Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.
10.5. Procedura de preparare
10.5.1. Extracţia eşantionului
Se cîntăresc 2,5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg şi se introduc într-un balon gradat de 250 ml. Se adaugă 200 ml etanol şi se amestecă timp de o oră în agitator. Se adaugă 5 ml de soluţie Carrez I şi se amestecă timp de aproximativ 30 de secunde. Se adaugă aproximativ 5 ml de soluţie Carrez II şi se amestecă din nou timp de un minut. Se completează pînă la volum cu etanolul, se omogenizează şi se filtrează. Se îndepărtează 200 ml de filtrat şi se evaporă pînă la aproximativ jumătate din volum în scopul eliminării majorităţii etanolului. Reziduul rămas după evaporare se transferă cantitativ într-un balon gradat de 200 ml cu ajutorul apei calde, se răceşte, se completează pînă la volum cu apă, se omogenizează şi, dacă este necesar, se filtrează. Această soluţie se va utiliza pentru determinarea cantităţii zaharurilor reductoare şi, după inversie, a zaharurilor totale.
10.5.2. Determinarea zaharurilor reductoare
Cu ajutorul unei pipete se îndepărtează maximum 25 ml din soluţia care conţine mai puţin de 60 mg de zaharuri reductoare exprimate ca glucoză. Dacă este necesar, se completează pînă la 25 ml cu apă distilată şi se determină conţinutul în zaharuri reductoare prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul se exprimă sub formă de conţinut procentual de glucoză în eşantion.
10.5.3. Determinarea zaharurilor totale după inversie
Cu ajutorul unei pipete se recoltează 50 ml de soluţie şi se transferă într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă cîteva picături de soluţie de metiloranj, apoi, amestecînd continuu, se adaugă cu grijă acid clorhidric (a se vedea menţiunea de la subpunctul 10.3.5.) pînă cînd lichidul virează într-un roşu bine definit. Se adaugă 15 ml de acid clorhidric (a se vedea menţiunea de la subpunctul 10.3.6.), se scufundă balonul într-o baie de apă clocotindă şi se menţine acolo timp de 30 de minute. Se răceşte rapid la aproximativ 20°C şi se adaugă 15 ml de soluţie de hidroxid de sodiu. Se completează cu apă pînă la 100 ml şi se omogenizează. Se îndepărtează maximum 25 ml din soluţia care conţine mai puţin de 60 mg de zaharuri reductoare exprimate ca glucoză. Dacă este necesar, se completează pînă la 25 ml cu apă distilată şi se determină conţinutul în zaharuri reductoare prin metoda Luff-Schoorl. Rezultatul se exprimă în procente de glucoză sau, dacă este cazul, de zaharoză, prin multiplicare cu factorul 0,95.
10.5.4. Titrare prin metoda Luff-Schoorl
Cu ajutorul unei pipete se recoltează 25 ml de reactiv Luff-Schoorl şi se transferă într-un flacon Erlenmeyer de 300 ml; se adaugă exact 25 ml din soluţia de zaharuri limpezită. Se adaugă 2 granule de piatră ponce, se încălzeşte, amestecînd manual, deasupra unei flăcări libere cu înălţime medie, aducîndu-se lichidul la fierbere în aproximativ 2 minute. Flaconul Erlenmeyer se aşază imediat pe o plasă de sîrmă acoperită cu azbest avînd un orificiu cu diametru de aproximativ 6 cm sub care există o flacără aprinsă. Flacăra se reglează astfel încît să se încălzească doar baza flaconului Erlenmeyer. La flaconul Erlenmeyer se montează un condensator cu reflux. Se fierbe exact zece minute. Se răceşte imediat în apă rece şi, după aproximativ 5 minute, se titrează după cum urmează:
Se adaugă 10 ml de soluţie de iodură de potasiu şi, imediat după aceea (cu grijă, din cauza riscului formării unei spume abundente), se adaugă 25 ml de acid sulfuric. Se titrează în continuare cu soluţie de tiosulfat de sodiu pînă la apariţia unei coloraturi galben şters, adăugînd ca indicator soluţia de amidon şi încheind titrarea.
Se efectuează aceeaşi titrare pe un amestec de 25 ml de reactiv Luff-Schoorl cu 25 ml de apă, măsurat cu precizie, după ce s-au adăugat 10 ml de soluţie de iodură de potasiu şi 25 ml de acid sulfuric, fără a se fierbe.
10.6. Calcularea rezultatelor
Utilizînd datele indicate în tabelul nr.3 se stabileşte cantitatea de glucoză în mg care corespunde diferenţei dintre valorile celor două titrări, exprimate în mg de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru. Rezultatele se exprimă ca procent din eşantion.
10.7. Proceduri speciale
10.7.1. În cazul nutreţurilor bogate în melase şi al altor nutreţuri care nu sînt în mod particular omogene, se cîntăresc 20 g şi se introduc, împreună cu 500 ml de apă, într-un balon gradat de 1 litru. Se amestecă timp de o oră în agitator. Se limpezeşte cu ajutorul reactivilor Carrez I şi II astfel cum se descrie în subpunctul 10.5.1, utilizînd, de data aceasta, o cantitate de patru ori mai mare din fiecare reactiv. Se completează pînă la volum cu etanol 80% (v/v).
Se omogenizează şi se filtrează. Se elimină etanolul astfel cum se descrie în subpunctul 10.5.1. În absenţa amidonului dextrinizat, se completează pînă la volum cu apă distilată.
10.7.2. În cazul melaselor şi al materiilor prime pentru nutreţuri bogate în zaharuri şi aproximativ lipsite de amidon (roşcove, fulgi de rădăcină de sfeclă uscaţi etc.), se cîntăresc 5 g, se introduc într-un balon gradat de 250 ml, se adaugă 200 ml apă distilată şi se amestecă în agitator timp de o oră sau, dacă este necesar, mai mult. Se limpezeşte cu ajutorul reactivilor Carrez I şi II astfel cum se descrie în subpunctul 10.5.1. Se completează pînă la volum cu apă rece, se omogenizează şi se filtrează. Pentru determinarea cantităţii totale de zaharuri, se continuă astfel cum se descrie în subpunctul 10.5.3.
10.8. Observaţii
10.8.1. În scopul prevenirii formării de spumă este recomandabil să se adauge (indiferent de volum) aproximativ 1 ml de 3-metilbutan-l-ol înainte de fierbere cu reactiv Luff-Schoorl.
10.8.2. Diferenţa dintre conţinutul total de zaharuri după inversie exprimat ca glucoză şi conţinutul de zaharuri reductoare exprimat ca glucoză, multiplicată cu 0,95, reprezintă conţinutul procentual de zaharoză.
10.8.3. Pentru a determina conţinutul de zaharuri reductoare, cu excepţia lactozei, se pot adopta două metode:
10.8.3.1. Pentru un calcul aproximativ, conţinutul de lactoză stabilit printr-o metodă de analiză diferită se multiplică cu 0,675, iar rezultatul obţinut se scade din conţinutul de zaharuri reductoare.
10.8.3.2. Pentru un calcul precis al zaharurilor reductoare, cu excepţia lactozei, se utilizează acelaşi eşantion în cele două determinări finale. Una dintre analize se efectuează pe o parte din soluţia obţinută în conformitate prevederile subpunctului 10.5.1, alta pe o parte din soluţia obţinută în cursul determinării lactozei prin metoda stabilită în acest sens (după fermentarea celorlalte tipuri de zaharuri şi limpezire).
În ambele cazuri, cantitatea de zaharuri prezentă se determină prin metoda Luff-Schoorl şi se calculează în mg de glucoză. Una dintre valori se scade din cealaltă, iar diferenţa se exprimă ca procent din eşantion.
|
Tabelul nr.3 Tabel de valori pentru 25 ml de reactiv Luff-Schoorl ml de Na2S2O3 0,1 mol/litru, două minute încălzire, zece minute fierbere |
|||||||
| Na2S2O3 0,1 mol/litru |
Glucoză, fructoză zaharuri invertite C6H12O6 |
Lactoză C12H22O11 |
Maltoză C12H22O11 |
Na2S2O3 0,1 mol/litru |
|||
| ml | mg | diferenţă | mg | diferenţă | mg | diferenţă | ml |
| 1 | 2,4 | 2,4 | 3,6 | 3,7 | 3,9 | 3,9 | 1 |
| 2 | 4,8 | 2,4 | 7,3 | 3,7 | 7,8 | 3,9 | 2 |
| 3 | 7,2 | 2,5 | 11,0 | 3,7 | 11,7 | 3,9 | 3 |
| 4 | 9,7 | 2,5 | 14,7 | 3,7 | 15,6 | 4,0 | 4 |
| 5 | 12,2 | 2,5 | 18,4 | 3,7 | 19,6 | 3,9 | 5 |
| 6 | 14,7 | 2,5 | 22,1 | 3,7 | 23,5 | 4,0 | 6 |
| 7 | 17,2 | 2,6 | 25,8 | 3,7 | 27,5 | 4,0 | 7 |
| 8 | 19,8 | 2,6 | 29,5 | 3,7 | 31,5 | 4,0 | 8 |
| 9 | 22,4 | 2,6 | 33,2 | 3,8 | 35,5 | 4,0 | 9 |
| 10 | 25,0 | 2,6 | 37,0 | 3,8 | 39,5 | 4,0 | 10 |
| 11 | 27,6 | 2,7 | 40,8 | 3,8 | 43,5 | 4,0 | 11 |
| 12 | 30,3 | 2,7 | 44,6 | 3,8 | 47,5 | 4,1 | 12 |
| 13 | 33,0 | 2,7 | 48,4 | 3,8 | 51,6 | 4,1 | 13 |
| 14 | 35,7 | 2,8 | 52,2 | 3,8 | 55,7 | 4,1 | 14 |
| 15 | 38,5 | 2,8 | 56,0 | 3,9 | 59,8 | 4,1 | 15 |
| 16 | 41,3 | 2,9 | 59,9 | 3,9 | 63,9 | 4,1 | 16 |
| 17 | 44,2 | 2,9 | 63,8 | 3,9 | 68,0 | 4,2 | 17 |
| 18 | 47,1 | 2,9 | 67,7 | 4,0 | 72,2 | 4,3 | 18 |
| 19 | 50,0 | 3,0 | 71,7 | 4,0 | 76,5 | 4,4 | 19 |
| 20 | 53,0 | 3,0 | 75,7 | 4,1 | 80,9 | 4,5 | 20 |
| 21 | 56,0 | 3,1 | 79,8 | 4,1 | 85,4 | 4,6 | 21 |
| 22 | 59,1 | 3,1 | 83,9 | 4,1 | 90,0 | 4,6 | 22 |
| 23 | 62,2 | 88,0 | 94,6 | 23 | |||
XI. DETERMINAREA LACTOZEI
11.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Această metodă permite determinarea conţinutului de lactoză în nutreţurile care au un conţinut de lactoză mai mare de 0,5%.
11.2. Principiul de aplicare
Zaharurile se dizolvă în apă. Soluţia este supusă fermentaţiei de către drojdia Saccharomyces cerevisiae care nu descompune lactoza. După limpezire şi filtrare, conţinutul de lactoză al filtratului se determină prin metoda Luff-Schoorl.
11.3. Reactivi utilizaţi
11.3.1. Suspensie de Saccharomyces cerevisiae: se suspendă 25 g de drojdie proaspătă în 100 ml de apă. Suspensia se păstrează în frigider o perioadă de maximum o săptămînă.
11.3.2. Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc, Zn(CH3COO)2 × 2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă pînă la 100 ml.
11.3.3. Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu K4Fe(CN)6 × 3H2O în apă. Se completează cu apă pînă la 100 ml.
11.3.4. Reactiv Luff-Schoorl:
Amestecînd cu grijă, se toarnă soluţie de acid citric (a se vedea menţiunea de la subpunctul 11.3.4.2.) în soluţia de carbonat de sodiu, conform prevederilor subpunctului 11.3.4.3. Se adaugă soluţia de sulfat de cupru (a se vedea menţiunea de la subpunctul 11.3.4.1.) şi se completează pînă la 1 litru cu apă. Se lasă la decantare peste noapte şi se filtrează. Se verifică concentraţia reactivului obţinut astfel (Cu 0,05 mol/litru; Na2CO3 1 mol/litru). ph-ul soluţiei este aproximativ 9,4.
11.3.4.1. Soluţie de sulfat de cupru: se dizolvă 25 g de sulfat de cupru, CuSO4 × 5H2O, lipsită de fier, în 100 ml apă.
11.3.4.2. Soluţie de acid citric: se dizolvă 50 g de acid citric, C6H8O7 × H2O, în 50 ml de apă.
11.3.4.3. Soluţie de carbonat de sodiu: se dizolvă 143,8 g de carbonat de sodiu anhidru în aproximativ 300 ml de apă caldă. Se lasă să se răcească.
11.3.5. Granule de piatră ponce fierte în acid clorhidric, spălate în apă şi uscate.
11.3.6. Iodură de potasiu, soluţie 30% (greutate/volum).
11.3.7. Acid sulfuric 3 mol/litru.
11.3.8. Soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru.
11.3.9. Soluţie de amidon: se adaugă un amestec de 5 g de amidon solubil cu 30 ml de apă la un litru de apă în stare de fierbere. Se fierbe timp de 3 minute, se lasă să se răcească şi, dacă este necesar, se adaugă 10 mg de iodură de mercur ca agent de conservare.
11.4. Dispozitiv
Baie de apă cu termostat reglat la 38-40°C.
11.5. Procedura de preparare
Se cîntăreşte 1 g de eşantion cu o abatere de 1 mg şi se introduce într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă 25-30 ml de apă. Balonul se introduce într-o baie de apă aflată la temperatura de fierbere, timp de 30 de minute, apoi se răceşte la aproximativ 35°C. Se adaugă 5 ml de suspensie de drojdie (a se vedea menţiunea de la subpunctul 11.3.1.) şi se omogenizează. Balonul se lasă să stea timp de două ore într-o baie de apă la temperatura de 38-40°C. Se răceşte la aproximativ 20°C.
Se adaugă 2,5 ml de soluţie Carrez I şi se amestecă timp de treizeci de secunde, apoi se adaugă 2,5 ml de soluţie Carrrez II şi se amestecă din nou timp de treizeci de secunde. Se completează cu apă pînă la 100 ml, se amestecă şi se filtrează. Cu ajutorul unei pipete, se îndepărtează o cantitate de filtrat care nu depăşeşte 25 ml şi care conţine, de preferinţă, 40-80 mg de lactoză, apoi se transferă într-un flacon Erlenmeyer de 300 ml. Dacă este necesar, se completează cu apă pînă la 25 ml.
Se efectuează un test martor în acelaşi mod cu 5 ml de suspensie de drojdie, conform prevederilor subpunctului 11.3.1. Se determină conţinutul de lactoză prin metoda Luff-Schoorl, după cum urmează: se adaugă exact 25 ml de reactiv Luff-Schoorl şi două granule de piatră ponce. Se amestecă manual concomitent cu încălzirea deasupra unei flăcări libere de înălţime medie, iar lichidul se aduce la fierbere în aproximativ două minute. Flaconul Erlenmeyer se aşează imediat pe o plasă de sîrmă acoperită cu azbest avînd un orificiu cu diametru de aproximativ 6 cm sub care există o flacără aprinsă. Flacăra se reglează astfel încît să se încălzească doar baza flaconului Erlenmeyer. La flaconul Erlenmeyer se montează un condensator cu reflux. Se fierbe exact zece minute. Se răceşte imediat în apă rece şi, după aproximativ 5 minute, se titrează după cum urmează:
Se adaugă 10 ml de soluţie de iodură de potasiu şi, imediat după aceea (cu grijă, din cauza riscului formării unei spume abundente), se adaugă 25 ml acid sulfuric. Se titrează cu soluţie de tiosulfat de sodiu pînă la apariţia unei culori galben şters, se adaugă soluţia de amidon şi se finalizează titrarea.
Se efectuează aceeaşi titrare pe un amestec de 25 ml de reactiv Luff-Schoorl cu 25 ml de apă, măsurat cu precizie, după ce s-au adăugat 10 ml de soluţie de iodură de potasiu şi 25 ml de acid sulfuric, fără a se fierbe.
11.6. Calcularea rezultatelor
Utilizînd datele indicate în tabelul nr.3, se stabileşte cantitatea de lactoză în mg care corespunde diferenţei dintre rezultatele celor două titrări, exprimate în ml de tiosulfat de sodiu 0,1 mol/litru.
Rezultatul pentru lactoza anhidră se exprimă ca procent din eşantion.
11.7. Observaţii
Pentru produsele care conţin mai mult de 40% zahăr fermentescibil, se utilizează mai mult de 5 ml de suspensie de drojdie, specificată în subpunctul 11.3.1.
XII. DETERMINAREA AMIDONULUI
Metoda polarimetrică
12.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea în nutreţuri a conţinutului de amidon şi a produselor de degradare a amidonului cu masă moleculară mare cu scopul de a se verifica conformitatea cu valoarea energetică declarată, conform prevederilor descrise în anexa nr.7 la prezenta Hotărîre.
12.2. Principiul de aplicare
Metoda cuprinde două determinări. În prima, eşantionul este tratat cu acid clorhidric diluat. După limpezire şi filtrare, se măsoară rotaţia optică a soluţiei prin polarimetrie.
În cea de-a doua, eşantionul este extras cu etanol 40%. După acidificarea filtratului cu acid clorhidric, limpezire şi filtrare, se măsoară rotaţia optică la fel ca în prima determinare.
Diferenţa dintre cele două măsurători, multiplicată cu un factor cunoscut, oferă conţinutul de amidon al eşantionului.
12.3. Reactivi utilizaţi
12.3.1. Acid clorhidric, soluţie cu concentraţie 25% (g/g): 1,126 g/ml.
12.3.2. Acid clorhidric, soluţie 1,13% (greutate/volum)
Concentraţia se verifică prin titrare folosind o soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru în prezenţa roşului de metil 0,1% (greutate/volum) în etanol 94% (v/v). Pentru neutralizarea a 10 ml sînt necesari 30,94 ml de NaOH 0,1 mol/litru.
12.3.3. Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH3COO)2 × 2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă pînă la 100 ml.
12.3.4. Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu K4Fe(CN)6 × 3H2O în apă. Se completează cu apă pînă la 100 ml.
12.3.5. Etanol, soluţie cu concentraţie de 40% (v/v): 0,948 g/ml la 20°C.
12.4. Dispozitive
12.4.1. Flacon Erlenmeyer de 250 ml cu îmbinare de sticlă şlefuită standard şi cu condensator cu reflux.
12.4.2. Polarimetru sau zaharimetru.
12.5. Procedura de aplicare
12.5.1. Prepararea eşantionului
Eşantionul se zdrobeşte pînă cînd devine suficient de fin pentru a trece complet printr-o sită cu orificii rotunde de 0,5 mm.
12.5.2. Determinarea rotaţiei optice totale (P sau S) (a se vedea observaţia de la subpunctul 12.7.1.)
Se cîntăresc 2,5 g din eşantionul zdrobit cu abatere de 1 mg şi se introduc într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă 25 ml de acid clorhidric, conform prevederilor subpunctului 12.3.2., se agită pentru a obţine o distribuţie uniformă a eşantionului de testat şi se adaugă încă 25 ml de acid clorhidric (a se vedea menţiunea de la subpunctul 12.3.2.). Se scufundă balonul într-o baie de apă care fierbe, agitîndu-se cu putere şi în mod constant în primele trei minute pentru a preveni formarea de aglomerări. Cantitatea de apă din baia de apă trebuie să fie suficientă pentru ca baia să rămînă la punctul de fierbere atunci cînd balonul este introdus în ea. Balonul nu trebuie să fie scos din baie în timp ce este agitat. După exact 15 minute, se scoate din baie, se adaugă 30 ml de apă rece şi se răceşte imediat la 20°C.
Se adaugă 5 ml de soluţie Carrez I şi se agită timp de aproximativ 30 de secunde. Apoi se adaugă 5 ml de soluţie Carrez II şi se agită din nou timp de aproximativ 30 de secunde. Se completează cu apă pînă la volum, se amestecă şi se filtrează. Dacă filtratul nu este perfect limpede (ceea ce se întîmplă rar), se repetă determinarea folosind o cantitate mai mare din soluţiile Carrez I şi II, de exemplu 10 ml.
Se măsoară rotaţia optică a soluţiei într-un tub de 200 mm cu polarimetrul sau cu zaharimetrul.
12.5.3. Determinarea rotaţiei optice (P′ sau S′) a substanţelor solubile în etanol 40%
Se cîntăresc 5 g din eşantion cu abatere de 1 mg, se introduc într-un balon gradat de 100 ml şi se adaugă aproximativ 80 ml de etanol (a se vedea observaţia de la subpunctul 12.7.2.). Se lasă balonul să stea timp de o oră la temperatura camerei; în acest timp, se agită cu putere de şase ori astfel încît eşantionul de testat să se amestece complet cu etanolul. Se completează pînă la volum cu etanol, se amestecă şi se filtrează.
Se pipetează 50 ml de filtrat (corespunde la 2,5 g de eşantion) într-un flacon Erlenmeyer de 250 ml, se adaugă 2,1 ml de acid clorhidric (a se vedea menţiunea de la subpunctul 12.3.1.) şi se agită puternic. La flaconul Erlenmeyer se montează un condensator cu reflux, iar vasul se scufundă într-o baie de apă în fierbere. După exact 15 minute, se scoate flaconul Erlenmeyer din baie, se transferă conţinutul într-un balon gradat de 100 ml, clătind cu puţină apă rece şi se răceşte la 20°C.
Se limpezeşte folosind soluţiile Carrez I şi II, se completează pînă la volum cu apă, se amestecă, se filtrează şi se măsoară rotaţia optică astfel cum se indică la subpunctul 12.5.2.
12.6. Calcularea rezultatelor
Conţinutul de amidon (%) se calculează după cum urmează:
12.6.1. Măsurare cu polarimetrul
Conţinut de amidon (%) = 2000 (P - P1)/[α]D20°,
unde:
P = rotaţia optică totală în grade unghiulare;
P′ = rotaţia optică în grade unghiulare a substanţelor solubile în etanol 40% (V/V);
[α]D20 = rotaţia optică specifică a amidonului pur. Valorile numerice acceptate în mod convenţional pentru acest factor sînt următoarele:
+ 185,9°: amidon din orez
+ 185,7°: amidon din cartofi
+ 184,6°: amidon din porumb
+ 182,7°: amidon din grîu
+ 181,5°: amidon din orz
+ 181,3°: amidon din ovăz
+ 184,0°: alte tipuri de amidon şi amestecuri de amidon în nutreţuri combinate.
12.6.2. Măsurare cu zaharimetrul
Conţinut de amidon (%) = 2000/[α]D20° × (2N × 0,665) × (S - S1)/100 - 26,6N × (S - S1)/[α]D20°,
unde:
S = rotaţia optică totală în grade zaharimetrice;
S′ = rotaţia optică în grade zaharimetrice a substanţelor solubile în etanol 40% (v/v);
N = greutatea (g) zaharozei în 100 ml de apă determinînd o rotaţie optică de 100 grade zaharimetrice măsurată cu un tub de 200 mm
16,29 g pentru zaharimetrele franceze
26 g pentru zaharimetrele germane
20 g pentru zaharimetrele mixte;
[α]D20 = rotaţia optică specifică a amidonului pur (a se vedea indicaţiile de la subpunctul 12.6.1.).
12.6.3. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 0,4 în valoare absolută pentru un conţinut de amidon mai mic de 40% şi 1% în valoare relativă în cazul conţinutului de amidon egal sau mai mare de 40%.
12.7. Observaţii
12.7.1. În cazul în care eşantionul conţine mai mult de 6% carbonaţi, calculaţi sub formă de carbonat de calciu, aceştia trebuie distruşi prin tratare cu o cantitate perfect adecvată de acid sulfuric diluat înaintea determinării rotaţiei optice totale.
12.7.2. În cazul produselor cu un conţinut mare de lactoză, cum ar fi zerul praf sau laptele praf degresat, se procedează după cum urmează după adăugarea a 80 ml etanol. La balon se fixează un condensator cu reflux, iar balonul se scufundă într-o baie de apă la 50°C timp de 30 minute. Se lasă să se răcească şi se continuă analiza astfel cum se indică la subpunctul 12.5.3.
12.7.3. În cazul în care sînt prezente în cantităţi semnificative în nutreţuri, următoarele materii prime pentru nutreţuri sînt cunoscute ca dînd naştere la interferenţe atunci cînd conţinutul de amidon se determină prin metoda polarimetrică şi, din acest motiv, se pot obţine rezultate incorecte:
produse din sfeclă (de zahăr), precum pulpă de sfeclă (de zahăr), melasă de sfeclă (de zahăr), pulpă melasată de sfeclă (de zahăr), vinasă de sfeclă (de zahăr), zahăr (din sfeclă);
pulpă de citrice;
seminţe de in; şrot de seminţe de in; şrot de seminţe de in rezultat după extracţie;
seminţe de rapiţă; şrot de seminţe de rapiţă; şrot de seminţe de rapiţă rezultat după extracţie; coji de seminţe de rapiţă;
seminţe de floarea soarelui; şrot de seminţe de floarea-soarelui rezultat după extracţie; seminţe de floarea-soarelui parţial decorticate, rezultate după extracţie;
şrot de copra; şrot de copra rezultat după extracţie;
pulpă de cartofi;
drojdie deshidratată;
produse bogate în inulină (de exemplu, fulgi şi făină de topinambur);
jumări.
XIII. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE CENUŞĂ BRUTĂ
13.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea în nutreţuri a conţinutului de cenuşă brută.
13.2. Principiul de aplicare
Eşantionul se calcinează la 550°C; reziduul se cîntăreşte.
13.3. Reactiv utilizat
Nitrat de amoniu, soluţie 20% (greutate/volum).
13.4. Dispozitive
13.4.1. Plită.
13.4.2. Cuptor electric cu muflă, dotat cu termostat.
13.4.3. Creuzete pentru calcinare fabricate din silice, porţelan sau platină, de formă rectangulară (aproximativ 60 × 40 × 25 mm) sau circulară (diametru: 60-75 mm, înălţime: 20-40 mm).
13.5. Procedura de preparare
Se cîntăresc aproximativ 5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg (2,5 g pentru produsele cu tendinţă de umflare) şi se introduc într-un creuzet pentru calcinare, care în prealabil a fost încălzit la 550°C, răcit şi tarat. Se aşează creuzetul pe plită şi se încălzeşte progresiv pînă la carbonizarea materialului. Se calcinează în conformitate cu menţiunile de la subpunctul 13.5.1. sau 13.5.2.
13.5.1. Se introduce creuzetul în cuptorul cu muflă calibrat, reglat la 550°C. Se menţine la această temperatură pînă la obţinerea unei cenuşi albe, gri deschis sau roşiatice, aparent lipsită de particule carbonizate. Se introduce creuzetul într-un desicator, se lasă să se răcească şi se cîntăreşte imediat.
13.5.2. Se introduce creuzetul în cuptorul cu muflă calibrat, reglat la 550°C. Se calcinează timp de 3 ore. Se introduce creuzetul într-un desicator, se lasă să se răcească şi se cîntăreşte imediat. Se calcinează din nou timp de 30 minute pentru a asigura că greutatea cenuşii rămîne constantă (pierderea de greutate între două cîntăriri succesive trebuie să fie mai mică sau egală cu 1 mg).
13.6. Calcularea rezultatelor
Greutatea reziduului se calculează prin deducerea tarei.
Rezultatul se exprimă ca procent din eşantion.
13.7. Observaţii
13.7.1. Cenuşa substanţelor dificil de calcinat trebuie supusă unei calcinări iniţiale timp de cel puţin trei ore, urmată de răcire şi de adăugarea cîtorva picături de soluţie de nitrat de amoniu 20% sau de apă (cu grijă, pentru a evita dispersarea cenuşii şi formarea de aglomerări). Se continuă calcinarea după uscarea în cuptor. Operaţia se repetă pînă cînd calcinarea este completă.
13.7.2. În cazul substanţelor rezistente la tratamentul descris în subpunctul 13.7.1., se procedează în felul următor: după calcinare timp de trei ore, se introduce cenuşa în apă caldă şi se filtrează printr-un filtru mic, lipsit de cenuşă. Filtrul şi conţinutul său se calcinează în creuzetul iniţial. Filtratul se introduce în creuzetul răcit, se evaporă pînă la uscare, se calcinează şi se cîntăreşte.
13.7.3. În cazul uleiurilor şi grăsimilor, se cîntăresc cu precizie 25 g de eşantion într-un creuzet de dimensiuni adecvate. Se carbonizează prin aprinderea materialului cu ajutorul unei benzi de filtru de hîrtie, lipsit de cenuşă. După combustie, se umectează cu cît mai puţină apă. Se usucă şi se calcinează astfel cum se descrie în subpunctul 13.5.
XIV. DETERMINAREA CENUŞII INSOLUBILE ÎN ACID CLORHIDRIC
14.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea în nutreţuri a conţinutului de substanţe minerale insolubile în acid clorhidric.
Se pot utiliza două metode, în funcţie de natura eşantionului.
14.1.1. Metoda A: aplicabilă materiilor prime pentru nutreţuri organice şi majorităţii nutreţurilor combinate.
14.1.2. Metoda B: aplicabilă compuşilor şi amestecurilor minerale, precum nutreţurilor combinate al căror conţinut de substanţe insolubile în acid clorhidric, determinat conform metodei A, este mai mare de 1%.
14.2. Principiul de aplicare
14.2.1. Metoda A: eşantionul se calcinează, cenuşa se fierbe în acid clorhidric, iar reziduul insolubil se filtrează şi se cîntăreşte.
14.2.2. Metoda B: eşantionul se tratează cu acid clorhidric. Soluţia se filtrează, reziduul se calcinează, iar cenuşa astfel obţinută se tratează conform metodei A.
14.3. Reactivi utilizaţi
14.3.1. Acid clorhidric 3 mol/litru.
14.3.2. Acid tricloracetic, soluţie 20% (greutate/volum).
14.3.3. Acid tricloracetic, soluţie 1% (greutate/volum).
14.4. Dispozitive
14.4.1. Plită.
14.4.2. Cuptor electric cu muflă, dotat cu termostat.
14.4.3. Creuzete pentru calcinare fabricate din silice, porţelan sau platină, de formă rectangulară (aproximativ 60 × 40 × 25 mm) sau circulară (diametru: 60-75 mm, înălţime: 20-40 mm).
14.5. Procedura de preparare
14.5.1. Metoda A:
Eşantionul se calcinează pentru determinarea cenuşii brute. Se poate utiliza şi cenuşă obţinută din analiza respectivă.
Se introduce cenuşa într-un pahar de laborator de 250-400 ml, utilizînd 75 ml de acid clorhidric. Se aduce lent la fierbere şi se fierbe încet timp de cincisprezece minute. Soluţia caldă se filtrează printr-un filtru de hîrtie lipsit de cenuşă, iar reziduul se spală cu apă caldă pînă cînd reacţia acidă nu mai este vizibilă. Filtrul care conţine reziduul se usucă şi se calcinează într-un creuzet tarat, la o temperatură de minimum 550°C şi maximum 700°C. Se răceşte într-un desicator şi se cîntăreşte.
14.5.2. Metoda B
Se cîntăresc 5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg şi se introduc într-un pahar de laborator de 250-400 ml. Se adaugă succesiv 25 ml apă şi 25 ml acid clorhidric, se amestecă şi se aşteaptă ca efervescenţa să înceteze. Se adaugă încă 50 ml de acid clorhidric. Se aşteaptă ca degajarea de gaz să înceteze, apoi se introduce paharul de laborator într-o baie de apă la temperatura de fierbere şi se menţine acolo timp de 30 de minute sau, dacă este necesar, mai mult, pentru ca amidonul eventual prezent să se hidrolizeze complet. Se filtrează pînă este încă cald, printr-un filtru lipsit de cenuşă, iar filtrul se spală în 50 ml de apă caldă (a se vedea observaţia indicată în subpunctul 14.7.). Se introduce filtrul care conţine reziduul într-un creuzet pentru calcinare, se usucă şi se calcinează la o temperatură de minimum 550°C şi maximum 700°C. Se introduce cenuşa într-un pahar de laborator de 250-400 ml, utilizînd 75 ml de acid clorhidric; se continuă astfel cum se descrie în subpunctul 14.5.1.
14.6. Calcularea rezultatelor
Se calculează greutatea reziduului prin deducerea tarei. Rezultatul se exprimă ca procent din eşantion.
14.7. Observaţie
Dacă filtrarea se dovedeşte dificilă, se reia analiza, înlocuind cei 50 ml de acid clorhidric cu 50 ml de acid tricloracetic 20% şi spălînd filtrul într-o soluţie caldă de acid tricloracetic 1%.
XV. DETERMINAREA CARBONAŢILOR
15.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea în majoritatea nutreţurilor a cantităţii de carbonaţi, exprimaţi în mod convenţional ca şi carbonat de calciu.
15.2. Principiul de aplicare
Carbonaţii se descompun în acidul clorhidric; dioxidul de carbon eliberat se colectează într-un tub gradat, iar volumul său se compară cu cel eliberat în aceleaşi condiţii de o cantitate cunoscută de carbonat de calciu.
15.3. Reactivi utilizaţi
15.3.1. Acid clorhidric, concentraţie 1,10 g/ml.
15.3.2. Carbonat de calciu.
15.3.3. Acid sulfuric, aproximativ 0,05 mol/litru, colorat cu roşu de metil.
15.4. Dispozitiv
Aparat Scheibler-Dietrich.
15.5. Calcularea rezultatelor
Conţinutul de carbonaţi, exprimaţi ca şi carbonat de calciu, se calculează prin utilizarea următoarei formule:
X = V × 100/V1 × 2m,
unde:
X =% (g/g) de carbonaţi în eşantioane, exprimaţi ca şi carbonat de calciu;
V = ml de CO2 eliberat de porţia de eşantion;
V1 = ml de CO2 eliberat de 0,5 g de CaCO3;
m = greutatea, în grame, a porţiei de eşantion.
XVI. DETERMINAREA FOSFORULUI TOTAL
Metoda fotometrică
16.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea în nutreţuri a conţinutului de fosfor total. Ea este indicată în special pentru analiza produselor sărace în fosfor. În anumite cazuri (produs bogat în fosfor), se poate utiliza o metodă gravimetrică.
16.2. Principiul de aplicare
Eşantionul se mineralizează, fie prin combustie uscată (în cazul nutreţurilor organice), fie prin dizolvare în mediu acid (în cazul nutreţurilor combinate minerale şi al celor lichide), iar apoi se introduce în soluţie acidă.
Soluţia se tratează cu reactivul molibdovanadat. Densitatea optică a soluţiei galbene astfel formate se măsoară cu un spectrofotometru la 430 nm.
16.3. Reactivi utilizaţi
16.3.1. Carbonat de calciu.
16.3.2. Acid clorhidric, ρ20 = 1,10 g/ml (aproximativ 6 mol/litru).
16.3.3. Acid azotic, ρ20 = 1,045 g/ml.
16.3.4. Acid azotic, ρ20 = 1,38-1,42 g/ml.
16.3.5. Acid sulfuric, ρ20 = 1,84 g/ml.
16.3.6. Reactiv molibdovanadat: se amestecă 200 ml de soluţie de heptamolibdat de amoniu (a se vedea menţiunea de la subpunctul 16.3.6.1.), 200 ml de soluţie de monovanadat de amoniu, conform indicaţiilor de la subpunctul 16.3.6.2. şi 134 ml de acid azotic, indicat în subpunctul 16.3.4., într-un balon gradat de 1 litru. Se completează pînă la volum cu apă.
16.3.6.1. Soluţie de heptamolibdat de amoniu: se dizolvă în apă fierbinte 100 g de heptamolibdat de amoniu (NH4) 6Mo7O24 × 4H2O. Se adaugă 10 ml de amoniac (concentraţie 0,91 g/ml) şi se completează cu apă pînă la 1 litru.
16.3.6.2. Soluţie de monovanadat de amoniu: se dizolvă 2,35 g de monovanadat de amoniu NH4VO3 în 400 ml de apă fierbinte. Amestecînd constant, se adaugă lent 20 ml de acid azotic diluat [7 ml de HNO3, indicat în subpunctul 16.3.4., + 13 ml de H2O] şi se completează cu apă pînă la 1 litru.
16.3.7. Soluţie etalon de 1 mg de fosfor per ml: se dizolvă 4,387 g de fosfat diacid de potasiu KH2PO4 în apă. Se completează cu apă pînă la 1 litru.
16.4. Dispozitive
16.4.1. Creuzete pentru calcinare din silice, porţelan sau platină.
16.4.2. Cuptor cu muflă electric, dotat cu termostat reglat la 550°C.
16.4.3. Flacon Kjeldahl de 250 ml.
16.4.4. Baloane gradate şi pipete de precizie.
16.4.5. Spectrofotometru.
16.4.6. Eprubete cu diametru de aproximativ 16 mm, cu dopuri gradate la un diametru de 14,5 mm; capacitate: 25-30 ml.
16.5. Procedura de preparare
16.5.1. Prepararea soluţiei
În funcţie de natura eşantionului, soluţia se prepară astfel cum se indică în subpunctul 16.5.1.1. sau 16.5.1.2.
16.5.1.1. Procedura uzuală
Se cîntăreşte 1 g de eşantion, sau mai mult, cu o abatere de 1 mg. Se introduce eşantionul de testat într-un flacon Kjeldahl, se adaugă 20 ml de acid sulfuric, se agită pentru a impregna complet substanţa cu acid şi pentru a preveni ca substanţa să adere pe pereţii flaconului, se încălzeşte şi se menţine la punctul de fierbere timp de 10 minute. Se lasă să se răcească uşor, se adaugă 2 ml de acid azotic (a se vedea menţiunea de la subpunctul 16.3.4.), se încălzeşte uşor, se lasă să se răcească uşor, se mai adaugă puţin acid azotic, indicat în subpunctul 16.3.4. şi se readuce la punctul de fierbere. Se repetă această procedură pînă se obţine o soluţie incoloră. Se răceşte, se adaugă puţină apă, se decantează lichidul într-un balon gradat de 500 ml clătind flaconul Kjeldahl cu apă fierbinte. Se lasă să se răcească, se completează pînă la volum cu apă, se omogenizează şi se filtrează.
16.5.1.2. Eşantioane care conţin substanţe organice şi sînt lipsite de fosfaţi diacizi de calciu şi magneziu
Se cîntăresc aproximativ 2,5 g de eşantion cu abatere de 1 mg într-un creuzet de calcinare. Se amestecă eşantionul de testat cu 1 g de carbonat de calciu pînă cînd se obţine un amestec complet omogen. Se calcinează în cuptor la 550°C pînă se obţine o cenuşă albă sau gri (o cantitate mică de cărbune se ignoră). Se transferă cenuşa într-un pahar de laborator de 250 ml. Se adaugă 20 ml de apă şi acid clorhidric pînă cînd efervescenţa încetează. Se adaugă încă 10 ml de acid clorhidric. Se aşează paharul de laborator pe o baie de nisip şi conţinutul se evaporă pînă la uscare, pentru a face silicea insolubilă. Se redizolvă reziduul în 10 ml de acid azotic (a se vedea menţiunea de la subpunctul 16.3.3.) şi se fierbe pe baia de nisip sau pe o plită timp de 5 minute, fără a se evapora pînă la uscare. Se decantează lichidul într-un balon gradat de 500 ml, clătind paharul de mai multe ori cu apă fierbinte. Se lasă să se răcească, se completează pînă la volum cu apă, se omogenizează şi se filtrează.
16.5.2. Apariţia coloraţiei şi măsurarea densităţii optice
Se diluează o parte alicotă de filtrat obţinut ca la subpunctul 16.5.1.1. sau 16.5.1.2. pentru a obţine o concentraţie de fosfor de maximum 40 μg/ml. Se introduc 10 ml din această soluţie într-o eprubetă, descrisă în subpunctul 16.4.6 şi se adaugă 10 ml de reactiv molibdovanadat. Se omogenizează şi se lasă să stea timp de cel puţin 10 minute la 20°C. Densitatea optică se măsoară cu un spectrofotometru la 430 nm, prin comparaţie cu o soluţie obţinută prin adăugarea de 10 ml de reactiv molibdovanadat la 10 ml de apă.
16.5.3. Curba de calibrare
Din soluţia etalon (a se vedea menţiunea de la subpunctul 16.3.7.) se prepară soluţii care conţin 5, 10, 20, 30 şi 40 μg de fosfor per ml, respectiv. Se iau 10 ml din fiecare din aceste soluţii şi se adaugă la 10 ml de reactiv molibdovanadat. Se omogenizează şi se lasă să stea timp de cel puţin 10 minute la 20°C. Densitatea optică se măsoară astfel cum se indică în subpunctul 16.5.2.
Se trasează curba de calibrare prin înscrierea grafică a densităţilor optice în raport cu cantităţile corespunzătoare de fosfor. Pentru concentraţii cuprinse între 0 şi 40 μg/ml, curba va fi liniară.
16.6. Calcularea rezultatelor
Cantitatea de fosfor din eşantionul de testat se determină prin utilizarea curbei de calibrare.
Rezultatul se exprimă ca procent din eşantion.
Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele obţinute în două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu depăşesc:
3%, relativ la rezultatul mai mare, pentru un conţinut de fosfor mai mic de 5%;
0,15% în valoare absolută, pentru un conţinut de fosfor egal sau mai mare de 5%.
XVII. DETERMINAREA CLORULUI DIN CLORURI
17.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea cantităţii de clor din clorurile solubile în apă, exprimate convenţional ca clorură de sodiu. Este aplicabilă tuturor nutreţurilor.
17.2. Principiul de aplicare
Clorurile se dizolvă în apă. Dacă produsul conţine materii organice, se limpezeşte. Soluţia se acidifică uşor cu acid azotic, iar clorurile se precipită sub formă de clorură de argint cu ajutorul unei soluţii de nitrat de argint. Excesul de nitrat de argint se titrează cu o soluţie de tiocianat de amoniu, prin metoda Volhard.
17.3. Reactivi utilizaţi
17.3.1. Soluţie de tiocianat de amoniu 0,1 mol/litru.
17.3.2. Soluţie de nitrat de argint 0,1 mol/litru.
17.3.3. Soluţie saturată de sulfat feric de amoniu (NH4)Fe(SO4)2.
17.3.4. Acid azotic, concentraţie: 1,38 g/ml.
17.3.5. Eter dietilic.
17.3.6. Acetonă.
17.3.7. Soluţie Carrez I: se dizolvă 21,9 g de acetat de zinc Zn(CH3COO)2 × 2H2O şi 3 g de acid acetic glacial în apă. Se completează cu apă pînă la 100 ml.
17.3.8. Soluţie Carrez II: se dizolvă 10,6 g de ferocianură de potasiu K4Fe(CN)6 × 3H2O în apă. Se completează cu apă pînă la 100 ml.
17.3.9. Cărbune activ, lipsit de cloruri şi fără a le absorbi.
17.4. Dispozitiv
Mixer (agitator): aproximativ 35-40 rpm.
17.5. Procedura de preparare
17.5.1. Prepararea soluţiei
În funcţie de natura eşantionului, se prepară o soluţie conform indicaţiilor menţionate în subpunctul 17.5.1.1., 17.5.1.2. sau 17.5.1.3.
În acelaşi timp, se efectuează un test martor fără eşantionul de analizat.
17.5.1.1. Eşantioane fără materii organice
Se cîntăresc maximum 10 g de eşantion cu o abatere de 1 mg, care conţin maximum 3 g de clor sub formă de cloruri. Se introduc, împreună cu 400 ml de apă, într-un balon gradat de 500 ml la aproximativ 20°C. Se amestecă timp de treizeci de minute în agitator, se aduce la volum, se omogenizează şi se filtrează.
17.5.1.2. Eşantioane care conţin materii organice, cu excepţia produselor menţionate în subpunctul 17.5.1.3.
Se cîntăresc aproximativ 5 g de eşantion cu o abatere de 1 mg şi se introduc, împreună cu 1 g de cărbune activ, într-un balon gradat de 500 ml. Se adaugă 400 ml apă la aproximativ 20°C şi 5 ml de soluţie Carrez I, se amestecă timp de 30 de secunde, apoi se adaugă 5 ml de soluţie Carrez II. Se amestecă timp de treizeci de minute în agitator, se aduce la volum, se omogenizează şi se filtrează.
17.5.1.3. Nutreţuri preparate termic, turte şi făină de in, produse bogate în făină de in şi alte produse bogate în mucilagii sau în substanţe coloidale (de exemplu amidon dextrinat)
Se prepară soluţia astfel cum se descrie în subpunctul 17.5.1.2., dar nu se filtrează. Se decantează (dacă este necesar, se centrifughează), se îndepărtează 100 ml lichid supernatant şi se transferă într-un flacon de măsurare de 200 ml.
Se amestecă cu acetonă şi se aduce la volum cu acest solvent, se omogenizează şi se filtrează.
17.5.2. Titrarea
Cu ajutorul unei pipete, se transferă într-un flacon Erlenmeyer o cantitate cuprinsă între de 25 şi 100 ml de filtrat (în funcţie de conţinutul anticipat de clor), obţinut astfel cum se descrie în subpunctul 17.5.1.1., 17.5.1.2. sau 17.5.1.3. Porţia alicotă nu trebuie să conţină mai mult de 150 mg de clor (Cl). Dacă este necesar, se diluează cu maximum 50 ml de apă, se adaugă 5 ml acid azotic, 20 ml de soluţie saturată de sulfat feric de amoniu şi două picături de soluţie de tiocianat de amoniu transferată cu ajutorul unei biurete umplute pînă la gradaţia zero. Cu ajutorul unei biurete, se transferă soluţia de nitrat de argint astfel încît să se obţină un exces de 5 ml. Se adaugă 5 ml de eter dietilic şi se agită puternic pentru a coagula precipitatul. Excesul de nitrat de argint se titrează cu soluţia de tiocianat de amoniu pînă cînd coloraţia maro-roşcat a persistat timp de un minut.
17.6. Calcularea rezultatelor
Cantitatea de clor (X), exprimată ca % de clorură de sodiu, se calculează cu ajutorul următoarei formule:
X = 5,845 × (V1 - V2)/m,
unde:
V1 = ml de soluţie de nitrat de argint 0,1 mol/l adăugată;
V2 = ml de soluţie de tiocianat de amoniu 0,1 mol/l utilizată la titrare;
m = greutatea eşantionului.
Dacă testul martor indică un consum de soluţie de nitrat de argint 0,1 mol/l, se deduce această valoare din volum (V1 - V2).
17.7. Observaţii
17.7.1. Titrarea se poate face şi prin potenţiometrie.
17.7.2. În cazul produselor foarte bogate în uleiuri şi grăsimi, se procedează mai întîi la o degresare cu eter dietilic sau cu eter de petrol.
17.7.3. În cazul făinii de peşte, titrarea se poate efectua prin metoda Mohr.
Anexa nr.4
la Hotărîrea Guvernului
nr.686 din 13 septembrie 2012
METODELE DE ANALIZĂ
pentru controlul nivelului admisibil de aditivi în nutreţuri
I. DETERMINAREA VITAMINEI A
1.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea nivelului de vitamină A (retinol) din nutreţuri şi premixuri. Vitamina A include alcoolul all-trans-retinil şi izomerii săi cis, care se determină prin această metodă. Conţinutul de vitamină A se exprimă în unităţi internaţionale (UI) per kg. O UI corespunde activităţii a 0,3 μg de alcool all-trans-vitamina A sau a 0,344 μg all-trans-vitamina A acetat sau 0,550 μg all-trans-vitamina A palmitat.
Limita de cuantificare este 2000 UI de vitamina A/kg.
1.2. Principiul de aplicare
Eşantionul se hidrolizează cu o soluţie de hidroxid de potasiu etanolic, iar vitamina A se extrage cu eter de petrol.
Solventul se îndepărtează prin evaporare, iar reziduul se dizolvă în metanol şi, dacă este cazul, se diluează pînă la concentraţia necesară. Conţinutul de vitamina A se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă cu fază inversată (RP-HPLC) cu ajutorul unui detector de UV sau de fluorescenţă. Parametrii cromatografiei se aleg astfel încît să nu existe separaţie între alcoolul all-trans-vitamina A şi izomerii săi cis.
1.3. Reactivi utilizaţi
1.3.1. Etanol, σ = 96%.
1.3.2. Eter de petrol, interval de fierbere 40-60°C.
1.3.3. Metanol.
1.3.4. Soluţie de hidroxid de potasiu, c = 50 g/100 ml.
1.3.5. Soluţie de ascorbat de sodiu, c = 10 g/100 ml (a se vedea observaţiile de la subpunctul 1.7.7.).
1.3.6. Sulfură de sodiu, Na2S • xH2O (x = 7-9).
1.3.6.1. Soluţie de sulfură de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, β = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaţiile de la subpunctul 1.7.8.).
1.3.7. Soluţie de fenolftaleină, c = 2 g/100 ml în etanol.
1.3.8. 2-propanol.
1.3.9. Fază mobilă pentru HPLC: amestec de metanol şi apă, de exemplu 980 + 20 (v + v). Proporţia exactă este determinată de caracteristicile coloanei folosite.
1.3.10. Azot, lipsit de oxigen.
1.3.11. All-trans-vitamina A acetat, extra pură, cu activitate certificată, de exemplu 2,80 × 106 UI/g
1.3.11.1. Soluţie stoc de all-trans-vitamina A acetat: se cîntăresc 50 mg de vitamina A acetat cu o abatere de 0,1 mg într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în 2-propanol şi se completează pînă la semn cu acelaşi solvent.
Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 1400 UI vitamină A per ml. Conţinutul exact se determină în conformitate cu indicaţiile de la subpunctul 1.5.6.3.1.
1.3.12. All-trans-vitamină A palmitat, extra pură, cu activitate certificată, de exemplu 1,80 × 106 UI/g
1.3.12.1. Soluţie stoc de all-trans-vitamină A palmitat: se cîntăresc 80 mg de vitamină A palmitat cu o abatere de 0,1 mg într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în 2-propanol şi se completează pînă la semn cu acelaşi solvent. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 1400 UI vitamina A per ml. Conţinutul exact se determină în conformitate cu indicaţiile de la subpunctul 1.5.6.3.2.
1.3.13. 2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observaţiile de la subpunctul 1.7.5.).
1.4. Dispozitive
1.4.1. Evaporator rotativ cu vid.
1.4.2. Sticlărie laborator brună.
1.4.2.1. Baloane cu fund plat sau flacoane tip Erlenmeyer, 500 ml, cu orificiu din sticlă şlefuită.
1.4.2.2. Baloane gradate cu dopuri de sticlă şlefuită, cu gît îngust, de 10, 25, 100 şi 500 ml.
1.4.2.3. Pîlnii de separare, conice, 1000 ml, cu dopuri de sticlă şlefuită.
1.4.2.4. Flacoane piriforme, 250 ml, cu orificiu din sticlă şlefuită.
1.4.3. Condensator Allihn, cu lungime a mantalei de 300 mm, cu îmbinare de sticlă şlefuită şi cu adaptor pentru conductă de alimentare cu gaz.
1.4.4. Filtru de hîrtie plisată pentru separarea fazelor, cu diametru de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).
1.4.5. Echipament HPLC cu sistem de injecţie
1.4.5.1. Coloană pentru cromatografie lichidă, 250 mm × 4 mm, C18, cu particule de 5 sau 10 μm, sau echivalent (criteriu de performanţă: un singur vîrf pentru toţi izomerii de retinol în condiţiile HPLC).
1.4.5.2. Detector de UV sau de fluorescenţă, cu ajustare variabilă a lungimii de undă.
1.4.6. Spectrofotometru cu celule de cuarţ de 10 mm.
1.4.7. Baie de apă cu agitator magnetic.
1.4.8. Aparat de extracţie compus din:
1.4.8.1. Cilindru din sticlă cu capacitatea de 1 l prevăzut cu gît şi dop de sticlă şlefuite.
1.4.8.2. Piesă din sticlă şlefuită echipată cu o tijă laterală şi un tub reglabil care trece prin centru. Tubul ajustabil are un capăt inferior în formă de “U” şi o duză la capătul opus, astfel încît stratul superior de lichid din cilindru să poată fi transferat într-o pîlnie de separare.
1.5. Procedura de preparare
Vitamina A este sensibilă la lumină (UV) şi la oxidare. Toate operaţiunile se efectuează în absenţa luminii (se utilizează sticlărie brună sau protejată cu o folie de aluminiu) şi a oxigenului (alimentare cu azot). În timpul extracţiei, aerul de deasupra lichidului se înlocuieşte cu azot (a se evita excesul de presiune slăbind din cînd în cînd dopul).
1.5.1. Prepararea eşantionului
Se macină eşantionul astfel încît să poată trece printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, evitîndu-se producerea de căldură. Măcinarea se efectuează imediat înainte de cîntărire şi saponificare, altfel pot exista pierderi de vitamină A.
1.5.2. Saponificarea
În funcţie de conţinutul de vitamină A, se cîntăresc 2-25 g de eşantion cu o abatere de 1 mg într-un balon cu fund plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml. Se adaugă, agitînd circular, 130 ml de etanol, aproximativ 100 mg de 2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT), 2 ml de soluţie de ascorbat de sodiu şi 2 ml de soluţie de sulfură de sodiu. Se montează un condensator (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.4.3.) la balon şi acesta se scufundă într-o baie de apă cu agitator magnetic. Se încălzeşte pînă la fierbere şi se lasă să reflueze timp de 5 minute. Apoi se adaugă 25 ml de soluţie de hidroxid de potasiu prin condensatorul Allihn şi se lasă să reflueze timp de încă 25 min, amestecînd continuu sub un jet slab de azot. Apoi se clăteşte condensatorul cu aproximativ 20 ml de apă, iar conţinutul balonului se lasă să se răcească la temperatura camerei.
1.5.3. Procedura de extracţie
Se transferă cantitativ prin decantare soluţia de saponificare clătind cu un volum total de 250 ml de apă într-o pîlnie de separare de 1000 ml sau în aparatul de extracţie. Se clăteşte balonul utilizat la saponificare succesiv cu 25 ml de etanol şi 100 ml de eter de petrol, iar lichidul de clătire se transferă în pîlnia de separare sau în aparatul de extracţie. Proporţia de apă şi etanol în soluţiile combinate trebuie să fie de aproximativ 2:1. Se agită energic timp de 2 minute şi se lasă la decantat timp de 2 minute.
1.5.3.1. Extracţia cu ajutorul unei pîlnii de separare (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.4.2.3.)
Cînd straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la subpunctul 1.7.3.), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pîlnie de separare. Se repetă de două ori această extracţie cu 100 ml de eter de petrol, apoi de încă două ori cu 50 ml de eter de petrol.
Se spală de două ori extractele combinate în pîlnia de separare agitînd circular uşor (pentru a se evita formarea de emulsii) cu porţii de 100 ml de apă şi repetînd agitarea cu alte porţii de apă de 100 ml pînă cînd apa rămîne incoloră la adăugarea de soluţie de fenolftaleină (patru spălări sînt de obicei suficiente). Se filtrează extractul spălat cu un filtru plisat uscat pentru separarea fazelor cu scopul de a se îndepărta apa suspendată într-un balon gradat de 500 ml. Se clăteşte pîlnia de separare şi filtrul cu 50 ml de eter de petrol, se completează pînă la semn cu eter de petrol şi se amestecă bine.
1.5.3.2. Extracţia cu ajutorul unui aparat de extracţie (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.4.8.)
Cînd straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la subpunctul 1.7.3.), se înlocuieşte dopul cilindrului de sticlă cu piesa din sticlă şlefuită şi se amplasează capătul inferior în formă de “U” a tubului reglabil astfel încît să se afle exact deasupra nivelului interfeţei. Aplicînd o presiune din linia de azot asupra tijei laterale, se transferă stratul superior de eter de petrol într-o pîlnie de separare de 1000 ml. Se adaugă 100 ml de eter de petrol în cilindrul de sticlă, se pune dopul şi se agită energic. Se lasă straturile să se separe şi se transferă stratul superior în pîlnia de separare. Se repetă procedura de extracţie cu încă 100 ml de eter de petrol, apoi de două ori cu porţii de 50 ml de eter de petrol şi se adaugă straturile de eter de petrol în pîlnia de separare.
Se spală extractele combinate de eter de petrol astfel cum se descrie la subpunctul 1.5.3.1. şi se procedează astfel cum se descrie la subpunctul respectiv.
1.5.4. Prepararea soluţiei eşantion pentru HPLC
Se pipetează o porţie alicotă din soluţia de eter de petrol (de la subpunctul 1.5.3.1. sau 1.5.3.2.) într-un flacon piriform de 250 ml. Se evaporă solventul aproape pînă la uscare în evaporatorul rotativ cu presiune redusă la o temperatură a băii care să nu depăşească 40°C. Se restabileşte presiunea atmosferică prin admisia azotului şi se îndepărtează flaconul din evaporatorul rotativ. Se elimină restul de solvent cu un jet de azot, iar reziduul se dizolvă imediat într-un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (concentraţia de vitamină A trebuie să fie cuprinsă în intervalul 5-30 UI/ml).
1.5.5. Determinarea prin HPLC
Vitamina A se separă pe o coloană cu fază inversată C18 (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.4.5.1.), iar concentraţia se măsoară cu un detector de UV (325 nm) sau un detector de fluorescenţă (excitaţie: 325 nm, emisie: 475 nm) (1.4.5.2.).
Se injectează o porţie alicotă (de exemplu 20 μl) din soluţia metanolică obţinută la subpunctul 1.5.4. şi se eluează cu faza mobilă, descrisă în subpunctul 1.3.9. Se calculează înălţimea medie a vîrfului (aria) mai multor injectări ale aceleiaşi soluţii de eşantion şi înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor mai multor injectări ale soluţiilor de calibrare, conform prevederilor subpunctului 1.5.6.2.
Condiţii HPLC
Următoarele condiţii specificate în tabelul nr.1 din prezenta anexă se oferă cu titlu orientativ; se pot aplica alte condiţii cu condiţia ca ele să genereze rezultate echivalente.
|
Tabelul nr.1 Condiţii HPLC |
|
| Tehnica de măsurare | Valorile indicate |
| Coloana pentru cromatografie lichidă, conform specificaţiilor de la subpunctul 1.4.5.1. | 250 mm × 4 mm, C18, particule de 5 μm sau 10 μm sau echivalent |
| Faza mobilă (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.3.9.) | Mixtură de metanol (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.3.3.) şi apă, de exemplu 980 + 20 (v + v) |
| Rata fluxului | 1 -2 ml/minut |
| Detector (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.4.5.2.) | Detector de UV (325 nm) sau detector de fluorescenţă (excitaţie: 325 nm/emisie: 475 nm) |
1.5.6. Calibrarea
1.5.6.1. Prepararea soluţiilor etalon de lucru
Se pipetează 20 ml de soluţie stoc de vitamină A acetat sau 20 ml de soluţie stoc de vitamină A palmitat într-un balon cu fund plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml şi se hidrolizează astfel cum se descrie în subpunctul 1.5.2., dar fără a se adăuga 2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT). În continuare se extrage cu eter de petrol conform prevederilor descrise în subpunctul 1.5.3. şi se completează pînă la 500 ml cu eter de petrol. Se evaporă 100 ml din acest extract în evaporatorul rotativ (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.5.4.) aproape pînă la uscare, se îndepărtează solventul care rămîne cu un jet de azot şi se redizolvă reziduul în 10 ml de metanol. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 560 UI vitamină A per ml. Conţinutul exact se determină în conformitate cu indicaţiile de la subpunctul 1.5.6.3.3.
Soluţia etalon de lucru trebuie proaspăt preparată înainte de utilizare.
Se pipetează 2 ml din această soluţie etalon de lucru într-un balon gradat de 20 ml, se completează pînă la semn cu metanol şi se amestecă. Concentraţia nominală a acestei soluţii etalon de lucru diluate este de 56 UI de vitamina A per ml.
1.5.6.2. Prepararea soluţiilor de calibrare şi curba de calibrare
Se transferă 1, 2, 5 şi 10 ml din soluţia etalon de lucru diluată într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează pînă la semn cu metanol şi se amestecă. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sînt de 2,8, 5,6, 14 şi respectiv 28 UI de vitamină A per ml.
Se injectează de mai multe ori cîte 20 μl din fiecare soluţie de calibrare şi se determină înălţimile medii (ariile) ale vîrfurilor. Utilizînd înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor, se trasează o curbă de calibrare ţinînd cont de rezultatele obţinute cu soluţia de control UV (a se vedea indicaţia de la subpunctul 1.5.6.3.3.).
1.5.6.3. Standardizarea UV (sub acţiunea razelor ultraviolete) a soluţiilor etalon
1.5.6.3.1. Soluţia stoc de vitamină A acetat
Se pipetează 2 ml din soluţia stoc de vitamină A acetat într-un balon gradat de 50 ml şi se completează pînă la semn cu 2-propanol. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 56 UI de vitamină A per ml. Se pipetează 3 ml din această soluţie diluată de vitamină A acetat într-un balon gradat de 25 ml şi se completează pînă la semn cu 2-propanol. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 6,72 UI de vitamină A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluţii comparativ cu cel al soluţiei de 2-propanol, în spectrofotometru, în intervalul 300-400 nm. Maximumul de extincţie trebuie să fie între 325 şi 327 nm.
Calculul conţinutului de vitamină A:
UI vitamină A/ml = E326 × 19
(E11% cm pentru vitamină A acetat = 1530 la 326 nm în 2-propanol)
1.5.6.3.2. Soluţia stoc de vitamină A palmitat
Se pipetează 2 ml de soluţie stoc de vitamină A palmitat într-un balon gradat de 50 ml şi se completează pînă la gradaţie cu propanol-2. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 56 UI de vitamină A per ml. Se pipetează 3 ml din această soluţie diluată de vitamină A palmitat într-un balon gradat de 25 ml şi se completează pînă la semn cu 2-propanol. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 6,72 UI de vitamină A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluţii comparativ cu cel al soluţiei de 2-propanol, în spectrofotometru, în intervalul 300-400 nm. Maximumul de extincţie trebuie să fie între 325 şi 327 nm.
Calculul conţinutului de vitamină A:
UI vitamină A/ml = E326 × 19
(E11% cm pentru vitamină A palmitat = 957 la 326 nm în 2-propanol)
1.5.6.3.3. Soluţia etalon de lucru de vitamină A
Se pipetează 3 ml din soluţia etalon de lucru nediluată de vitamină A, preparată conform prevederilor descrise în subpunctul 1.5.6.1, într-un balon gradat de 50 ml şi se completează pînă la semn cu 2-propanol. Se pipetează 5 ml din această soluţie într-un balon gradat de 25 ml şi se completează pînă la semn cu 2-propanol. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 6,72 UI de vitamină A per ml. Se măsoară spectrul UV al acestei soluţii comparativ cu cel al soluţiei de 2-propanol, în spectrofotometru, în intervalul 300-400 nm.
Maximumul de extincţie trebuie să fie între 325 şi 327 nm.
Calculul conţinutului de vitamină A:
UI vitamină A/ml = E326 × 18,3
(E11% cm pentru vitamină A alcool = 1821 la 325 nm în 2-propanol)
1.6. Calcularea rezultatelor
Din înălţimea (aria) medie a vîrfurilor de vitamină A ale soluţiei de eşantion se determină concentraţia soluţiei de eşantion în UI/ml prin referire la curba de calibrare.
Conţinutul w de vitamină A al eşantionului, în UI/kg, este dat de următoarea formulă:
w = 500 × c × V2 × 1000/V1 × m [UI/kg],
în care:
c = concentraţia de vitamină A a soluţiei de eşantion (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.5.4.), în UI/ml;
V1 = volumul soluţiei de eşantion (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.5.4), în ml;
V2 = volumul de alicotă prelevat la subpunctul 1.5.4., în ml;
m = greutatea porţiei de testat, în g.
1.7. Observaţii
1.7.1. Pentru eşantioanele cu concentraţii mici de vitamină A poate fi utilă combinarea extractelor cu eter de petrol provenite din două operaţii de saponificare (cantitate cîntărită: 25 g) într-o soluţie de eşantion pentru determinare prin HPLC.
1.7.2. Greutatea eşantionului prelevat pentru analiză nu conţine mai mult de 2 g de grăsimi.
1.7.3. Dacă separarea fazelor nu are loc, se adaugă aproximativ 10 ml de etanol pentru a fragmenta emulsia.
1.7.4. În cazul uleiului din ficat şi al altor grăsimi pure, timpul de saponificare se prelungeşte la 45-60 minute.
1.7.5. Hidrochinona poate fi folosită în locul 2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT).
1.7.6. Utilizîndu-se o coloană cu fază normală, separarea izomerilor de retinol este posibilă. Dar în acest caz, înălţimile (ariile) vîrfurilor izomerilor all-cis şi all-trans trebuie însumate pentru a face calcule.
1.7.7. Se pot folosi aproximativ 150 mg de soluţie de acid ascorbic în locul soluţiei de ascorbat de sodiu.
1.7.8. Se pot folosi aproximativ 50 mg de EDTA în locul soluţiei de sulfură de sodiu.
1.7.9. În cazul analizei vitaminei A în înlocuitorii de lapte, se acordă o atenţie deosebită la:
saponificare: din cauza cantităţii de grăsimi prezente în eşantion, poate fi necesară creşterea cantităţii de soluţie de hidroxid de potasiu;
extracţie: din cauza prezenţei emulsiilor, poate fi necesară adaptarea valorii raportului de 2:1 pentru apă/etanol.
Pentru a verifica dacă metoda de analizare aplicată generează rezultate fiabile pentru această matrice specifică (înlocuitor de lapte), se aplică un test de recuperare pe o porţie suplimentară de testat. Dacă rata de recuperare este mai mică de 80%, rezultatul analitic trebuie corectat în funcţie de recuperare.
1.8. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele obţinute în două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 15% relativ la rezultatul mai mare.
II. DETERMINAREA VITAMINEI E
2.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea nivelului de vitamină E din nutreţuri şi premixuri. Conţinutul de vitamină E se exprimă ca mg DL-α-tocoferol acetat per kg. 1 mg DL-α-tocoferol acetat corespunde la 0,91 mg DL-α-tocoferol (vitamină E).
Limita de cuantificare este 2 mg de vitamină E/kg. Această limită de cuantificare se obţine doar cu detectorul de fluorescenţă. Cu un detector de UV, limita de cuantificare este 10 mg/kg.
2.2. Principiul de aplicare
Eşantionul se hidrolizează cu o soluţie etanolică de hidroxid de potasiu, iar vitamina E se extrage cu eter de petrol. Solventul se îndepărtează prin evaporare, iar reziduul se dizolvă în metanol şi, dacă este necesar, se diluează pînă la concentraţia necesară. Conţinutul de vitamina E se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă cu fază inversată (RP-HPLC), utilizînd un detector de fluorescenţă sau de UV.
2.3. Reactivi utilizaţi
2.3.1. Etanol, σ = 96%.
2.3.2. Eter de petrol, interval de fierbere 40-60°C.
2.3.3. Metanol.
2.3.4. Soluţie de hidroxid de potasiu, c = 50 g/100 ml.
2.3.5. Soluţie de ascorbat de sodiu, c = 10 g/100 ml (a se vedea observaţiile de la subpunctul 2.7.7.).
2.3.6. Sulfură de sodiu, Na2S • xH2O (x = 7-9).
2.3.6.1. Soluţie de sulfură de sodiu, c = 0,5 mol/l în glicerol, β = 120 g/l (pentru x = 9) (a se vedea observaţiile de la subpunctul 2.7.8.).
2.3.7. Soluţie de fenolftaleină, c = 2 g/100 ml în etanol.
2.3.8. Fază mobilă pentru HPLC: amestec de metanol şi apă, de exemplu 980 + 20 (v + v). Proporţia exactă este determinată de caracteristicile coloanei folosite.
2.3.9. Azot, lipsit de oxigen.
2.3.10. DL-α-tocoferol acetat, extra pur, cu activitate certificată
2.3.10.1. Soluţie stoc de DL-α-tocoferol acetat: se cîntăresc 100 mg de DL-α-tocoferol acetat cu o abatere de 0,1 mg într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în etanol şi se completează pînă la semn cu acelaşi solvent. 1 ml din această soluţie conţine 1 mg de DL-α-tocoferol acetat. (pentru control UV a se vedea descrierea de la subpunctul 2.5.6.1.3.; pentru stabilizare a se vedea observaţiile de la subpunctul 2.7.4.).
2.3.11. DL-α-tocoferol, extra pur, cu activitate certificată
2.3.11.1. Soluţia stoc de DL-α-tocoferol: se cîntăresc 100 mg de DL-α-tocoferol cu o abatere de 0,1 mg într-un balon gradat de 100 ml. Se dizolvă în etanol şi se completează pînă la semn cu acelaşi solvent. 1 ml din această soluţie conţine 1 mg de DL-α-tocoferol (pentru control UV a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.5.6.2.3.; pentru stabilizare a se vedea observaţiile de la subpunctul 2.7.4.).
2.3.12. 2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT) (a se vedea observaţiile de la subpunctul 2.7.5.).
2.4. Dispozitive
2.4.1. Evaporator rotativ cu generare de film.
2.4.2. Sticlărie laborator brună.
2.4.2.1. Baloane cu fund plat sau flacoane tip Erlenmeyer, 500 ml, cu orificiu din sticlă şlefuită.
2.4.2.2. Baloane gradate cu dopuri de sticlă şlefuită, cu gît îngust, de 10, 25, 100 şi 500 ml.
2.4.2.3. Pîlnii de separare, conice, 1000 ml, cu dopuri de sticlă şlefuită.
2.4.2.4. Flacoane piriforme, 250 ml, cu orificiu din sticlă şlefuită.
2.4.3. Condensator Allihn, cu lungime a mantalei de 300 mm, cu îmbinare de sticlă şlefuită şi cu adaptor pentru conductă de alimentare cu gaz.
2.4.4. Filtru de hîrtie plisată pentru separarea fazelor, cu diametru de 185 mm (de exemplu Schleicher & Schuell 597 HY 1/2).
2.4.5. Echipament HPLC cu sistem de injecţie.
2.4.5.1. Coloană pentru cromatografie lichidă, 250 mm × 4 mm, C18, particule de 5 sau 10 μm, sau echivalent.
2.4.5.2. Detector de fluorescenţă sau de UV, cu ajustare variabilă a lungimii de undă.
2.4.6. Spectrofotometru cu celule de cuarţ de 10 mm.
2.4.7. Baie de apă cu agitator magnetic.
2.4.8. Aparat de extracţie.
2.5. Procedura de preparare
Vitamina E este sensibilă la lumină (UV) şi la oxidare. Toate operaţiunile se efectuează în absenţa luminii (în recipiente de sticlă brună sau protejate cu folie de aluminiu) şi în absenţa oxigenului (se expune unui flux de azot). În timpul extracţiei, aerul de deasupra lichidului se înlocuieşte cu azot (a se evita excesul de presiune slăbind din cînd în cînd dopul).
2.5.1. Pregătirea eşantionului
Se macină eşantionul pentru a trece printr-o sită cu ochiuri de 1 mm, evitîndu-se producerea de căldură.
Măcinarea trebuie efectuată imediat înainte de cîntărire şi saponificare, în caz contrar riscîndu-se pierderi de vitamina E.
2.5.2. Saponificarea
În funcţie de greutatea conţinutului de vitamina E, se cîntăresc, cu o abatere de 0,01 g, 2-25 g de eşantion într-un balon cu fund plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer, de 500 ml. Se adaugă succesiv, agitînd circular, 130 ml de etanol, cca 100 mg de 2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT), 2 ml de soluţie de ascorbat de sodiu şi 2 ml de soluţie de sulfură de sodiu (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.3.6). Se montează un condensator la vas şi se introduce vasul într-o baie de apă cu agitator magnetic. Se încălzeşte pînă la fierbere şi se lasă să reflueze timp de 5 minute. Apoi se adaugă 25 ml de soluţie de hidroxid de potasiu prin condensator şi se lasă să reflueze timp de încă 25 minute, amestecînd sub un flux uşor de azot. Apoi se clăteşte condensatorul cu circa 20 ml de apă şi se răceşte conţinutul vasului la temperatura camerei.
2.5.3. Procedura de extracţie
Se transferă cantitativ prin decantare soluţia saponificată, prin clătire cu un volum total de 250 ml de apă într-o pîlnie de separare de 1 000 ml sau în aparatul de extracţie. Se clăteşte succesiv vasul de saponificare cu 25 ml de etanol şi 100 ml de eter de petrol şi se transferă lichidul de clătire în pîlnia de separare sau în aparatul de extracţie. Proporţia de apă şi etanol în soluţiile combinate trebuie să fie de cca 2:1. Se agită energic timp de 2 minute şi se lasă să se sedimenteze timp de 2 minute.
2.5.3.1. Extracţia utilizînd o pîlnie de separare (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.4.2.3)
Cînd straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la subpunctul 2.7.3.), se transferă stratul de eter de petrol într-o altă pîlnie de separare. Se repetă această extracţie de două ori cu 100 ml eter de petrol şi de două ori cu 50 ml eter de petrol.
Se spală de două ori extractele combinate în pîlnia de separare amestecînd uşor (pentru a se evita formarea de emulsii) cu cantităţi de 100 ml de apă şi din nou, prin agitare repetată cu alte cantităţi de apă de 100 ml pînă cînd apa rămîne incoloră după adăugarea unei soluţii de fenolftaleină (patru spălări sînt în general suficiente). Se filtrează extractul spălat cu un filtru cutat uscat pentru separarea fazelor pentru a se elimina apa în suspensie şi se transferă într-un balon gradat de 500 ml. Se clătesc pîlnia de separare şi filtrul cu 50 ml eter de petrol, se completează pînă la semn cu eter de petrol şi se amestecă bine.
2.5.3.2. Extracţia utilizînd un aparat de extracţie (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.4.8.)
Cînd straturile s-au separat (a se vedea observaţia de la subpunctul 2.7.3.), se înlocuieşte dopul cilindrului de sticlă prin inserţie de sticlă şlefuită şi se amplasează extremitatea inferioară în formă de “U” a tubului reglabil astfel încît să se afle exact deasupra nivelului interfeţei. Aplicînd o presiune de la generatorul de azot prin braţul lateral, se transferă stratul superior de eter de petrol într-o pîlnie de separare de 1 000 ml. Se adaugă 100 ml de eter de petrol în cilindrul de sticlă, se pune dopul şi se agită energic. Se lasă straturile să se separe şi se transferă stratul superior în pîlnia de separare. Se repetă procedura de extracţie cu încă 100 ml eter de petrol, apoi de două ori cu cantităţi de 50 ml eter de petrol şi se adaugă straturile de eter de petrol în pîlnia de separare.
Se spală extractele combinate de eter de petrol conform procedurii descrise în subpunctul 2.5.3.1. şi se procedează conform punctului menţionat.
2.5.4. Prepararea soluţiei de eşantion pentru HPLC
Se pipetează o parte alicotă din soluţia de eter de petrol (de la subpunctul 2.5.3.1. sau 2.5.3.2.) într-un balon piriform de 250 ml. Se evaporă solventul aproape în totalitate pe evaporatorul rotativ, cu presiune redusă, la o temperatură a băii de apă de maximum 40°C. Se restabileşte presiunea atmosferică prin admisie de azot, conform prevederilor subpunctului 2.3.9. şi se îndepărtează balonul de pe evaporatorul rotativ. Se elimină restul de solvent cu un curent de azot (a se vedea observaţia de la subpunctul 2.3.9.) şi se dizolvă imediat reziduul într-un volum cunoscut (10-100 ml) de metanol (concentraţia de DL-α-tocoferol trebuie să fie de ordinul a 5-30 μg/ml).
2.5.5. Determinarea prin HPLC
Vitamina E se separă pe o coloană C18 cu fază inversată (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.4.5.1.), iar concentraţia se măsoară cu un detector de fluorescenţă (excitaţie: 295 nm, emisie: 330 nm) sau cu un detector de UV (292 nm), conform prevederilor descrise în subpunctul 2.4.5.2.
Se injectează o parte alicotă (de exemplu 20 μl) din soluţia metanolică obţinută conform prevederilor indicate în subpunctul 2.5.4. şi se eluează cu faza mobilă (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.3.8.). Se calculează înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor pentru mai multe injectări ale aceleiaşi soluţii eşantion şi înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor pentru mai multe injectări ale soluţiilor de calibrare, conform prevederilor subpunctului 2.5.6.2.
Condiţii HPLC
Următoarele condiţii specificate în tabelul nr.2 sînt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica şi alte condiţii, dacă acestea conduc la rezultate echivalente.
|
Tabelul nr.2 Condiţii HPLC |
|
| Tehnica de măsurare | Valorile indicate |
| Coloana pentru cromatografie lichidă, conform specificaţiilor de la subpunctul 2.4.5.1. | 250 mm × 4 mm, C18, particule de 5 μm sau 10 μm sau echivalent |
| Faza mobilă (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.3.8.) | Amestec de metanol şi apă de exemplu 980 + 20 (v + v) |
| Debit | 1 -2 ml/minut |
| Detector (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.4.5.2.) | Detector de fluorescenţă (excitaţie: 295 nm/emisie: 330 nm) sau detector de UV (292 nm) |
2.5.6. Calibrarea (acetat de DL-α-tocoferol sau DL-α-tocoferol)
2.5.6.1. Etalon de acetat de DL-α-tocoferol
2.5.6.1.1. Prepararea soluţiei etalon de lucru
Se picură din pipetă 25 ml din soluţia stoc de acetat de DL-α-tocoferol (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.3.10.1.) într-un balon cu fundul plat sau într-un flacon tip Erlenmeyer, de 500 ml şi se hidrolizează conform procedurii descrise la subpunctul 2.5.2. Se realizează apoi extracţia cu eter de petrol conform descrierii de la sunpunctul 2.5.3. şi se completează pînă la 500 ml cu eter de petrol. Se lasă să se evapore 25 ml din acest extract aproape în totalitate în evaporatorul rotativ (a se vedea observaţia de la subpunctul 2.5.4.), se îndepărtează solventul rămas într-un curent de azot şi se dizolvă din nou reziduul în 25 ml de metanol. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 45,5 μg DL-α-tocoferol per ml, echivalent cu 50 μg acetat de DL-α-tocoferol per ml. Soluţia etalon de lucru trebuie să fie preparată imediat înainte de utilizare.
2.5.6.1.2. Prepararea soluţiilor de calibrare şi a curbei de calibrare
Se transferă 1, 2, 4 şi 10 ml din soluţia etalon de lucru într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează pînă la semn cu metanol şi se amestecă. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sînt 2,5, 5, 10 şi 25 μg/ml acetat de DL-α-tocoferol, echivalent cu 2,28, 4,55, 9,1 μg/ml şi 22,8 μg/ml DL-α-tocoferol.
Se injectează de mai multe ori cîte 20 μl din fiecare soluţie de calibrare şi se determină înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor. În funcţie de înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor, se trasează o curbă de calibrare.
2.5.6.1.3. Standardizarea UV (sub acţiunea razelor ultraviolete) a soluţiei stoc de acetat de DL-α-tocoferol (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.3.10.1.)
Se diluează 5 ml din soluţia stoc de acetat de DL-α-tocoferol în 25 ml de etanol şi se măsoară spectrul UV al acestei soluţii faţă de etanol în spectrofotometru, între 250 nm şi 320 nm.
Absorbţia maximă este de 284 nm:
E11% 1 cm = 43,6 la 284 nm în etanol
La această diluţie trebuie să se obţină o valoare de extincţie între 0,84 şi 0,88.
2.5.6.2. Etalonul de DL-α-tocoferol
2.5.6.2.1. Prepararea soluţiei etalon de lucru
Se pun cu pipeta 2 ml din soluţia stoc de DL-α-tocoferol într-un balon gradat de 50 ml, se dizolvă în metanol şi se completează pînă la semn cu metanol. Concentraţia nominală a acestei soluţii este de 40 μg DL-α-tocoferol per ml, echivalent cu 44 μg acetat DL-α-tocoferol per ml. Soluţia etalon de lucru trebuie să fie preparată imediat înainte de utilizare.
2.5.6.2.2. Prepararea soluţiilor de calibrare şi a curbei de calibrare
Se transferă 1, 2, 4 şi 10 ml din soluţia etalon de lucru într-o serie de baloane gradate de 20 ml, se completează pînă la semn cu metanol şi se amestecă. Concentraţiile nominale ale acestor soluţii sînt 2, 4, 8 şi 20 μg/ml DL-α-tocoferol, echivalent cu 2,2, 4,4, 8,79 μg/ml şi 22 μg/ml acetat de DL-α-tocoferol.
Se injectează de mai multe ori cîte 20 μl din fiecare soluţie de calibrare şi se determină înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor. În funcţie de înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor, se trasează o curbă de calibrare.
2.5.6.2.3. Standardizarea UV (sub acţiunea rezelor ultraviolete) a soluţiei stoc de DL-α-tocoferol (a se vedea observaţia de la subpunctul 2.3.11.1.)
Se diluează 2 ml din soluţia stoc de DL-α-tocoferol în 25 ml de etanol şi se măsoară spectrul UV al acestei soluţii faţă de etanol în spectrofotometru între 250 nm şi 320 nm.
Absorbţia maximă este de 292 nm:
E11% 1 cm = 75,8 la 292 nm în etanol
La această diluţie trebuie să se obţină o valoare de extincţie de 0,6.
2.6. Calcularea rezultatelor
Pornindu-se de la înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor de vitamina E ale soluţiei de eşantion, se determină concentraţia soluţiei de eşantion în μg/ml (calculată ca acetat de α-tocoferol) prin referire la curba de calibrare (vezi subpunctul 2.5.6.1.2. sau 2.5.6.2.2.).
Conţinutul w de vitamina E al eşantionului, exprimat în mg/kg, este dat de următoarea formulă:
w = 500 × c × V2/V1 × m [mg/kg],
unde:
c = concentraţia de vitamina E (ca acetat de α-tocoferol) al soluţiei de eşantion (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.5.4.) în μg/ml;
V1 = volumul soluţiei de eşantion (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.5.4.), în ml;
V2 = volumul părţii alicote luate conform subpunctului 2.5.4., în ml;
m = greutatea porţiunii de testat, în g.
2.7. Observaţii
2.7.1. Pentru eşantioanele cu o concentraţie redusă de vitamina E, poate fi utilă combinarea extractelor în eter de petrol provenite din două saponificări (cantitate cîntărită: 25 g) într-o soluţie de eşantion pentru determinarea prin HPLC.
2.7.2. Eşantionul prelevat pentru analiză nu conţine mai mult de 2 g de grăsime.
2.7.3. Dacă nu are loc separaţia fazelor, se adaugă cca 10 ml de etanol pentru a fragmenta emulsia.
2.7.4. Odată efectuată măsurătoarea spectrofotometrică a soluţiei de acetat de DL-α-tocoferol sau de DL-α-tocoferol, conform prevederilor subpunctului 2.5.6.1.3. sau 2.5.6.2.3., se adaugă cca 10 mg de 2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT) la soluţie (a se vedea menţiunea de la subpunctul 2.3.10.1.) şi se conservă soluţia la frigider (durata maximă de stocare patru săptămîni).
2.7.5. 2,6-di-terţ-butil-4-metilfenol (BHT) poate fi înlocuit cu hidrochinonă.
2.7.6. Utilizîndu-se o coloană în fază normală este posibilă separarea tocoferolilor α, β, γ şi δ.
2.7.7. Soluţia de ascorbat de sodiu poate fi înlocuită cu cca 150 mg de acid ascorbic.
2.7.8. Soluţia de sulfură de sodiu poate fi înlocuită cu cca 50 mg de EDTA.
2.7.9. Acetatul de vitamina E hidrolizează foarte rapid în condiţii alcaline fiind, prin urmare, foarte sensibil la oxidare, mai ales în prezenţa oligoelementelor, cum ar fi fierul sau cuprul. Determinarea vitaminei E în premixuri la niveluri de peste 5000 mg/kg ar avea drept consecinţă o degradare a vitaminei E. Prin urmare, pentru confirmare se recomandă o metodă HPLC care include o formulă pentru dizolvarea enzimatică a vitaminei E în absenţa fazei de saponificare alcalină.
2.8. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele realizate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 15% din rezultatul superior.
III. DETERMINAREA OLIGOELEMENTELOR FIER, CUPRU, MANGAN ŞI ZINC
3.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea oligoelementelor fier, cupru, mangan şi zinc din nutreţuri. Limitele de cuantificare sînt:
fier (Fe): 20 mg/kg;
cupru (Cu): 10 mg/kg;
mangan (Mn): 20 mg/kg;
zinc (Zn): 20 mg/kg.
3.2. Principiul de aplicare
Eşantionul este pus în soluţie de acid clorhidric după distrugerea materiei organice, dacă aceasta este prezentă. Se determină elementele fier, cupru, mangan şi zinc, după o diluare corespunzătoare, cu ajutorul spectrometriei de absorbţie atomică.
3.3. Reactivi utilizaţi
Pentru prepararea reactivilor şi a soluţiilor analitice se foloseşte apă fără cationii care urmează să fie determinaţi, obţinută fie prin distilarea dublă a apei într-un distilator din sticlă borosilicat sau din cuarţ, fie prin dublu tratament cu răşină schimbătoare de ioni.
Reactivii trebuie să fie cel puţin de calitate analitică. Absenţa elementului care urmează să fie determinat trebuie verificată într-un experiment martor. Dacă este necesar, reactivii trebuie să fie purificaţi în continuare.
3.3.1. Acid clorhidric (d: 1,19 g/ml).
3.3.2. Acid clorhidric (6 mol/litru).
3.3.3. Acid clorhidric (0,5 mol/litru).
3.3.4. Acid fluorhidric 38-40% (v/v) cu un conţinut de fier (Fe) de mai puţin de 1 mg/litru şi un reziduu după evaporare de mai puţin de 10 mg (ca sulfat)/litru.
3.3.5. Acid sulfuric (d: 1,84 g/ml).
3.3.6. Peroxid de hidrogen [circa 100 volume de oxigen (30% în greutate)].
3.3.7. Soluţie etalon de fier (1000 μg Fe/ml) preparată conform prevederilor descrise în subpunctul 3.3.7.1. sau o soluţie echivalentă folosită în comerţ: se dizolvă 1 g de sîrmă de fier în 200 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea observaţia de la subpunctul 3.3.2.), se adaugă 16 ml de peroxid de hidrogen şi se completează pînă la un litru cu apă.
3.3.7.1. Soluţie etalon de lucru de fier (100 μg Fe/ml) preparată diluînd o parte din soluţia etalon cu 9 părţi de apă.
3.3.8. Soluţie etalon de cupru (1000 μg Cu/ml) preparată conform indicaţiilor descrise în subpunctul 3.3.8.1. sau o soluţie echivalentă folosită în comerţ: se dizolvă 1 g de praf de cupru în 25 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea observaţia de la subpunctul 3.3.2.), se adaugă 5 ml de peroxid de hidrogen şi se completează pînă la un litru cu apă.
3.3.8.1. Soluţie etalon de cupru de lucru (10 μg Cu/ml) preparată diluînd o parte din soluţia standard (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.8.) cu 9 părţi de apă şi apoi diluînd o parte din soluţia rezultată cu 9 părţi de apă.
3.3.9. Soluţie etalon de mangan (1000 μg Mn/ml) preparată conform prevederilor descrise în subpunctul 3.3.9.1. sau o soluţie echivalentă folosită în comerţ: se dizolvă 1 g de praf de mangan în 25 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.2.) şi se completează pînă la un litru cu apă.
3.3.9.1. Soluţie etalon de lucru de mangan (10 μg Mn/ml) preparată diluînd o parte din soluţia etalon cu 9 părţi de apă şi apoi diluînd o parte din soluţia rezultată cu 9 părţi de apă.
3.3.10. Soluţie etalon de zinc (1000 μg Zn/ml) preparată conform indicaţiilor descrise în subpunctul 3.3.10.1. sau o soluţie echivalentă utilizată în comerţ: se dizolvă 1 g de zinc sub formă de benzi sau folii în 25 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.2.) şi se completează pînă la un litru cu apă.
3.3.10.1. Soluţie etalon de lucru de zinc (10 μg Zn/ml) preparată diluînd o parte din soluţia etalon cu 9 părţi de apă şi apoi diluînd o parte din soluţia rezultată cu 9 părţi de apă.
3.3.11. Soluţie de clorură de lantan: se dizolvă 12 g de oxid de lantan în 150 ml de apă, se adaugă 100 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.2.) şi se completează pînă la un litru cu apă.
3.4. Dispozitive
3.4.1. Cuptor cu muflă cu reglare de temperatură şi, preferabil, cu dispozitiv de înregistrare.
3.4.2. Sticlăria trebuie să fie de tip borosilicat rezistent şi se recomandă folosirea aparaturii rezervate exclusiv pentru determinarea oligoelementelor.
3.4.3. Spectrofotometru de absorbţie atomică care îndeplineşte cerinţele metodei cu privire la sensibilitatea şi precizia în intervalul necesar.
3.5. Procedura de preparare
Este important ca atunci cînd se măsoară oligoelementele să se ţină cont de riscul de contaminare, în special cu zinc, cupru şi fier. Din acest motiv, echipamentul folosit în cursul preparării eşantioanelor trebuie să nu conţină aceste metale.
Pentru reducerea riscului general de contaminare, se lucrează într-o atmosferă fără praf, folosind un echipament curăţat cu mare atenţie şi o sticlărie spălată cu grijă. Determinarea zincului este în mod special sensibilă la multe tipuri de contaminare, de exemplu prin intermediul sticlăriei, al reactivilor, al prafului etc.
Greutatea eşantionului care urmează să fie calcinat rezultă din cantitatea aproximativă de oligoelemente din nutreţuri în raport cu sensibilitatea spectrofotometrului folosit. Pentru anumite tipuri de nutreţuri, sărace în oligoelemente, poate fi necesar să se înceapă cu un eşantion de 10-20 g şi să se completeze soluţia finală numai pînă la 100 ml.
Arderea trebuie efectuată într-un cuptor închis fără injectare de aer sau de oxigen.
Temperatura indicată de pirometru nu trebuie să depăşească 475°C.
3.5.1. Eşantioane care conţin materie organică
3.5.1.1. Arderea şi prepararea soluţiei pentru analiză
3.5.1.1.1. Respectînd prevederile pct.3.5. se introduc 5-10 g de eşantion cîntărit cu o abatere de 0,2 mg într-un creuzet de cuarţ sau platină, se usucă într-un cuptor la 105°C şi se introduce creuzetul în cuptorul cu muflă neîncălzit. Se închide cuptorul şi se măreşte treptat temperatura pînă la 450-475°C, timp de circa 90 minute. Se menţine temperatura timp de 4-16 ore (de exemplu, peste noapte), pentru a îndepărta materialul carbonic şi apoi se deschide cuptorul şi se lasă să se răcească.
Se umezeşte cenuşa cu apă şi se transferă substanţa obţinută într-un pahar de laborator de 250 ml. Se spală creuzetul cu o cantitate totală de circa 5 ml de acid clorhidric (a se vedea observaţia de la subpunctul 3.3.1.) şi se adaugă acesta din urmă încet şi cu atenţie în paharul de laborator (poate apărea o reacţie puternică din cauza formării de CO2). Se adaugă acid clorhidric (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.1.), picătură cu picătură, agitîndu-se, pînă cînd efervescenţa încetează. Se evaporă pînă la uscare, agitîndu-se din cînd în cînd cu o baghetă de sticlă.
Se adaugă apoi 15 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea observaţia de la subpunctul 3.3.2.) la reziduu, apoi circa 120 ml de apă. Se amestecă cu bagheta de sticlă, care se lasă în paharul de laborator, şi se acoperă paharul cu o sticlă de ceas. Se aduce încet la fierbere şi se menţine la punctul de fierbere pînă cînd cenuşa se dizolvă complet. Se filtrează cu hîrtie de filtru lipsită de cenuşă şi se colectează filtratul într-un balon gradat de 250 ml. Se spală paharul de laborator şi se filtrează cu 5 ml de acid clorhidric 6 mol/litru fierbinte (a se vedea observaţia de la subpunctul 3.3.2.) şi de două ori cu apă fiartă. Se umple balonul gradat cu apă pînă la semn (concentraţia de HCl: circa 0,5 mol/litru).
3.5.1.1.2. Dacă reziduul din filtru este negru (cărbune), se reintroduce în cuptor şi se calcinează din nou la 450-475°C.
Calcinarea, care necesită numai cîteva ore (circa 3-5 ore), este completă cînd cenuşa este albă sau aproape albă.
Se dizolvă reziduul cu aproximativ 2 ml de acid clorhidric, conform prevederilor subpunctului 3.3.1., se evaporă pînă la uscare şi se adaugă 5 ml de acid clorhidric 6 mol/litru (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.2). Se încălzeşte, se filtrează soluţia în balonul gradat şi se umple cu apă pînă la semn (concentraţia HCl: circa 0,5 mol/litru).
3.5.1.2. Determinarea spectrofotometrică
3.5.1.2.1. Pregătirea soluţiilor de calibrare
Pentru fiecare dintre elementele care urmează să fie determinate se prepară din soluţiile etalon de lucru descrise în subpunctele 3.3.7.1., 3.3.8.1., 3.3.9.1. şi 3.3.10.1. o gamă de soluţii de calibrare, fiecare soluţie de calibrare avînd o concentraţie de HCl de aproximativ 0,5 mol/litru şi (în cazul fierului, manganului şi zincului) o concentraţie de clorură de lantan echivalentă cu 0,1% La (g/v).
Concentraţiile de oligoelemente selectate trebuie să se situeze în intervalul sensibilităţii spectrofotometrului utilizat. Tabelele nr.3, nr.4, nr.5 şi nr.6 indică compoziţiile unor seturi tipice de soluţii de calibrare.
|
Tabelul nr.3 Concentraţia de fier |
|||||||
| Unitatea de măsură | Valorile indicate | ||||||
| μg Fe/ml | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| ml de soluţie etalon de lucru (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.7.1.) (1 ml = 100 μg Fe) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| ml HCl (a se vedea menţiunea de la subpunctul 1.3.2.) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |
| + 10 ml de soluţie de clorură de lantan (descrisă în subpunctul 3.3.11.) şi se completează pînă la 100 ml cu apă | |||||||
|
Tabelul nr.4 Concentraţia de cupru |
|||||||
| Unitatea de măsură | Valorile indicate | ||||||
| μg Cu/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1 |
| ml de soluţie etalon de lucru (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.8.1.) (1 ml = 10 μg Cu) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| ml HCl (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.2.) | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 | 8 |
|
Tabelul nr.5 Concentraţia de mangan |
|||||||
| Unitatea de măsură | Valorile indicate | ||||||
| μg Mn/ml | 0 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1 |
| ml de soluţie etalon de lucru (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.9.1.) (1 ml = 10 μg Mn) | 0 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| ml HCl (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.2.) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |
| + 10 ml de soluţie de clorură de lantan (menţionată în subpunctul 3.3.11.) şi se completează pînă la 100 ml cu apă | |||||||
|
Tabelul nr.6 Concentraţia de Zinc |
|||||||
| Unitatea de măsură | Valorile indicate | ||||||
| μg Zn/ml | 0 | 0,05 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 |
| ml de soluţie etalon de lucru (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.10.1.) (1 ml = 10 μg Zn) | 0 | 0,5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 |
| ml HCl (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.2.) | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 | 7 |
| + 10 ml de soluţie de clorură de lantan (menţionată în subpunctul 3.3.11.) şi se completează pînă la 100 ml cu apă | |||||||
3.5.1.2.2. Prepararea soluţiei pentru analiză
Pentru determinarea cuprului, soluţia preparată la subpunctul 3.5.1.1. poate fi, în mod normal, folosită direct. Dacă este necesar să se obţină o concentraţie situată în intervalul soluţiilor de calibrare, o parte alicotă poate fi pipetată într-un balon gradat de 100 ml şi completată pînă la semn cu acid clorhidric 0,5 mol/litru (a se vedea menţiunea de la subpunctul 3.3.3.).
Pentru determinarea fierului, manganului şi zincului, se pipetează o parte alicotă din soluţia preparată la subpuntul 3.5.1.1. într-un balon gradat de 100 ml, se adaugă 10 ml de soluţie de clorură de lantan şi se completează pînă la semn cu acid clorhidric 0,5 mol/litru, specificat în subpunctul 3.3.3. (a se vedea punctul 3.8. din prezenta anexă).
3.5.1.2.3. Experiment martor
Experimentul martor trebuie să includă toate etapele prevăzute în procedura de preparare, cu excepţia faptului că materialul eşantion este omis. Soluţia de calibrare “0” nu trebuie să fie folosită ca martor.
3.5.1.2.4. Măsurarea absorbţiei atomice
Se măsoară absorbţia atomică a soluţiilor de calibrare şi a soluţiei care urmează să fie analizată folosind o flacără aer-acetilenă oxidantă, la următoarele lungimi de undă:
Fe: 248,3 nm
Cu: 324,8 nm
Mn: 279,5 nm
Zn: 213,8 nm
Fiecare măsurătoare se realizează de patru ori.
3.5.2. Nutreţuri minerale
Dacă eşantionul nu conţine materie organică, calcinarea prealabilă nu este necesară. Se procedează conform descrierii de la subpunctul 3.5.1.1.1. Evaporarea cu acid fluorhidric poate fi omisă.
3.6. Calcularea rezultatelor
Folosind o curbă de calibrare, se calculează concentraţia de oligoelemente în soluţia care urmează să fie analizată şi se exprimă rezultatul în mg de oligoelemente per kg de eşantion (ppm).
3.7. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion de către acelaşi laborant nu depăşeşte:
a) 5 mg/kg, în valoare absolută, pentru conţinutul de oligoelement în cauză pînă la 50 mg/kg;
b) 10% din valoarea superioară, pentru un conţinut de oligoelement în cauză de la 50 pînă la 100 mg/kg;
c) 10 mg/kg, în valoare absolută, pentru un conţinut de oligoelement în cauză de la 100 pînă la 200 mg/kg;
d) 5% din valoarea superioară, pentru un conţinut de oligoelement în cauză mai mare de 200 mg/kg.
3.8. Observaţii
Prezenţa de cantităţi mari de fosfaţi ar putea interfera cu determinarea fierului, manganului şi zincului. Astfel de interferenţe trebuie să fie corectate adăugînd soluţie de clorură de lantan. Dacă, însă, în eşantion, raportul de greutate Ca + Mg/P este > 2, adăugarea soluţiei de clorură de lantan la soluţia de analizat şi la soluţiile de calibrare poate fi omisă.
IV. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE HALOFUGINONĂ
DL-trans-7-brom-6-clor-3-[3-(3-hidroxi-2-piperidil)acetonil]-chinazolin-4-3H)-onă-hidrobromid
4.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea conţinutului de halofuginonă din nutreţuri. Limita de cuantificare este de 1 mg/kg.
4.2. Principiul de aplicare
După tratarea cu apă fierbinte, halofuginona se extrage ca bază liberă în acetat de etil şi ulterior se separă ca hidroclorid, într-o soluţie apoasă de acid. Extractul se purifică prin cromatografie prin schimb ionic. Conţinutul de halofuginonă se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă cu fază inversată (RP-HPLC), prin utilizarea unui detector de raze UV.
4.3. Reactivi utilizaţi
4.3.1. Acetonitril, de calitate HPLC.
4.3.2. Răşină Amberlit XAD-2.
4.3.3. Acetat de amoniu.
4.3.4. Acetat de etil.
4.3.5. Acid acetic glacial.
4.3.6. Substanţa etalon halofuginonă (DL-trans-7-brom-6-clor-3-[3-hidroxi-2-piperidil)acetonil]chinazolin-4-(3H)-onă hidrobromid, E 764)
4.3.6.1. Soluţie etalon stoc de halofuginonă, 100 μg/ml
Se cîntăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 50 mg de halofuginonă într-un balon gradat de 500 ml, apoi se dizolvă în soluţie tampon de acetat de amoniu, se completează pînă la semn cu soluţie tampon şi se amestecă. Această soluţie este stabilă timp de trei săptămîni, la 5°C, dacă este depozitată la întuneric.
4.3.6.2. Soluţii de calibrare
Se transferă 1, 2, 3, 4 şi 6 ml de soluţie etalon stoc într-o serie de baloane gradate de 100 ml. Se completează pînă la semn cu fază mobilă (a se vedea menţiunea de subpunctul 4.3.21.) şi se amestecă. Soluţiile au concentraţii de 1, 2, 3, 4 şi 6 μg/ml de halofuginonă. Aceste soluţii se prepară imediat înainte de utilizare.
4.3.7. Acid clorhidric (ρ20 aproximativ 1,16 g/ml).
4.3.8. Metanol.
4.3.9. Nitrat de argint.
4.3.10. Ascorbat de sodiu.
4.3.11. Carbonat de sodiu.
4.3.12. Clorură de sodiu.
4.3.13. EDTA (acid etilendiaminotetraacetic, sare disodică).
4.3.14. Apă, de calitate HPLC.
4.3.15. Soluţie de carbonat de sodiu, c = 10 g/100 ml.
4.3.16. Soluţie de carbonat de sodiu saturată cu clorură de sodiu, c = 5 g/100 ml
Se dizolvă 50 g de carbonat de sodiu în apă, se diluează pînă la 1 litru şi se adaugă clorură de sodiu pînă la saturarea soluţiei.
4.3.17. Acid clorhidric, aproximativ 0,1 mol/l
Se diluează 10 ml de HCl în apă pînă la 1 litru.
4.3.18. Soluţie tampon de acetat de amoniu, aproximativ 0,25 mol/l
Se dizolvă 19,3 g de acetat de amoniu şi 30 ml de acid acetic glacial în apă de calitate HPLC şi se diluează pînă la 1 litru.
4.3.19. Prepararea răşinii de Amberlit XAD-2
Se spală cu apă o cantitate corespunzătoare de Amberlit, pînă la îndepărtarea tuturor ionilor de clor, după cum indică testul cu nitrat de argint, conform prevederilor subpunctului 4.3.20., efectuat pe faza apoasă eliminată. Apoi se spală răşina cu 50 ml de metanol, se elimină metanolul şi se depozitează răşina în metanol proaspăt.
4.3.20. Soluţie de nitrat de argint, aproximativ 0,1 mol/l
Se dizolvă 0,17 g de nitrat de argint în 10 ml de apă.
4.3.21. Fază mobilă HPLC
Se amestecă 500 ml de acetonitril, de calitate HPLC cu 300 ml soluţie tampon de acetat de amoniu şi 1200 ml de apă, de calitate HPLC. Se aduce pH-ul la valoarea 4,3 folosind acid acetic glacial. Se trece printr-un filtru de 0,22 μm (a se vedea menţiunea de la subpunctul 4.4.8.) şi se degazează soluţia (de exemplu prin ultrasonare timp de 10 minute). Această soluţie este stabilă timp de o lună dacă este depozitată într-un recipient închis, la întuneric.
4.4. Dispozitive
4.4.1. Baie cu ultrasunete.
4.4.2. Evaporator rotativ cu generare de film.
4.4.3. Centrifugă.
4.4.4. Echipament HPLC cu detector de raze UV cu lungimi de undă variabile sau detector cu grup de diode
4.4.4.1. Coloană pentru cromatografie lichidă, 300 mm × 4 mm, C18, particule de 10 μm sau o coloană echivalentă.
4.4.5. Coloană de sticlă (300 mm × 10 mm) prevăzută cu filtru de sticlă sinterizată şi cu robinet de închidere.
4.4.6. Filtre din fibră de sticlă, cu diametru de 150 mm.
4.4.7. Filtre cu membrană de 0,45 μm.
4.4.8. Filtre cu membrană de 0,22 μm.
4.5. Procedura de preparare
Halofuginona ca bază liberă este instabilă în soluţii alcaline sau de acetat de etil. Ea nu trebuie să rămînă în acetat de etil mai mult de 30 de minute.
4.5.1. Aspecte generale
4.5.1.1. Se analizează un nutreţ martor pentru a verifica absenţa halofuginonei şi a substanţelor interferente.
4.5.1.2. Se efectuează un test de recuperare prin analiza nutreţului martor care a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de halofuginonă, similară cu cea prezentă în eşantion. Pentru a obţine o concentraţie de 3 mg/kg se adaugă 300 μl din soluţia etalon stoc la 10 g de nutreţ martor, se amestecă şi se aşteaptă 10 minute înainte de a se începe etapa de extracţie, conform prevederilor descrise în subpunctul 4.5.2.
Conform acestei metode, nutreţul martor este similar, ca tip, cu eşantionul, iar la analiză nu se detectează halofuginonă.
4.5.2. Procedura de extracţie
Se cîntăresc, cu o abatere de 0,1 g, 10 g de eşantion preparat, într-un tub de centrifugă de 200 ml, se adaugă 0,5 g de ascorbat de sodiu, 0,5 g de EDTA (acid etilendiaminotetraacetic, sare disodică) şi 20 ml de apă, apoi se amestecă. Se plasează tubul într-o baie de apă timp de 5 minute (80°C). După răcire la temperatura camerei se adaugă 20 ml soluţie de carbonat de sodiu şi se amestecă. Se adaugă imediat 100 ml de acetat de etil şi se agită energic cu mîna timp de 15 secunde. Apoi tubul se aşează într-o baie cu ultrasunete timp de 3 minute şi se slăbeşte dopul. Se centrifughează timp de 2 minute şi se decantează faza de acetat de etil printr-un filtru de fibră de sticlă, într-o pîlnie de separare de 500 ml. Se repetă extracţia eşantionului cu o a doua cantitate de 100 ml acetat de etil. Se spală extractele combinate timp de 1 minut cu 50 ml de soluţie de carbonat de sodiu saturată cu clorură de sodiu şi se îndepărtează stratul apos.
Se extrage stratul organic timp de 1 minut cu 50 ml de acid clorhidric. Se trece stratul inferior de acid printr-o pîlnie de separare de 250 ml. Se extrage din nou stratul organic timp de 1,5 minute, cu o altă cantitate de 50 ml acid clorhidric, apoi se combină cu primul extract. Se spală extractele de acid combinate prin agitare circulară timp de aproximativ 10 secunde cu 10 ml de acetat de etil.
Se transferă cantitativ stratul apos într-un balon cu fund rotund de 250 ml şi se îndepărtează faza organică. Se evaporă din soluţia acidă tot acetatul de etil rămas utilizînd un evaporator rotativ cu generare de film.
Temperatura băii de apă trebuie să nu depăşească 40°C. În condiţiile unei presiuni de aproximativ 25 mbar întreaga cantitate de acetat de etil rezidual se îndepărtează în 5 minute la 38°C.
4.5.3. Curăţarea
4.5.3.1. Pregătirea coloanei de Amberlit
Pentru fiecare extract de eşantion se pregăteşte cîte o coloană XAD-2. Se transferă 10 g de Amberlit preparat într-o coloană de sticlă cu metanol. Se adaugă un dop mic de vată de sticlă deasupra patului de răşină. Se scurge metanolul din coloană şi se spală răşina cu 100 ml de apă, oprind fluxul pe măsură ce lichidul ajunge la partea superioară a patului de răşină. Se lasă coloana să se echilibreze timp de 10 minute înainte de utilizare. Niciodată nu se lasă coloana să se usuce.
4.5.3.2. Curăţarea eşantionului
Se transferă cantitativ extractul, obţinut conform prevederilor subpunctului 4.5.2. în partea superioară a coloanei de Amberlit preparată şi se eluează, îndepărtînd apoi eluatul. Rata de eluare nu trebuie să depăşească 20 ml/minut. Se clăteşte balonul cu fund rotund cu 20 ml de acid clorhidric, apoi acesta se foloseşte pentru spălarea coloanei de răşină. Se suflă orice urmă de soluţie acidă rămasă cu ajutorul unui curent de aer. Se îndepărtează lichidele de spălare. Se adaugă 100 ml de metanol în coloană şi se eluează 5-10 ml; se colectează eluatul într-un balon cu fundul rotund de 250 ml. Se lasă metanolul rămas timp de 10 minute să se echilibreze cu răşina şi se continuă eluarea la o rată care să nu depăşească 20 ml/minut, colectînd eluatul în acelaşi balon cu fundul rotund. Se evaporează metanolul pe evaporatorul rotativ cu generare de film; temperatura băii de apă trebuie să nu depăşească 40°C. Se transferă cantitativ reziduul într-un balon gradat de 10 ml, utilizînd faza mobilă HPLC. Se completează pînă la semn cu ajutorul fazei mobile şi se amestecă. Se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană.
Această soluţie se păstrează pentru determinarea prin HPLC (a se vedea menţiunea de la subpunctul 4.5.4.).
4.5.4. Determinarea prin HPLC
4.5.4.1. Parametrii admisibili
Următoarele condiţii specificate în tabelul nr.7 sînt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica şi alte condiţii, dacă acestea duc la rezultate echivalente.
|
Tabelul nr.7 Condiţii HPLC |
|
| Tehnica de măsurare | Valorile indicate |
| Coloana pentru cromatografie lichidă | 300 mm × 4 mm, C18, particule de 10 μm sau o coloană echivalentă |
| Faza mobilă | Amestec descris în subpunctul 1.3.21. |
| Debit | 1,5-2 ml/minut |
| Lungimea undei de detecţie | 243 nm |
| Volum de injecţie | 40-100 μl. |
Stabilitatea sistemului cromatografic se verifică prin injectarea de mai multe ori a soluţiei de calibrare, conţinînd 3 μg/ml, pînă la obţinerea de înălţimi (sau de arii) ale vîrfurilor şi de timpi de retenţie constanţi.
4.5.4.2. Curba de calibrare
Se injectează fiecare soluţie de calibrare de mai multe ori şi se determină înălţimile (ariile) vîrfurilor pentru fiecare concentraţie. Se trasează o curbă de calibrare utilizînd înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor soluţiilor de calibrare ca ordonate şi concentraţiile corespunzătoare, în μg/ml, ca abscise.
4.5.4.3. Soluţia de eşantion
Se injectează extractul de eşantion (a se vedea menţiunea de la subpunctul 4.5.3.2.) de mai multe ori, utilizînd acelaşi volum ca cel utilizat pentru soluţiile de calibrare şi se determină înălţimea (aria) medie a vîrfurilor pentru vîrfurile de halofuginonă.
4.6. Calcularea rezultatelor
Concentraţia soluţiei de eşantion în μg/ml se determină plecînd de la înălţimea (aria) medie a vîrfurilor de halofuginonă a soluţiei de eşantion prin referire la curba de calibrare.
Conţinutul de halofuginonă w (mg/kg) al eşantionului este dat de formula următoare:
w = c × 10/m,
unde:
c = concentraţia de halofuginonă din soluţia de eşantion, în μg/ml;
m = greutatea porţiunii de testat, în grame.
4.7. Validarea rezultatelor
4.7.1. Identitatea
Identitatea analitului poate fi confirmată prin cocromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode cu care se compară spectrul extractului de eşantion cu cel al soluţiei de calibrare, care conţine 6 μg/ml.
4.7.1.1. Cocromatografie
Un extract de eşantion este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare de soluţie de calibrare. Cantitatea de halofuginonă adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea estimată de halofuginonă găsită în extractul de eşantion.
După luarea în considerare atît a cantităţii adăugate, cît şi a diluţiei extractului, creşte numai înălţimea vîrfului de halofuginonă. Lărgimea vîrfului, la jumătate din înălţimea sa maximă, trebuie să se încadreze într-o variaţie de ± 10% din lărgimea originală.
4.7.1.2. Detecţia cu grup de diode
Rezultatele se evaluează după următoarele criterii:
a) lungimea de undă a absorbţiei maxime a spectrelor eşantionului şi a etalonului, înregistrată la vîrful cel mai înalt al cromatogramei, trebuie să fie aceeaşi într-o marjă determinată de puterea de rezoluţie a sistemului de detecţie. Pentru detecţia cu grup de diode, aceasta este de obicei de ± 2 nm;
b) între 225 şi 300 nm, spectrele eşantionului şi ale etalonului, înregistrate la vîrful cel mai înalt al cromatogramei, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci cînd sînt prezente aceleaşi maxime şi cînd deviaţia dintre două spectre nu depăşeşte în niciun punct observat 15% din absorbanţa analitului etalon;
c) între 225 şi 300 nm, spectrele curbei ascendente, ale punctului maxim şi ale curbei descendente ale vîrfului produs de extractul de eşantion nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci cînd sînt prezente aceleaşi maxime şi cînd deviaţia dintre două spectre nu depăşeşte în nici-un punct observat 15% din absorbanţa spectrului punctului maxim.
Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa analitului nu a fost confirmată.
4.7.2. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 0,5 mg/kg pentru un conţinut de halofugiononă de pînă la 3 mg/kg.
4.7.3. Procedura de recuperare
Pentru eşantionul martor îmbogăţit se realizează o recuperare de minimum 80%.
V. DETERMINAREA ROBENIDINEI
Clorhidrat de 1,3-bis[(4-clorbenziliden)amino]guanidin
5.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea conţinutului de robenidină din nutreţuri. Limita de cuantificare este de 5 mg/kg.
5.2. Principiul de aplicare
Eşantionul se extrage cu metanol acidifiat. Extractul se usucă şi o parte alicotă se curăţă într-o coloană de oxid de aluminiu. Robenidina se eluează din coloană cu metanol, se concentrează şi se completează pînă la un volum adecvat cu fază mobilă. Conţinutul de robenidină se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă cu fază inversată (RP-HPLC), utilizînd un detector de radiaţii UV.
5.3. Reactivi utilizaţi
5.3.1. Metanol.
5.3.2. Metanol acidifiat
Se transferă 4 ml de acid clorhidric (ρ20 = 1,18 g/ml) într-un balon gradat de 500 ml, se completează pînă la semn cu metanol şi se amestecă. Soluţia se prepară imediat înainte de utilizare.
5.3.3. Acetonitril, de calitate HPLC.
5.3.4. Sită moleculară
Tip 3A, 8-12 noduri ale sitei (noduri de 1,6-2,5 mm, aluminosilicat cristalin, diametrul porilor 0,3 mm).
5.3.5. Oxid de aluminiu, activitate acidă grad I pentru cromatografia pe coloană
Se transferă 100 g de oxid de aluminiu într-un recipient adecvat şi se adaugă 2 ml de apă. Se închide şi se agită aproximativ 20 de minute. Se păstrează într-un recipient bine închis.
5.3.6. Soluţie de fosfat diacid de potasiu, c = 0,025 mol/l
Se dizolvă 3,4 g de fosfat diacid de potasiu în apă (de calitate HPLC), într-un balon gradat de 1000 ml, se completează pînă la semn şi se amestecă.
5.3.7. Soluţie de fosfat acid disodic, c = 0,025 mol/l
Se dizolvă 3,55 g de fosfat acid disodic anhidru (sau 4,45 g de dihidrat sau 8,95 g de dodecahidrat) în apă (de calitate HPLC), într-un balon gradat de 1 litru, se completează pînă la semn şi se amestecă.
5.3.8. Fază mobilă HPLC
Se amestecă următorii reactivi:
650 ml de acetonitril, de calitate HPLC;
250 ml apă (de calitate HPLC);
50 ml soluţie de fosfat diacid de potasiu;
50 ml soluţie de fosfat acid disodic.
Se trece printr-un filtru de 0,22 μm (a se vedea menţiunea de la subpunctul 5.4.6.) şi se degazează soluţia (de exemplu, prin ultrasonare timp de 10 minute).
5.3.9. Substanţa etalon
Robenidină pură: clorhidrat de 1,3-bis[(4-clorobenziliden)amino]guanidin.
5.3.9.1. Soluţia etalon stoc de robenidină: 300 μg/ml
Se cîntăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 30 mg de substanţă etalon de robenidină pură. Se dizolvă în metanol acidifiat într-un balon gradat de 100 ml, se completează pînă la semn cu acelaşi solvent şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu şi se păstrează la întuneric.
5.3.9.2. Soluţie etalon intermediară de robenidină : 12 μg/ml
Se transferă 10 ml din soluţia etalon stoc într-un balon gradat de 250 ml, se completează pînă la semn cu faza mobilă HPLC şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu şi se păstrează la întuneric.
5.3.9.3. Soluţii de calibrare
Se transferă 5, 10, 15, 20 şi 25 ml de soluţie etalon intermediară într-o serie de baloane gradate de 50 ml.
Se completează pînă la semn cu fază mobilă şi se amestecă. Aceste soluţii corespund concentraţiilor de 1,2, 2,4, 3,6, 4,8 şi 6 μg/ml de robenidină. Soluţiile se prepară imediat înainte de a fi utilizate.
5.3.10. Apă de calitate HPLC.
5.4. Dispozitive
5.4.1. Coloană de sticlă
Construită din sticlă brună, prevăzută cu robinet de închidere şi un rezervor cu capacitatea de aproximativ 150 ml, diametru interior 10-15 mm, lungime 250 mm.
5.4.2. Agitator mecanic sau magnetic.
5.4.3. Evaporator rotativ cu generare de film.
5.4.4. Echipament HPLC cu detector de radiaţii UV cu lungimi de undă variabile sau cu detector cu grup de diode care funcţionează în intervalul 250-400 nm
5.4.4.1. Coloană pentru cromatografie lichidă: 300 mm × 4 mm, C18, particule de 10 μm sau echivalent.
5.4.5. Hîrtie de filtru din fibră de sticlă (Whatman GF/A sau echivalentă).
5.4.6. Filtre cu membrană, 0,22 μm.
5.4.7. Filtre cu membrană, 0,45 μm.
5.5. Procedura de preparare
Robenidina este sensibilă la lumină. Pentru toate operaţiile se foloseşte sticla brună.
5.5.1. Aspecte generale
5.5.1.1. Se analizează un nutreţ martor pentru a verifica absenţa robenidinei şi a substanţelor interferente.
5.5.1.2. Se efectuează un test de recuperare prin analizarea nutreţului martor care a fost îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de robenidină, similară cu cea prezentă în eşantion. Pentru a obţine o concentraţie de 60 mg/kg, se transferă 3 ml din soluţia etalon stoc într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml. Se evaporă soluţia pînă la cca 0,5 ml într-un curent de azot. Se adaugă 15 g din nutreţul martor, se amestecă şi se aşteaptă 10 minute înainte de a se începe etapa de extracţie, conform prevederilor subpunctului 5.5.2.
Pentru această metodă, nutreţul martor este similar, ca tip, cu eşantionul, iar la analiză nu se detectează robenidină.
5.5.2. Procedura de extracţie
Se cîntăresc cu o abatere de 0,01 g, aproximativ 15 g de eşantion preparat. Se transferă într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml şi se adaugă 100 ml metanol acidifiat, se închide şi se agită timp de 1 oră în agitator. Se filtrează soluţia prin hîrtie de filtru din fibră de sticlă şi se colectează întregul filtrat într-un flacon tip Erlenmeyer de 150 ml. Se adaugă 7,5 g de sită moleculară, se închide şi se agită timp de 5 minute. Se filtrează imediat prin hîrtie de filtru din fibră de sticlă. Se conservă această soluţie pentru etapa de purificare (a se vedea observaţia de la subpunctul 5.5.3.).
5.5.3. Procedura de purificare
5.5.3.1. Pregătirea coloanei de oxid de aluminiu
Se introduce un tampon mic de vată de sticlă în capătul inferior al coloanei de sticlă şi se împinge utilizînd o baghetă de sticlă. Se cîntăresc 11 g din oxidul de aluminiu preparat şi se transferă în coloană. Pe parcursul acestei etape este important ca expunerea la aer să fie redusă la minimum. Se loveşte uşor coloana încărcată în partea inferioară pentru a permite stabilizarea oxidului de aluminiu.
5.5.3.2. Purificarea eşantionului
Se transferă în coloană cu pipeta 5 ml de extract de eşantionul preparat, conform prevederilor descrise în subpunctul 5.5.2. Vîrful pipetei se menţine aproape de peretele coloanei şi se permite ca soluţia să fie absorbită de oxidul de aluminiu. Se eluează robenidina din coloană folosind 100 ml metanol, cu un debit de 2-3 ml/minut şi se colectează eluatul într-un balon cu fundul rotund de 250 ml. Se evaporă soluţia de metanol pînă la uscare sub presiune redusă la 40°C, prin intermediul unui evaporator rotativ cu generare de film. Se redizolvă reziduul în 3-4 ml de fază mobilă HPLC şi se transferă cantitativ într-un balon gradat de 10 ml. Se clăteşte balonul de mai multe ori cu cantităţi de 1-2 ml de fază mobilă şi se transferă lichidul de clătire în balonul gradat. Se completează pînă la semn cu acelaşi solvent şi se amestecă. Se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană de 0,45 μm. Această soluţie se păstrează pentru determinarea prin HPLC.
5.5.4. Determinarea prin HPLC
5.5.4.1. Parametrii admisibili
Următoarele condiţii specificate în tabelul nr.8 sînt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica şi alte condiţii, dacă acestea conduc la rezultate echivalente.
|
Tabelul nr.8 Condiţii HPLC |
|
| Tehnica de măsurare | Valorile indicate |
| Coloana pentru cromatografie lichidă | 300 mm × 4 mm, C18, particule de 10 μm sau echivalent |
| Faza mobilă | Amestec descris în subpunctul 5.3.8. |
| Debit | 1,5 -2 ml/minut |
| Lungimea undei de detecţie | 317 nm |
| Volum de injecţie | 20-50 μl. |
Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, prin injectarea de mai multe ori a soluţiei de calibrare care conţine 3,6 μg/ml, pînă la obţinerea de valori de vîrf şi de timpi de retenţie constanţi.
5.5.4.2. Curba de calibrare
Fiecare soluţie de calibrare se injectează de mai multe ori şi se determină înălţimile (ariile) vîrfurilor pentru fiecare concentraţie. Se trasează o curbă de calibrare utilizînd înălţimile sau ariile medii ale vîrfurilor soluţiilor de calibrare ca ordonate şi concentraţiile corespunzătoare, în μg/ml, ca abscise.
5.5.4.3. Soluţia de eşantion
Se injectează de mai multe ori extractul de eşantion, obţinut conform prevederilor subpunctului 5.5.3.2., folosind acelaşi volum ca şi în cazul soluţiilor de calibrare şi se determină înălţimea (aria) medie a vîrfurilor pentru vîrfurile de robenidină.
5.6. Calcularea rezultatelor
Din înălţimea (aria) medie a vîrfurilor robenidinei din soluţia de eşantion se determină concentraţia în μg/ml a soluţiei de eşantion prin referire la curba de calibrare.
Conţinutul de robenidină w (mg/kg) din eşantion este dat de formula următoare:
w = c × 200/m,
unde:
c = concentraţia de robenidină din soluţia de eşantion, în μg/ml;
m = greutatea porţiunii de testat, în grame.
5.7. Validarea rezultatelor
5.7.1. Identitatea
Identitatea analitului poate fi confirmată prin cocromatografie sau prin folosirea unui detector cu grup de diode, prin intermediul căruia se compară spectrul extractului de eşantion şi cel al soluţiei de calibrare conţinînd 6 μg/ml.
5.7.1.1. Cocromatografie
Un extract de eşantion se îmbogăţeşte prin adăugarea unei cantităţi adecvate de soluţie de calibrare.
Cantitatea de robenidină adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea estimată de robenidină constatată în extractul de eşantion.
Numai înălţimea vîrfului de robenidină creşte după luarea în considerare a cantităţii adăugate şi a diluţiei extractului. Lărgimea vîrfului la jumătatea înălţimii sale maxime trebuie să se încadreze într-o variaţie de aproximativ 10% din lărgimea iniţială.
5.7.1.2. Detecţia cu grup de diode
Rezultatele se evaluează după următoarele criterii:
a) lungimea de undă a absorbţiei maxime a spectrelor eşantionului şi a etalonului, înregistrată la vîrful cel mai înalt al cromatogramei, trebuie să fie aceeaşi, într-o marjă determinată de puterea de rezoluţie a sistemului de detecţie. Pentru detectarea cu grup de diode, aceasta este în mod normal de aproximativ 2 nm;
b) între 225 şi 400 nm, spectrele eşantionului şi ale etalonului, înregistrate la vîrful cel mai înalt al cromatogramei, nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci cînd sînt prezente aceleaşi maxime şi cînd deviaţia dintre două spectre nu depăşeşte în nici-un punct observat 15% din absorbanţa analitului etalon;
c) între 225 şi 400 nm, spectrele curbei ascendente, ale punctului maxim şi ale curbei descendente ale vîrfului produs de extractul de eşantion nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci cînd sînt prezente aceleaşi maxime şi cînd deviaţia dintre spectre nu depăşeşte în niciun punct observat 15% din absorbanţa spectrului punctului maxim.
Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa analitului nu a fost confirmată.
5.7.2. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească 10% din valoarea superioară, pentru un conţinut de robenidină mai mare de 15 mg/kg.
5.7.3. Procedura de recuperare
Pentru un eşantion martor îmbogăţit, recuperarea este de cel puţin 85%.
VI. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE DICLAZURIL
(+)-4-clorfenil [2,6-diclor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2yl)fenil]-acetonitril
6.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea conţinutului de diclazuril din nutreţuri şi premixuri. Limita de detecţie este de 0,1 mg/kg, iar limita de cuantificare este de 0,5 mg/kg.
6.2. Principiul de aplicare
După adăugarea unui standard intern, eşantionul este extras cu metanol acidifiat. Pentru nutreţuri, o parte alicotă a extractului este purificată pe un cartuş C18 pentru extracţie în fază solidă. Diclazurilul este eluat din cartuş cu un amestec de metanol acidifiat şi apă. După evaporare, reziduul se dizolvă într-un amestec DMF/apă. Pentru premixuri, extractul se evaporă şi reziduul se dizolvă într-un amestec DMF/apă. Conţinutul de diclazuril se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC) cu gradient ternar şi cu fază inversată, prin utilizarea unui detector UV.
6.3. Reactivi utilizaţi
6.3.1. Apă, de calitate HPLC.
6.3.2. Acetat de amoniu.
6.3.3. Sulfat acid de tetrabutilamoniu (TBHS).
6.3.4. Acetonitril, de calitate HPLC.
6.3.5. Metanol, de calitate HPLC.
6.3.6. N,N-dimetilformamidă (DMF).
6.3.7. Acid clorhidric, ρ20 = 1,19 g/ml.
6.3.8. Substanţă etalon: diclazuril II-24: (+)-4-clorfenil [2,6 diclor-4-(2,3,4,5-tetrahidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-il) fenil] acetonitril, cu puritate garantată, E771
6.3.8.1. Soluţie etalon stoc de diclazuril, 500 μg/ml
Se cîntăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 25 mg de substanţă etalon de diclazuril într-un balon gradat de 50 ml.
Se dizolvă în N,N-dimetilformamidă (DMF), se completează pînă la semn cu N,N-dimetilformamidă (DMF) şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o temperatură ≤ 4°C, soluţia este stabilă timp de o lună.
6.3.8.2. Soluţia etalon de diclazuril, 50 μg/ml
Se transferă 5 ml din soluţia etalon stoc de diclazuril într-un balon gradat de 50 ml, se completează pînă la semn cu N,N-dimetilformamidă (DMF) şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o temperatură ≤ 4°C, soluţia este stabilă timp de o lună.
6.3.9. Substanţă etalon internă: 2,6 diclor-α-(4-clorfenil)-4-[4,5-dihidro-3,5-dioxo-1,2,4-triazină-2 (3H)-il]α-metilben-zen-acetonitril
6.3.9.1. Soluţie etalon stoc internă de diclazuril, 500 μg/ml
Se cîntăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 25 mg de substanţă etalon internă într-un balon gradat de 50 ml. Se dizolvă în N,N-dimetilformamidă (DMF), se completează pînă la semn cu N,N-dimetilformamidă (DMF) şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o temperatură ≤ 4°C, soluţia este stabilă timp de o lună.
6.3.9.2. Soluţie etalon internă, 50 μg/ml
Se transferă 5 ml din soluţia etalon stoc internă de etalon intern (a se vedea menţiunea de la subpunctul 6.3.9.1.) într-un balon gradat de 50 ml, se completează pînă la semn cu N,N-dimetilformamidă (DMF) şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o temperatură ≤ 4°C, soluţia este stabilă timp de o lună.
6.3.9.3. Soluţie etalon internă pentru premixuri, p/1 000 mg/ml
(p = conţinut nominal în diclazuril al premixului în mg/kg)
Se cîntăresc, cu o abatere de 0,1 mg, p/10 mg de substanţă etalon internă într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în N,N-dimetilformamidă (DMF) într-o baie cu ultrasunete, conform prevederilor subpunctului 6.4.6., se completează pînă la semn cu N,N-dimetilformamidă (DMF) şi se amestecă. Se împachetează balonul în folie de aluminiu sau se utilizează un balon de culoare brună şi se depozitează în frigider. La o temperatură ≤ 4°C, soluţia este stabilă timp de o lună.
6.3.10. Soluţie de calibrare, 2 μg/ml
Se pipetează 2 ml din soluţia etalon de diclazuril (a se vedea menţiunea de la subpunctul 6.3.8.2) şi 2 ml din soluţia etalon internă, specificată în subpunctul 6.3.9.2., într-un balon gradat de 50 ml. Se adaugă 16 ml de N,N-dimetilformamidă (DMF), se completează pînă la semn cu apă şi se amestecă. Soluţia trebuie preparată imediat înainte de utilizare.
6.3.11. Cartuş C18 pentru extracţie în fază solidă, de exemplu Bond Elut, mărime: 1 cc, greutatea absorbentului: 100 mg.
6.3.12. Solvent de extracţie: metanol acidifiat
Se pipetează 5 ml de acid clorhidric în 1 000 ml de metanol, de calitate HPLC şi se amestecă.
6.3.13. Fază mobilă pentru HPLC
6.3.13.1. Eluent A: acetat de amoniu – soluţie de sulfat acid de tetrabutilamoniu.
Se dizolvă 5 g de acetat de amoniu şi 3,4 g de sulfat acid de tetrabutilamoniu (TBHS) în 1000 ml de apă, de calitate HPLC şi se amestecă.
6.3.13.2. Eluent B: acetonitril, de calitate HPLC.
6.3.13.3. Eluent C: metanol, de calitate HPLC.
6.4. Dispozitive
6.4.1. Agitator mecanic.
6.4.2. Echipament pentru HPLC cu gradient ternar
6.4.2.1. Coloană pentru cromatografie lichidă, Hypersil ODS, particule de 3 μm, 100 mm × 4,6 mm sau echivalent.
6.4.2.2. Detector UV cu ajustare variabilă a lungimii de undă sau detector cu grup de diode.
6.4.3. Evaporator rotativ cu generare de film.
6.4.4. Filtru cu membrană, 0,45 μm.
6.4.5. Distribuitor în vid.
6.4.6. Baie cu ultrasunete.
6.5. Procedura de preparare
6.5.1. Aspecte generale
6.5.1.1. Nutreţ martor
Se analizează un nutreţ martor pentru a verifica absenţa diclazurilului şi a substanţelor interferente. Nutreţul martor este similar, ca tip, cu eşantionul, iar prin analiză nu se detectează nici diclazuril, nici substanţe interferente.
6.5.1.2. Test de recuperare
Se efectuează un test de recuperare prin analiza nutreţului martor îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de diclazuril, similară cu cea prezentă în eşantion. Pentru a obţine o concentraţie de 1 mg/kg, se adaugă 0,1 ml din soluţia etalon stoc, conform prevederilor subpunctului 6.3.8.1., la 50 g din nutreţul martor, se amestecă bine şi se lasă timp de 10 minute, amestecînd din nou de mai multe ori înainte de a continua (a se vedea menţiunea de la subpunctul 6.5.2).
Alternativ, dacă nu este disponibil un nutreţ martor similar, ca tip, cu eşantionul (a se vedea prevederile descrise în subpunctul 6.5.1.1), testul de recuperare poate fi efectuat prin metoda standard de adăugare a etalonului. În acest caz, eşantionul de analizat se îmbogăţeşte adăugînd o cantitate de diclazuril similară celei deja prezente în eşantion. Acest eşantion este analizat împreună cu eşantionul neîmbogăţit, iar recuperarea poate fi calculată prin scădere.
6.5.2. Procedura de extracţie
6.5.2.1. Nutreţuri
Se cîntăresc, cu o abatere de 0,01 g, aproximativ 50 g de eşantion. Se transferă într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml, se adaugă 1 ml din soluţia etalon internă (a se vedea subpunctul 6.3.9.2.), 200 ml din solventul de extracţie şi se astupă flaconul. Se agită amestecul în agitator mecanic pe parcursul nopţii. Se lasă să se sedimenteze timp de 10 minute. Se transferă o parte alicotă de 20 ml din supernatant într-un recipient de sticlă adecvat şi se diluează în 20 ml apă.
Se transferă această soluţie într-un cartuş de extracţie, specificat în subpunctul 6.3.11. şi se trece prin acesta prin aplicare de vid (a se vedea subpunctul 6.4.5.). Se spală cartuşul cu 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracţie: metanol acidifiat şi apă, 65 + 35 (V + V). Se elimină fracţiunile colectate şi se eluează compuşii cu ajutorul a 25 ml dintr-un amestec de solvent de extracţie şi apă, 80 + 20 (V + V). Se evaporă această fracţiune pînă la uscare prin intermediul evaporatorului rotativ la 60°C. Se dizolvă reziduul în 1 ml N,N-dimetilformamidă (DMF), se adaugă 1,5 ml de apă, de calitate HPLC şi se amestecă. Se filtrează cu un filtru cu membrană. Se continuă cu determinarea prin HPLC, conform prevederilor subpunctului 6.5.3.
6.5.2.2. Premixuri
Se cîntăresc, cu o abatere de 0,001 g, aproximativ 1 g de eşantion. Se transferă într-un flacon tip Erlenmeyer de 500 ml, se adaugă 1 ml din soluţia etalon internă (a se vedea menţiunea de la subpunctul 6.3.9.3.) şi 200 ml din solventul de extracţie şi se astupă flaconul. Se agită amestecul în agitator mecanic pe parcursul nopţii. Se lasă să se sedimenteze timp de 10 minute. Se transferă o parte alicotă de 10000/p ml (p = conţinutul nominal în diclazuril al premixului în mg/kg) din supernatant într-un balon cu fund rotund de dimensiuni adecvate. Se evaporă acest amestec pînă la uscare, la presiune scăzută şi la 60°C, cu ajutorul unui evaporator rotativ. Se dizolvă din nou reziduul în 10 ml de N,N-dimetilformamidă (DMF), se adaugă 15 ml de apă, de calitate HPLC şi se amestecă. Se continuă cu determinarea prin HPLC, conform prevederilor subpunctului 6.5.3.
6.5.3. Determinarea prin HPLC
6.5.3.1. Parametrii admisibili
Următoarele condiţii specificate în tabelul nr.9 sînt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica şi alte condiţii, dacă acestea conduc la rezultate echivalente.
|
Tabelul nr.9 Condiţii HPLC |
|
| Tehnica de măsurare | Valorile indicate |
| Coloana pentru cromatografie lichidă | Hypersil ODS, particule de 3 μm, 100 mm × 4,6 mm sau echivalent |
| Faza mobilă | Eluent A: Soluţie apoasă de acetat de amoniu şi sulfat acid de tetrabutilamoniu;
Eluent B: acetonitril, de calitate HPLC; Eluent C: metanol, de calitate HPLC |
| Modul de eluţie | Gradient linear;
Condiţii iniţiale: A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V); După 10 min, eluţia prin gradient timp de 30 min la: A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V). Se clăteşte cu B timp de 10 minute. |
| Debit | 1,5-2 ml/minut |
| Volum de injecţie | 20 μl |
| Lungimea undei de detecţie | 280 nm |
Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic injectîndu-se de mai multe ori soluţia de calibrare care conţine 2 μg/ml, pînă cînd se obţin valori de vîrf şi timpi de retenţie constanţi.
6.5.3.2. Soluţia de calibrare
Se injectează 20 μl din soluţia de calibrare de mai multe ori şi se determină înălţimea (aria) medie a vîrfurilor de diclazuril şi a vîrfurilor etalonului intern.
6.5.3.3. Soluţia de eşantion
Se injectează 20 μl din soluţia de eşantion, obţinută conform prevederilor subpunctului 6.5.2.1. sau 6.5.2.2. de mai multe ori şi se determină înălţimea (aria) medie a vîrfului de diclazuril şi a vîrfurilor etalonului intern.
6.6. Calcularea rezultatelor
6.6.1. Nutreţuri
Conţinutul în diclazuril w (în mg/kg) al eşantionului este dat de următoarea formulă:
w = hd,s × hi,c/hi,s × hd,c × cd,c × 10V/m [mg/kg],
unde:
hd,s = înălţimea (aria) vîrfului de diclazuril din soluţia de eşantion, preparată conform prevederilor subpunctului 6.5.2.1.;
hi,s = înălţimea (aria) vîrfului etalonului intern din soluţia de eşantion, preparată conform prevederilor subpunctului 6.5.2.1.;
hd,c = înălţimea (aria) vîrfului de diclazuril din soluţia de calibrare, preparată conform prevederilor subpunctului 6.3.10.;
hi,c = înălţimea (aria) vîrfului etalonului intern din soluţia de calibrare, preparată conform prevederilor subpunctului 6.3.10.;
cd,c = concentraţia de diclazuril din soluţia de calibrare în μg/ml (a se vedea menţiunea de la subpunctul 6.3.10.);
m = greutatea porţiunii de testat, în g;
V = volumul extractului de eşantion conform prevederilor descrise în subpunctul 6.5.2.1. (adică 2,5 ml).
6.6.2. Premixuri
Conţinutul în diclazuril w (în mg/kg) al eşantionului este dat de următoarea formulă:
w = hd,s × hi,c / hi,s × hd,c × cd,c × 0,02V × p/m [mg/kg],
unde:
hd,s = înălţimea (aria) vîrfului de diclazuril din soluţia de eşantion, preparată conform prevederilor subpunctului 6.5.2.2.;
hi,s = înălţimea (aria) vîrfului etalonului intern din soluţia de eşantion, preparată conform prevederilor subpunctului 6.5.2.2.;
hd,c = înălţimea (aria) vîrfului de diclazuril din soluţia de calibrare, preparată conform prevederilor subpunctului 6.3.10.;
hi,c = înălţimea (aria) vîrfului etalonului intern din soluţia de calibrare, preparată conform prevederilor subpunctului 6.3.10.;
cd,c = concentraţia de diclazuril din soluţia de calibrare în μg/ml (a se vedea menţiunea de la subpunctul 6.3.10.);
m = greutatea porţiunii de testat, în g;
V = volumul extractului de eşantion conform prevederilor descrise în subpunctul 6.5.2.2. (adică 25 ml);
p = conţinutul nominal de diclazuril al premixului în mg/kg.
6.7. Validarea rezultatelor
6.7.1. Identitatea
Identitatea analitului poate fi confirmată prin cocromatografie sau prin utilizarea unui detector cu grup de diode care permite compararea spectrelor extractului de eşantion, obţinut conform prevederilor descrise în subpunctul 6.5.2.1. sau 6.5.2.2. şi ale soluţiei de calibrare, preparată conform prevederilor subpunctului 6.3.10.
6.7.1.1. Cocromatografie
Un extract de eşantion, obţinut conform prevederilor descrise în subpunctul 6.5.2.1. sau 6.5.2.2., este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi adecvate din soluţia de calibrare, preparată conform prevederilor subpunctului 6.3.10. Cantitatea de diclazuril adăugată trebuie să fie similară cu cantitatea de diclazuril constatată în extractul de eşantion.
Numai înălţimea vîrfului de diclazuril şi a vîrfului etalonului intern creşte după luarea în considerare atît a cantităţii adăugate, cît şi a diluţiei extractului. Lărgimea vîrfului, la jumătatea înălţimii sale, trebuie să se încadreze în ± 10% din lărgimea iniţială a vîrfului de diclazuril sau a vîrfului etalonului intern al extractului de eşantion neîmbogăţit.
6.7.1.2. Detecţia cu grup de diode
Rezultatele se evaluează în funcţie de următoarele criterii:
a) lungimea de undă a absorbţiei maxime a spectrelor eşantionului şi etalonului, înregistrată la vîrful cel mai înalt al cromatogramei, trebuie să fie aceeaşi, într-o marjă determinată de puterea de rezoluţie a sistemului de detecţie. Pentru detecţia cu grup de diode, acest interval este în general de ± 2 nm;
b) între 230 şi 320 nm, spectrele eşantionului şi etalonului înregistrate la vîrful cel mai înalt al cromatogramei nu trebuie să fie diferite pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci cînd sînt prezente aceleaşi maxime şi cînd deviaţia dintre spectre nu depăşeşte în niciun punct observat 15% din absorbanţa analitului etalon;
c) între 230 şi 320 nm, spectrele curbei ascendente, ale punctului maxim şi ale curbei descendente ale vîrfului produs de extractul de eşantion nu trebuie să fie diferite unele de altele pentru acele părţi ale spectrului situate între 10 şi 100% din absorbanţa relativă. Acest criteriu este îndeplinit atunci cînd sînt prezente aceleaşi maxime şi cînd deviaţia dintre spectre nu depăşeşte în nici-un punct observat 15% din absorbanţa spectrului celui mai înalt vîrf al cromatogramei.
Dacă unul din aceste criterii nu este îndeplinit, prezenţa analitului nu a fost confirmată.
6.7.2. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească:
a) 30% din valoarea superioară pentru un conţinut în diclazuril situat între 0,5 şi 2,5 mg/kg;
b) 0,75 mg/kg pentru un conţinut în diclazuril situat între 2,5 şi 5 mg/kg;
c) 15% din valoarea superioară pentru un conţinut de diclazuril mai mare de 5 mg/kg.
6.7.3. Procedura de recuperare
Pentru un eşantion (martor) îmbogăţit, recuperarea este de cel puţin 80%.
6.8. Observaţii
Trebuie să se demonstreze în prealabil că reacţia diclazurilului este liniară pentru toată gama de concentraţii măsurate.
VII. DETERMINAREA CONŢINUTULUI DE LASALOCID SODIC
Sare sodică a unui acid monocarboxilic polieter, produsă de Streptomyces lasaliensis
7.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea conţinutului în lasalocid sodic din nutreţuri şi premixuri. Limita de detecţie este de 5 mg/kg, iar limita de cuantificare este de 10 mg/kg.
7.2. Principiul de aplicare
Lasalocidul sodic este extras din eşantion cu metanol acidifiat şi dozat prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă cu fază inversată (RP-HPLC) cu ajutorul unui detector spectrofluorimetric.
7.3. Reactivi utilizaţi
7.3.1. Fosfat diacid de potasiu (KH2PO4).
7.3.2. Acid ortofosforic, g (g/g) = 85%.
7.3.3. Soluţie de acid ortofosforic, c = 20%.
Se diluează 23,5 ml acid ortofosforic în 100 ml de apă.
7.3.4. 6-metil-2-heptilamin (1,5-dimetilhexilamină), g (g/g) = 99%.
7.3.5. Metanol, de calitate HPLC.
7.3.6. Acid clorhidric, densitate = 1,19 g/ml.
7.3.7. Soluţie tampon de fosfat, c = 0,01 mol/1.
Se dizolvă 1,36 g de fosfat diacid de potasiu (KH2PO4) în 500 ml de apă, de calitate HPLC, se adaugă 3,5 ml de acid ortofosforic şi 10 ml de 6-metil-2-heptilamină. Se ajustează pH-ul la 4 cu ajutorul soluţiei de acid ortofosforic şi se diluează cu apă, de calitate HPLC, completîndu-se pînă la 1000 ml.
7.3.8. Metanol acidifiat
Se transferă 5 ml de acid clorhidric într-un balon gradat de 1000 ml, se completează pînă la semn cu metanol, de calitate HPLC şi se amestecă. Soluţia trebuie preparată imediat înainte de utilizare.
7.3.9. Fază mobilă HPLC, soluţie tampon de fosfat şi metanol 5 + 95 (V + V)
Se amestecă 5 ml de soluţie tampon de fosfat cu 95 ml de metanol.
7.3.10. Substanţă etalon de lasalocid sodic cu puritate garantată, C34H53O8Na (sare sodică a unui acid monocarboxilic polieter, produsă de Streptomyces lasaliensis), E 763
7.3.10.1. Soluţie etalon stoc de lasalocid sodic, 500 μg/ml
Se cîntăresc, cu o abatere de 0,1 mg, 50 mg de lasalocid sodic, descris în subpunctul 7.3.10., într-un balon gradat de 100 ml, se dizolvă în metanol acidifiat, se completează pînă la semn cu acelaşi solvent şi se amestecă. Soluţia se prepară imediat înainte de utilizare.
7.3.10.2. Soluţie etalon intermediară de lasalocid sodic, 50 μg/ml
Se pipetează 10 ml din soluţia etalon stoc (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.10.1.) într-un balon gradat de 100 ml, se completează pînă la semn cu metanol acidifiat şi se amestecă. Soluţia se prepară imediat înainte de utilizare.
7.3.10.3. Soluţii de calibrare
Se transferă 1, 2, 4, 5 şi 10 ml de soluţie etalon intermediară într-o serie de baloane gradate de 50 ml. Se completează pînă la semn cu metanol acidifiat şi se amestecă. Aceste soluţii corespund concentraţiilor de 1, 2, 4, 5 şi 10 μg de lasalocid sodic pe ml. Ele se prepară imediat înainte de utilizare.
7.3.11. Apă de calitate HPLC.
7.4. Dispozitive
7.4.1. Baie cu ultrasunete (sau baie de apă cu agitare) cu reglaj de temperatură
7.4.2. Filtre cu membrană, 0,45 μm
7.4.3. Echipament HPLC cu sistem de injecţie, permiţînd injectarea de volume de 20 μl
7.4.3.1. Coloană pentru cromatografie lichidă de 125 mm × 4 mm, fază inversată C18, particule de 5 μm sau echivalent
7.4.3.2. Spectrofluorimetru cu ajustare variabilă a lungimii de undă pentru excitaţie şi emisie
7.5. Procedura de preparare
7.5.1. Aspecte generale
7.5.1.1. Nutreţ martor
Pentru a efectua testul de recuperare (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.5.1.2.), se analizează un nutreţ martor pentru a verifica absenţa lasalocidului sodic şi a substanţelor interferente. Nutreţul martor este similar, ca tip, cu eşantionul; nu se detectează nici lasalocid sodic, nici substanţe interferente.
7.5.1.2. Test de recuperare
Se efectuează un test de recuperare prin analiza nutreţului martor îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi de lasalocid sodic, similară cu cea prezentă în eşantion. Pentru a obţine o concentraţie de 100 mg/kg, se transferă 10 ml de soluţie etalon stoc (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.3.10.1.) într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml şi se evaporă soluţia pînă la aproximativ 0,5 ml. Se adaugă 50 g de nutreţ martor, se amestecă bine şi se lasă timp de 10 minute, amestecînd din nou de mai multe ori înainte de a trece la etapa de extracţie, conform prevederilor subpunctului 7.5.2.
Alternativ, dacă nu este disponibil un nutreţ martor similar, ca tip, cu eşantionul (vezi prevederile subpunctului 7.5.1.1.), testul de recuperare poate fi efectuat prin metoda standard de adăugare a etalonului. În acest caz, eşantionul de analizat este îmbogăţit cu o cantitate de lasalocid sodic asemănătoare celei deja prezente în eşantion. Acesta este analizat împreună cu eşantionul neîmbogăţit, iar recuperarea se poate calcula prin diferenţă.
7.5.2. Procedura de extracţie
7.5.2.1. Nutreţuri
Se cîntăresc cu o abatere de 0,01 g, de la 5 la 10 g de eşantion într-un flacon tip Erlenmeyer de 250 ml cu dop.
Se picură cu pipeta 100 ml de metanol acidifiat. Se închide uşor şi se agită circular pentru a se dispersa.
Flaconul se plasează într-o baie cu ultrasunete la aproximativ 40°C timp de 20 de minute, se scoate şi se lasă să se răcească la temperatura camerei. Se lasă în repaus timp de aproximativ o oră, pînă la decantarea materiilor în suspensie, apoi se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană de 0,45 μm într-un recipient adecvat. Se continuă cu determinarea prin HPLC, conform prevederilor subpunctului 7.5.3.
7.5.2.2. Premixuri
Se cîntăresc, cu o abatere de 0,001 g, 2 g de premix nemăcinat într-un balon gradat de 250 ml. Se adaugă 100 ml de metanol acidifiat şi se agită circular pentru a se dispersa. Se pune balonul şi conţinutul acestuia într-o baie cu ultrasunete la aproximativ 40°C timp de 20 de minute, apoi se scoate şi se lasă să se răcească la temperatura camerei. Se completează pînă la semn cu metanol acidifiat şi se amestecă bine. Se lasă în repaus timp de aproximativ o oră, pînă la decantarea materiilor în suspensie, apoi se filtrează o parte alicotă printr-un filtru cu membrană de 0,45 μm. Se diluează un volum adecvat de filtrat limpede cu metanol acidifiat, pentru a produce o soluţie de testat finală care să conţină aproximativ 4 μg/ml de lasalocid sodic. Se continuă cu determinarea prin HPLC, conform prevederilor subpunctului 7.5.3.
7.5.3. Determinarea prin HPLC
7.5.3.1. Parametrii admisibili
Următoarele condiţii specificate în tabelul nr.10 sînt propuse cu titlu orientativ; se pot aplica şi alte condiţii, dacă acestea conduc la rezultate echivalente.
|
Tabelul nr.10 Condiţii HPLC |
|
| Tehnica de măsurare | Valorile indicate |
| Coloana pentru cromatografie lichidă | 125 mm × 4 mm, fază inversată C18, particule de 5 μm sau echivalent |
| Faza mobilă | Amestec de soluţie tampon de fosfat, obţinută conform prevederilor subpunctului 7.3.7. şi metanol, 5 + 95 (V + V) |
| Debit | 1-2 ml/minut |
| Volum de injecţie | 20 μl |
| Lungimea undei de detecţie | Excitaţie: 310 nm
Emisie: 419 nm |
Se verifică stabilitatea sistemului cromatografic, injectînd de mai multe ori soluţia de calibrare conţinînd 4 μg/ml, pînă la obţinerea de înălţimi (arii) ale vîrfurilor şi de timpi de retenţie constanţi.
7.5.3.2. Curba de calibrare
Se injectează fiecare soluţie de calibrare de mai multe ori şi se determină înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor pentru fiecare concentraţie. Se trasează o curbă de calibrare utilizînd valorile (ariile) medii ale vîrfurilor ca ordonate şi concentraţiile corespunzătoare, în μg/ml, ca abscise.
7.5.3.3. Soluţia de eşantion
Se injectează extractul de eşantion, obţinut conform prevederilor descrise în subpunctul 7.5.2.1. sau 7.5.2.2. de mai multe ori utilizînd acelaşi volum cu cel reţinut pentru soluţia de calibrare şi se determină înălţimile (ariile) medii ale vîrfurilor de lasalocid sodic.
7.6. Calcularea rezultatelor
Plecînd de la înălţimea (aria) medie a vîrfurilor soluţiei de eşantion, se determină concentraţia de lasalocid sodic (μg/ml) prin referire la curba de calibrare.
7.6.1. Nutreţuri
Conţinutul de lasalocid sodic w (în mg/kg) al eşantionului este dat de următoarea formulă:
w = c × V1/m [mg/kg],
unde:
c = concentraţia de lasalocid sodic a soluţiei de eşantion, preparată conform prevederilor subpunctului 7.5.2.1., în μg/ml;
V1 = volumul extractului de eşantion, conform prevederilor descrise în subpunctul 7.5.2.1., în ml (adică 100);
m = greutatea porţiunii de testat, în g.
7.6.2. Premixuri
Conţinutul de lasalocid sodic w (în mg/kg) al eşantionului este dat de următoarea formulă:
w = c × V2 × f/m [mg/kg],
unde:
c = concentraţia de lasalocid sodic a soluţiei de eşantion, preparată conform prevederilor subpunctului 7.5.2.2., în μg/ml;
V2 = volumul extractului de eşantion, conform prevederilor descrise în subpunctul 7.5.2.2., în ml (adică 250);
f = factorul de diluţie (a se vedea menţiunea de la subpunctul 7.5.2.2.);
m = greutatea porţiunii de testat, în g.
7.7. Validarea rezultatelor
7.7.1. Identitatea
Metodele bazate pe spectrofluorimetrie sînt mai puţin supuse interferenţelor decît cele care utilizează un detector UV. Identitatea analitului poate fi confirmată de către cocromatografie.
7.7.1.1. Cocromatografie
Un extract de eşantion, preparat conform prevederilor subpunctului 7.5.2.1. sau 7.5.2.2., este îmbogăţit prin adăugarea unei cantităţi corespunzătoare de soluţie de calibrare. Cantitatea de lasalocid sodic adăugată trebuie să fie asemănătoare cantităţii de lasalocid sodic constatată în extractul de eşantion. Numai înălţimea vîrfului corespunzător lasalocidului sodic se măreşte după ce s-a luat în calcul cantitatea de lasalocid sodic adăugată şi diluţia extractului. Lărgimea vîrfului, la jumătatea înălţimii, trebuie să se încadreze între ± 10% din lărgimea iniţială a vîrfului produs de extractul de eşantion neîmbogăţit.
7.7.2. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească:
15% din valoarea superioară pentru un conţinut de lasalocid sodic situat între 30 şi 100 mg/kg;
15 mg/kg pentru un conţinut de lasalocid sodic situat între 100 şi 200 mg/kg;
7,5% din valoarea superioară pentru un conţinut de lasalocid sodic mai mare de 200 mg/kg.
7.7.3. Procedura de recuperare
Pentru un eşantion de nutreţ (martor) îmbogăţit, recuperarea este de cel puţin 80%. Pentru eşantioanele de premixuri îmbogăţite, recuperarea este de cel puţin 90%.
Anexa nr.5
la Hotărîrea Guvernului
nr.686 din 13 septembrie 2012
[Anexa nr.5 în redacţia Hot.Guv. nr.844 din 25.10.2017, în vigoare 03.11.2017]
METODELE DE ANALIZĂ
pentru controlul substanţelor nedorite în nutreţuri
1. DETERMINAREA CONŢINUTULUI
DE GOSIPOL LIBER ŞI TOTAL
1.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezenta metodă permite determinarea nivelurilor de gosipol liber, de gosipol total şi de substanţe chimic înrudite cu acesta din sămînţă de bumbac, făină de sămînţă de bumbac şi brichete de sămînţă de bumbac şi din nutreţuri combinate care conţin aceste materii prime pentru nutreţuri, atunci cînd gosipolul liber, gosipolul total şi substanţele chimic înrudite cu acesta sînt prezente în concentraţie mai mare de 20 mg/kg.
1.2. Principiul de aplicare
Gosipolul se extrage în prezenţa a 3-aminopropan-1-ol, fie cu un amestec de propan-2-ol şi hexan, pentru determinarea gosipolului liber, fie cu dimetilformamidă, pentru determinarea gosipolului total. Gosipolul este convertit de anilină în gosipol-dianilină, a cărei densitate optică se măsoară la lungimea de undă de 440 nm.
1.3. Reactivi utilizaţi
1.3.1. Amestec de propan-2-ol-hexan: se amestecă 60 de părţi volumetrice de propan-2-ol cu 40 de părţi volumetrice de n-hexan.
1.3.2. Solvent A: Se plasează într-un balon gradat de 1 litru aproximativ 500 ml de amestec de propan-2-ol-hexan, 2 ml de 3-aminopropan-1-ol, 8 ml de acid acetic glacial şi 50 ml de apă. Se aduce la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan. Acest reactiv este stabil timp de o săptămînă.
1.3.3. Solvent B: Se pipetează 2 ml de 3-aminopropan-1-ol şi 10 ml de acid acetic glacial într-un balon gradat de 100 ml. Se răceşte la temperatura camerei şi se aduce la volum cu N, N-dimetilformamidă. Acest reactiv este stabil timp de o săptămînă.
1.3.4. Anilină: Dacă densitatea optică a testului martor depăşeşte 0,022, se distilează anilina peste praf de zinc, îndepărtînd primele şi ultimele fracţiuni de 10% de distilat. Acest reactiv este răcit în frigider, este depozitat într-un vas din sticlă brună cu dop şi se păstrează timp de cîteva luni.
1.3.5. Soluţie etalon de gosipol A: Se plasează 27,9 mg de acetat de gosipol într-un balon gradat de 250 ml. Se dizolvă şi se aduce la volum cu solvent A. Se pipetează 50 ml din această soluţie într-un balon gradat de 250 ml şi se completează pînă la volum cu solvent A. Concentraţia de gosipol a acestei soluţii este de 0,02 mg/ml. Se lasă să stea timp de o oră la temperatura camerei înainte de utilizare.
1.3.6. Soluţie etalon de gosipol B: Se plasează 27,9 mg de acetat de gosipol într-un balon gradat de 50 ml, se dizolvă şi se aduce la volum cu solvent B. Concentraţia de gosipol a acestei soluţii este de 0,5 mg/ml.
Soluţiile etalon de gosipol A şi B rămîn stabile timp de 24 de ore dacă sînt protejate de lumină.
1.4. Dispozitive
1.4.1. Mixer: aproximativ 35 rpm.
1.4.2. Spectrofotometru.
1.5. Procedura de preparare
1.5.1. Eşantionul de testat
Cantitatea de eşantion de testat folosită depinde de conţinutul estimat de gosipol al eşantionului. Se lucrează cu un eşantion de testat mic şi cu o parte alicotă de filtrat relativ mare, pentru a obţine suficient gosipol pentru a permite măsurarea fotometrică precisă. Pentru determinarea gosipolului liber din sămînţă de bumbac, făină de sămînţă de bumbac şi din brichetele de sămînţă de bumbac, eşantionul de testat nu depăşeşte 1 g. Pentru nutreţurile combinate, aceasta poate fi de maximum 5 g. O parte alicotă de 10 ml de filtrat este suficientă în majoritatea cazurilor. Aceasta conţine între 50 şi 100 μg de gosipol. Pentru determinarea gosipolului total, eşantionul de testat este între 0,5 g şi 5 g, pentru ca o parte alicotă de 2 ml de filtrat să conţină între 40 şi 200 μg de gosipol. Analiza se efectuează la o temperatură a camerei de aproximativ 20°C.
1.5.2. Determinarea gosipolului liber
Se plasează eşantionul de testat într-un balon cu gît şlefuit de 250 ml, fundul balonului fiind acoperit cu sticlă pisată. Utilizînd o pipetă, se adaugă 50 ml de solvent A, se astupă balonul şi se amestecă timp de o oră în mixer. Se filtrează printr-un filtru uscat şi se colectează filtratul într-un balon mic cu gît şlefuit. În timpul filtrării se acoperă pîlnia cu o sticlă de ceas.
Se pipetează părţi alicote identice de filtrat conţinînd 50-100 μg de gosipol în fiecare din cele două baloane gradate de 25 ml (A şi B). Dacă este necesar, se aduce la volum pînă la 10 ml cu solvent A. Apoi se completează conţinutul balonului A pînă la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan. Această soluţie va fi folosită ca soluţie de referinţă faţă de care se măsoară soluţia de eşantion.
Se pipetează 10 ml de solvent A în fiecare din celelalte două baloane gradate de 25 ml (C şi D). Se completează conţinutul balonului C pînă la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan. Această soluţie va fi utilizată ca soluţie de referinţă faţă de care se măsoară soluţia testului martor.
Se adaugă 2 ml de anilină în fiecare din baloanele D şi B. Se încălzesc timp de 30 de minute deasupra unei băi de apă în fierbere, pentru a apărea culoarea. Se răcesc la temperatura camerei, se aduc la volum cu amestec de propan-2-ol-hexan, se omogenizează şi se lasă să stea timp de o oră.
Se determină densitatea optică a soluţiei testului martor D, prin comparaţie cu soluţia de referinţă C, precum şi densitatea optică a soluţiei de eşantion B, prin comparaţie cu soluţia de referinţă A, în spectrofotometru la 440 nm folosind celule de sticlă de 1 cm.
Se scade densitatea optică a soluţiei testului martor din cea a soluţiei de eşantion, ceea ce reprezintă densitatea optică corectată. Din această valoare se calculează conţinutul în gosipol liber, conform indicaţiilor de la punctul 1.6. din prezenta anexă.
1.5.3. Determinarea gosipolului total
Se plasează un eşantion de testat care conţine 1-5 mg de gosipol într-un balon gradat de 50 ml şi se adaugă 10 ml de solvent B. În acelaşi timp, se prepară un test martor, adăugîndu-se 10 ml de solvent B în alt balon gradat de 50 ml. Se încălzesc cele două baloane timp de 30 de minute deasupra unei băi de apă în fierbere. Se răcesc la temperatura camerei şi se completează conţinutul fiecărui balon pînă la volum cu un amestec de propan-2-ol-hexan. Se omogenizează şi se lasă să se depună timp de 10-15 minute, apoi se filtrează şi se colectează filtratele în baloane cu gît şlefuit.
Se pipetează 2 ml de filtrat de eşantion în fiecare din cele două baloane gradate de 25 ml, şi 2 ml de filtrat al testului martor în fiecare din celelalte două baloane de 25 ml. Se completează conţinutul unui balon din fiecare serie pînă la 25 ml cu amestecul de propan-2-ol-hexan. Aceste soluţii sînt utilizate ca soluţii de referinţă.
Se adaugă 2 ml de anilină în fiecare dintre celelalte două baloane. Se încălzesc timp de 30 de minute deasupra unei băi de apă în fierbere pînă va apărea culoarea. Se răcesc la temperatura camerei, se aduc la volumul de 25 ml cu amestecul de propan-2-ol-hexan, se omogenizează şi se lasă să stea timp de o oră. Se determină densitatea optică în conformitate cu indicaţiile de la subpunctul 1.5.2., pentru gosipolul liber. Din această valoare se calculează conţinutul de gosipol total, în conformitate cu indicaţiile de la punctul 1.6. din prezenta anexă.
1.6. Calcularea rezultatelor
Rezultatele pot fi calculate fie pe baza densităţii optice specifice, menţionate în subpunctul 1.6.1., fie prin referire la o curbă de calibrare, conform prevederilor descrise în punctul 1.6.2. din prezenta anexă.
1.6.1. Cu ajutorul densităţii optice specifice
Densităţile optice specifice, în condiţiile descrise, sînt următoarele:
1) Gosipolul liber E × 1%/ 1 cm = 625;
2) Gosipolul liber E × 1%/ 1 cm = 600.
Conţinutul de gosipol liber sau de gosipol total al eşantionului este calculat folosind următoarea formulă:
% gosipol:E × 1250/E1%1cm × p × a ,
unde:
E = densitatea optică corectată, determinată conform indicaţiilor de la subpunctul 1.5.2.;
p = eşantion de testat, în g;
a = partea alicotă a filtratului, în ml.
1.6.2. Cu ajutorul curbei de calibrare
1) Gosipolul liber
Se prepară 2 serii de cinci baloane gradate de 25 ml. Se pipetează părţi alicote de 2, 4, 6, 8 şi 10 ml de soluţie etalon de gosipol A în fiecare serie de baloane. Se aduc la volum pînă la 10 ml cu solventul A. Se completează fiecare serie cu un balon gradat de 25 ml conţinînd numai 10 ml de solvent A, care reprezintă testul martor.
Se aduc la volum baloanele din prima serie, inclusiv balonul testului martor, pînă la 25 ml cu un amestec de propan-2-ol-hexan, care reprezintă serii de referinţă.
Se adaugă 2 ml de anilină la fiecare din baloanele din a doua serie, inclusiv balonul testului martor. Se încălzesc timp de 30 de minute deasupra unei băi de apă în fierbere, pînă va apărea culoarea. Se răcesc la temperatura camerei, se aduc la volum cu un amestec de propan-2-ol-hexan, se omogenizează şi se lasă să stea o oră, care reprezintă serii etalon.
Se determină, conform indicaţiilor de la subpunctul 1.5.2. din prezenta anexă, densitatea optică a soluţiilor din seriile etalon, prin comparaţie cu soluţiile corespunzătoare din seriile de referinţă. Se trasează curba de calibrare prin reprezentarea grafică a densităţilor optice în raport cu cantităţile de gosipol, în μg.
2) Gosipolul total
Se prepară şase baloane gradate de 50 ml. În primul balon se plasează 10 ml de solvent B, iar în celelalte – 2, 4, 6, 8 şi 10 ml de soluţie etalon de gosipol B. Se completează conţinutul fiecărui balon pînă la 10 ml cu solvent B. Se încălzesc timp de 30 de minute într-o baie de apă în fierbere. Se răcesc la temperatura camerei, se completează volumul cu un amestec de propan-2-ol-hexan şi se omogenizează.
Se plasează 2 ml din aceste soluţii în fiecare din cele două serii a cîte şase baloane gradate de 25 ml. Se completează conţinutul baloanelor din prima serie pînă la 25 ml cu un amestec de propan-2-ol-hexan, care reprezintă serii de referinţă.
Se adaugă 2 ml de anilină la fiecare balon din a doua serie. Se încălzesc timp de 30 de minute într-o baie de apă în fierbere. Se răcesc la temperatura camerei, se aduc la volum cu un amestec de propan-2-ol-hexan, se omogenizează şi se lasă să stea timp de o oră, care reprezintă serii etalon.
Se determină, conform indicaţiilor de la subpunctul 1.5.2. din prezenta anexă, densitatea optică a soluţiilor din seriile etalon, prin comparaţie cu soluţiile corespunzătoare din seriile de referinţă. Se trasează curba de calibrare prin reprezentarea grafică a densităţilor optice în raport cu cantităţile de gosipol, în μg.
1.6.3. Repetabilitatea
Diferenţa dintre rezultatele a două determinări paralele efectuate pe acelaşi eşantion nu trebuie să depăşească:
1) 15%, în valoare relativă, pentru un conţinut de gosipol mai mic de 500 ppm;
2) 75 ppm, în valoare absolută, pentru un conţinut de gosipol de minimum 500 ppm şi maximum 750 ppm;
3) 10%, în valoare relativă la cea mai înaltă valoare, pentru un conţinut de gosipol mai mare de 750 ppm.
2. DETERMINAREA NIVELURILOR DE DIOXIDE
ŞI A NIVELURILOR DE DIFENILI POLICLORIRAŢI
ASEMĂNĂTORI DIOXINEI
I. Metode de eşantionare şi de interpretare a rezultatelor analitice
1.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Eşantioanele destinate controalelor oficiale ale nivelurilor de dioxine, cum sînt p-dibenzodioxinele policlorurate (PCCD), dibenzofurani policloruraţi () şi de bifenili policloruraţi (PCB) de tipul dioxinelor şi PCB-uri care nu sînt de tipul dioxinelor din nutreţuri, indicaţi în tabelul nr.1 din prezenta anexă, asemănători dioxinei din nutreţuri se prelevează în conformitate cu indicaţiile din anexa nr.1. Este necesar să se aplice cerinţele cantitative referitoare la controlul substanţelor sau al produselor uniform repartizate în nutreţuri, în conformitate cu indicaţiile de la capitolul 3, secţiunea I, anexa nr.1 la prezenta hotărîre. Eşantioanele colective obţinute astfel se consideră ca reprezentative pentru loturile sau subloturile din care sînt prelevate. Respectarea conţinuturilor maxime stabilite în Hotărîrea Guvernului nr.1405 din 10 decembrie 2008 “Cu privire la aprobarea Normei sanitar-veterinare privind igiena nutreţurilor şi conţinutul substanţelor nedorite în nutreţuri” se stabileşte pe baza conţinuturilor determinate în eşantioanele de laborator.
Metodele de screening sînt utilizate pentru selectarea acelor probe cu niveluri de PCDD-uri/PCDF-uri şi PCB-uri de tipul dioxinelor care depăşesc nivelurile maxime sau pragurile de acţiune. Acestea permit o capacitate mărită de analiză a probelor, eficientă din punctul de vedere al costurilor, sporind astfel şansa de a descoperi noi incidente cu un nivel mare de expunere şi riscuri de sănătate importante pentru consumatori. Metodele de screening se bazează pe metode bioanalitice sau metode GC-MS.
Rezultatele probelor care depăşesc valoarea-limită pentru verificarea conformităţii cu nivelul maxim trebuie să fie verificate de către o nouă analiză completă din proba originală printr-o metodă de confirmare.
Metodele de confirmare furnizează informaţii complete sau complementare care permit identificarea şi cuantificarea certă a PCDD-urilor/PCDF-urilor şi a PCB-urilor de tipul dioxinelor la pragul maxim sau, la necesitate, la pragul de acţiune. Astfel de metode utilizează cromatografia în fază gazoasă/spectrometria de masă de înaltă rezoluţie (GC-HRMS) sau cromatografia în fază gazoasă/spectrometria de masă în tandem (în continuare – GC-MS/MS).
1.2. Conformitatea lotului sau sublotului cu specificaţiile
Lotul este acceptat dacă rezultatul analitic al unei analize unice nu depăşeşte conţinutul maxim stabilit în Hotărîrea Guvernului nr.1405 din 10 decembrie 2008, luîndu-se în considerare incertitudinea de măsurare.
Lotul nu se conformează conţinutului maxim stabilit în Hotărîrea Guvernului nr.1405 din 10 decembrie 2008 dacă rezultatul analitic pentru limita superioară, confirmat de o analiză paralelă, depăşeşte cu un grad de certitudine conţinutul maxim.
|
Tabelul nr.1 Tabelul factorilor de echivalenţă toxică pentru dioxine, furani şi compuşi PCB asemănători dioxinei |
|||
| Congener (acelaşi grup) | Valoare1 TEF |
Congener (acelaşi grup) | Valoare TEF |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| p-dibenzodioxine (PCDD-uri) şi p-dibenzofurani (PCDF-uri) | Compuşi PCB asemănători dioxinei | ||
| 2,3,7,8-TCDD | 1 | 0,0001 | |
| 1,2,3,7,8-PeCDD | 1 | Non-orto PCB | |
| 1,2,3,4,7,8-HxCDD | 0,1 | PCB 77 | |
| 1,2,3,6,7,8-HxCDD | 0,1 | PCB 81 | 0,0003 |
| 1,2,3,7,8,9-HxCDD | 0,1 | PCB 126 | 0,1 |
| 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD | 0,01 | PCB 169 | 0,03 |
| OCDD | 0,0003 | Mono-orto PCB | |
| Dibenzofurani (PCDF) | PCB 105 | 0,00003 | |
| 2,3,7,8-TCDF | 0,1 | PCB 114 | 0,00003 |
| 1,2,3,7,8-PeCDF | 0,03 | PCB 118 | 0,00003 |
| 2,3,4,7,8-PeCDF | 0,3 | ||
| 1,2,3,4,7,8-HxCDF | 0,1 | PCB 123 | 0,00003 |
| 1,2,3,6,7,8-HxCDF | 0,1 | PCB 156 | 0,00003 |
| 1,2,3,7,8,9-HxCDF | 0,1 | PCB 157 | 0,00003 |
| 2,3,4,6,7,8-HxCDF | 0,1 | PCB 167 | 0,000003 |
| 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF | 0,01 | PCB 189 | 0,00003 |
| 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF | 0,01 | ||
| OCDF | 0,0003 | ||
|
Abrevieri utilizate: TEF = toxic equivalencyfactors; T = tetra; Pe = penta; Hx = hexa; Hp = hepta; O = octa; CDD = clordibenzo-p-dioxină; CDF = clordibenzofuran; CB =clorobifenil |
|||
Incertitudinea măsurării poate fi luată în considerare în una dintre următoarele două modalităţi:
1) calculîndu-se incertitudinea extinsă cu ajutorul unui coeficient de acoperire 2 care dă un nivel de încredere de aproximativ 95%. Un lot nu este conform dacă valoarea măsurată minus U este mai mare de nivelul maxim.
În cazul unei determinări separate a dioxinelor şi a PCB-urilor asemănători dioxinei, suma incertitudinii extinse estimate a rezultatelor analitice separate ale dioxinelor şi ale PCB-urilor asemănători dioxinei se utilizează pentru suma dioxinelor şi a PCB-urilor asemănători dioxinei;
2) stabilindu-se limita de decizie (CCα), limita la care şi de la care este permis să se concluzioneze cu probabilitatea de eroare α că o probă nu este conformă.
Limita de decizie se stabileşte în conformitate cu cerinţele în materie de identificare sau de identificare şi cuantificare.
Un lot este neconform dacă valoarea măsurată este egală sau mai mare decît CCα.
II. Pregătirea eşantioanelor şi cerinţele privind metodele
de analiză utilizate pentru controlul oficial al nivelurilor de
dioxine (PCDD/PCDF) şi de PCB asemănători dioxinelor
2.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezentele cerinţe se aplică atunci cînd nutreţurile şi materiile prime pentru nutreţuri sînt analizate pentru a se determina dioxinele, cum sînt dibenzo-p-dioxinele policlorurate (PCDD), dibenzofuranii policloruraţi şi bifenilii policloruraţi asemănători dioxinelor (PCB).
Monitorizarea prezenţei dioxinelor în nutreţuri se poate realiza printr-o strategie care implică o metodă de depistare, cu scopul de a selecta acele eşantioane cu niveluri de dioxine şi de PCB-uri asemănători dioxinei care au valori mai puţin de 25% inferioare sau superioare concentraţiei de interes. Concentraţia de dioxine din acele eşantioane în care se identifică niveluri semnificative trebuie determinată/confirmată printr-o metodă de confirmare.
Metodele de depistare sînt utilizate pentru a se detecta prezenţa dioxinelor şi a PCB-urilor asemănători dioxinelor la concentraţia de interes. Aceste metode au o capacitate mare de procesare a eşantioanelor şi sînt folosite pentru a împărţi pe categorii un număr mare de eşantioane potenţial pozitive. Sînt concepute special pentru a evita rezultatele fals negative.
Metodele de confirmare furnizează date complete sau complementare care permit identificarea şi cuantificarea certă a dioxinelor şi a PCB-urilor asemănători dioxinelor la concentraţia de interes.
2.2. Context
Avînd în vedere faptul că eşantioanele din mediu şi cele biologice, inclusiv eşantioanele de nutreţuri/materii prime pentru nutreţuri, conţin, în general, amestecuri complexe de diverşi congeneri ai dioxinelor, a fost elaborat conceptul factori de echivalenţă toxică (TEF), pentru a facilita evaluarea riscurilor. Aceşti TEF au fost stabiliţi pentru a exprima concentraţiile de amestecuri de PCDD şi PCDF 2,3,7,8-substituiţi şi de PCB non-orto şi mono-orto clor-substituiţi care au o activitate asemănătoare dioxinei în echivalenţi toxici (TEQ) de 2, 3, 7, 8-TCDD. Concentraţiile substanţelor individuale într-un eşantion anumit se înmulţesc cu valoarea TEF corespunzătoare şi apoi se adună, pentru a se obţine concentraţia totală de compuşi asemănători dioxinelor, exprimată ca TEQ.
Limita specifică de cuantificare acceptată pentru un congener individual este concentraţia unui analit dintr-un extract de eşantion care produce un răspuns instrumental pentru doi ioni diferiţi, care trebuie monitorizaţi printr-un raport semnal/zgomot de 3:1 pentru semnalul cel mai puţin sensibil, şi îndeplineşte condiţiile de bază, precum timpul de retenţie şi raportul izotopic.
În cazul în care, din motive tehnice, calculul raportului semnal/zgomot nu furnizează rezultate fiabile, punctul cel mai mic de concentraţie de pe o curbă de etalonare care oferă o deviaţie acceptabilă (≤ 30 %) şi coerentă (măsurată cel puţin la începutul şi la sfîrşitul unei serii analitice de probe) de la factorul de răspuns relativ mediu calculat pentru toate punctele de pe curba de etalonare pentru fiecare serie de probe. Limita de cuantificare (LOQ) se calculează de la cel mai mic punct de concentraţie, ţinînd cont de recuperarea etaloanelor interne şi de prelevarea de probe.
Metodele bioanalitice de screening nu vor da rezultate la nivel de congener, ci doar o indicaţie a nivelului TEQ, exprimată în echivalente bioanalitice (BEQ), pentru că nu toţi compuşii prezenţi într-un extract de probă care produce un răspuns în cadrul testului pot să îndeplinească toate cerinţele principiului TEQ.
Rezultatele obţinute la eşantionarea unei părţi dintr-un lot de nutreţuri se consideră valabile pentru toate nutreţurile din aceeaşi clasă sau de aceeaşi descriere din lotul respectiv.
2.3. Cerinţe de asigurare a calităţii care trebuie respectate în cursul pregătirii eşantioanelor
Se aplică dispoziţiile generale privind prepararea eşantioanelor pentru analiză, stabilite în anexa nr.2 la prezenta hotărîre.
De asemenea, trebuie să fie îndeplinite următoarele cerinţe:
1) eşantioanele se păstrează şi se transportă în recipiente din sticlă, aluminiu, polipropilenă sau polietilenă. Din recipientul care conţine eşantion trebuie să fie îndepărtate urmele de praf de hîrtie. Sticlăria se clăteşte cu solvenţi controlaţi în prealabil în vederea detectării dioxinelor;
2) se realizează o analiză martor prin efectuarea întregii proceduri analitice, dar omiţînd numai eşantionul;
3) greutatea eşantionului utilizat pentru extracţie trebuie să fie suficientă pentru a îndeplini cerinţele referitoare la sensibilitate;
4) se efectuează controlul reactivilor, al sticlăriei şi al echipamentului pentru a preveni şi a exclude o posibilă influenţă a rezultatelor pe bază de TEQ sau de BEQ;
5) pentru metodele bioanalitice, toată sticlăria şi toţi solvenţii utilizaţi în cadrul analizei sînt testaţi pentru a se constata dacă sînt liberi de compuşi care perturbă detectarea compuşilor ţintă în intervalul de lucru. Sticlăria se clăteşte cu solvenţi sau se încălzeşte la temperaturi înalte pentru a elimina urmele de PCDD-uri/PCDF-uri, compuşi de tipul dioxinelor şi compuşi interferenţi de pe suprafaţa acesteia;
6) cantitatea probei utilizate pentru extracţie este necesară pentru a îndeplini cerinţele referitoare la un interval de lucru redus, inclusiv concentraţiile nivelurilor maxime sau pragul de acţiune;
7) în măsura în care acest lucru este relevant, fiecare probă de laborator este mărunţîtă şi este amestecată cu grijă printr-un procedeu care s-a dovedit că realizează o omogenizare completă, cum este, de exemplu, proba mărunţită astfel, încît să treacă printr-o sită cu ochiuri de 1 mm. Probele se usucă înainte de mărunţire, dacă conţinutul de umiditate este prea mare.
2.4. Cerinţele aplicabile laboratorului naţional de referinţă
1) Laboratorul naţional de referinţă trebuie să demonstreze performanţa unei metode în zona nivelului de interes, cu un coeficient de variaţie acceptabil la repetarea analizei.
2) Limita de cuantificare pentru o metodă de confirmare trebuie să se situeze într-un interval de o cincime din nivelul de interes, pentru a garanta că în intervalul nivelului de interes sînt îndepliniţi coeficienţi de variaţie acceptabili.
3) Ca măsuri interne de control al calităţii, trebuie să fie efectuate periodic controale martor, experimente cu eşantioane contaminate sau analize ale unor eşantioane de control, cu material de referinţă certificat.
4) Participarea permanentă la studii interlaboratoare pentru determinarea dioxinelor şi a PCB-urilor asemănătoare dioxinelor în structura alimentelor/nutreţurilor.
5) Laboratorul naţional de referinţă pentru analiza probelor prelevate în cadrul controalelor oficiale trebuie să fie acreditat conform standardului naţional SM SR EN ISO/IEC 17025 “Cerinţe generale pentru competenţa laboratoarelor de încercări şi etalonări”.
6) Laboratorul naţional de referinţă care aplică metode de screening pentru controlul de rutină al probelor stabileşte o cooperare strînsă cu laboratoarele care aplică metoda de confirmare, atît pentru controlul calităţii, cît şi pentru confirmarea rezultatului analitic al probelor suspectate.
2.5. Cerinţe aplicabile procedurilor analitice pentru dioxine şi PCB-uri asemănători dioxinelor
Cerinţele fundamentale pentru acceptarea procedurilor analitice sunt următoarele:
1) Sensibilitate înaltă şi limite de detecţie joase. Pentru PCDD şi PCDF, cantităţile detectabile trebuie să fie de ordinul femtogramelor TEQ (10-15 g) din cauza toxicităţii extreme a unora dintre aceşti compuşi. Este cunoscut faptul că PCB se află la niveluri mai ridicate decît PCDD şi PCDF. Pentru majoritatea congenerilor de PCB, o sensibilitate de ordinul nanogramelor (10-9 g) este deja suficientă. Pentru măsurarea congenerilor PCB-urilor asemănători dioxinelor mai toxici, în special congeneri non-orto substituiţi, extremitatea inferioară a intervalului de lucru ajunge la niveluri mici de ordinul picogramelor (10-12 g). Pentru toţi ceilalţi congeneri PCB, o limită de cuantificare de ordinul nanogramelor (10-9 g) este suficientă şi trebuie să fie atinsă aceeaşi sensibilitate ca şi pentru PCDD şi PCDF.
2) Pentru o selectivitate înaltă este necesară o distincţie a PCDD-urilor, PCDF-urilor şi PCB-urilor asemănători dioxinelor în raport cu o multitudine de alţi compuşi coextraşi şi cu posibile interferenţe, prezenţi în concentraţii de pînă la cîteva ordine de mărime mai mari decît cele ale analiţilor studiaţi. Pentru metodele de cromatografie în fază gazoasă/spectrometrie de masă (CG/SM) este necesară o distincţie între diferiţi congeneri, cum ar fi între compuşii toxici, precum cei şaptesprezece PCDD-uri şi PCDF-uri substituiţi la 2,3,7,8 şi PCB-uri asemănători dioxinelor şi alţii. Biotestele trebuie să permită determinarea selectivă a valorilor TEQ, ca sumă de PCDD, PCDF şi PCB asemănători dioxinelor.
Curăţarea probelor are drept scop eliminarea compuşilor care duc la rezultate fals-neconforme sau a compuşilor care pot atenua rezultatul, ducînd la rezultate fals-conforme.
3) Pentru o acurateţe ridicată este necesar ca determinarea să furnizeze o estimare validă şi fiabilă a concentraţiei reale dintr-un eşantion. O acurateţe ridicată este necesară pentru a se evita respingerea rezultatului analizei unui eşantion din cauza fiabilităţii reduse a estimării TEQ. Acurateţea este exprimată ca veridicitate, ceea ce reprezintă diferenţa dintre valoarea medie măsurată pentru un analit dintr-un material certificat şi valoarea certificată a acesteia, exprimată ca procentaj din această valoare şi precizie (RSDR), deviaţia standard relativă, calculată în baza rezultatelor generate în condiţii de reproductibilitate.
Metodele de depistare pot include biotestele şi metodele CG/SM. Metodele de confirmare cuprind cromatografia în fază gazoasă de înaltă rezoluţie/spectrometria de masă de înaltă rezoluţie (în continuare – HRGC/HRMS).
Laboratoarele demonstrează performanţa unei metode în intervalul nivelului maxim, de exemplu, 0,5x, 1x şi 2x nivelul maxim, cu un coeficient de variaţie acceptabil pentru analize repetate, în timpul procedurii de validare şi în timpul analizei de rutină.
Ca măsuri interne de control al calităţii se efectuează periodic controale ale martorului, experimente cu îmbogăţire sau analize ale unor probe de control, dacă este posibil, cu material de referinţă certificat. Se înregistrează şi se verifică grafice de control al calităţii pentru controalele martorului, experimentele cu îmbogăţire sau analizele unor probe de control, pentru a garanta că performanţa analitică este conformă cerinţelor.
Pentru o metodă bioanalitică de screening, stabilirea limitei de cuantificare nu este o cerinţă indispensabilă, însă metoda trebuie să dovedească că se poate face distincţie între valoarea-martor şi valoarea-limită. La furnizarea unui nivel BEQ se stabileşte un nivel de raportare pentru a se lua decizii legate de probele care prezintă un răspuns sub acest nivel. Nivelul de raportare se dovedeşte a fi diferit de probele-martor din cadrul procedurii cel puţin cu un factor de trei, cu un răspuns inferior intervalului de lucru. Prin urmare, se calculează pornind de la probe care conţin compuşii ţintă în jurul nivelului minim necesar şi nu de la un raport semnal/zgomot sau un test martor.
Pentru valoarea totală TEQ, trebuie să fie respectate următoarele criterii, indicate în tabelul nr.2:
|
Tabelul nr.2 Valoarea totală TEQ |
||
| Metode de depistare | Metode de confirmare | |
| Rată de fals negative | < 5% | |
| Veridicitate | – 20% pînă la + 20% | |
| Precizie RSDR | < 25% | < 15% |
| Repetabilitate RSDr | <20% | |
2.5.1. Atît metodele GC-MS, cît şi metodele bioanalitice pot fi folosite pentru screening. Pentru metodele GC-SM trebuie să fie respectate cerinţele prevăzute la punctul 2.6. din prezenta anexă. Pentru metodele bioanalitice celulare sînt prevăzute cerinţe specifice la punctul 2.7. din prezenta anexă.
Laboratoarele care aplică metode de screening pentru controlul de rutină al probelor stabilesc o cooperare strînsă cu laboratoarele care aplică metoda de confirmare.
Verificarea posibilei suprimări a răspunsului celular şi a citotoxicităţii de 20% din extractele de probe sînt măsurate în screening-ul de rutină cu şi fără 2,3,7,8-TCDD care se adaugă în funcţie de nivelul maxim sau de pragul de acţiune, pentru a verifica dacă răspunsul este, eventual, suprimat de către substanţele interferente prezente în extractul de probă. Concentraţia măsurată a probei îmbogăţite se compară cu suma concentraţiei extractului neîmbogăţit, plus concentraţia cu îmbogăţire. Dacă această concentraţie măsurată este peste 25% mai mică decît concentraţia calculată, aceasta indică posibilitatea eliminării semnalului, iar proba respectivă este supusă analizei de confirmare prin GC-HRMS. Rezultatele sînt monitorizate în graficele de control al calităţii.
Aproximativ 2-10% din probele conforme, în funcţie de matricea probei şi de experienţa laboratorului, se confirmă prin GC-HRMS.
Cel puţin în condiţii de validare, metodele bioanalitice oferă o indicaţie valabilă a nivelului TEQ, calculat şi exprimat ca BEQ.
Pentru metodele bioanalitice efectuate în condiţii de repetabilitate, valoarea RSDr intralaborator ar fi, în general, mai mică decît RSDR, ceea ce reprezintă reproductibilitatea.
2.5.2. Determinarea ratelor fals-conforme pornind de la datele de control al calităţii.
Se determină rata rezultatelor fals-conforme care rezultă din screeningul probelor sub şi peste nivelul maxim sau pragul de acţiune. Ratele fals-conforme reale sînt sub 5%. Atunci cînd, în urma controlului de calitate al probelor conforme, sînt disponibile cel puţin 20 de rezultate confirmate per matrice/grup de matrice, concluziile privind rata fals-conformă trebuie să fie desprinse din această bază de date. Rezultatele probelor analizate prin intermediul testărilor interlaboratoare sau în timpul incidentelor de contaminare, care acoperă un interval de concentraţii de pînă la, de exemplu, 2x nivelul maxim, pot fi, de asemenea, incluse în cele cel puţin 20 de rezultate pentru evaluarea ratei fals-conforme. Probele acoperă cele mai frecvente modele pentru congeneri, reprezentînd diverse surse.
Deşi testele de screening au ca scop detectarea probelor care depăşesc pragul de acţiune, criteriul de determinare a ratelor fals-conforme este nivelul maxim, ţinînd cont de incertitudinea de măsurare a metodei de confirmare.
2.6. Cerinţe specifice privind metodele CG-SM care trebuie respectate în scop de depistare sau de confirmare
1) Adăugarea de etaloane interne de PCDD/F-uri 2,3,7,8 clor-substituite şi de PCB-uri asemănători dioxinei marcate cu 13C trebuie să fie realizată chiar de la începutul efectuării metodei de analiză, de exemplu, înaintea extracţiei, pentru validarea procedurii analitice. Trebuie să fie adăugat cel puţin un congener pentru fiecare din grupele omoloage tetra-octo-clorurate de PCDD/F şi cel puţin un congener pentru fiecare dintre grupele omoloage de PCB-uri asemănători dioxinei sau, în caz alternativ, cel puţin un congener pentru fiecare funcţie de înregistrare a ionului selecţionat prin spectrometrie de masă, utilizat pentru monitorizarea PCDD/F şi a PCB asemănători dioxinei.
Trebuie să existe o preferinţă clară, mai ales în cazul metodelor de confirmare, pentru utilizarea tuturor celor 17 etaloane interne de PCDD/F 2,3,7,8-clor-substituite marcate cu 13C şi a tuturor celor 12 etaloane interne de PCB-uri asemănători dioxinei marcate cu 13C.
2) Se determină, la fel, factorii de răspuns relativ pentru acei congeneri pentru care nu se adaugă niciun analog marcat cu 13C, utilizînd soluţii de calibrare corespunzătoare.
3) Pentru nutreţurile de origine vegetală şi cele de origine animală care conţin mai puţin de 10% grăsime, este obligatorie adăugarea etaloanelor interne înainte de extracţie. Pentru nutreţurile de origine animală ce conţin mai mult de 10% grăsime, etaloanele interne se pot adăuga fie înaintea extracţiei, fie după extracţia grăsimii. Se efectuează o validare adecvată a eficienţei metodei de extracţie, în funcţie de etapa în care se introduce etaloanele interne şi de modul în care se consemnează rezultatele, în funcţie de produs sau de grăsime.
4) Înaintea analizei CG/SM trebuie să fie adăugat unul sau două etaloane de recuperare, care reprezintă etaloane surogat.
5) Este necesar controlul recuperării. Pentru metodele de confirmare, recuperarea etaloanelor interne individuale trebuie să fie situată în intervalul 60-120%. Se acceptă şi recuperări inferioare sau superioare pentru congeneri individuali, în special pentru dibenzodioxine şi dibenzofurani hepta- şi octo-cloruraţi, atît timp cît contribuţia acestora la valoarea TEQ nu depăşeşte 10% din valoarea TEQ totală, bazată pe suma dintre PCDD/F şi PCB asemănători dioxinei. Pentru metodele de depistare, recuperarea trebuie să fie situată în intervalul 30-140%.
6) Separarea dioxinelor de compuşii cloruraţi interferenţi, cum sînt PCB-uri neasemănători dioxinei şi difenileterii cloruraţi, se realizează prin tehnici cromatografice adecvate, de preferinţă pe coloană de florisil, alumină şi/sau cărbune.
7) Separarea izomerilor prin cromatografie în fază gazoasă este de < 25% de la vîrf la vîrf, între 1,2,3,4,7,8-HxCDF şi 1,2,3,6,7,8-HxCDF.
8) Determinarea dioxinei şi a furanilor tetra-octocloruraţi se realizează prin metoda de diluţie a izotopilor HRGC/HRMS.
9) Diferenţa dintre limita superioară şi limita inferioară trebuie să nu depăşească 20% pentru nutreţurile caracterizate de o contaminare cu dioxine situată în interval sau peste nivelul maxim de contaminare. Pentru nutreţurile cu niveluri de contaminare mult sub nivelul maxim, diferenţa se poate situa în intervalul 25-40%.
2.7. Metode analitice de depistare
2.7.1.1. Abordare de depistare
Se pot aplica diferite abordări analitice, utilizînd o metodă de depistare.
Răspunsul eşantioanelor este comparată cu cea a unui eşantion de referinţă la nivelul de interes.
Cerinţe:
1) În fiecare serie de testări trebuie să fie inclus un eşantion martor şi unul de referinţă, care se supun extracţiei şi testării în acelaşi timp şi în condiţii identice. Eşantionul de referinţă trebuie să prezinte un răspuns cu mult mai mare în comparaţie cu un martor.
2) Se includ eşantioane de referinţă suplimentare de 0,5x şi 2x nivelul de interes, pentru a se demonstra eficacitatea testului în intervalul de interes, pentru controlul nivelului de interes.
3) Atunci cînd se testează alte matrice, trebuie să fie demonstrat că eşantionul sau eşantioanele de referinţă sînt cele corespunzătoare, de preferinţă prin includerea eşantioanelor la care s-a dovedit prin HRGC/HRMS că au un nivel TEQ în jurul celui al eşantionului de referinţă sau, altfel, a unui martor contaminat la nivelul respectiv.
4) Deoarece etaloanele interne nu pot fi utilizate în bioteste, testele cu privire la repetabilitate sînt foarte importante, pentru a se obţine informaţii privind deviaţia standard în cadrul unei serii de teste. Coeficientul de variaţie trebuie să fie inferior valorii de 30%.
5) Pentru bioteste se definesc compuşii-ţintă, interferenţele potenţiale şi nivelurile maxime tolerabile ale martorului.
2.7.1.2. Abordare cantitativă
Aceasta necesită o serie de diluţii standard, procese de curăţare şi de măsurare duble sau triple, precum şi controale de recuperare şi ale martorului. Rezultatul poate fi exprimat ca TEQ, presupunîndu-se astfel că acei compuşi care se află la originea semnalului corespund principiului TEQ. Acest lucru se poate realiza prin utilizarea TCDD sau a unui amestec etalon de dioxină/furan/PCB asemănător dioxinei, pentru a se obţine o curbă de calibrare pentru calculul nivelului TEQ din extract şi, astfel, din eşantion.
Cantitatea obţinută se corectează apoi cu valoarea TEQ calculată pentru un eşantion martor, pentru a se ţine cont de impurităţile din solvenţi şi din substanţele chimice utilizate, şi pentru recuperare, calculată în baza valorii TEQ dintr-un eşantion de control al calităţii apropiată de limita de interes.
O parte din aparenta pierdere de recuperare poate fi determinată de efectele matricei şi/sau de diferenţele dintre valorile TEF în bioteste şi valorile TEF oficiale stabilite de Organizaţia Mondială a Sănătăţii.
2.7.2. Cerinţe privind metodele analitice pentru depistare
1) Depistarea se poate face prin metode analitice CG/SM sau prin bioteste. Pentru metodele CG/SM trebuie utilizate cerinţele prevăzute la punctul 2.6. Pentru biotestele celulare se stabilesc cerinţe specifice descrise la subpunctul 2.7.3., iar pentru biotestele realizate cu ajutorul kiturilor de testat se stabilesc cerinţe specifice menţionate în subpunctul 2.7.4.
2) Sînt necesare informaţii privind numărul de rezultate fals pozitive şi fals negative obţinute pentru un set mare de eşantioane peste sau sub nivelul maxim sau nivelul de intervenţie, prin comparaţie cu conţinutul TEQ determinat printr-o metodă analitică de confirmare. Ratele efective de rezultate fals negative trebuie să se situeze sub 1%. Rata de rezultate fals pozitive este suficient de scăzută pentru a face ca utilizarea instrumentului de depistare să fie avantajoasă.
3) Rezultatele pozitive trebuie confirmate întotdeauna printr-o metodă analitică de confirmare HRGC/HRMS.
Eşantioanele dintr-o gamă largă de TEQ se confirmă prin HRGC/HRMS, aproximativ 2-10% din eşantioanele negative. Se furnizează informaţii privind corespondenţa dintre rezultatele biotestelor şi cele ale HRGC/HRMS.
2.7.2.1. Metodele bioanalitice sînt bazate pe utilizarea de principii biologice, precum testele pe bază de celule sau de receptori sau imunodozări Prezentul subpunct stabileşte cerinţe pentru metodele bioanalitice în general.
O metodă de screening, în principiu, clasifică o probă ca fiind conformă. În acest scop, nivelul BEQ calculat este comparat cu valoarea-limită. Probele sub valoarea-limită sînt declarate conforme, probele egale sau peste valoarea-limită sînt suspectate a fi neconforme, necesitînd o analiză printr-o metodă de confirmare. În practică, un nivel BEQ corespunzînd la 2/3 din nivelul maxim poate servi drept valoare-limită cu condiţia să se asigure o rată fals-conformă sub 5% şi o rată acceptabilă pentru rezultate fals-neconforme. Cu niveluri maxime diferite pentru PCDD-uri/PCDF-uri şi pentru suma de PCDD-uri/PCDF-uri şi PCB-uri de tipul dioxinelor, verificarea conformităţii probelor fără fracţionare necesită valori-limită corespunzătoare ale biotestelor pentru PCDD-uri/PCDF-uri. Pentru verificarea probelor care depăşesc pragurile de acţiune, un procentaj corespunzător al pragului de acţiune respectiv ar fi adecvat ca valoare-limită.
2.7.3. Cerinţe specifice pentru bioteste celulare
1) Cînd se execută un biotest, fiecare testare necesită o serie de concentraţii de referinţă ale TCDD sau ale unui amestec de dioxină/furan, ceea ce reprezintă curbă de răspuns pentru o doză completă cu un R2> 0,95. În scop de depistare se poate utiliza o curbă de nivel scăzut extinsă, pentru analiza eşantioanelor cu conţinut scăzut.
2) Pentru rezultatul biotestului într-un interval de timp constant se utilizează pe o foaie de control al calităţii o concentraţie TCDD de referinţă, aproximativ de 3x limita de cuantificare.
3) Graficele de control al calităţii pentru fiecare tip de material de referinţă se înregistrează şi se verifică pentru a se garanta că rezultatul este conform cu liniile directoare stabilite.
4) Pentru calculele cantitative, realizarea diluţiei eşantionului trebuie să se situeze în cadrul porţiunii liniare a curbei de răspuns. Eşantioanele situate deasupra porţiunii liniare a curbei de răspuns trebuie diluate şi testate din nou. Se recomandă testarea a cel puţin trei diluţii o dată.
5) Procentul deviaţiei standard nu depăşeşte 15% într-o determinare triplă pentru fiecare diluţie a eşantionului şi 30% pentru trei experimente independente.
6) Limita de detecţie poate fi stabilită la de 3 ori valoarea deviaţiei standard a solventului martor sau a răspunsului de fond. Altă abordare constă în aplicarea unui răspuns care se situează deasupra răspunsului de fond-factor de inducţie de 5x martorul solventului, calculat din curba de calibrare a zilei. Limita de cuantificare poate fi stabilită ca o valoare de la 5x pînă la 6x deviaţia standard a martorului solventului sau a răspunsului de fond ori poate fi aplicat un răspuns ce este clar superior răspunsului de fond-factor de inducţie de 10x martorul solventului, calculat din curba de calibrare a zilei.
2.7.4. Cerinţe specifice pentru biotestele realizate pe bază de kituri
1) Să fie garantate că biotestele pe bază de kituri au o sensibilitate şi o fiabilitate pentru a fi aplicate nutreţurilor.
2) Să fie respectate instrucţiunile producătorului privind pregătirea şi analiza eşantioanelor.
3) Kiturile de testare nu se utilizează după data expirării.
4) Nu se utilizează materiale sau componente destinate utilizării cu alte kituri.
5) Kiturile de testare se păstrează la o temperatură de depozitare situată în cadrul unui interval specificat şi se utilizează la temperatura de lucru specificată.
6) Limita de detecţie pentru imunodozări este determinată ca suma mediei şi a valorii de 3x deviaţia standard, bazată pe o serie de 10 analize repetate ale martorului şi care este împărţită la valoarea pantei ecuaţiei de regresie liniară.
7) Pentru testele realizate în laborator se utilizează etaloane de referinţă, pentru a garanta că răspunsul la etalon se situează într-un interval acceptabil.
2.8. Raportarea rezultatelor
În măsura în care procedura analitică utilizată permite acest lucru, rezultatele analitice conţin niveluri individuale ale congenerilor PCDD/F şi PCB; rezultatele analitice se raportează ca limită inferioară, limită superioară şi limită medie, pentru a se include un maxim de informaţii în raportarea rezultatelor, permiţînd astfel interpretarea rezultatelor în conformitate cu cerinţele specifice.
De asemenea, raportarea include conţinutul de lipide al eşantionului şi metoda utilizată pentru extracţia lipidelor.
Trebuie să fie disponibile informaţii despre recuperările etaloanelor interne individuale, dacă recuperările se situează în afara intervalului menţionat la punctul 2.6., dacă depăşesc nivelul maxim.
Atunci cînd se stabileşte conformitatea eşantionului trebuie să se ţină cont de incertitudinea măsurării, acest parametru trebuie să fie, la fel, disponibil. Rezultatul analizei se raportează ca indicele x+/–U, unde “x” este rezultatul analitic şi “U” este incertitudinea de măsurare extinsă, folosind un factor de acoperire 2, care dă un nivel de încredere de aproximativ 95%. În cazul unei determinări separate a dioxinelor şi a PCB-urilor asemănători dioxinei, suma incertitudinii extinse estimate a rezultatelor analitice separate ale dioxinelor şi ale PCB-urilor asemănători dioxinei se utilizează pentru suma dioxinelor şi a PCB-urilor asemănători dioxinei.
Dacă incertitudinea de măsurare se ia în considerare aplicîndu-se CCα, acest parametru se comunică.
2.8.1. Pregătirea probelor şi cerinţe privind metodele analitice utilizate pentru controlul oficial al nivelurilor PCB-urilor care nu sînt de tipul dioxinelor (PCB # 28, 52, 101, 138, 153, 180)
Cerinţele stabilite în prezentul capitol se aplică atunci cînd nutreţurile sînt analizate pentru controlul oficial al nivelurilor de bifenili policloruraţi care nu sînt de tipul dioxinelor, PCB-uri care nu sînt de tipul dioxinelor, precum şi în alte scopuri de reglementare.
În calitate de metodă aplicată se foloseşte metoda gaz-cromatografică de detectare prin captură de electroni (GC-CDE, GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS) sau metode echivalente.
În sensul identificării şi confirmării analiţilor de interes, timpul de retenţie este relativ în raport cu etaloanele interne sau etaloanele de referinţă, cu o deviaţie acceptabilă ± 0,25%.
Separarea gaz-cromatografică a tuturor celor şase PCB-uri indicatori, şi anume PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 şi PCB 180, de substanţele interferente, în special PCB-uri co-eluante, mai ales în cazul în care nivelurile probelor sînt în limite legale şi neconformitatea trebuie să se confirme, congeneri despre care s-a constatat că sînt adesea co-eluanţi sînt, de exemplu, PCB 28/31, PCB 52/69 şi PCB 138/163/164. Pentru GC-MS este necesar să se ţină seama şi de interferenţele posibile din partea fragmentelor de congeneri mai puternic cloruraţi.
Cerinţe pentru tehnici GC-SM
Monitorizarea a cel puţin:
1) doi ioni specifici pentru HRMS;
2) doi ioni specifici de m/z>200 sau trei ioni specifici de m/z>100 pentru LRMS;
3) un ion precursor şi doi ioni produs pentru MS-MS.
Deviaţia relativă a abundenţei izotopice relative pentru fragmentele de masă selecţionate şi valoarea teoretică a abundenţei izotopice sau etalonul de etalonare pentru ionul ţintă, care reprezintă ionul monitorizat cu cea mai ridicată abundenţă izotopică, şi ionul (ionii) calificativ(i) vor fi prezentate în tabelul nr.3.
|
Tabelul nr.3 |
||
| Intensitatea relativă a ionului (ionilor) calificativ(i) în comparaţie cu ionul ţintă |
GC-EI-MS (deviaţie relativă) |
GC-CI-MS, GCMSn (deviaţie relativă) |
| > 50 % | ± 10 % | ± 20 % |
| > 20 % la 50 % | ± 15 % | ± 25 % |
| > 10 % la 20 % | ± 20 % | ± 30 % |
| ≤ 10 % | ± 50 % (1) | ± 50 % (1) |
|
Număr de fragmente de masă cu intensitate relativă >10 %, prin urmare nu se recomandă să se folosească ion(i) calificativ(i) cu o intensitate relativă mai mică de 10 % în comparaţie cu ionul ţintă. |
||
Performanţa metodei se validează în intervalul nivelului maxim, de la 0,5 la 2 ori nivelul maxim, cu un coeficient de variaţie acceptabil pentru analiza repetată.
Valorile-martor nu sînt mai mari de 30% din nivelul contaminării care corespunde nivelului maxim.
2.8.2.Controlul recuperărilor
Se utilizează etaloane interne cu proprietăţi fizico-chimice comparabile cu cele ale analiţilor de interes.
1) Cerinţe privind metodele care utilizează toţi cei şase congeneri ai PCB-urilor indicatori marcaţi cu un izotop:
a) rezultatele sînt corectate pentru recuperările etaloanelor interne;
b) recuperările etaloanelor interne marcate cu un izotop sînt între 50 şi 120%;
c) recuperările inferioare sau superioare pentru congenerii individuali cu o contribuţie la suma celor şase PCB-uri indicatori mai mică de 10% sînt acceptabile.
2) Cerinţe privind metodele care nu utilizează toate cele şase etaloane interne marcate cu un izotop sau alte etaloane interne:
a) recuperarea etalonului (etaloanelor) intern(e) se controlează pentru fiecare probă;
b) recuperările etalonului (etaloanelor) intern(e) sînt între 60 şi 120%;
c) rezultatele sînt corectate pentru recuperările etaloanelor interne.
Caracteristici de performanţă: criterii pentru suma celor şase PCB-uri indicatori la nivelul maxim.
| Autenticitate | – 30 pînă la + 30 % |
| Precizie intermediară (RSD %) | ≤ 20 % |
| Diferenţa dintre estimarea superioară şi estimarea inferioară a calculului | ≤ 20 % |
2.8.3. Raportarea rezultatelor
În măsura în care procedura analitică utilizată permite acest lucru, rezultatele analitice includ nivelurile de congeneri individuali ai PCB-urilor şi sînt indicate drept estimare inferioară, estimare superioară şi medie, pentru a include o cantitate maximă de informaţii în raportarea rezultatelor, ceea ce permite o interpretare a rezultatelor în conformitate cu cerinţele specifice.
Raportul include metoda utilizată pentru extracţia PCB-urilor şi a lipidelor.
Recuperările etaloanelor interne individuale sînt disponibile dacă recuperările se situează în afara intervalului menţionat la subpunctul 2.8.2. din prezenta anexă, dacă se depăşeşte nivelul maxim, iar în celelalte cazuri, la cerere.
Atunci cînd se decide conformitatea unei probe, se ţine seama de incertitudinea de măsurare, acest parametru este, la fel, pus la dispoziţie.
Rezultatele analitice se raportează ca indicele x ± U, unde “x” este rezultatul analitic şi “U” este incertitudinea de măsurare extinsă, folosind un factor de acoperire 2, care dă un nivel de încredere de aproximativ 95%.
În cazul în care se ia în considerare incertitudinea de măsurare prin aplicarea CCα, acest parametru se raportează.
Rezultatele se exprimă în aceleaşi unităţi şi prin cel puţin acelaşi număr de zecimale precum nivelurile maxime prevăzute de Hotărîrea Guvernului nr.1405 din 10 decembrie 2008 cu privire la aprobarea Normei sanitar-veterinare privind igiena nutreţurilor şi conţinutul substanţelor nedorite în nutreţuri.
[Anexa nr.5 în redacţia Hot.Guv. nr.844 din 25.10.2017, în vigoare 03.11.2017]
Anexa nr.6
la Hotărîrea Guvernului
nr.686 din 13 septembrie 2012
[Anexa nr.6 în redacţia Hot.Guv. nr.844 din 25.10.2017, în vigoare 03.11.2017]
METODELE DE ANALIZĂ
privind determinarea constituenţilor de origine animală
pentru controlul oficial al nutreţurilor
1. CONDIŢII PENTRU DETECTAREA, IDENTIFICAREA
SAU ESTIMAREA PRIN EXAMINARE MICROSCOPICĂ A
CONSTITUENŢILOR DE ORIGINE ANIMALĂ ÎN NUTREŢURI
1.1. Obiectiv şi domeniu de aplicare
Prezentele condiţii se utilizează în cazul în care detectarea constituenţilor de origine animală, definiţi ca produse rezultate din prelucrarea carcaselor sau a unor părţi din corpul mamiferelor, păsărilor de crescătorie sau peştilor, din nutreţuri se realizează prin examinare microscopică în cadrul unui program de inspecţie coordonat în domeniul nutriţiei animalelor.
Determinarea constituenţilor de origine animală în nutreţuri se efectuează prin microscopie optică sau reacţie în lanţ a polimerazei (PCR), în conformitate cu dispoziţiile stabilite în prezenta anexă.
Aceste două metode fac posibilă detectarea prezenţei constituenţilor de origine animală în materiile prime pentru nutreţuri şi nutreţuri combinate. Totuşi, ele nu fac posibilă calcularea cantităţii acestor constituenţi în materiile prime pentru nutreţuri şi nutreţuri combinate. Ambele metode au o limită de detecţie sub 0,1% g/g.
Metoda PCR face posibilă identificarea grupului taxonomic al constituenţilor de origine animală prezenţi în materiile prime pentru nutreţuri şi nutreţuri combinate.
În funcţie de tipul de nutreţ în curs de testare, aceste metode pot fi utilizate în cadrul unui singur protocol operaţional, fie singure, fie combinate împreună în conformitate cu procedurile standard de operare, stabilite de laboratorul de referinţă al Uniunii Europene pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale şi publicate pe pagina web oficială al acestuia.
1.2. Sensibilitate
În funcţie de natura constituenţilor de origine animală, este posibilă detectarea unor cantităţi foarte mici în nutreţuri (< 0,1%).
1.3. Principiul de aplicare
Pentru identificare se utilizează un eşantion reprezentativ, prelevat în conformitate cu indicaţiile din anexa nr.1 şi care a fost supus unei preparări. Protocolul descris în punctul 1.9. din prezenta anexă este adecvat pentru tratarea nutreţurilor cu un conţinut mic de umiditate.
Nutreţurile cu un conţinut de umiditate mai mare de 14% se usucă înaintea tratamentului. Nutreţurile sau materiile prime pentru nutreţuri speciale, precum grăsimile sau uleiurile necesită un tratament specific, prevăzute în punctul 1.9. din prezenta anexă.
Constituenţii de origine animală se identifică pe baza caracteristicilor tipice, identificabile prin examinare microscopică, cum sînt fibrele musculare şi alte particule de carne, cartilagiile, oasele, coarnele, părul, părul de porc, sîngele, penele, cojile de ouă, oasele şi solzii de peşte.
Identificarea trebuie să se realizeze atît pentru fracţia care a trecut prin sită, conform prevederilor descrise în subpunctul 1.6.1., cît şi pentru sedimentul concentrat de eşantion, în conformitate cu prevederile menţionate în subpunctul 1.6.2. din prezenta anexă.
1.4. Reactivi utilizaţi
1.4.1. Agent de includere
1.4.1.1. Tetracloretilenă cu greutatea specifică 1,62.
1.4.1.2.Soluţie de roşu de alizarină, care se diluează 2,5 ml acid clorhidric 1M în 100 ml apă şi se adaugă 200 mg roşu de alizarină în soluţia obţinută.
1.4.1.3. Clorhidrat (soluţie apoasă, 60% g/v).
1.4.1.4. Leşie (NaOH 2,5% g/v sau KOH 2,5% g/v) pentru fracţiile cernute.
1.4.1.5. Ulei de parafină sau glicerol, cu vîscozitatea: 68-81 pentru examinarea microscopică a sedimentului.
1.4.1.6. Norland® Optical Adhesive 65 (vîscozitate: 1 200 cP) sau o răşină cu proprietăţi echivalente pentru pregătirea lamelor permanente.
1.4.1.7. Reactiv Fehling, preparat înainte de utilizare din părţi egale de 1/1 a două soluţii stoc A şi B. Soluţia A: se dizolvă 6,9 g sulfat de cupru (II) pentahidrat în 100 ml apă. Soluţia B: se dizolvă 34,6 g tartrat de sodiu şi potasiu tetrahidrat şi 12 g NaOH în 100 ml apă.
1.4.1.8. Tetrametilbenzidină/Peroxid de hidrogen. Se dizolvă 1 g de 3,3′, 5,5′ tetrametilbenzidină în 100 ml de acid acetic glacial şi 150 ml apă. Înainte de utilizare, se amestecă patru părţi din această soluţie tetrametilbenzidină cu o parte de peroxid de hidrogen 3 %.
1.4.2. Agenţi de clătire
1.4.2.1. Alcool 96%.
1.4.2.2. Acetonă.
1.4.3. Agent de concentrare
1.4.3.1. Tetracloretilenă cu densitatea 1,62.
1.4.4. Reactivi de colorare
1.4.4.1. Soluţie de iod/iodură de potasiu. Se dizolvă 2 g iodură de potasiu în 100 ml apă şi se adaugă 1 g de iod agitînd frecvent.
1.4.4.2. Roşu de alizarină. Se diluează 2,5 ml acid clorhidric 1M. în 100 ml apă şi se adaugă 200 mg roşu de alizarină în soluţia obţinută.
1.4.4.3. Reactiv cistină – 2 g acetat de plumb, 10 g NaOH/100 ml H2O.
1.4.4.4. Soluţie de iod/iodură de potasiu, dizolvată în etanol 70%.
1.4.5. Reactiv decolorant
1.4.5.1. Soluţie comercială de hipoclorit de sodiu cu o concentraţia de 9-14% clor activ.
1.5. Echipament şi accesorii
1.5.1. Balanţă analitică, cu precizia de 0,001 g, cu excepţia sedimentului concentrat: 0,001 g.
1.5.2. Dispozitiv de măcinat (moară de măcinat sau mojar, în special pentru nutreţuri ce conţin > 15% grăsime, detectată la analiză).
1.5.3. Sită cu ochiuri pătrate cu lărgimea de maximum 0,25 mm şi 1 mm lăţime.
1.5.4. Pîlnie de separare sau pahar de laborator de decantare cu fund conic.
1.5.5. Microscop stereoscopic (mărire de minimum 40 de ori).
1.5.6. Microscop compus (mărire de minimum 400 de ori), lumină transmisă sau lumină polarizată.
1.5.7. Sticlărie de laborator standard.
1.5.8. Echipamente pentru pregătirea lamelor: lame de microscop clasice, lame tubulare, lame de acoperire cu mărimea de 20×20 mm, pensete, spatulă fină.
Toată aparatura se curăţă cu grijă. Pîlniile de separare şi sticlăria se spală în maşina de spălat. Sitele se curăţă cu o perie cu peri aspri.
1.6. Procedura de preparare
Pentru a se evita contaminarea încrucişată în laborator, toate echipamentele reutilizabile sînt curăţate cu grijă înainte de utilizare. Piesele pîlniei de separare sînt demontate înainte de curăţare. Piesele pîlniei de separare şi sticlăria sînt prespălate manual şi apoi spălate în maşina de spălat. Sitele sînt curăţate, utilizînd o perie cu peri sintetici aspri. Se recomandă curăţarea finală a sitelor cu acetonă şi aer comprimat după cernerea materiilor grase, precum făina de peşte.
Dacă ambele fracţii se analizează ca eşantioane individuale, nutreţurile sub formă de pelete se cern în prealabil.
Cel puţin 50 g de eşantion se tratează, dacă este necesar, se macină cu grijă cu un dispozitiv de măcinare adecvat pentru a obţine o structură corespunzătoare. Din materialul măcinat se iau două porţiuni reprezentative, una pentru fracţia cernută de cel puţin 5 g, avînd în vedere menţiunea de la subpunctul 1.6.1 din prezenta anexă şi una pentru sedimentul concentrat de cel puţin 5 g, avînd în vedere menţiunea de la subpunctul 1.6.2 din prezenta anexă.
Pentru identificare se poate aplica suplimentar colorarea cu reactivi de colorare, conform prevederilor subpunctului 1.6.3 din prezenta anexă.
Pentru a indica natura proteinelor animale şi originea particulelor, se poate utiliza un sistem de decizie asistată de tipul ARIES şi pot fi documentate eşantioane de referinţă.
1.6.1. Pentru analiza eşantioanelor altele decît grăsimi sau uleiuri
Eşantioanele cu un conţinut de umiditate >14% se usucă înainte de tratare.
Se recomandă să se cearnă în prealabil la 1 mm nutreţurile sub formă de pelete şi grăunţele, apoi să se pregătească şi să se analizeze cele două fracţiuni rezultate ca eşantioane distincte.
Subeşantionarea şi măcinarea: cel puţin 50 g din eşantion constituie subeşantioane pentru a fi analizate şi ulterior măcinate.
1) Extragerea şi prepararea sedimentului: o porţiune de 10 g, cu o precizie de 0,01 g, din subeşantionul măcinat este transferată în pîlnia de separare sau în paharul de sedimentare cu fund conic şi se adaugă 50 ml de tetracloretilenă. Porţiunea transferată în pîlnie este limitată la 3 g în cazul făinii de peşte sau al altor produse de origine animală pure, ingrediente minerale sau preamestecuri care generează sedimente în proporţie de peste 10%.
Amestecul se scutură energic cel puţin 30 de secunde şi se mai adaugă cu atenţie cel puţin 50 ml de tetracloretilenă în timp ce se spală suprafaţa interioară a pîlniei pentru a îndepărta orice urmă de particule. Amestecul rezultat se lasă să stea cel puţin cinci minute înainte de a separa sedimentul prin deschiderea robinetului.
2) Dacă se utilizează un pahar de sedimentare cu fund conic, se agită energic amestecul cel puţin 15 secunde şi particulele care rămîn pe pereţii paharului sînt spălate cu atenţie de pe suprafaţa interioară cu cel puţin 10 ml de tetracloretilenă curată.
Amestecul se lasă să stea 3 minute şi apoi se agită din nou 15 secunde, iar particulele care rămîn pe pereţii paharului sînt spălate cu atenţie de pe suprafaţa interioară cu cel puţin 10 ml de tetracloretilenă curată. Amestecul rezultat se lasă să stea cel puţin 5 minute şi apoi fracţiunea lichidă se înlătură şi se elimină prin decantare atentă, avînd grijă să nu se piardă nimic din sediment.
3) Sedimentul se usucă şi apoi se cîntăreşte cu o precizie de 0,001 g. Dacă peste 5% din sediment constă în particule >0,50 mm, se cerne la 0,25 mm şi se examinează cele două fracţiuni rezultate.
4) Extragerea şi prepararea reziduului de flotaţie: după recuperarea sedimentului prin metoda descrisă mai sus, trebuie să rămînă două faze în pîlnia de separare: una lichidă care constă în tetracloretilenă şi una solidă alcătuită din material care pluteşte. Această fază solidă este reziduul de flotaţie care se recuperează, turnînd toată tetracloretilena din pîlnie prin deschiderea robinetului. Prin răsturnarea pîlniei de separare, reziduul de flotaţie este transferat într-o placă Petri mare şi uscat la aer într-o hotă de tiraj. Dacă peste 5% din reziduul de flotaţie constă în particule >0,50 mm, se cerne la 0,25 mm şi se examinează cele două fracţiuni rezultate.
5) Pregătirea materiei prime: se pregăteşte o porţiune de cel puţin 5 g de subeşantion măcinat. Dacă peste 5% din materie constă în particule >0,50 mm, se cerne la 0,25 mm şi se examinează cele două fracţiuni rezultate.
1.6.2. Identificarea constituenţilor de origine animală din fracţiile cernute
Un eşantion de cel puţin 5 g se cerne prin sită în două fracţii. Fracţia (fracţiile) cernută (cernute) cu particule mari (sau o parte reprezentativă a fracţiei) se aplică în strat subţire pe un suport adecvat şi se examinează sistematic la microscopul stereoscopic cu măriri diferite pentru detectarea constituenţilor de origine animală.
Lamelele preparate cu fracţia (fracţiile) cu particule fine se examinează sistematic la microscopul compus cu măriri diferite pentru detectarea constituenţilor de origine animală.
1.6.3. Identificarea constituenţilor de origine animală din sedimentul concentrat
Cel puţin 5 g se cîntăresc cu o precizie de pînă la 0,001 g de eşantion se transferă într-o pîlnie de separare sau într-un vas de laborator de decantare cu fund conic şi se tratează cu cel puţin 50 ml tetracloretilenă. Soluţia se agită sau se amestecă de mai multe ori.
1) Dacă se utilizează o pîlnie de separare închisă, sedimentul se lasă să stea un timp de cel puţin trei minute înainte de a fi separat. Se repetă agitarea şi sedimentul se lasă iar să stea timp de cel puţin trei minute.
Se separă din nou sedimentul.
2) Dacă se utilizează un pahar de laborator deschis, sedimentul se lasă să stea cel puţin cinci minute înainte de a fi separat.
Sedimentul total se usucă şi apoi se cîntăreşte cu o precizie de 0,001 g. Cîntărirea este efectuată doar dacă este necesară o estimare. Dacă sedimentul conţine multe particule mari, se poate cerne printr-o sită în două fracţii.
Sedimentul uscat se examinează la microscopul stereoscopic şi la microscopul compus pentru detectarea constituenţilor osoşi.
1.6.4. Pregătirea eşantioanelor constînd în grăsimi sau uleiuri
Pentru pregătirea eşantioanelor constînd în grăsimi sau uleiuri se aplică următorul protocol:
1) dacă grăsimea este solidă, se încălzeşte într-un cuptor pînă cînd devine lichidă;
2) cu ajutorul unei pipete, 40 ml de grăsime sau ulei se transferă din partea inferioară a eşantionului într-un tub de centrifugă;
3) se centrifughează timp de 10 minute la 4000 rpm;
4) dacă grăsimea este solidă după centrifugare, se încălzeşte într-un cuptor pînă cînd devine lichidă;
5) se repetă centrifugarea timp de 5 minute la 4000 rpm;
6) cu ajutorul unei linguri mici sau al unei spatule, jumătate din impurităţile decantate sînt transferate spre examinare către lame microscopice, recomandîndu-se glicerolul ca mediu de montare.
1.6.5. Utilizarea agenţilor de includere şi a reactivilor de colorare
Pentru a facilita identificarea la microscop a constituenţilor de origine animală se pot utiliza agenţi de includere şi reactivi de colorare speciali.
Clorhidrat: prin încălzire cu atenţie, structurile celulare se văd mai clar, ca urmare a faptului că granulele de amidon se gelatinizează, iar conţinuturile celulare nedorite sînt eliminate.
Leşie: atît hidroxidul de sodiu, cît şi hidroxidul de potasiu limpezesc materialul nutreţului, facilitînd detecţia fibrelor musculare, a părului sau a altor structuri cheratinoase.
Ulei de parafină şi glicerol: constituenţii osoşi pot fi identificaţi bine în acest agent de includere pentru că majoritatea lacunelor rămîn umplute cu aer şi apar sub formă de găuri negre de aproximativ 5-15 μm.
Soluţie de iod/iodură de potasiu: se utilizează pentru detecţia amidonului de culoare albastră-violetă şi a proteinelor de culoare galbenă-portocalie. Dacă este necesar, soluţiile pot fi diluate.
Soluţie de roşu de alizarină: coloraţie roşie/roz a oaselor, precum şi a oaselor şi solzilor de peşte. Înainte de uscarea sedimentului, în conformitate cu prevederile subpunctul 1.6.2 din prezenta anexă, întregul sediment se transferă într-o eprubetă de sticlă şi se clăteşte de două ori cu aproximativ 5 ml de alcool, astfel de fiecare dată se utilizează un agitator, iar solventul se lasă să stea timp de aproximativ un minut şi se elimină.
Înainte de a utiliza acest reactiv de colorare, sedimentul se decolorează adăugîndu-se cel puţin 1 ml de soluţie de hipoclorit de sodiu. Se permite ca reacţia să continue timp de 10 minute.
Eprubeta se umple cu apă, se aşteaptă timp de 2-3 minute ca sedimentul să se decanteze, iar apa şi particulele în suspensie se elimină. Sedimentul se clăteşte de încă două ori cu aproximativ 10 ml de apă, iar pentru aceasta, de fiecare dată, se utilizează un agitator, care se lasă să stea şi apoi se elimină apa.
În funcţie de cantitatea de reziduu, se adaugă două pînă la zece sau mai multe picături de soluţie de roşu de alizarină. Amestecul se agită şi se permite desfăşurarea reacţiei timp de cîteva secunde. Sedimentul colorat se clăteşte de două ori cu aproximativ 5 ml de alcool, apoi o dată cu acetonă, astfel, de fiecare dată, se utilizează un agitator, solventul se lasă să stea timp de aproximativ un minut şi se elimină. Astfel sedimentul este pregătit pentru a fi uscat.
Reactiv cistină: prin încălzire cu atenţie, constituenţii care conţin cistină cu ar fi păr, pene etc. devin de culoare negru-maro.
1.6.6. Examinarea nutreţurilor susceptibile de a conţine făină de peşte
Se examinează la microscopul compus, în conformitate cu prevederile subpunctelor 1.6.1 şi 1.6.2 din prezenta anexă, cel puţin o lamelă din fracţia fină cernută şi din fracţia fină de sediment.
Dacă eticheta indică prezenţa făinii de peşte în ingrediente sau dacă se suspectează sau se detectează prezenţa făinii de peşte la examinarea iniţială, se examinează cel puţin încă două lamele cu fracţie fină cernută din eşantionul original, precum şi fracţia de sediment total.
1.6.7. Lamele microscopice se pregătesc din sediment şi, în funcţie de alegerea operatorului, fie din reziduu de flotaţie, fie din materie primă. În cazul în care s-a utilizat cernerea în timpul pregătirii eşantioanelor, se pregătesc cele două fracţiuni rezultate - cea fină şi cea grosieră. Porţiunile de testat din fracţiuni întinse pe lame trebuie să fie reprezentative pentru întreaga fracţiune.
Lamele microscopice se montează cu mediul de montare adecvat în conformitate cu procedurile standard de operare stabilite de laboratorul de referinţă al Uniunii Europene pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale şi publicate pe pagina web oficială al acestuia. Lamele se acoperă cu lame de acoperire.
Observaţiile microscopice se realizează utilizînd microscopul compus pe sediment şi, în funcţie de alegerea operatorului, fie pe reziduul de flotaţie, fie pe materia primă. Microscopul stereoscopic poate fi utilizat suplimentar faţă de microscopul compus pentru fracţiunile grosiere. Fiecare lamă se examinează în întregime la diferite amplificări.
Numărul minim de lame care trebuie observate în fiecare etapă a protocolului de observare trebuie să fie strict respectat, cu excepţia cazului în care întregul material al fracţiunii nu permite să se ajungă la numărul prevăzut de lame. Nu se observă mai mult de 6 lame pentru fiecare determinare.
Pentru a facilita identificarea naturii şi originii particulelor, operatorul poate utiliza instrumente de sprijin, precum sisteme de asistare în luarea deciziilor, biblioteci de imagini şi eşantioane de referinţă.
1.6.8. Numărul determinărilor
Dacă în urma unei prime determinări efectuate în conformitate cu protocolul de observare nu se detectează nicio particulă animală de o anumită natură, cum sînt animale terestre sau peşti, nu este necesară nicio determinare suplimentară.
Dacă în urma unei prime determinări efectuate în conformitate cu protocoalele de observare, după caz, numărul total al particulelor animale de o anumită natură detectate, precum animale terestre sau peşti, variază de la 1 la 5, se efectuează o a doua determinare, pornind de la un nou subeşantion de 50 g.
Dacă în urma determinării a doua, numărul de particule animale de această anumită natură detectate variază de la 0 la 5, rezultatul analizei se raportează utilizînd terminologia stabilită la punctul 1.6 din prezenta anexă, dacă nu, se efectuează o a treia determinare, pornind de la un nou subeşantion de 50 g.
În cazul în care, în urma primei şi a celei de a doua determinări, suma particulelor de o anumită natură detectate în cele două determinări este mai mare de 15, nu este necesară nicio determinare suplimentară, iar rezultatul analizei se raportează direct, utilizînd terminologia stabilită la punctul 1.6 din prezenta anexă. Dacă în urma celei de a treia determinări, suma particulelor animale de o anumită natură detectate pe parcursul celor trei determinări este mai mare de 15, rezultatul analizei se raportează, utilizînd terminologia stabilită la punctul 1.6 din prezenta anexă.
1.7. Calcul şi evaluare
Autoritatea sanitar-veterinară competentă supraveghează ca procedurile descrise la prezentul punct să fie utilizate pentru toate analizele oficiale în vederea estimării cantităţii şi nu doar a prezenţei constituenţilor de origine animală.
Calculul se poate realiza doar în cazul în care constituenţii de origine animală conţin fragmente osoase.
Fragmentele osoase ale speciilor terestre cu sînge cald, de exemplu, mamifere şi păsările, se pot distinge de diferitele tipuri de os de peşte pe o lamelă microscopică, cu ajutorul lacunei tipice. Proporţia de constituenţi de origine animală din eşantion se estimează luînd în considerare următoarele:
1) proporţia estimată în % per greutate de fragmente osoase în sedimentul concentrat;
2) proporţia în % per greutate de os din constituenţii de origine animală.
Pentru estimare trebuie să se examineze, dacă este posibil, cel puţin trei lamele şi cel puţin cinci cîmpuri pentru fiecare lamelă. În nutreţurile combinate, sedimentul concentrat conţine, de regulă, nu numai fragmente de oase de animale terestre şi de oase de peşte, ci şi alte particule cu greutate specifică mare, cum ar fi minerale, nisip, fragmente de plante lignificate şi altele.
1.7.1. Valoarea estimată a procentajului de fragmente osoase:
1) % de fragmente de oase de animale terestre = (S × c)/g;
2) % de fragmente de oase şi solzi de peşte = (S × d)/g,
unde:
S = greutatea sedimentului în mg;
c = factor de corecţie a %-ului pentru porţiunea estimată de oase de animale terestre din sediment;
d = factor de corecţie a %-ului pentru porţiunea estimată de fragmente de oase şi solzi de peşte din sediment;
g = greutatea eşantionului pentru sedimentare în mg.
1.7.2. Valoarea estimată a constituenţilor de origine animală
Dacă tipul făinii de origine animală prezente în eşantion este confirmat, conţinutul acesteia se va determina conform următoarelor formule:
1) conţinutul estimat de constituenţi al produselor din animale terestre:
(%) = (S × c)/(g × f) × 100;
2) conţinutul estimat de constituenţi al produselor din peşte:
(%) = (S × d)/(g × f) × 100,
unde:
S = greutatea sedimentului în mg;
c = factor de corecţie a %-ului pentru porţiunea estimată de constituenţi de oase de animale terestre din sediment;
d = factor de corecţie a %-ului pentru porţiunea estimată de fragmente de oase şi solzi de peşte din sediment;
f = factor de corecţie pentru proporţia de oase din constituenţii de origine animală din eşantionul examinat;
g = greutatea eşantionului pentru sedimentare în mg.
1.8. Exprimarea rezultatelor examinării
Raportul conţine cel puţin informaţii privind prezenţa constituenţilor derivaţi din animale terestre şi din făină de peşte. Diferitele cazuri se raportează în modul descris în subpunctele 1.8.1 şi 1.8.2.
1.8.1. Referitor la prezenţa constituenţilor derivaţi din animale terestre:
1) în măsura în care a fost perceptibil la microscop, în eşantionul analizat nu a fost detectat niciun constituent derivat din animale terestre; sau
2) în măsura în care a fost perceptibil la microscop, în eşantionul analizat au fost detectaţi constituenţi derivaţi din animale terestre.
1.8.2. Referitor la prezenţa făinii de peşte:
1) în măsura în care a fost perceptibil la microscop, niciun constituent derivat din peşte nu a fost detectat în eşantionul analizat;
2) în măsura în care a fost perceptibil la microscop, în eşantionul analizat au fost detectaţi constituenţi derivaţi din peşte.
Dacă sînt detectaţi constituenţi derivaţi din peşte sau din animale terestre, raportul privind rezultatele examinării, dacă este necesar, poate să indice o estimare a cantităţii de componente detectate (x %, <0,1%, 0,1-0,5%, 0,5-5% sau >5%), alte specificaţii privind tipul animalului terestru, dacă este posibil, precum şi constituenţii de origine animală identificaţi, cum sînt fibre musculare, cartilaje, oase, coarne, păr, peri de porc, pene, sînge, coji de ouă, oase de peşte, solzi.
În cazul în care se estimează cantitatea de constituenţi de origine animală, se menţionează factorul de corecţie “f” utilizat.
În cazul în care se identifică componente osoase derivate din animalele terestre, raportul conţine menţiunea suplimentară “Nu se poate exclude posibilitatea provenienţei din mamifere a constituenţilor menţionaţi anterior”.
Această menţiune suplimentară nu este necesară în cazurile în care fragmentele osoase provenite de la animale terestre sînt specificate ca fragmente osoase provenite de la păsări de crescătorie sau mamifere.
1.9. Protocol facultativ pentru analiza grăsimilor sau a uleiurilor
Pentru analiza grăsimilor sau a uleiurilor se poate utiliza următorul protocol:
1) Dacă grăsimea este solidă, aceasta se încălzeşte, de exemplu într-un cuptor cu microunde, pînă cînd devine lichidă.
2) Cu ajutorul unei pipete, se transferă 40 ml de grăsime din partea inferioară a eşantionului într-un tub de centrifugă.
3) Se centrifughează timp de 10 minute la 4000 rpm.
4) Dacă grăsimea se solidifică după centrifugare, aceasta se încălzeşte încă o dată într-un cuptor pînă cînd devine lichidă. Se repetă centrifugarea timp de cinci minute la 4000 rpm.
5) Cu ajutorul unei linguri mici sau al unei spatule se transferă jumătate din impurităţile decantate într-o placă Petri sau pe o lamelă de microscop pentru identificarea microscopică a unui posibil conţinut de constituenţi de origine animală, cum ar fi fibre de carne, pene, fragmente osoase. Ca agent de includere pentru microscopie se recomandă uleiul de parafină sau glicerolul.
6) Impurităţile rămase se utilizează pentru sedimentare, conform descrierii de la subpunctul 1.6.2.
7) Impurităţile rămase se utilizează pentru prepararea sedimentului astfel cum se descrie în prezenta anexă la subpunctul 1.6.1.
1.9.1. Utilizarea agenţilor de colorare
Pentru a facilita identificarea corectă a constituenţilor de origine animală, operatorul poate utiliza agenţi de colorare în timpul pregătirii eşantioanelor, în conformitate cu orientările emise de laboratorul de referinţă al Uniunii Europene pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale şi publicate pe pagina web oficială al acestuia.
În cazul în care se utilizează soluţie de roşu de alizarină pentru colorarea sedimentelor, se aplică următorul protocol:
1) sedimentul uscat se transferă într-o eprubetă de sticlă şi se clăteşte de două ori cu aproximativ 5 ml de etanol. De fiecare dată se utilizează un agitator timp de 30 de secunde, solventul se lasă să se decanteze aproximativ un minut şi 30 de secunde şi se elimină prin turnare;
2) sedimentul se decolorează, adăugîndu-se cel puţin 1 ml de soluţie de hipoclorit de sodiu. Se permite ca reacţia să continue 10 minute. Tubul se umple cu apă, sedimentul se lasă să se decanteze 2-3 minute, iar apa şi particulele în suspensie se elimină uşor prin turnare;
3) sedimentul se mai clăteşte de două ori cu aproximativ 10 ml de apă. Se utilizează un agitator timp de 30 de secunde, se lasă să se decanteze şi se elimină apa prin turnare de fiecare dată;
4) se adaugă între 2 şi 10 picături de soluţie de roşu de alizarină, iar amestecul se agită. Se permite desfăşurarea reacţiei timp de 30 de secunde şi sedimentul colorat se clăteşte de două ori cu aproximativ 5 ml de etanol, apoi o dată cu acetonă. De fiecare dată se utilizează un agitator timp de 30 de secunde. Solventul se lasă să se decanteze aproximativ un minut şi se elimină prin turnare;
5) sedimentul colorat se usucă.
1.10. Determinarea constituenţilor de origine animală în nutreţuri a polimerazei (PCR)
Fragmentele de acid dezoxiribonucleic (în continuare – ADN) de origine animală care pot fi prezente în materiile prime pentru nutreţuri şi nutreţuri combinate sînt detectate printr-o tehnică de amplificare genetică prin PCR, care vizează secvenţe de ADN specifice speciei.
Metoda PCR necesită, în primul rînd, o etapă de extragere a ADN-ului. Etapa de amplificare se aplică ulterior extractului de ADN astfel obţinut, în vederea detectării speciilor de animale vizate de test.
1.10.1. Reactivi şi echipamente pentru etapa de extragere a ADN-ului
Se utilizează numai reactivii aprobaţi de laboratorul de referinţă al Uniunii Europene pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale şi publicaţi pe pagina web oficială al acestuia.
Se utilizează numai primerii şi sondele cu secvenţe de oligonucleotide validate de către laboratorul de referinţă al Uniunii Europene pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale.
1.10.2. Se utilizează doar soluţiile de amestec principal care nu conţin reactivi susceptibili să conducă la rezultate false din cauza prezenţei de ADN animal.
1) reactivi de decontaminare;
2) soluţie de acid clorhidric – 0,1 N;
3) înălbitor – soluţie de hipoclorit de sodiu la 0,15% din clor activ;
4) reactivi necorozivi pentru decontaminarea dispozitivelor costisitoare, precum balanţele analitice, de exemplu, DNA EraseTM al MP Biomedicals;
5) echipamente;
6) balanţă analitică cu o precizie de 0,001 g;
7) echipament de măcinare;
8) thermocycler care permite PCR în timp real;
9) microcentrifugă pentru tuburi de microcentrifugare;
10) set de micropipete care permit introducerea cu pipeta de la 1 μl pînă la 1 000 μl;
11) material de plastic standard de biologie moleculară: tuburi de microcentrifugare, vîrfuri de plastic filtrate pentru micropipete, plăci pentru thermocycler;
12) Congelatoare pentru depozitarea eşantioanelor şi reactivilor.
1.10.3. Pregătirea eşantioanelor
Pregătirea eşantioanelor de laborator înainte de extragerea ADN-ului respectă cerinţele prevăzute în anexa nr.2 la prezenta hotărîre.
Cel puţin 50 g din eşantion constituie subeşantioane pentru a fi analizate şi ulterior măcinate.
Pregătirea eşantioanelor se efectuează într-o încăpere diferită de cele dedicate extragerii ADN-ului şi a reacţiilor de amplificare genetică descrise în ISO 24276.
Se pregătesc două porţiuni de testat de cel puţin 100 mg fiecare.
1.10.4. Extragerea ADN-ului
Extragerea ADN-ului se efectuează pe fiecare porţiune de testat pregătită, utilizînd procedurile PSO stabilite de laboratorul de referinţă al Uniunii Europene pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale şi publicate pe pagina web oficială al acestuia. Se pregătesc două controale de extragere pentru fiecare serie de extrageri descrise în ISO 24276:
1) un control martor de extragere;
2) un control de extragere al ADN-ului pozitiv.
Amplificarea genetică se efectuează utilizînd metodele validate pentru fiecare specie care necesită identificare. Aceste metode sînt prevăzute în procedurile PSO stabilite de laboratorul de referinţă al Uniunii Europene pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale şi publicate pe pagina web oficială al acestuia. Fiecare extract de ADN se analizează în cel puţin două diluţii diferite în scopul de a evalua inhibarea.
Se pregătesc două controale de amplificare pentru fiecare specie ţintă, astfel cum se descrie în ISO 24276:
1) se utilizează un control ţintă al ADN-ului pozitiv pentru fiecare placă sau serie de teste PCR;
2) se utilizează un control al reactivului de amplificare, denumit de asemenea, control fără etalon pentru fiecare placă sau serie de teste PCR.
1.10.5. Interpretarea şi exprimarea rezultatelor
Atunci cînd raportează rezultatele, laboratorul indică cel puţin greutatea porţiunilor de testat utilizate, tehnica de extragere utilizată, numărul de determinări efectuate şi limita de detecţie a metodei.
Rezultatele nu sînt interpretate şi raportate în cazul în care controlul de extragere al ADN-ului pozitiv şi controalele ţintă ale ADN-ului pozitiv nu oferă rezultate pozitive pentru obiectivul care face obiectul testului, în timp ce controlul reactivului de amplificare este negativ.
În cazul în care rezultatele celor două porţiuni de testat nu sînt consecvente, se repetă cel puţin etapa de amplificare genetică. Atunci cînd laboratorul suspectează că extractele de ADN pot fi cauza inconsecvenţei, se efectuează o nouă extracţie de ADN şi o altă amplificare genetică înainte de interpretarea rezultatelor.
Exprimarea finală a rezultatelor se bazează pe integrarea şi interpretarea rezultatelor celor două porţiuni de testat în conformitate cu procedurile PSO stabilite de laboratorul de referinţă al Uniunii Europene pentru detectarea proteinelor animale în hrana pentru animale şi publicate pe pagina web oficială al acestuia.
Un rezultat negativ este raportat în cazul în care niciun ADN de la X nu a fost detectat în eşantionul prezentat, X fiind specia de animale sau grupul de specii de animale care sînt vizate de test.
Un rezultat pozitiv este raportat în cazul în care a fost detectat ADN de la X în eşantionul prezentat, X fiind specia de animale sau grupul de specii de animale care sînt vizate de test.
[Anexa nr.6 în redacţia Hot.Guv. nr.844 din 25.10.2017, în vigoare 03.11.2017]
Anexa nr.7
la Hotărîrea Guvernului
nr.686 din 13 septembrie 2012
METODA DE DETERMINARE
a valorii energetice a nutreţurilor combinate pentru păsările de crescătorie
1. METODA DE CALCUL ŞI EXPRIMAREA VALORII ENERGETICE
PENTRU PĂSĂRILE DE CRESCĂTORIE
1.1. Valoarea energetică a hranei combinate pentru păsările de crescătorie se calculează aplicîndu-se formula specificată în punctul 1.2.
1.2. Această valoare se exprimă în megajouli (MJ) de energie metabolizabilă (EM), corectată pentru azot, per kilogram de nutreţuri combinate:
MJ/kg de EM = 0,1551 × % proteină brută + 0,3431 × % grăsime brută + 0,1669 × % amidon + 0,1301 × % zaharuri totale (exprimate în zaharoză).
1.3. Prelevarea eşantionului din nutreţurile combinate şi determinarea conţinutului de compuşi analitici indicaţi în metoda de calcul trebuie să se efectueze în conformitate cu următoarele metode:
a) pentru determinarea conţinutului de grăsime brută: procedura B a metodei de determinare a uleiurilor şi a grăsimilor brute, din anexa nr.3, capitolul VIII;
b) pentru determinarea conţinutului de amidon: metoda polarimetrică, din anexa nr.3, capitolul XII.
2. TOLERANŢE APLICABILE VALORILOR DECLARATE
ŞI EXPRIMAREA REZULTATULUI
2.1. În cazul în care la inspecţia oficială se constată o diferenţă (valoare energetică mai mare sau mai mică a hranei pentru păsări) între rezultatul inspecţiei şi valoarea energetică menţionată, se admite o toleranţă minimă de 0,4 MJ/kg EM.
2.2. Rezultatul obţinut prin aplicarea formulei indicate în punctul 1.2. se exprimă cu o zecimală.