BIZLEXЗаконодательство Республики Молдова
Содержание
Постановления

Постановление № 48 от 27.01.2009

об утверждении Ветеринарно-санитарной нормы, устанавливающей условия для здоровья животных и общественного здоровья и санитарно-ветеринарной сертификации при импорте в Республику Молдова живых животных и сырого мяса, происходящего от них

Тип документа
Постановления
Дата принятия
27.01.2009

ПРАВИТЕЛЬСТВО РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА

ПОСТАНОВЛЕНИЕ

об утверждении Ветеринарно-санитарной нормы, устанавливающей

условия для здоровья животных и общественного здоровья и

санитарно-ветеринарной сертификации при импорте в

Республику Молдова живых животных и сырого мяса,

происходящего от них

N 48  от  27.01.2009

 (в силу 06.02.2009) 

Мониторул Офичиал N 23-26 ст.102 от 06.02.2009

* * *

В соответствии с положениями ст.20 Закона о ветеринарной деятельности № 221-XVI от 19 октября 2007 г. (Официальный монитор Республики Молдова, 2008 г., № 51-54, ст.153), в целях предупреждения заноса и распространения заразных болезней животных, разрешения импорта в Республику Молдова здоровых животных, безвредных и безопасных продуктов животного происхождения, а также выполнения Плана действий Республика Молдова – Европейский Союз Правительство

ПОСТАНОВЛЯЕТ:

1. Утвердить Ветеринарно-санитарную норму, устанавливающую условия для здоровья животных и общественного здоровья и санитарно-ветеринарной сертификации при импорте в Республику Молдова живых животных и сырого мяса, происходящего от них (прилагается).

2. Контроль за выполнением настоящего постановления возложить на Национальное агентство по безопасности пищевых продуктов.

[Пкт.2 изменен Пост.Прав. N 513 от 02.07.2014, в силу 04.07.2014]

Утверждена

Постановлением Правительства

№ 48 от 27 января 2009 г.

ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНАЯ НОРМА,

устанавливающая условия для здоровья животных и общественного здоровья

и санитарно-ветеринарной сертификации при импорте в Республику Молдова

некоторых живых животных и сырого мяса, происходящего от них

ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. Ветеринарно-санитарная норма, устанавливающая условия для здоровья животных и общественного здоровья и санитарно-ветеринарной сертификации при импорте в Республику Молдова некоторых живых животных и сырого мяса, происходящего от них (в дальнейшем – Ветеринарно-санитарная норма), устанавливает условия здоровья для импорта в Республику Молдова живых животных, за исключением лошадиных, и для импорта сырого мяса, в том числе конины.

Настоящая Ветеринарно-санитарная норма не применяется при импорте мясных продуктов, недомашних животных, предназначенных для спектаклей или выставок, когда эти животные не содержатся или не выращиваются в естественных условиях, а также при импорте недомашних животных, принадлежащих циркам или используемых в научных целях, в том числе для консервирования или экспериментирования авторизированным органом, институтом или центром.

2. Настоящая Ветеринарно-санитарная норма гармонизирована с консолидированным вариантом Решения Совета ЕС 542 от 21 декабря 1976 года о составлении списка третьих стран или их регионов и определении условий для здоровья животных и общественного здоровья и ветеринарно-санитарной сертификации для импорта в Союз определенных живых животных и свежего мяса от них.

3. Основные понятия, использованные в настоящей Ветеринарно-санитарной норме, имеют следующие значения:

животное – любое животное, выращиваемое или содержащееся для выработки продуктов, шерсти, кожи, для репродукции и в других целях;

обработанный съедобный орган – съедобный орган, из которого полностью были сняты все кости, хрящи, трахея и главные бронхи, лимфатические узлы и соединительная ткань, жир и слизистые; что касается мяса домашнего крупного рогатого скота, съедобными органами считаются и цельные щечные мышцы, надрезанные по правилам санитарно-ветеринарной экспертизы.

ТРЕБОВАНИЯ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ К ИМПОРТУ ЖИВЫХ

ЖИВОТНЫХ В РЕСПУБЛИКУ МОЛДОВА

4. Ввоз живых животных в Республику Молдова разрешается только в случае, если эти животные отвечают требованиям пунктов 5, 6, 8, 9 и 10 настоящей Ветеринарно-санитарной нормы.

5. Животные должны отвечать требованиям соответствующего сертификата, заполненного в соответствии с образцом, приведенным в приложении № 1 к настоящей Ветеринарно-санитарной норме, и в случае, когда они соответствуют также дополнительным гарантиям, затребованным в соответствующем сертификате.

6. Животные не должны перевозиться в транспортных средствах, перевозящих других животных, не предназначенных для Республики Молдова или с более плохим состоянием здоровья.

7. Во время транспортировки в Республику Молдова животных нельзя разгружать на территории страны, не имеющей авторизации на импорт в Республику Молдова такого типа животных.

8. Во время транспортировки в Республику Молдова животные не должны пересекать ни автодорожным, ни железнодорожным транспортом, ни пешком территорию какой-либо страны или региона страны, не имеющей авторизации на импорт такого вида животных в Республику Молдова.

9. Животные должны прибыть на пограничный пункт на границе Республики Молдова в 10-дневный срок с даты загрузки в экспортирующей стране и в сопровождении санитарно-ветеринарного сертификата соответствующего образца, заполненного и подписанного официальным ветеринарным врачом экспортирующей страны.

10. В случае транспортировки по морю 10-дневный период продлевается на время морского путешествия. В этом случае к санитарно-ветеринарному сертификату прилагается декларация (в оригинале) капитана судна, составленная в соответствии с аддендумом, предусмотренным в приложении № 2 к настоящей Ветеринарно-санитарной норме.

ТРЕБОВАНИЯ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПОСЛЕ ИМПОРТА

11. Животные, предназначенные для немедленного убоя, после завершения процедуры по импорту отправляются прямо на бойню назначения, где подлежат убою в течение пяти дней.

12. Репродуктивные животные, животные, предназначенные для производства или для откорма, а также животные, предназначенные для зоопарков, парков для развлечений и для охотничьих или природных заповедников, поставляются непосредственно в объект назначения, где они остаются в течение не менее 30 дней, а затем выводятся из объекта, за исключением случаев их перевозки непосредственно на бойню.

ТРЕБОВАНИЯ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПРИ ИМПОРТЕ

СВЕЖЕГО МЯСА В РЕСПУБЛИКУ МОЛДОВА

13. Импорт в Республику Молдова свежего мяса, предназначенного для потребления, происходящего от животных, указанных в пункте 3, и от лошадей, разрешается только в случае, если соблюдаются положения пунктов 14 и 15 настоящей Ветеринарно-санитарной нормы.

14. Свежее мясо должно отвечать условиям соответствующего сертификата, заполненного в соответствии с образцом, предусмотренным в приложении № 3 к настоящей Ветеринарно-санитарной норме, с учетом указанных специальных условий, и выполнять также дополнительные гарантии, затребованные в соответствующем сертификате.

15. На пункте контроля на границе Республики Молдова свежее мясо должно сопровождаться санитарно-ветеринарным сертификатом соответствующего образца, заполненного и подписанного официальным ветеринарным врачом экспортирующей страны.

ТРЕБОВАНИЯ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ПОСЛЕ ИМПОРТА

16. После осуществленного импорта в перерабатывающее предприятие отправляются следующие категории свежего мяса:

а) неошкуренные туши парнокопытной дичи, предназначенные к употреблению в пищу после обработки;

b) обработанные съедобные органы домашнего крупного рогатого скота, предназначенные для употребления в пищу в форме мясных продуктов после последующей термической обработки путем варки при внутренней температуре не менее 80°С или стерилизации в герметически закрытых контейнерах.

17. Для категорий продуктов, указанных в подпункте b) пункта 16 настоящей санитарно-ветеринарной нормы, предприятие назначения должно получить специальную авторизацию и полномочия по переработке данных продуктов.

СЕРТИФИКАЦИЯ

18. Санитарно-ветеринарные сертификаты для импорта живых животных и свежего мяса в Республику Молдова, предусмотренные в настоящей Ветеринарно-санитарной норме, составляются в соответствии с примечаниями к приложениям № 1, 2 и 3. Вместе с тем можно использовать электронную сертификацию или другие авторизованные и согласованные на международном уровне системы.

Приложение № 1

к Ветеринарно-санитарной норме,

устанавливающей условия для здоровья

животных и общественного здоровья и

санитарно-ветеринарной сертификации

при импорте в Республику Молдова

некоторых живых животных и сырого

мяса, происходящего от них

Образцы сертификатов

Образцы

1. Санитарно-ветеринарные сертификаты заполняются экспортирующей страной на основании образцов, представленных в настоящем приложении, согласно соответствующему образцу сертификата для данного животного. Они должны содержать необходимые аттестации, которые нумеруются согласно образцу Санитарно-ветеринарного сертификата.

2. Должен представляться единый и индивидуальный сертификат для животных, экспортируемых из одной страны (в некоторых случаях – с одной территории), который отправляется в то же место назначения, в том же вагоне или автотранспортном средстве, тем же самолетом или судном.

3. Оригинал каждого санитарно-ветеринарного сертификата состоит из одного листа (лицевой и оборотной стороны) или, в случае если требуется более детальная информация, представлен таким образом, чтобы все листы были частью единого и неделимого документа.

4. Санитарно-ветеринарный сертификат заполняется на молдавском и английском языках.

5. В случае, если к санитарно-ветеринарному сертификату прилагаются дополнительные страницы с целью идентификации разных элементов партии (таблица пункта 8.2 из образца сертификата), эти страницы также считаются частью ветеринарного сертификата, если на каждой странице проставлена печать и имеется подпись официального ветеринарного врача, ответственного за сертификацию.

6. В случае, если санитарно-ветеринарный сертификат, включая дополнительную таблицу, предусмотренную в пункте 5 настоящего приложения, содержит больше страниц, каждая страница нумеруется в ее нижней части (номер страницы из общего количества страниц), а в верхней части страницы – кодовым номером сертификата, присвоенным компетентным органом.

7. Оригинал санитарно-ветеринарного сертификата заполняется и подписывается официальным ветеринарным врачом в течение 24 часов до загрузки партии для экспорта в Республику Молдова.

Цвет подписи должен отличаться от цвета текста. Это правило применяется и для других штампов, за исключением рельефных или филигранных.

8. Санитарно-ветеринарный сертификат в оригинале сопровождает партию до контрольного пункта границы Республики Молдова.

Приложение № 2

к Ветеринарно-санитарной норме,

устанавливающей условия для здоровья

животных и общественного здоровья и

санитарно-ветеринарной сертификации

при импорте в Республику Молдова

некоторых живых животных и сырого

мяса, происходящего от них

Часть I

Аддендум для транспортировки животных по морю

(Заполняется и прилагается к ветеринарному сертификату в случае, если

транспортировка до границы Республики Молдова осуществляется,

даже частично, по морю)

(To be completed and attached to the veterinary certificate when transport to

Republic of Moldova frontier includes, even for part of the journey,

transportation by ship.)

Часть II

Условия для авторизации пунктов сбора животных

Назначенные пункты сбора должны соответствовать следующим требованиям:

I. Находиться под контролем официального ветеринарного врача.

II. Находиться в центре зоны диаметром 20 км, в которой, в соответствии с официальными данными, не было выявлено ни одного случая ящура в течение не менее 30 дней до их использования в качестве назначенных пунктов сбора.

III. До их использования в качестве назначенных центров они должны быть очищены и продезинфицированы дезинфектантом, официально разрешенным в экспортирующей стране для борьбы с болезнью, указанной в пункте II.

IV. Располагать с учетом их вместимости для предоставления крова:

(а) оборудованием, предназначенным только для этого использования; (b) легко очищаемым и дезинфицируемым оборудованием для погрузки и разгрузки животных, для их содержания в надлежащих условиях, для кормления и поения и для проведения необходимого лечения; (с) соответствующим оборудованием для инспекции и изоляции; (d) соответствующим оборудованием для чистки и дезинфекции помещений и транспорта; (е) достаточной площадью для хранения кормов, соломенных подстилок и навоза; (f) подходящими системами для сбора и эвакуации сточных вод; (g) помещением для официального ветеринарного врача.

V. При функционировании иметь достаточное количество ветеринарных врачей для выполнения всех возложенных на него обязанностей.

VI. Принимать только идентифицированных животных с целью гарантирования прослеживаемости. В этой связи в случае, если животные приняты, хозяин или ответственное лицо должны убедиться, что животные должным образом идентифицированы и сопровождаются документами или сертификатами для здоровья животных для данных видов и категорий. Кроме того, данное лицо регистрирует в регистре или в базе данных и сохраняет в течение трех лет имя хозяина, происхождение, дату приема и дату передачи, идентификационный номер животных или номер регистрации поголовья происхождения и пункт назначения животных, а также регистрационный номер транспортировщика и регистрационный номер грузовика, в котором перевозятся или в который загружаются животные.

VII. Все животные, проходящие через эти пункты, должны соответствовать условиям здоровья, установленным для импорта в Республику Молдова животных указанных категорий.

VIII. Животные, предназначенные для экспорта в Республику Молдова и проходящие через пункт сбора, должны по истечении шести дней после прибытия быть погружены и отправлены непосредственно к границе экспортирующей страны: (а) не входя в контакт с другими парнокопытными животными, кроме тех, которые соответствуют условиям здоровья, установленным для импорта в Республику Молдова для соответствующей категории животных; (b) быть распределены по группам таким образом, чтобы одна группа не содержала вместо репродуктивных животных или для производства и животных, предназначенных для немедленного убоя; (с) в транспортных средствах или контейнерах, которые были заранее очищены и продезинфицированы дезинфицирующим средством, официально разрешенным в экспортирующей стране для эффективной борьбы с болезнью, указанной в пункте II настоящей части, и которые построены так, чтобы помет, соломенная подстилка или корма не выпадали во время перевозки.

IX. В случае, если установленные для экспорта животных в Республику Молдова условия вынуждают провести тест до погрузки в установленный срок, данный срок должен включить период сбора, ограниченный шестью днями со дня прибытия животных в назначенные центры.

X. Экспортирующая страна указывает центры, назначенные для репродуктивных и продуктивных животных, и центры, назначенные для животных, предназначенных для убоя, и сообщает названия и адреса этих центров, а также актуализированные данные компетентному центральному органу импортирующей страны.

XI. Экспортирующая страна устанавливает процедуру, согласно которой осуществляется официальный надзор за назначенными центрами, и гарантирует проведение данного надзора.

XII. Проводятся регулярные проверки, чтобы убедиться, что установленные требования для назначения продолжают выполняться. В случае несоблюдения требований или прекращения деятельности назначение может быть возобновлено только в случае, если компетентный орган удостоверится, что центр соблюдает все вышеуказанные требования.

Часть III

Протоколы стандартизации материалов и процедур тестирования

Туберкулез (TBL)

Тест для простой внутрикожной туберкулинизации бычьим туберкулином проводится в соответствии с Ветеринарно-санитарной нормой по проблемам здоровья животных, влияющим на торговлю Республики Молдова крупным рогатым скотом и свиньями. В случае свиней простая внутрикожная туберкулинизация птичьим туберкулином проводится в соответствии с положениями вышеуказанной Ветеринарно-санитарной нормы, а местом инъекции является вялая кожа у основания уха.

Бруцеллез (Bruсella abortus) (BRL)

Тест сероагглютинации, реакция фиксации комплемента, тест с буферным бруцеллезным антигеном и тест иммуноадсорбции с энзиматически маркированными антителами (ELISA) проводятся в соответствии с положениями Ветеринарно-санитарной нормы по проблемам здоровья животных, влияющим на торговлю Республики Молдова крупным рогатым скотом и свиньями.

Бруцеллез (Bruсella melitensis) (BRL)

Тест проводится в соответствии с положениями Ветеринарно-санитарной нормы по проблемам здоровья животных, влияющим на торговлю Республики Молдова крупным рогатым скотом и свиньями.

Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота (EBL)

Тест иммунодиффузии в агаре и тест иммуноадсорбции с энзиматически маркированными антителами (ELISA) проводятся в соответствии с положениями Ветеринарно-санитарной нормы по проблемам здоровья животных, влияющим на торговлю Республики Молдова крупным рогатым скотом и свиньями.

Блютанг (BTG)

А. Блокирующий или сравнительный тест ELISA проводится в соответствии со следующим протоколом:

Сравнительный тест ELISA, использующий моноклональные антитела 3-17-A3, может идентифицировать антитела для всех известных серотипов вируса Блютанга (BTV).

Принцип теста состоит в прерывании некой реакции между антигеном BTV и моноклональными специфическими групповыми антителами (3-17-А3) при добавлении сыворотки тестирования. Антитела BTV, присутствующие в сыворотке для тестирования, блокируют реактивность моноклонального антитела (АсМ) и вызывают уменьшение ожидаемой эволюции цвета после добавления энзиматически маркированного антимышиного антитела и хромогена /субстрата. Сыворотки могут быть тестированы в едином разведении 1:5 (спот-тест – аппендикс 1) или титрированы (титрирование сыворотки – аппендикс 2) для определения точек разведения. Ингибиторные значения, превышающие 50%, могут считаться положительными.

Материалы и реактивы

1. Пластинки для соответствующей микротитрации ELISA.

2. Антиген: поставляемый в форме клеточного концентрата, приготовленного по нижеописанной процедуре, который хранится при температуре –20°С или –70°С.

3. Тампон для блокирования: соляной фосфат-тампон (PBS), содержащий 0,3% отрицательной сыворотки КРС по отношению к вирусу Блютанга, 0,1% (v/v) Tween-20 (поставляемый в форме сиропа полиоксиэтилена сорбитона монолаурата) в PBS.

4. Моноклональные антитела: 3-17-А3 (поставляемый в форме супернатанта из гибрида тканевой культуры), направленные против специфичного полипептида VP7, хранятся при температуре –20°С или лиофилизированный и разведенный 1/100 с буферным тампоном перед употреблением.

5. Конъюгат: кроличий противомышиный глобулин (адсорбированный и разведенный), конъюгированный пероксидазой из хрена и хранящийся в темном месте при температуре 4°С.

6. Хромоген и субстрат: Ортофелин диамина (хромоген OFD), окончательная концентрация которого составляет 0,4 мг/мл в дистиллированной стерильной воде. Перекись водорода (субстрат 30% w/v), 0,05% v/v, добавленный непосредственно перед употреблением (5µl H2O2 per 10 ml OFD). (С OFD необходимо работать осторожно, используя резиновые перчатки, продукт может быть мутагенным.).

7. Серная кислота: раствор серной кислоты 1 М, 26,6 мл кислоты, добавленные к 473,4 мл дистиллированной воды. (Внимание – всегда добавляется кислота в воду, а не вода в кислоту).

8. Орбитальная мешалка.

9. Счетчик ELISA чашек (тест может быть прочитан и невооруженным глазом).

Схема тестирования

Сс: контроль конъюгата (без сыворотки /без моноклонального антитела);

С++: контроль с сильноположительной сывороткой; С+: контроль со слабоположительной сывороткой; С–: контроль с отрицательной сывороткой; Сm: контроль моноклонального антитела (без сыворотки).

Аппендикс 1: Единое разведение (1:5) – Схема (40 сывороток/чашку)

Аппендикс 2: Схема титрирования сыворотки (10 сывороток/чашку)

Процедура тестирования:

Процедура:

1. Добавляется BTV антиген к претитрированной концентрации PBS, тщательно перемешивается с помощью ультразвукового аппарата для дисперсирования вируса (при отсутствии ультразвукового аппарата тщательно перемешивается с помощью пипетки) и добавляется 50 µл во все лунки ELISA чашки. Чашка легко ударяется о стол для дисперсирования антигена.

2. Инкубируется 60 минут при температуре 37°С в инкубаторе-мешалке. Лунки промываются три раза путем заполнения и опорожнения лунок нестерильным PBS и просушиваются адсорбирующей бумагой.

3. Контрольные лунки: в лунки Сс добавляется 100 µл блокирующего тампона. Добавляется 50 µл отрицательной и положительной контрольной сыворотки в разведении 1:5 (10 µл сыворотки + 40 µл блокирующего тампона) в лунки С–, С+ и, соответственно, С++. Добавляется 50 µл блокирующего тампона в контрольные лунки АсМ. Единый метод титрирования: тестируемые сыворотки в разведении 1:5 с двойным блокирующим тампоном добавляются в лунки колонок от 3 то 12 (10 µл сыворотки + 40 µл блокирующего тампона) в соответствии с предыдущей схемой.

или

Метод титрации сыворотки: Приготавливается ряд разведений в геометрической прогрессии каждого образца тестирования (от 1:5 до 1:640) в одном блокирующем тампоне из 8 лунок каждой колонки от 3 до 12.

4. Непосредственно после добавления сыворотки для тестирования разбавляется АсМ в 1:100 в блокирующем тампоне и добавляется 50 µл во все лунки чашки, за исключением бланка.

5. Инкубируется в течение 60 минут при температуре 37°С. Промывается три раза PBS и просушивается адсорбирующей бумагой.

6. Разбавляется концентрат кроличьей антимышиной сыворотки 1:5 в блокирующем тампоне и добавляется 50 µл во все лунки чашки.

7. Инкубируется в течение 60 минут при температуре 37°С. Промывается три раза PBS и просушивается адсорбирующей бумагой.

8. OPD размораживается и непосредственно перед употреблением добавляются 5 µл 30% перекиси водорода к каждым 10 мл OPD. Добавляется 50 µл во все лунки чашки. Необходимо подождать разбавления цвета в течение приблизительно 10 минут, и реакция с серной кислотой 1М прекращается (50 µл в лунку). Цвет должен разбавляться в контрольных АсМ лунках и в лунках, содержащих сыворотку BTV без антител.

9. Исследуются либо невооруженным глазом, либо с использованием спектрофотометра и делаются заметки.

Анализ результатов:

Используя программу, на компьютере размещаются значения оптической плотности (DO) и процент ингибиции (PI) тестируемых сывороток и бланка на основании среднего значения полученного в лунках контроля антигена. Эти значения DO и PI используются для определения допустимых пределов проведенного тестирования. Высшие пределы (UСL) и нижние (LСL) контроля АсМ (антиген плюс АсМ в отсутствие тестируемой сыворотки) находятся между значениями 0,4 и 1,4 DO. Не соответствующие вышеупомянутым критериям чашки должны быть исключены. При отсутствии компьютерной программы значения DO печатаются с помощью ELISA принтера. Высчитывается среднее значение оптической плотности для лунок с контрольным антигеном, которое равно 100%. Значение DO заканчивается у 50%, и вычисляется вручную положительность и отрицательность каждой пробы. Процент значения ингибиции (PI) = 100 – (DO каждого контроля/ среднее значение DO Сm) × 100.

Лунки, содержащие дубликат отрицательной контрольной сыворотки, дубликат лунок бланков, должны иметь значения PI между +25% и –25% и, соответственно, между +95% и +105%. Несоответствие данным пределам не делает чашку несоответствующей, но предупреждает о формировании фонового цвета. Слабо- и сильноположительные контрольные сыворотки должны иметь значения PI в рамках +81% и +100% и, соответственно, +51% и +80%.

Порог диагностики для тестируемых сывороток составляет 50% (PI 50% или DO 50%).

Пробы со значениями PI>50% считаются отрицательными. Пробы, имеющие значения PI больше, чем порог для лунок в дубликате, считаются подозрительными; эти пробы могут повторно тестироваться методом единого тестирования и/или с использованием метода титрирования. Положительные пробы также могут титрироваться для определения степени положительности.

Чтение невооруженным глазом: Положительные и отрицательные пробы легко определить невооруженным глазом, слабоположительные и сильноотрицательные пробы труднее определить невооруженным глазом.

Приготовление BTV вирусного антигена для ELISA:

1. 40-60 клеточных линий ВНК-21, конфлюентных со средой Eagle без сыворотки, промываются три раза и инфицируются серотипом 1 вируса Блютанга в среде Eagle без сыворотки.

2. Инкубируется при температуре 37°С и ежедневно исследуется цитопатический эффект (СPE).

3. При достижении эффекта СPE в 90-100% чашек каждой клеточной линии собирается перемешанный вирус для расщепления прилипших к стенкам клеток.

4. Для фрагментации клеток центрифугируется при 2000-3000 rpm.

5. Супернатант удаляется, и клетки снова помещаются в суспензию из приблизительно 30 мл PBS, содержащую 1% “Sarkosyl” и 2 мл фенилметилсульфониловой флуоруры (лизирующий тампон). Может появиться гелификация клеток; в этом случае добавляется лизирующий тампон для уменьшения данного эффекта. (NB: фенилметилсулфониловая флуорура опасна – манипулировать крайне осторожно).

6. Клетки диссоциируются в течение 60 секунд с помощью ультразвукового зонда при амплитуде 30 микрон.

7. Центрифугируется при 10000 rpm в течение 10 минут.

8. Супернатант хранится при температуре +4°С, и снова помещается в суспензию фрагмент клеток, оставшийся в 10-20 мл лизирующего тампона.

9. Перемешивается с помощью ультразвукового аппарата и оседает, всего три раза, сохраняя супернатант на каждой стадии.

10. Супернатанты перемешиваются и центрифугируются при 24000 rpm (100000 г) в течение 120 минут при температуре +4°С через подушечку 40% сукрозы (m/v в PBS) с помощью трубок 30 мл для центрифугации Beсkmann и ротора SW 28.

11. Супернатант удаляется, трубки оставляются, чтобы с них все стекло, и снова помещаются в суспензию фрагмент PBS через соникацию. Антиген хранится в отдельных частях при температуре –20°С.

Титрирование антигена вируса BTV для ELISA

A. Титрирование антигена блютанга для ELISA делается с использованием обратной техники ELISA. Разбавление в геометрической прогрессии антигена титрируется в зависимости от константного разбавления (1/100) моноклонального антитела 3-17-3А. Используется следующий протокол:

1. Антиген BTV титрируется в PBS в разведении 1:20 в микротитрирующей чашке в серии разведений в геометрической прогрессии (50 µл/лунку) с использованием многоканальной пипетки.

2. Инкубируется в течение часа при температуре 37°С в орбитальной мешалке.

3. Чашки промываются три раза PBS.

4. Добавляется 50 µл моноклонального антитела 3-17-А3 (разведение 1/100) в каждой лунке чашки для микротитрирования.

5. Инкубируется в течение часа при температуре 37°С в орбитальной мешалке.

6. Чашки промываются три раза PBS.

7. Добавляется 50 µл антимышиного кроличьего глобулина, конъюгивированного переоксидазой из хрена, разведенной в оптимально титрированной концентрации, в каждой лунке чашки микротитрирования.

8. Инкубируется в течение часа при температуре 37°С.

9. Добавляется субстрат и хромоген в соответствии с предыдущими указаниями. Реакция прерывается после 10 минут при добавлении серной кислоты 1 М (50 µл/лунку). В конкурирующем тесте моноклональные антитела должны быть в избытке, выбирается разведение антигена, находящееся на графике титрирования (в зоне плато), которое дает DO приблизительно 0,8 после 10 минут.

В. Тест иммунодиффузии в агаровом желе проводится в соответствии со следующим протоколом:

Антиген:

Приготавливается осадок антигена в любой системе для клеточной культуры, сопоставимой с быстрым размножением референтного серотипа вируса блютанга. Рекомендуются клетки ВНК или Vero. Антиген присутствует в жидком супернатанте в конце вирусного роста, но требует концентрации в 50-100 раз больше, чтобы быть эффективным. Этого можно добиться с помощью любой процедуры стандартной протеиновой концентрации; виральный антиген может быть инактивирован при добавлении 0,3% (v/v) бетапропиолактона.

Контрольная положительная сыворотка

С помощью антигена и международной референтной сыворотки вырабатывается стандартная отечественная сыворотка, стандартизированная для получения оптимальной пропорции по отношению к международной референтной сыворотке, лиофилизованной и использованной в каждом тесте в качестве контрольной сыворотки.

Сыворотка для тестирования

Процедура: Наливается 1% агарозы, приготовленной в борном тампоне или тампоне барбитала натрия, рН от 8,5 до 9,0, в чашке Петри с минимальной глубиной 3,0 мм. Последовательность для тестирования из семи без влажности лунок, каждая диаметром 5,0 мм, вырезанных в агаре. Последовательность состоит в центральной лунке и шести лунках, расположенных вокруг нее по кругу радиусом 3 мм. Центральная лунка заполняется стандартным антигеном. Периферические лунки 2, 4 и 6 заполняются положительной сывороткой, а лунки 1, 3 и 5 заполняются сыворотками для тестирования. Система инкубируется в течение 72 часов при температуре окружающей среды, во влажной закрытой сушильной камере.

Интерпретация:

Сыворотка для тестирования является положительной, когда формируется специфичная линия осадков с антигеном и полная линия идентификации контрольной сывороткой. Сыворотка для тестирования является отрицательной в случае, если не формирует специфическую линию с антигеном и не отклоняется от контрольного графика. Чашки Петри должны быть обследованы на темном фоне с использованием непрямого освещения.

Геморрагическая эпизоотическая болезнь (EHD)

Тест иммунодиффузии в агаровом желе делается в соответствии со следующим протоколом:

Антиген:

Приготавливается осадок антигена в любой системе клеточной культуры, сравнимой с быстрым размножением серотипа (серотипов) геморрагической эпизоотической болезни. Рекомендуются клетки ВНК или Vero. Антиген присутствует в жидком супернатанте в конце вирусного роста, но требует концентрации от 50 до 100 раз больше, чтобы быть эффективным. Этого можно добиться любой процедурой стандартной протеиновой концентрации; виральный антиген может быть инактивирован при добавлении 0,3% (v/v) бетапропиолактона.

Контрольная положительная сыворотка

С помощью антигена и международной референтной сыворотки вырабатывается стандартная отечественная сыворотка, стандартизированная для получения оптимальной пропорции по отношению к международной референтной сыворотке, лиофилизованной и использованной в каждом тесте в качестве контрольной сыворотки.

Сыворотка для тестирования

Процедура: Наливается 1% агарозы, приготовленной в борном тампоне или тампоне барбитала натрия, рН от 8,5 до 9,0, в чашке Петри с минимальной глубиной 3,0 мм. Последовательность для тестирования из семи без влажности лунок, каждая диаметром 5,0 мм, вырезанных в агаре. Последовательность состоит в центральной лунке и шести лунках, расположенных вокруг нее по кругу радиусом 3 мм. Центральная лунка заполняется стандартным антигеном. Периферические лунки 2, 4 и 6 заполняются положительной сывороткой, а лунки 1, 3 и 5 заполняются сыворотками для тестирования. Система инкубируется в течение 72 часов при температуре окружающей среды, во влажной закрытой сушильной камере.

Интерпретация: Сыворотка для тестирования является положительной, когда формируется специфичная линия осадков с антигеном и полная линия идентификации контрольной сывороткой. Сыворотка для тестирования отрицательна в случае, если не формирует специфическую линию с антигеном и не отклоняется от контрольного графика. Чашки Петри должны быть обследованы на темном фоне с использованием непрямого освещения.

Инфекционный ринотрахеит КРС (IBR) /

инфекционный вульвовагинит

Тест нейтрализации сыворотки делается в соответствии с нижеописанным протоколом:

Сыворотка: Все сыворотки инактивируются в тепле, при температуре 56°С в течение 30 минут перед использованием.

Процедура: Для теста константной нейтрализации сывороток разных видов вирусов, проведенного на чашках для микротитрирования, используются клетки MDBK или иные соответствующие клетки. Сolorado, Oxford или любой другой вид референтного вируса используются в дозе 100 TСID50 для 0,025 мл; перемешиваются группы неразбавленной инактивированной сыворотки в одинаковом объеме (0,25 мл) виральной суспензии. Перемешанные сыворотки /вирус инкубируются при температуре 37°С в течение 24 часов в чашках для микротитрирования, до добавления клеток MDBK. Клетки используются в концентрации, составляющей полный монострат после 24 часов.

Контроль: (i) контроль инфекционности вируса; (ii) контроль токсичности сыворотки; (iii) контроль неинъектированных клеток; (iv) референтные антисыворотки.

Интерпретация: Результаты теста нейтрализации и титр вируса, используемого при тестировании, регистрируются после от трех до шести дней инкубации при температуре 37°С. Титры сыворотки считаются отрицательными в случае, если не присутствует ни одной нейтрализации при разведении 1/2 (неразведенная сыворотка).

Ящур (FMD)

А. Сбор проб из пищевода/глотки и их тестирование проводятся в соответствии с нижеописанным протоколом:

Реактивы: Перед сбором приготавливается среда для транспортировки. В контейнеры, количество которых соответствует числу животных, которые будут тестированы, распределяется по 2 мл. Используемые контейнеры должны выдержать заморозку твердым СO2 или жидким азотом.

Пробы добываются с использованием специального тампона или “пробанг”. Для сбора проб пробанг проводится через рот над языком и до верхней части пищевода. Испытывается вычистка эпителия на поверхности верхней части пищевода и глотки при движении аппарата по сторонам и вертикально. Затем пробанг вытаскивается, желательно после проглатывания животным. Пробанг должен быть полным и содержать смесь слизи, слюны, жидкости из пищевода и клеточные фрагменты. Следует принять меры, чтобы каждая проба содержала видимый клеточный материал.

Нужно избегать резких движений, которые могут вызвать кровотечения. Отобранные от данных животных пробы могут быть сильно зараженными руминальным содержанием. В данном случае эти пробы выбрасываются, и рот животного промывается водой или физраствором до повтора сбора.

Переработка проб:

Качество каждой группы проб, отобранных с помощью пробанга, исследуется и 2 мл их добавляется в одинаковый объем транспортировочной среды в устойчивый к замораживанию контейнер.

Контейнеры закрываются герметично, пломбируются, дезинфицируются и этикетируются. Пробы хранятся в прохладной среде (+4°С) и изучаются в течение трех-четырех часов или хранятся в сухом льду (–69°С) или в жидком азоте и хранятся замороженными до исследования. Между сборами пробанг дезинфицируется и ополаскивается три раза теплой водой.

Тест для выявления вируса ящура (FMD)

Группы проб прививаются в культуры клеток щитовидной железы КРС с использованием, как минимум, трех пробирок для каждой группы проб. Могут быть использованы и другие соответствующие клетки, а также первичные клетки из почек КРС, но необходимо учитывать, что эти клетки менее чувствительны к некоторым видам вируса FMD. Пробирки инкубируются при температуре 37°С в специальном аппарате и исследуются в течение 48 часов для определения присутствия цитопатического эффекта (СPE). В случае, если они отрицательные, культуры переводятся в другие культуры и исследуются в течение 48 часов. Должна быть подтверждена специфичность любого СPE.

Рекомендуемые среды для транспортировки:

1. Фосфат-тампон 0,08М, с рН 7,2, содержащий альбумин и сыворотку КРС 0,01%, красный фенол 0,002% и антибиотики.

2. Среда с тканевой культурой (например, Eagle MEM), которая содержит тампон Hepes 0,04, альбумин из сыворотки КРС и антибиотики, рН 7,2.

3. Нужно добавлять антибиотики в следующих дозах: на мл окончательной среды для транспортировки, например, пенициллин 1000 UI, сульфат неомицина 100 UI, сульфат полимиксина B 50 UI, микостатин 100 UI.

В. Тест нейтрализации сыворотки вируса проводится в соответствии со следующим протоколом:

Реактивы: Приготавливается антиген-сток FMDV в клеточных культурах или на языках КРС и хранится при температуре –70°С или ниже или при температуре –20°С после добавления 50%-ного глицерола. Он и представляет собой антиген-сток. В таких условиях вирус FMD является стабильным, и титры варьируют незначительно в течение нескольких месяцев.

Процедура: Тест проводится на чашках для микротитрации с плоским дном, предназначенных для тканевых культур с использованием чувствительных клеток, как, например, IBRS, BHK-21, или почечных клеток КРС. 1/4 сывороток для тестирования разводится в среде клеточных культур без сыворотки, в которые добавляются 100 UI/мл неомицина или других соответствующих антибиотиков. Сыворотки инактивируются при температуре 56°С в течение 30 минут и используются в объеме 0,05 мл из них для приготовления двойных серий на чашках для микротитрирования с помощью ансы для разбавления на 0,05 мл. Затем в каждую лунку добавляется претитрированный вирус, разбавленный также в среде культуры без сыворотки, содержащей 100 TСID50/0,05 мл. После инкубирования при температуре 37°С в течение часа, для допущения реакции нейтрализации, в каждую лунку добавляется по 0,05 мл клеточной суспензии, которая содержит 0,05-1,0 × 106 клеток в 1 мл клеточной среды, содержащей сыворотку без FMD антител, а чашки пломбируются. Чашки инкубируются при температуре 37°С. Моностраты становятся конфлюентными в течение 24 часов. СРЕ, нормально, становятся достаточно развитыми в течение 48 часов, чтобы позволить микроскопическое чтение теста. В этот момент можно произвести финальное микроскопическое чтение, или же чашки можно зафиксировать и окрасить для микроскопического чтения, используя, например, 10%-ный формалиновый физраствор и метилен 0,05%.

Контроль: Контроли каждого теста включают гомологичную антисыворотку с данным титром, контроль клеток, контроль токсичности сыворотки, контроль среды и титрирование вируса, на основе чего вычисляется реальное использованное количество вируса в тесте.

Интерпретация: Лунки, имеющие СPE, считаются зараженными, и титры нейтрализации представляют обратность окончательного разбавления сыворотки, присутствующей в смесях сыворотки /вируса к финальному пункту 50%, оцененному по методу Спирмана-Карбена.

Тесты считаются действительными в случае, если реальное количество использованного вируса для каждой лунки находится между 101,5 и 102,5 TСID50, и титр референтной сыворотки не колеблется более 2 к предусмотренному титру, определенному по методу предыдущего титрирования. В случае, если контроли находятся за этими пределами, тесты повторяются. Окончательный титр 1/11 или меньше считается отрицательным.

С. Детектирование и квантификация антитела тестом ELISA проводится в соответствии со следующим протоколом:

Реактивы: Кроличьи сыворотки против семи типов антигена 146S вируса ящура (FMDV), используемые в оптимальной концентрации, предусмотренной в тампоне карбоната /бикарбоната с рН 9,6. Приготавливаются антигены из выбранных вирусов, культивированных на клеточных моностратах BHK-21. Используются неочищенные супернатанты и доставляются, согласно протоколу, но без сыворотки, чтобы получить разбавление, которое после добавления равного объема PBST (соленого тампона фосфата, содержащего 0,05% Тween-20 и красный феноловый индикатор) давало бы оптическую плотность между 1,2 и 1,5. Вирусы могут быть использованы и инактивированы. PBST используется как разбавитель. Приготавливаются антисыворотки морских свинок при инъекции свинкам антигена 146S из каждого серотипа. Приготавливается оптимальная концентрация, предопределенная в PBST, с 10% нормальной сыворотки КРС и 5% нормальной кроличьей сыворотки. Используется кроличий иммуноглобулин антисвинки с пероксидазой из хрена в оптимальной концентрации, предопределенной в PBST, содержащей 10% нормальной сыворотки КРС и 5% нормальной кроличьей сыворотки.

Сыворотки для тестирования разбавляются в PBST.

Процедура:

1. Чашки ELISA с 50 мл противовирусной кроличьей сыворотки накрываются и оставляются на ночь во влажном помещении при комнатной температуре.

2. В чашках для микротитрирования с многочисленными лунками и с круглым дном (чашки-носители) приготавливаются, в объеме 50 микролитров, серии разбавления в геометрической прогрессии, в дубликате, из каждой сыворотки для тестирования, начиная с разведения 1/4. В каждую лунку добавляется 50 микролитров из постоянной дозы антигена, смеси оставляются на ночь при температуре 4°С. Добавление антигена сокращает изначальное разбавление на 1/8.

3. Чашки ELISA промываются пять раз с PBST.

4. Затем 50 микролитров смеси сыворотки/антигена переносится из чашки-носителя в ELISA-чашки покрытые кроличьей сывороткой, и инкубируются при температуре 37°С в течение часа в циркулярной мешалке.

5. После промывания в каждую лунку добавляется 50 µл антисыворотки морской свинки, указанной в пункте 4. Чашки инкубируются при температуре 37°С в течение часа в циркулярной мешалке.

6. Чашки промываются, и в каждую лунку добавляется 50 µл кроличьего иммуноглобулина антисвинки, конъюгированного с пероксидазой из хрена.

Чашки инкубируются при температуре 37°С в течение часа в циркулярной мешалке.

7. Чашки промываются, и в каждую лунку добавляется 50 µл ортофенилен диамина, содержащего 0,05% H2O2 (30%) m/v.

8. После 15 минут реакция с H2SO4 1,25 M прекращается.

Проводится спектрофотометрическое считывание чашек при 492 нм с помощью счетчика ELISA, подсоединенного к микрокалькулятору.

Контроль: Для каждого использованного антигена 40 лунок содержат не сыворотку, а антисыворотку, разбавленную в PBST. Двойная серия разбавления в геометрической прогрессии референтной гомологичной антисыворотки КРС. Двойная серия разбавлений в геометрической прогрессии отрицательной сыворотки КРС.

Интерпретация: Титры антител показаны как показатели окончательного разбавления тестированных сывороток, давая 50%-ные средние значения DO, зарегистрированного в контрольных лунках вируса, где сыворотка для тестирования отсутствует. Высшие значения титров 1/40 считаются положительными.

Болезнь Ауески (AJD)

А. Тест нейтрализации сыворотки проводится в соответствии со следующим протоколом:

Сыворотка: Все сыворотки инактивируются в тепле при температуре 56°С в течение 30 минут перед использованием.

Процедура: Для теста нейтрализации сыворотки разных типов вирусов, проводимого в чашках для микротитрации, используются системы клеток Vero или других чувствительных клеток. Вирус болезни Ауески используется к дозе 100 TСID50 для 0,025 мл; группы неразведенных инактивированных сывороток в равном количестве перемешиваются (0,025 мл) с виральной суспензией. Смеси сывороток/вирусов инкубируются при температуре 37°С в течение 2 часов, в чашках для микротитрирования, до добавления соответствующих клеток.

Клетки используются в концентрациях, формирующих полный монослой после 24 часов.

Контроль: (i) контроль заразности вируса; (ii) контроль токсичности сыворотки; (iii) контроль непривитых клеточных культур; (iv) референтные антисыворотки.

Интерпретация: Результаты теста нейтрализации и титры вируса, используемого при тестировании, регистрируются после трех до пяти дней инкубации при температуре 37°С.

Титры сывороток меньше 1/2 (неразбавленная сыворотка) считаются отрицательными.

В. Любой другой тест, признанный в торговле свиньями, предназначенными для Республики Молдова.

Заразный гастроэнтерит (TGE)

Тест нейтрализации сыворотки проводится в соответствии со следующим протоколом:

Сыворотка: Все сыворотки инактивируются в тепле (при температуре 56°С) в течение 30 минут перед использованием.

Процедура: Для теста константной нейтрализации сыворотки разных типов вирусов, проведенного в чашках для микротитрирования, используются системы клеток А72 (собачьи опухоли) или другие чувствительные клетки. Вирус TGE используется в дозе 100 TСID50 для 0,025 мл; перемешиваются пробы неразбавленной дезактивированной сыворотки одинакового объема (0,025 мл) виральной суспензии. Смеси сыворотки/вируса инкубируются при температуре 37°С в течение от 30 до 60 минут, в чашках для микротитрации, до добавления соответствующих клеток. Клетки используются в концентрации, формирующей целый монострат после 24 часов. В каждую лунку наливается 0,1 мл клеточной суспензии.

Контроль: (i) контроль заразности вируса; (ii) контроль токсичности сыворотки; (iii) контроль непривитых клеточных культур; (iv) референтные антисыворотки.

Интерпретация: Результаты теста нейтрализации и титры вируса, используемого при тестировании, регистрируются после трех до пяти дней инкубации при температуре 37°С.

Титры сывороток меньше 1/2 (финальное разбавление) считаются отрицательными. В случае, если пробы неразбавленной сыворотки токсичны для клеточных тканей, эти сыворотки могут быть разбавлены в пропорции 1/2 перед использованием для тестирования. Это соответствует финальному разбавлению сыворотки 1/4. В таких случаях титры сывороток меньше 1/4 (финальное разбавление) считаются отрицательными.

Везикулярная болезнь свиней (SVD)

Тесты для везикулярной болезни свиньи (SVD) проводятся в соответствии с положениями ветеринарно-санитарного законодательства Республики Молдова.

Классическая чума свиней (СSF)

Тесты для классической чумы свиней (СSF) проводятся в соответствии с положениями ветеринарно-санитарного законодательства Республики Молдова.

Тесты для СSF должны проводиться в соответствии с основными линиями, установленными в Пособии по стандартам МЭБ для диагностических тестов и вакцинации (часть 2.1.13).

Чувствительность и специфичность серологического теста для классической чумы свиней вынуждают проводить его в национальной лаборатории, располагающей системой обеспечения качества. Необходимо продемонстрировать, что использованные тесты позволяют распознавать целую гамму сильно- и слабоположительных референтных сывороток и выявлять антитела в острой и конвалесцентной стадиях.

Приложение № 3

к Ветеринарно-санитарной норме,

устанавливающей условия для здоровья

животных и общественного здоровья и

санитарно-ветеринарной сертификации

при импорте в Республику Молдова

некоторых живых животных и сырого

мяса, происходящего от них

Образцы ветеринарных сертификатов

Образцы

1. Санитарно-ветеринарные сертификаты составляются экспортирующей страной на основании образцов сертификатов, предусмотренных в приложении, согласно соответствующему образцу сертификата данного мяса. Они содержат требуемые аттестации, пронумерованные согласно образцу, и, по случаю, дополнительные гарантии.

2. Должен представляться единый и индивидуальный сертификат для мяса, экспортируемого из одной территории, предусмотренный в настоящем приложении, в то же место назначения, в том же вагоне или автотранспортном средстве, в том же самолете или судне.

3. Оригинал каждого сертификата состоит из одного листа (лицевая и оборотная сторона) или, в случае, если требуется больше информации, оформляется таким образом, чтобы все листы были частью единого и неделимого документа.

4. Сертификат заполняется на молдавском и/или на английском языке.

5. В случае, если к сертификату прилагаются дополнительные страницы с целью идентификации различных элементов партии (таблица п.8.3. образца сертификата), данные страницы также считаются частью сертификата при проставлении на каждой странице печати и подписи официального ветеринарного врача, ответственного за сертификацию.

6. В случае, если сертификат, включая дополнительные таблицы, предусмотренные в пункте 5, содержит больше страниц, каждая страница нумеруется в ее нижней части – (номер страницы из общего количества страниц) – и предусматривается, чтобы в верхней части страницы проставлялся кодовый номер сертификата, присвоенный компетентным органом.

7. Оригинал сертификата должен быть заполнен и подписан официальным ветеринарным врачом.

Цвет подписи должен отличаться от цвета текста. Это правило применяется и для других штампов, за исключением рельефных или филигранных.

8. Оригинал сертификата должен сопровождать партию до пункта контроля на границе Республики Молдова.