617/20.08.2013 Hotărîre cu privire la aprobarea completărilor ce se operează în Hotărîrea Guvernului nr.558 din 22 iulie 2011

GUVERNUL REPUBLICII MOLDOVA

H O T Ă R Î R E

cu privire la aprobarea completărilor ce se operează

în Hotărîrea Guvernului nr.558 din 22 iulie 2011

nr. 617  din  20.08.2013

 (în vigoare 06.09.2013) 

Monitorul Oficial nr.191-197 art.736 din 06.09.2013

* * *

Guvernul HOTĂRĂŞTE:

Se aprobă completările ce se operează în Hotărîrea Guvernului nr.558 din 22 iulie 2011 “Privind măsurile de urgenţă din domeniul fitosanitar pentru a preveni introducerea şi răspîndirea în Republica Moldova a unor organisme de carantină” (se anexează).

Aprobate

prin Hotărîrea Guvernului

nr.617 din 20 august 2013

COMPLETĂRILE

ce se operează în Hotărîrea Guvernului nr.558 din 22 iulie 2011

Hotărîrea Guvernului nr.558 din 22 iulie 2011 “Privind măsurile de urgenţă din domeniul fitosanitar pentru a preveni introducerea şi răspîndirea în Republica Moldova a unor organisme de carantină” (Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2011, nr.122–127, art.630) se completează după cum urmează:

1) punctul 1 al hotărîrii se completează cu subpunctele 13), 14), 15) cu următorul cuprins:

“13) Măsurile privind combaterea veştejirii bacteriene a cartofului în Republica Moldova, conform anexei nr.13;

14) Măsurile privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. în Republica Moldova, conform anexei nr.14;

15) Măsurile privind combaterea rîiei negre a cartofului în Republica Moldova, conform anexei nr.15.”;

2) se completează cu anexele 13), 14) şi 15) cu următorul cuprins:

“Anexa nr.13

la Hotărîrea Guvernului

nr.558 din 22 iulie 2011

MĂSURILE

privind combaterea veştejirii bacteriene a cartofului în Republica Moldova

Măsurile privind combaterea veştejirii bacteriene a cartofului în Republica Moldova transpun Directiva 93/85/CEE a Consiliului din 4 octombrie 1993 privind combaterea veştejirii bacteriene a cartofului, publicată în Jurnalul Oficial L 259 din 18 octombrie 1993 şi Directiva 2006/56/CE a Comisiei din 12 iunie 2006 de modificare a anexelor la Directiva 93/85/CEE a Consiliului, publicată în Jurnalul Oficial L 182 din 4 iulie 2006.

1. Măsurile privind combaterea veştejirii bacteriene a cartofului în Republica Moldova (în continuare – Măsuri) stabilesc minimul necesar de acţiuni care trebuie întreprinse pentru combaterea răspîndirii în Republica Moldova a bacteriei Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al. (în continuare – organism).

2. În sensul prezentelor Măsuri şi în conformitate cu art.2 din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară, noţiunile utilizate se definesc după cum urmează:

măsură de control – orice acţiune care urmează a fi întreprinsă de organul de control fitosanitar, în scopul localizării, prevenirii apariţiei şi diseminării organismului în vederea eradicării acestuia;

organism – bacteria Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

3. Organul de control fitosanitar, în temeiul prevederilor art.4 din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară, efectuează controale oficiale sistematice de detectare a organismului la tuberculi şi la plantele de cartof (Solanum tuberosum L.) provenite de la subdiviziunile teritoriale, pentru confirmarea absenţei acestuia.

4. În scopul efectuării acestor controale, în cazul tuberculilor, se prelevează mostre de cartofi de sămînţă, de preferinţă din loturi depozitate, şi se supun testelor oficiale de laborator sau testelor monitorizate oficial, care utilizează metoda stabilită în anexa nr.1 la prezentele Măsuri, în vederea detectării şi diagnosticării organismului în temeiul art.8 şi art.9 din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară. În caz de necesitate, se efectuează controale vizuale oficiale sau se monitorizează oficial prin tăierea altor mostre de tuberculi.

5. În cazul plantelor, se efectuează inspecţii în conformitate cu metodele adecvate, iar mostrele sînt supuse unei testări oficiale sau sînt monitorizate oficial în temeiul art.8 şi art.9 din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară.

6. Numărul, originea, stratificarea şi perioada prelevării mostrelor se decid de organul de control fitosanitar în baza informaţiilor ştiinţifice şi a principiilor statistice, precum şi a biologiei organismului, ţinînd cont de sistemele de producţie a cartofului existente.

7. Suspectarea apariţiei sau prezenţa confirmată a organismului în plante de cartof şi tuberculi sau în tuberculii recoltaţi, depozitaţi sau comercializaţi pe raza de activitate a subdiviziunilor teritoriale, se raportează organului de control fitosanitar.

8. În cazul apariţiei unui organism suspectat, organul de control fitosanitar prelevează mostre şi asigură efectuarea testelor de laborator oficiale sau testelor oficial supravegheate, utilizînd metoda stabilită în anexa nr.1 la prezentele Măsuri şi în conformitate cu condiţiile precizate la pct.1 din anexa nr.2 la prezentele Măsuri, în scopul confirmării sau infirmării apariţiei suspectate a organismului. În cazul confirmării prezenţei organismului, se aplică prevederile stabilite la pct.2 din anexa nr.2 la prezentele Măsuri.

9. Organul de control fitosanitar, în scopul confirmării sau infirmării apariţiei suspectate a organismului, în temeiul prevederilor art.12 din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară, în cazurile cînd:

1) s-au constatat simptome vizuale de diagnostic suspecte, sugerînd prezenţa bolii;

2) a fost identificat un test pozitiv de imunofluorescenţă, aşa cum este precizat în anexa nr.1 la prezentele Măsuri, sau un alt test pozitiv adecvat,

întreprinde următoarele acţiuni:

1) interzice circulaţia tuturor loturilor sau transporturilor din care s-au prelevat probe, aceasta putîndu-se efectua doar sub control oficial şi cu condiţia că nu există nici un risc identificabil de răspîndire a organismului;

2) aplică măsurile necesare pentru identificarea originii apariţiei suspectate;

3) introduce măsuri de precauţie suplimentare adecvate, bazate pe gradul de risc estimat, în vederea prevenirii oricărei răspîndiri a organismului. Aceste măsuri vor include controlul oficial al circulaţiei oricăror tuberculi sau plante în cadrul sau în afara oricărei premise asociate cu apariţia suspectată.

10. În cazul în care testele de laborator efectuate oficial sau testele monitorizate oficial, în conformitate cu metoda stabilită în anexa nr.1 la prezentele măsuri, confirmă prezenţa organismului într-o mostră de tuberculi, plante sau părţi de plante, organul de control fitosanitar, luînd în considerare principiile ştiinţifice fundamentate, biologia organismului şi sistemele particulare de producţie, comercializare şi prelucrare, întreprinde următoarele acţiuni:

1) declară contaminaţi tuberculii sau plantele, transportul şi/sau lotul, precum şi utilajul, vehiculele, containerele, depozitele sau părţi din acestea şi oricare alte obiecte, inclusiv ambalajele din care a fost prelevată proba şi, dacă este cazul, locul, respectiv locurile de producţie, precum şi cîmpul, respectiv cîmpurile de unde au fost recoltaţi tuberculii sau plantele;

2) stabileşte, luînd în considerare dispoziţiile pct.1 din anexa nr.3 la prezentele Măsuri, gradul extinderii contaminării probabile prin contact cu elementele declarate contaminate, înainte sau după recoltare, sau prin legătura producţiei cu contaminarea desemnată;

3) delimitează o zonă a determinării extinderii contaminării probabile şi a răspîndirii posibile a organismului, conform dispoziţiilor prevăzute la pct.2 din anexa nr.3 la prezentele Măsuri.

11. În conformitate cu prevederile pct.3 din anexa nr.3 la prezentele Măsuri, în cazul oricărei contaminări desemnate în conformitate cu pct.10 subpct.1) şi demarcării zonei conform pct.10 subpct.3) din prezentele Măsuri, se iau următoarele măsuri:

1) organul de control fitosanitar notifică autoritatea publică centrală pentru agricultură şi subdiviziunile sale teritoriale despre orice contaminare stabilită şi detaliile delimitării zonei. Detaliile acestei informaţii sînt folosite pentru uz intern;

2) în urma notificării stabilite la pct.11 şi a elementelor menţionate în aceasta este necesar ca subdiviziunile teritoriale ale organului de control fitosanitar vizate în notificare să aplice, după caz, prevederile pct.10 subpct.1), 2) şi 3).

12. În cazul în care tuberculii sau plantele au fost declarate contaminate conform pct.10 subpct.1), testele prevăzute la pct.8 se efectuează la toate stocurile de cartofi care au clone înrudite cu cei contaminaţi. Testele se efectuează pe numărul de tuberculi sau de plante necesare pentru determinarea sursei probabile de infecţie primară şi a întinderii contaminării probabile, de preferinţă după gradul de risc.

13. În urma testării, se efectuează, după caz, o declarare a contaminării, determinarea întinderii contaminării probabile şi delimitarea unei zone conform pct.10 subpct.1), 2) şi 3).

14. Tuberculii sau plantele declarate contaminate conform pct.10 subpct.1) nu pot fi plantate şi, sub control oficial, în temeiul prevederilor art.12 alin.(4) din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară sînt:

1) distruse; sau

2) eliminate într-un alt mod, în cadrul uneia sau mai multor măsuri sub control oficial, în conformitate cu pct.1 din anexa nr.4 la prezentele Măsuri, dacă s-a stabilit că nu există nici un risc identificabil de răspîndire a organismului.

15. Tuberculii sau plantele declarate contaminate, în conformitate pct.10, subpct.2) din prezentele Măsuri, nu pot fi plantate şi, fără a prejudicia rezultatul testelor pentru stocurile care au o relaţie clonală cu ei, sînt utilizate sau eliminate în mod adecvat, conform pct.2 din anexa nr.4 la prezentele Măsuri, sub control oficial, astfel încît să fie garantată absenţa riscului identificabil de răspîndire a organismului, în conformitate cu art.12 alin.(4) din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară.

16. Toate utilajele, vehiculele, containerele, depozitele, părţi din acestea sau orice alte obiecte, inclusiv materialul de ambalare, declarate contaminate conform pct.10 subpct.1) sau considerate ca probabil contaminate conform pct.10 subpct.2) trebuie distruse sau curăţate şi decontaminate, utilizîndu-se metodele corespunzătoare prevăzute la pct.3 din anexa nr.4 la prezentele Măsuri. După dezinfecţie aceste obiecte nu mai sînt considerate ca fiind contaminate.

17. Fără a prejudicia prevederile pct.14, 15 şi 16, se întreprind diferite măsuri în conformitate cu pct.10 subct.3), se aplică o serie de măsuri definite la pct.4 din anexa nr.4 la prezentele Măsuri.

18. Cartofii de sămînţă trebuie să îndeplinească cerinţele faţă de materialul semincer şi să provină direct dintr-un material care a fost obţinut în cadrul unui program aprobat oficial şi care a fost declarat liber de organism ca urmare a testelor efectuate oficial care s-a constatat că nu conţine organismul, în urma unei testări oficiale sau monitorizate oficial, utilizînd metoda descrisă în anexa nr.1 la prezentele Măsuri.

19.Testele menţionate mai sus sînt efectuate:

1) în cazurile în care contaminarea afectează producţia de cartofi de sămînţă, în cazul plantelor selecţiei clonale iniţiale;

2) în alte cazuri, pe plantele selecţiei clonale iniţiale sau pe probe reprezentative de cartofi de sămînţă din categoria de bază sau din generaţii anterioare.

20. Deţinerea şi manipularea organismului sînt interzise.

21. Prevederile pct.12, 13, 14 şi 20 ale prezentelor Măsuri nu se aplică în cazul unor scopuri experimentale sau ştiinţifice şi pentru lucrări de selecţie a soiurilor, cu condiţia ca aceste derogări să nu prejudicieze măsurile de combatere a organismului şi să nu creeze nici un risc de răspîndire a acestuia.

Anexa nr.1

la Măsurile privind combaterea

veştejirii bacteriene a cartofului

în Republica Moldova

PROTOCOLUL DE TESTARE

în vederea diagnosticării, detectării şi identificării agentului responsabil de veştejirea

bacteriană a cartofului – Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (Smith)

Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann şi Kotthoff) Davis et al.

Protocolul de testare menţionat în titlu se aplică pentru:

1) diagnosticarea veştejirii bacteriene pe tuberculii şi pe plantele de cartof;

2) detectarea Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe eşantioane de tuberculi şi de plante de cartof;

3) identificarea Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (în continuare – C. m. ssp. sepedonicus).

Se va ţine cont de următoarele principii generale:

1) protocoalele optimizate pentru diverse metode, reactivii validaţi şi modalităţile de preparare a materialului necesar pentru teste şi pentru controale figurează în anexele la prezenta anexă. În anexa A la prezenta anexă se furnizează lista laboratoarelor incluse pentru optimizarea şi validarea protocoalelor;

2) deoarece protocoalele implică detectarea unui organism dăunător care trebuie pus în carantină şi includ utilizarea culturilor viabile de C. m. ssp. sepedonicus ca materiale de control, este necesar ca procedurile să se desfăşoare în condiţii adecvate de carantină, cu instalaţii de laborator corespunzătoare de eliminare a deşeurilor şi în conformitate cu prevederile Hotărîrii Guvernului nr.356 din 31 mai 2012 “Pentru aprobarea unor acte normative privind implementarea Legii nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară”;

3) parametrii testelor trebuie să garanteze o detectare coerentă şi reproductibilă a nivelurilor de C. m. ssp. sepedonicus la pragurile stabilite pentru metodele selecţionate;

4) este necesară pregătirea exactă a martorilor pozitivi;

5) realizarea testelor în funcţie de pragurile cerute implică, de asemenea, stabilirea parametrilor corecţi, întreţinerea şi calibrarea echipamentelor, manevrarea şi conservarea atentă a reactivilor şi toate măsurile menite să împiedice contaminarea între eşantioane, de exemplu separarea martorilor pozitivi de eşantioanele pentru teste. Trebuie aplicate norme de control al calităţii pentru a evita apariţia oricărei greşeli, în special de ordin administrativ, în etichetare şi în documentaţie;

6) apariţia suspectată a unui focar, în sensul pct.9 din prezentele Măsuri, implică o reacţie pozitivă la testele de diagnostic sau de depistare efectuate pe o probă, după cum se indică în diagrame;

7) în cazul în care primul test de depistare a imunofluorescenţei (IF) sau de depistare a reacţiei în lanţ a polimerazei – Polimerarase Chain Reaction (în continuare – PCR)/ hibridizare fluorescentă in situ (denumit în continuare – FISH) este pozitiv, există o suspiciune de contaminare cu C. m. ssp. sepedonicus şi trebuie efectuat un al doilea test de depistare. În cazul în care şi al doilea test de depistare este pozitiv, suspiciunea este confirmată (apariţie suspectată) şi testele trebuie continuate în conformitate cu protocolul. În cazul în care al doilea test de depistare este negativ, proba este considerată necontaminată cu C. m. ssp.sepedonicus;

8) reacţia pozitivă la testul de imunofluorescenţă (IF) menţionată la punctul 9 din Măsuri este definită ca o reacţie pozitivă la testul de imunofluorescenţă confirmată de un al doilea test de depistare (PCR/FISH);

9) prezenţa confirmată, menţionată la pct.10 din Măsuri, implică izolarea şi identificarea unei culturi pure de C. m. ssp. sepedonicus cu confirmarea patogenicităţii.

1. Prezentarea diagramei funcţionale

1.1. Protocolul de detectare în vederea diagnosticării veştejirii bacteriene pe tuberculi şi plante de cartof care prezintă simptome ale bolii

Procedura de testare vizează tuberculii şi plantele de cartof care prezintă simptome caracteristice veştejirii bacteriene sau care prezintă suspiciunea prezenţei bolii respective. Procedura prevede un test rapid de depistare, izolarea organismului patogen plecînd de la ţesutul vascular infectat pe medii de diagnostic şi, în cazul unui rezultat pozitiv, identificarea culturii ca fiind C. m. ssp. sepedonicus.

⁽¹⁾ Simptomele sînt descrise în secţiunea 2 din prezenta anexă.

⁽²⁾ Testele adecvate sînt:

testul de imunofluorescenţă (secţiunea 4);

testul PCR (secţiunea 6);

testul FISH (secţiunea 5).

⁽³⁾ Deşi izolarea prin dizolvare şi însămînţare pe medii de cultură a agentului patogen provenit din materialul vegetal care prezintă simptome caracteristice este o sarcină simplă, punerea în cultură riscă să eşueze începînd cu stadiile avansate de infecţie. Bacteriile saprofite care se dezvoltă pe un ţesut bolnav riscă într-adevăr să se multiplice mult mai repede decît agentul patogen sau să îi inhibe creşterea pe mediul de izolare. Aşadar, se recomandă să se utilizeze în acelaşi timp medii neselective şi selective, de preferinţă de tip MTNA (secţiunea 8) sau să se recurgă la testul biologic (secţiunea 7).

⁽⁴⁾ Profilul morfologic al unei colonii caracteristice este prezentat în secţiunea 8.

⁽⁵⁾ Atunci cînd testul de izolare este negativ, în ciuda existenţei simptomelor caracteristice ale bolii, trebuie repetată izolarea.

⁽⁶⁾ Se poate identifica în mod viabil o cultură pură de C.m. sepedonicus utilizînd testele enumerate în secţiunea 9.

⁽⁷⁾ Testul pentru patogene este descris în secţiunea 10.

1.2. Protocolul de detectare şi de identificare a Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe eşantioane de tuberculi de cartof asimptomatice

Procedura de testare vizează detectarea infecţiilor latente ale tuberculilor de cartofi. Orice rezultat pozitiv la cel puţin două teste de depistare, bazate pe principii biologice diferite, trebuie completat cu izolarea organismului patogen, urmată, în caz de izolare a coloniilor caracteristice, de confirmarea unei culturi pure ca fiind C. m. ssp. sepedonicus. Rezultatul pozitiv al unui singur test de depistare nu este suficient pentru ca proba să fie considerată suspectă.

Testele de depistare şi testele de izolare trebuie să permită praguri de detectare cuprinse între 10³ şi 10⁴ celule/ml de extract concentrat repus în suspensie, inclus ca martori pozitivi în fiecare serie de teste.

⁽¹⁾ Dimensiunea eşantionului standard este de 200 tuberculi, deşi procedura poate fi aplicată şi unor eşantioane mai reduse, în cazul în care nu se dispune de 200 de tuberculi.

⁽²⁾ Extragerea organismului patogen şi metodele de concentrare sînt descrise în secţiunea 3.1.

⁽³⁾ În cazul în care cel puţin două teste bazate pe principii biologice diferite sînt pozitive, trebuie efectuate izolarea şi confirmarea. Se va realiza cel puţin un test de depistare. În cazul în care testul respectiv este negativ, proba se consideră negativă. În cazul în care testul este pozitiv, trebuie să se efectueze cel puţin un al doilea test de depistare bazat pe principii biologice diferite pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau următoarele sînt negative, proba este considerată negativă. În acest caz nu este necesară efectuarea altor teste.

⁽⁴⁾ Testul de imunofluorescenţă (IF).

Se utilizează întotdeauna un anticorp policlonal pentru testele de imunofluorescenţă. Se poate obţine o specificitate mai mare (a se vedea secţiunea 4), asociind anticorpului menţionat anticorpi monoclonali suplimentari.

⁽⁵⁾ Testul PCR – se utilizează reactivi şi protocoale PCR validate în mod corespunzător (a se vedea secţiunea 6).

⁽⁶⁾ Testul FISH – se utilizează reactivi şi protocoale validate (a se vedea secţiunea 5).

⁽⁷⁾ Izolare selectivă – asociată cu utilizarea unui mediu MTNA sau NCP-88 şi a unei diluări la 1/100 de extract concentrat repus în suspensie, izolarea selectivă constituie în numeroase cazuri o metodă bună de izolare directă a C.m. ssp. sepedonicus. Coloniile caracteristice se pot obţine la o perioadă între trei şi zece zile de la însămînţare. Atunci este posibil să se efectueze purificarea şi identificarea agentului patogen. Pentru a profita din plin de posibilităţile oferite de testul în cauză, trebuie să se pregătească cu grijă conurile de cartof prelevate de pe stolon pentru a evita contaminarea cu bacterii secundare legate de tuberculi, care constituie organisme concurente ale C. m. ssp. sepedonicus pe mediul de cultură şi sînt susceptibile de a înlocui agentul patogen menţionat. În cazul eşuării testului de însămînţare, izolarea trebuie efectuată pe baza plantelor utilizate pentru testul biologic (a se vedea secţiunea 8).

⁽⁸⁾ Testul biologic este utilizat pentru izolarea C.m. ssp.sepedonicus pe baza extractelor de cartofi prin îmbogăţire selectivă în vinete (Solanum melongena). Sînt necesare condiţii optime de incubare, în conformitate cu specificaţiile procedurii în cauză. Bacteriile care au efect inhibitor asupra C.m. ssp.sepedonicus în prezenţa unui mediu MTNA sau NCP-88 nu riscă să afecteze desfăşurarea testului menţionat (a se vedea secţiunea 7).

⁽⁹⁾ Profilul morfologic al unei colonii caracteristice este prezentat în secţiunea 8.

⁽¹⁰⁾ Punerea în cultură sau testele biologice prezintă riscul unui eşec din cauza concurenţei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care testele de depistare dau rezultate pozitive, dar testele de izolare sînt negative, trebuie repetate testele de izolare pe acelaşi extract sau cu ajutorul unor ţesuturi vasculare prelevate din apropierea stolonului de pe tuberculi tăiaţi provenind din acelaşi eşantion şi, după caz, trebuie testate eşantioane suplimentare.

⁽¹¹⁾ Se pot identifica în mod viabil culturi pure de izolaţi presupuşi de C. m. ssp. sepedonicus utilizînd testele enumerate în secţiunea 9.

⁽¹²⁾ Testul puterii patogene este descris în secţiunea 10.

1.3. Protocolul de detectare şi de identificare a Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus pe eşantioane asimptomatice de plante de cartof

⁽¹⁾ A se vedea secţiunea 3.2 pentru dimensiunea recomandată a eşantioanelor.

⁽²⁾ Extragerea organismului patogen şi metodele de concentrare sînt descrise în secţiunea 3.2.

⁽³⁾ În cazul în care cel puţin două teste bazate pe principii biologice diferite sînt pozitive, trebuie efectuate izolarea şi confirmarea.

Se realizează cel puţin un test de depistare. În cazul în care testul respectiv este negativ, eşantionul se consideră negativ. În cazul în care testul este pozitiv, trebuie să se efectueze cel puţin al doilea test de depistare, bazat pe principii biologice diferite, pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau următoarele sînt negative, eşantionul este considerat negativ. În acest caz nu este necesară efectuarea altor teste.

⁽⁴⁾ Testul de izolare selectivă şi profilul morfologic al unei colonii caracteristice sînt prezentate în secţiunea 8.

⁽⁵⁾ Testul IF este descris în secţiunea 4.

⁽⁶⁾ Testele PCR sînt descrise în secţiunea 6.

⁽⁷⁾ Testul FISH este descris în secţiunea 5.

⁽⁸⁾ Testul biologic este descris în secţiunea 7.

⁽⁹⁾ Punerea în cultură sau testele biologice prezintă riscul unui eşec din cauza concurenţei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care testele de depistare dau rezultate pozitive, dar testele de izolare sînt negative, trebuie repetate testele de izolare şi, după caz, trebuie testate eşantioane suplimentare.

⁽¹⁰⁾ Se pot identifica în mod viabil culturi pure de izolaţi presupuşi de C.m. ssp.sepedonicus utilizînd testele enumerate în secţiunea 9.

⁽¹¹⁾ Testul puterii patogene este descris în secţiunea 10.

2. Cercetarea vizuală a simptomelor veştejirii bacteriene

2.1. Plante de cartof

În contextul climatic european, simptomele rareori pot fi observate pe teren, iar atunci cînd este cazul, acest lucru se întîmplă numai la sfîrşitul sezonului. Adesea simptomele pot fi mascate de cele ale altor boli, de vătămări mecanice, îmbătrînire sau pot fi confundate cu acestea. Simptomele pot trece cu uşurinţă neobservate în momentul inspecţiei pe teren. Simptomele veştejirii sînt foarte diferite de cele care caracterizează veştejirea bacteriană. În general, prima progresează într-adevăr lent şi se limitează iniţial la marginea frunzelor.

Frunzele tinere infectate continuă adesea să crească, dar într-o manieră mai puţin evidentă în locurile infectate, ceea ce face ca frunzele respective să aibă forme neregulate. Frunzele atinse de obstrucţia ţesuturilor vasculare situate mai jos pe tulpină prezintă adesea pete clorotice intercostale de culoare galbenă sau portocalie. Se întîmplă ca foile, frunzele şi chiar şi tulpinile infectate să moară. Adesea, frunzele şi tuberculii scad doar în dimensiuni. Se întîmplă cîteodată să se constate o atrofiere a plantelor.

2.2. Tuberculi de cartof

1) Primul simptom al veştejirii bacteriene îl reprezintă, mai ales în apropierea stolonului, un aspect uşor sticlos sau translucid al ţesutului, fără înmuiere în jurul sistemului vascular. Inelul vascular poate prezenta, la stolon, o culoare uşor mai închisă decît de obicei. Primele simptome uşor de identificat sînt culoarea gălbuie a inelului vascular şi faptul că, în momentul în care se apasă uşor pe tubercul, din vase ies coloane de materie asemănătoare cu brînza.

Exsudatul respectiv conţine milioane de bacterii. Poate apărea o înnegrire a ţesutului vascular. În acest stadiu, bulbul prezintă simptome asemănătoare cu cele ale veştejirii bacteriene la Ralstonia solanacearum. Într-o primă fază, simptomele pot să se limiteze la o parte a inelului care nu este neapărat aproape de stolon, înainte de a se răspîndi treptat pe tot inelul. Pe măsură ce infecţia progresează, ţesuturile vasculare sînt distruse, iar cortexul exterior se poate separa de cortexul interior. În stadiile avansate ale infecţiei, la suprafaţa tuberculului apar fisuri cu marginile adesea colorate în roşu-brun. În mai multe cazuri observate recent în Europa se constată o putrezire simultană a cortexului central şi a inelului vascular, care antrenează o infestare secundară cu găurire internă şi necroză. O infestare fungică sau bacteriană secundară poate masca simptomele şi poate fi dificil şi chiar imposibil să se distingă simptomele avansate ale veştejirii bacteriene de simptomele altor putregaiuri ale tuberculilor. Nu trebuie excluse nici formele asimptomatice.

3. Prepararea eşantionului

3.1. Tuberculi de cartof

Eşantionul standard conţine 200 de tuberculi pe test. O eşantionare mai intensivă implică mai multe teste pe eşantioane standard. Un număr mai mare de tuberculi în eşantion va cauza inhibiţie sau o interpretare dificilă a rezultatelor. În cazul în care nu se dispune de un număr atît de mare de tuberculi, procedura poate fi aplicată fără dificultate pe eşantioane mai mici de 200 de tuberculi.

Validarea tuturor metodelor de detectare descrise în continuare se bazează pe teste realizate pe eşantioane de 200 de tuberculi.

Extractul de cartof descris în continuare mai poate fi utilizat şi pentru a detecta prezenţa bacteriei responsabile de putregaiul brun al cartofului, Ralstonia solanacearum.

Pretratamentul facultativ la prepararea eşantionului presupune următoarele acţiuni:

1) se spală tuberculii, aplicînd între eşantioane dezinfectanţi (compuşi cloruraţi, atunci cînd trebuie utilizat testul PCR, pentru eliminarea acidului dezoxiribonucleic patogen, şi detergenţi adecvaţi. Procedura de spălare menţionată este utilă (dar nu este neapărat obligatorie) în special pentru eşantioanele care conţin elemente de sol în excedent şi în cazul în care trebuie efectuat un test PCR sau o procedură de izolare directă;

2) se usucă tuberculii cu aer.

3.1.1. Cu ajutorul unui scalpel sau al unui cuţit pentru legume, curat şi dezinfectat, se cojeşte fiecare tubercul la nivelul stolonului pînă la apariţia ţesutului vascular.

Se decupează cu atenţie un mic con de ţesut vascular la nivelul stolonului, avînd grijă să se preleveze cît mai puţin ţesut nevascular posibil.

După caz, se pun deoparte şi se testează separat tuberculii care prezintă simptome suspecte de veştejire bacteriană.

În cazul în care se observă simptome suspecte de veştejire bacteriană în momentul prelevării conului de stolon, trebuie să se efectueze o inspecţie vizuală a tuberculului, după ce a fost tăiat în apropierea stolonului. Orice tubercul tăiat care prezintă simptome suspecte trebuie suberificat timp de două zile la temperatura mediului ambiant, apoi conservat în carantină (la o temperatură cuprinsă între 4° şi 10°C) pînă la efectuarea tuturor testelor. Toţi tuberculii din eşantion (inclusiv cei care prezintă simptome suspecte) trebuie conservaţi în conformitate cu anexa nr.2 la Măsuri.

3.1.2. Se colectează conurile de stolon în recipiente noi, de unică folosinţă, care să se poată închide şi/sau sigila (în cazul recipientelor refolosite, acestea se vor curăţa şi se vor dezinfecta integral cu ajutorul compuşilor cloruraţi). Este preferabil ca tratarea conurilor să se efectueze imediat. În caz contrar, conurile se depozitează în recipient fără a se adăuga tampon şi se refrigerează pentru o perioadă mai mică de 72 de ore sau se conservă la temperatura mediului ambiant pentru o perioadă mai scurtă de 24 de ore. Uscarea şi suberificarea, precum şi dezvoltarea saprofitelor în momentul depozitării conurilor pot împiedica detectarea agentului responsabil de veştejirea bacteriană.

3.1.3. Conurile de stolon se tratează în conformitate cu una dintre următoarele proceduri:

1) se acoperă stolonii cu o baie de tampon de extracţie în cantitate suficientă – în jur de 40 ml (a se vedea anexa C la prezenta anexă) şi se aşază într-un agitator rotativ (între 50 şi 100 ture/minut) timp de 4 ore, la o temperatură mai mică de 24°C sau timp de 16–24 ore, în cazul în care sînt refrigeraţi; sau

2) se omogenizează stolonii cu ajutorul unei cantităţi suficiente (în jur de 40 ml) de tampon de extracţie (a se vedea anexa C la prezenta anexă) într-un mixer, sau zdrobindu-l cu un ciocan din cauciuc sau cu un alt dispozitiv de zdrobire potrivit într-o pungă de macerare de unică folosinţă sigilată de 150 mm × 250 mm, sterilizată cu radiaţii ionizante.

Există un risc ridicat de contaminări încrucişate ale eşantioanelor atunci cînd eşantioanele sînt omogenizate cu mixerul. Se vor lua măsuri de precauţie pentru a evita orice vaporizare sau vărsare în timpul procesului de extracţie. Se va asigura folosirea unor lame de mixer şi a unor vase proaspăt sterilizate pentru fiecare probă. În cazul folosirii testului PCR, se va evita orice transport de ADN în recipientele sau în dispozitivele de zdrobire. În cazul în care se recurge la testul PCR, se recomandă zdrobirea în pungi de unică folosinţă şi utilizarea tuburilor de unică folosinţă.

3.1.4. Se decantează lichidul supernatant. În cazul în care lichidul este prea tulbure, se limpezeşte prin centrifugare la viteză redusă (la maximum 180 g timp de 10 minute, la o temperatură de 4°–10°C) sau prin filtrare în vid (40–100 μm), spălînd filtrul cu un tampon de extracţie suplimentară (10 ml) (a se vedea anexa C la anexa nr.1 la Măsuri).

3.1.5. Se concentrează fracţiunea bacteriană prin centrifugare la viteza de 7000 g timp de 15 minute (sau de 10000 g timp de 10 minute) la o temperatură cuprinsă între 4 şi 10°C, apoi se elimină lichidul supernatant fără a agita depozitul.

3.1.6. Se readuce depozitul în suspensie într-un tampon de 1,5 ml (a se vedea anexa C la anexa nr.1 la prezentele Măsuri). Se utilizează 500 μl pentru testele de C. m. ssp. sepedonicus, 500 μl pentru testele de Ralstonia solanacearum şi 500 μl ca valoare de referinţă. Se adaugă glicerol steril la concentraţia finală de 10–25% (în volum) la 500 μl din alicota de referinţă şi la alicota de test rămasă, se agită şi se depozitează la o temperatură între –16° şi –24°C (săptămîni) sau între –68° şi –86°C (luni). În timpul testelor, alicotele de test se păstrează la o temperatură de 4°–10°C.

Nu sînt recomandate congelările şi dezgheţările repetate.

În cazul în care extractul trebuie transportat, se va asigura livrarea în termen de 24–48 de ore într-o ladă frigorifică.

3.1.7. Pentru a evita contaminarea, este necesar ca toţi martorii pozitivi şi toate eşantioanele de C. m.ssp. sepedonicus să fie tratate separat, atît pentru testele de imunofluorescenţă, cît şi pentru toate celelalte teste.

3.2. Plante de cartof

Pentru a detecta populaţiile recente de C. m. ssp. sepedonicus este recomandabil să se testeze probe compozite. Procedura poate fi aplicată cu uşurinţă pentru probele compozite care conţin pînă la 200 de părţi de tulpini. Atunci cînd se efectuează anchete, anchetele respective trebuie să se bazeze pe un eşantion reprezentativ din punct de vedere statistic al populaţiei vegetale examinate.

3.2.1. Cu ajutorul unui cuţit sau al unei foarfece de grădină curate şi dezinfectate se taie un segment de 1–2 cm de la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra solului. După ce s-au dezinfectat rapid cu etanol de 70%, segmentele de tulpini se usucă imediat cu hîrtie de filtru.

Se colectează segmentele de tulpini într-un recipient steril închis, respectînd procedura de eşantionare expusă în continuare.

3.2.2. Segmentele de tulpini se tratează urmînd una dintre următoarele proceduri:

1) se acoperă segmentele de tulpină cu o baie de tampon de extracţie în cantitate suficientă – în jur de 40 ml (a se vedea anexa C la prezenta anexă) şi se aşază într-un agitator rotativ (între 50 şi 100 ture/minut) timp de 4 ore, la o temperatură mai mică de 24°C sau timp de 16–24 ore, în cazul în care sînt refrigerate; sau

2) segmentele se zdrobesc imediat într-o pungă de macerare rezistentă (de exemplu Stomacher sau Bioreba) cu o cantitate adecvată de tampon de extracţie (a se vedea anexa C la prezenta anexă) folosind un ciocan de cauciuc sau un alt dispozitiv de zdrobire corespunzător (de exemplu Homex). În caz contrar, segmentele trebuie să fie refrigerate (pentru o perioadă mai scurtă de 72 de ore) sau conservate la temperatura mediului ambiant (pentru o perioadă mai scurtă de 24 de ore).

3.2.3. După o sedimentare de 15 minute, se decantează lichidul supernatant.

3.2.4. De obicei, nu este necesar să se efectueze o nouă limpezire a extractului sau a concentraţiei fracţiunii bacteriene, cu toate acestea, limpezirea se poate efectua prin filtrare şi/sau centrifugare, în conformitate cu metoda descrisă de secţiunile 3.1.4.– 3.1.6.

3.2.5. Se separă extractul de probă iniţial sau concentrat în două părţi egale. Una dintre părţi se menţine pe toată durata testului la o temperatură de 4–10°C, iar cealaltă se depozitează la o temperatură între –16 şi –24°C (săptămîni) sau între –68 şi –86°C (luni), după ce s-a introdus în ea în prealabil o cantitate de 10–25% glicerol steril, în cazul în care va fi necesară efectuarea unui al doilea test.

4. Test de imunofluorescenţă

Ţinînd seama de capacitatea sa recunoscută de a atinge pragurile cerute, se recomandă utilizarea testului de imunofluorescenţă ca test principal de depistare.

În cazul în care testul de imunofluorescenţă este utilizat ca test principal de depistare şi rezultatul este unul pozitiv, trebuie să se efectueze un test PCR sau FISH ca test secundar. În cazul în care testul de imunofluorescenţă este folosit ca test secundar, iar rezultatul este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare, în conformitate cu indicaţiile din diagrama funcţională.

Atunci cînd testul de imunofluorescenţă se utilizează ca test principal, se foloseşte întotdeauna un anticorp policlonal. Atunci cînd un test de imunofluorescenţă efectuat cu un anticorp policlonal are un rezultat pozitiv, un test suplimentar al probei cu anticorp monoclonal poate permite o specificitate mai mare, dar, de asemenea, se poate dovedi mai puţin evident.

Trebuie să se folosească anticorpii unei suşe de referinţă a C. m. ssp. sepedonicus. Se recomandă să se determine titrul pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se defineşte ca fiind cea mai înaltă diluţie la care se obţine o reacţie optimă atunci cînd se testează o suspensie care conţine între 10⁵ şi 10⁶ celule pe mililitru a unei suşe omoloage de C. m.ssp. sepedonicus folosind un conjugat adecvat de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Soluţia brută de anticorpi policlonali sau monoclonali trebuie să prezinte un titru de imunofluorescenţă de cel puţin 1:2000. În momentul efectuării testului, diluţia/diluţiile de lucru ale anticorpilor trebuie să fie aproximativ egale cu jumătatea titrului.

Se folosesc anticorpi validaţi.

Testul trebuie efectuat pe extracte de probă proaspăt preparate. După caz, acesta poate fi efectuat cu succes pe extracte conservate în soluţie de glicerol, la o temperatură între –68° şi –86°C. Glicerolul poate fi separat de probă prin adăugarea unui ml de tampon de extract concentrat (a se vedea anexa D la prezenta anexă), centrifugare timp de 15 minute la 7000 g şi resuspendare în aceeaşi cantitate de tampon de extract concentrat. Acest lucru este rareori necesar, în special atunci cînd proba este fixată de lamă prin flambare (a se vedea punctul 2.2 din prezenta anexă).

Se pregătesc lame – martori pozitivi distincţi ai unei suşe omoloage sau ai oricărei alte suşe de referinţă a C.m. ssp. sepedonicus într-o suspensie de extract de cartof, astfel cum se indică în anexa B la prezenta anexă şi, eventual, într-o soluţie tampon.

Ca martor similar pe aceeaşi lamă, ar trebui utilizat, în măsura posibilului, ţesut infectat în mod natural, conservat prin liofilizare sau congelare între –16°C şi –24°C).

Ca martori negativi, se folosesc alicote de extract de probă care au dat, în prealabil, un rezultat negativ la teste.

Se utilizează lame de microscop cu multe godeuri dotate, de preferinţă, cu 10 ferestre cu un diametru minim de 6 mm.

Materialul de control se testează la fel ca probele.

4.1. Lamele se prepară folosind una dintre următoarele metode:

1) extracte finale cu conţinut relativ redus de amidon: se depune cu pipeta pe prima fereastră o cantitate standard (15 μl sînt suficienţi pentru un diametru al ferestrei de 6 mm; pentru ferestrele cu un diametru mai mare se alege o cantitate mai mare) dintr-o soluţie de 1/100 de extract concentrat de cartof repus în suspensie. Apoi se depune cu pipeta o cantitate similară de extract concentrat nediluat (1/1) pe ferestrele rămase din acel şir. Şirul următor poate fi folosit ca duplicat sau poate servi pentru o a doua probă, astfel cum se indică în figura 1;

2) alte extracte: se prepară diluţiile zecimale (la 1/10, la 1/100 şi la 1/1000) din extractul concentrat repus în suspensie în soluţia tampon. Se depune cu pipeta pe un şir de ferestre o cantitate standard (15 μl sînt suficienţi pentru un diametru al ferestrei de 6 mm; pentru ferestrele cu un diametru mai mare se alege o cantitate mai mare) de suspensie de extract pur şi de fiecare diluţie. Şirul următor poate fi folosit ca duplicat sau poate servi pentru o a doua probă, astfel cum se indică în figura 2.

4.2. Se usucă picăturile la temperatura mediului ambiant sau prin încălzire la temperaturi cuprinse între 40° şi 45°C. Celulele bacteriene se fixează pe lamă prin încălzire (15 minute la 60°C), prin flambare, cu ajutorul etanolului la 95% sau urmînd instrucţiunile specifice ale furnizorilor de anticorpi.

În cazul în care este necesar, lamele fixe pot fi refrigerate şi depozitate într-o cutie de desicaţie pentru cea mai scurtă perioadă posibilă (maximum 3 luni) înainte de efectuarea unui alt test.

4.3. Procedura testului de imunofluorescenţă

1) în conformitate cu metoda de preparare a lamelor de test indicată la pct.4.1 subpct.1) se prepară o serie de diluţii pe jumătate de anticorp într-un tampon de imunofluorescenţă. Primul godeu trebuie să primească 1/2 din titru (T/2), celelalte – 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titrul (T) şi de două ori titru (2T);

2) în conformitate cu metoda de preparare a lamelor de test indicată la pct.4.1 subpct.2) se prepară diluţia de lucru de anticorp într-un tampon de imunofluorescenţă. Diluţia de lucru are efect asupra specificităţii.

Figura 1. Prepararea lamei de test în conformitate cu pct.4.1. subpct.1) şi pct.4.3 subpct.1)

Diluţia de extract concentrat repus în suspensie

Figura 2. Pregătirea lamei de test în conformitate cu pct.4.1 subpct.2 şi pct.4.3 subpct.2)

Diluţia de lucru de antiser/anticorp

4.3.1. Se aşază lamele pe hîrtie umedă. Se acoperă complet fiecare fereastră de test cu una sau mai multe diluţii de anticorpi. Cantitatea de anticorpi aplicată pe fiecare fereastră trebuie să fie cel puţin egală cu volumul de extract aplicat.

În absenţa instrucţiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi, se aplică următoarele proceduri:

1) se incubează lamele pe hîrtie umedă şi sub un capac-clopot timp de 30 de minute, la temperatura mediului ambiant (18°–25°C);

2) se elimină picăturile de pe fiecare lamă şi se clăteşte cu grijă într-o soluţie tampon pentru imunofluorescenţă;

3) se spală prin imersie timp de cinci minute într-o soluţie tampon IF-Tween (a se vedea anexa C la prezenta anexă), apoi încă cinci minute într-o soluţie tampon IF. Se evită orice vaporizare sau vărsare care ar putea determina o contaminare încrucişată. Se elimină cu atenţie excesul de umiditate cu ajutorul hîrtiei sugative;

4) se aşază lamele pe hîrtie umedă. Se acoperă ferestrele de test cu conjugat FITC la diluţia utilizată la titrare. Cantitatea de conjugat aplicată pe ferestre trebuie să fie identică cu cantitatea de anticorpi utilizată;

5) se incubează lamele pe hîrtie umedă şi sub capac-clopot timp de 30 de minute, la temperatura mediului ambiant (18°–25°C);

6) se elimină de pe lamă picăturile de conjugat. Se clăteşte şi se spală în conformitate cu indicaţiile anterioare (subpct.3));

7) se elimină cu grijă excesul de umiditate. În fiecare fereastră se depun cu pipeta 5–10 μl dintr-o soluţie de glicerol tamponată cu fosfat la 0,1 M (a se vedea anexa C la prezenta anexă) sau un suport antidecolorare din comerţ, apoi se acoperă cu o lamelă.

4.4. Citirea testului de imunofluorescenţă

4.4.1. Se examinează lamele de test cu ajutorul unui microscop cu epifluorescenţă şi cu ajutorul filtrelor adaptate la excitaţia izotiocianatului de fluorescenţă, în imersie în ulei sau în apă şi cu o mărire de la 500 la 1000 de ori. Se examinează ferestrele în funcţie de două diametre perpendiculare şi în jurul perimetrului. Pentru probele care nu prezintă celule sau care prezintă doar un număr redus de celule se observă cel puţin 40 de cîmpuri microscopice.

Se începe prin a se controla lama martorului pozitiv. Celulele trebuie să prezinte o fluorescenţă vie şi să fie complet colorate la titrul de anticorp sau de diluţie de lucru determinat. În cazul unei colorări anormale, testul IF (secţiunea 4) trebuie repetat.

4.4.2. Se caută în ferestrele lamelor de test prezenţa celulelor care prezintă o fluorescenţă vie şi o morfologie caracteristică pentru C. m. ssp. sepedonicus. Intensitatea fluorescenţei trebuie să fie echivalentă cu cea a suşei-martor pozitiv pentru o diluţie identică de anticorpi. Celulele a căror colorare este incompletă sau care prezintă o fluorescenţă slabă nu trebuie luate în considerare.

La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întîmpla în cazul în care toate lamele dintr-un lot prezintă celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau în cazul în care celulele pozitive sînt izolate (în exteriorul ferestrelor) pe mediul de montare al lamei.

4.4.3. Există un anumit număr de probleme inerente specificităţii testului de imunofluorescenţă. Există un risc ridicat ca în extractele de conuri de stoloni şi de segmente de tulpini de cartof să apară populaţii nedorite de celule fluorescente, atipice din punct de vedere morfologic şi populaţii de bacterii saprofite care provoacă reacţii încrucişate şi au dimensiune şi morfologie similare cu C. m. ssp. sepedonicus.

4.4.4. Numai celulele fluorescente care au o dimensiune şi o morfologie caracteristice titrului sau diluţiei de lucru a anticorpilor menţionaţi la punctul 4.3 trebuie să fie luate în considerare.

4.4.5. Interpretarea testului de imunofluorescenţă:

1) în cazul în care proba conţine celule care prezintă o fluorescenţă vie şi o morfologie caracteristică, se evaluează numărul mediu de celule caracteristice pe cîmp microscopic şi se calculează numărul celulelor menţionate pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie (a se vedea anexa D la prezenta anexă).

Testul de imunofluorescenţă este considerat pozitiv atunci cînd eşantionul conţine cel puţin 5×10³ celule caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie. În acest caz, eşantionul este considerat ca fiind potenţial contaminat şi trebuie continuate testele;

2) testul de imunofluorescenţă este considerat negativ atunci cînd eşantionul conţine mai puţin de 5×10³ celule pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie şi proba este considerată necontaminată. Nu este necesară continuarea testelor.

5. Testul FISH

În cazul în care testul FISH este folosit ca test de depistare iniţial şi rezultatul lui este pozitiv, trebuie să se efectueze un test de imunofluorescenţă, ca al doilea test obligatoriu de depistare. În cazul în care testul FISH este folosit ca test secundar, iar rezultatul este pozitiv, diagnosticul trebuie completat de teste suplimentare, astfel cum se indică în diagrama funcţională.

Se utilizează oligosonde validate specifice C. m. ssp. sepedonicus (a se vedea anexa G la anexa nr.1 la prezentele Măsuri). Testele preliminare efectuate prin această metodă trebuie să permită detectarea reproductibilă a cel puţin 10³–10⁴ celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus adăugate extractelor de probe care au dus anterior la rezultate negative.

Este preferabil să se aplice procedura descrisă în continuare pentru extractele de probă proaspăt preparate, dar procedura poate funcţiona, de asemenea, cu extracte de probă conservate în soluţie de glicerol la temperaturi între –16°C şi –24°C sau între –68°C şi –86°C.

Ca martori negativi se folosesc alicote de extract de probă care au dus în prealabil la un rezultat negativ la testele de depistare a C. m. ssp. sepedonicus.

Ca martori pozitivi se prepară suspensii care conţin între 10⁵ şi 10⁶ celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus (de exemplu suşe NCPPB 4053 sau PD 406) într-o soluţie tampon fosfatată la 0,01 M, pe baza unei culturi de trei pînă la cinci zile (a se vedea anexa B din anexa nr.1 la prezentele Măsuri). Se prepară lame-martori pozitivi distincte ale suşei omoloage sau ale oricărei alte suşe de referinţă de C. m. ssp. sepedonicus într-o suspensie de extract de cartof, astfel cum se indică în anexa B la prezenta anexă.

Utilizarea unei oligosonde eubacteriene marcate cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) permite controlarea procesului de hibridizare, colorînd toate eubacteriile prezente în probă.

Materialul de control se testează la fel ca probele.

5.1. Fixarea extractului de cartof

Protocolul prezentat în cele ce urmează se bazează pe Wullings et al. (1998).

5.1.1. Se prepară soluţia de fixare (a se vedea anexa G la prezenta anexă).

5.1.2. Se introduc cu pipeta 100 μl din fiecare extract într-un tub Eppendorf şi sînt centrifugaţi timp de 8 minute la 7 000 g.

5.1.3. Se elimină lichidul supernatant şi se dizolvă extractul concentrat în 500 μl de fixativ preparat cu mai puţin de 24 de ore înainte. Se agită şi se lasă la incubat toată noaptea la 4°C. Se mai poate utiliza ca fixativ etanol la 96%. În acest caz, extractul concentrat menţionat la punctul 5.1.2 se dizolvă într-un amestec format din 50 μl de tampon fosfatat la 0,01 M şi din 50 μl etanol la 96%. Se amestecă la vortex şi se lasă la incubat la 4°C timp de 30–60 minute.

5.1.4. Se pune la centrifugat timp de 8 minute la 7000 g, se elimină lichidul supernatant şi se repune în suspensie extractul concentrat în 75 μl de tampon fosfatat la 0,01 M.

5.1.5. Se depun 16 μl de suspensii fixate pe o lamă multitest, astfel cum se indică în figura 3. Pe fiecare lamă se aplică două probe diferite, nediluate, şi din acestea se diluează 10 μl la 1:100 (într-un tampon fosfatat de 0,01 M). Restul soluţiei de probă (49 μl) poate fi conservată la –20°C, după ce s-a adăugat o cantitate de etanol la 96%. În cazul în care este necesară repetarea testului FISH, se elimină etanolul prin centrifugare şi se înlocuieşte cu o cantitate echivalentă de tampon fosfatat la 0,01 M (se omogenizează prin agitare).

Figura 3. Dispunerea unei lame pentru testul FISH

5.1.6. Lamele se usucă la aer (sau într-un uscător, la 37°C), apoi se fixează prin flambare.

În acest stadiu procedura poate fi întreruptă, iar hibridizarea poate continua în ziua următoare. Lamele trebuie depozitate la adăpost de praf, într-un loc uscat şi la temperatura mediului ambiant.

5.2. Prehibridizarea şi hibridizarea

5.2.1. Se prepară o soluţie de lizozimă avînd la bază 10 mg de lizozimă (Sigma L-6876) pentru 10 ml de tampon (100 mM Tri-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0). Soluţia menţionată poate fi conservată, dar nu trebuie congelată nici dezgheţată mai mult decît o singură dată. Fiecare eşantion se acoperă integral cu aproximativ 50 μl de soluţie de lizozimă şi se lasă la incubat timp de 10 minute la temperatura aerului ambiant, apoi lamele se scufundă o singură dată în apa demineralizată şi se usucă cu hîrtie de filtru.

Altă posibilitate: în fiecare godeu, în locul lizozimei, se adaugă la tampon (2mM Tri-HCl, 2mM CaCl2, pH 7,4) 50 μl de proteinază K la 40–400 μg/ml, apoi se lasă la incubat la 37°C timp de 30 de minute.

5.2.2. Se deshidratează celulele prin băi succesive de etanol la 50%, 80% şi 96% de un minut fiecare. Se aşază lamele pe un suport şi se lasă să se usuce în aer liber.

5.2.3. Se prepară o cameră de incubaţie umedă tapiţînd fundul unei cutii ermetice de hîrtie de filtru umedă sau de hîrtie de filtru impregnată cu hibmix 1x (a se vedea anexa G la prezenta anexă). Se pune la preincubat cutia timp de cel puţin 10 minute în cuptorul de hibridizare, la o temperatură de 55°C.

5.2.4. Se prepară soluţia de hibridizare (a se vedea anexa G la prezenta anexă) avînd la bază 45 μl pe lamă, apoi se pune la preincubat timp de cinci minute la o temperatură de 55°C.

5.2.5. Se aşază lamele pe o placă încălzită la 45°C şi se varsă 10 μl de soluţie de hibridizare în fiecare dintre cele patru godeuri ale fiecărei lame.

5.2.6. Se acoperă fiecare lamă cu două lamele (24×24 mm), avînd grijă să nu intre aer, apoi se aşază lamele în camera de hibridizare umedă preîncălzită şi se lasă acolo o noapte, în obscuritate şi la o temperatură de 55°C, pentru a permite desfăşurarea hibridizării.

5.2.7. Se prepară trei pahare de laborator care conţin 1 l de apă ultrapură, 1 l de hibmix 1x (334 ml de hibmix 3x şi 666 ml de apă ultrapură) şi 1 l de hibmix 1/2x (167 ml de hibmix 3x şi 833 ml de apă ultrapură). Fiecare dintre pahare se pune la preincubat în baie de aburi, la o temperatură de 55°C.

5.2.8. Lamele şi lamelele se îndepărtează şi se aşază pe un suport.

5.2.9. Se elimină excesul de sondă, punîndu-l la incubat timp de 15 minute la 55°C în paharul de laborator care conţine hibmixul 1x.

5.2.10. Se transferă suportul de lame într-o soluţie de spălat cu hibmix 1/2 şi se lasă la incubat timp de încă 15 minute.

5.2.11. Se scufundă rapid lamele într-o baie de apă ultrapură şi se usucă cu hîrtie de filtru. Se elimină excesul de umiditate aşezînd uşor hîrtia de filtru peste suprafaţa care trebuie uscată. Se pun cu pipeta în fiecare fereastră între 5 şi 10 μl de soluţie suport antidecolorare (de exemplu Vectashield de la Vecta Laboratories, CA, USA sau o soluţie echivalentă) şi se acoperă întreaga suprafaţă a lamei cu o lamelă mare (24×60 mm).

5.3. Citirea testului FISH

5.3.1. Se trece imediat la observarea lamelor cu ajutorul unui microscop cu epifluorescenţă care măreşte între 630 şi 1000x, sub o peliculă de ulei. Cu un filtru adaptat la izotiocianatul de fluoresceină (FITC), celulele eubacteriene (inclusiv majoritatea celulelor gram-negative) prezente în probă se colorează în verde fluorescent. Cu un filtru adaptat la tetrametilrodamină-5-izotiocianat, celulele de C. m. ssp. sepedonicus marcate cu Cy3 apar colorate în roşu fluorescent. Se compară morfologia celulelor cu cea a martorilor pozitivi. Celulele trebuie să fie complet colorate şi să prezinte o fluorescenţă vie. În caz de colorare anormală, testul FISH (punctul 9.4) trebuie repetat. Se examinează ferestrele pe baza a două diametre perpendiculare şi în jurul perimetrului. Pentru probele care nu prezintă celule sau care prezintă doar un număr redus de celule se observă cel puţin 40 de cîmpuri microscopice.

5.3.2. Se caută în ferestrele lamelor de test prezenţa celulelor care prezintă o fluorescenţă vie şi o morfologie caracteristică pentru C. m. ssp. sepedonicus.

Intensitatea fluorescenţei trebuie să fie echivalentă cu cea a suşei martor pozitiv sau superioară acesteia. Celulele a căror colorare este incompletă sau care prezintă o fluorescenţă slabă nu trebuie luate în considerare.

5.3.3. La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întîmpla în cazul în care toate lamele dintr-un lot prezintă celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau în cazul în care celulele pozitive sînt izolate (în exteriorul ferestrelor) pe mediul de montare al lamei.

5.3.4. Există un anumit număr de probleme inerente specificităţii testului FISH. Este posibil ca în extractele de conuri de stoloni şi de segmente de tulpini de cartofi să apară populaţii nedorite de celule fluorescente morfologic atipice şi de bacterii saprofite care provoacă reacţii încrucişate şi au mărimea şi morfologia asemănătoare cu C. m. ssp. sepedonicus. Fenomenul menţionat este, cu toate acestea, mult mai puţin frecvent decît în cazul testului de imunofluorescenţă.

5.3.5. Doar celulele fluorescente de mărime şi cu morfologie caracteristice trebuie luate în considerare (a se vedea punctul 5.3.2).

5.3.6. Interpretarea rezultatului testului FISH:

1) rezultatele testului FISH sînt valabile atunci cînd prin intermediul filtrului FITC se observă celule care prezintă o fluorescenţă vie de culoare verde şi o mărime şi o morfologie caracteristice pentru C. m. ssp. sepedonicus, iar prin intermediul filtrului rodamină se observă celule care prezintă o fluorescenţă vie de culoare roşie la toţi martorii pozitivi şi la nici un martor negativ. În cazul în care proba conţine celule care prezintă o fluorescenţă vie şi o morfologie caracteristică, se evaluează numărul mediu de celule caracteristice pe cîmp microscopic şi se calculează numărul celulelor respective pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie (a se vedea anexa D la prezenta anexă). Probele care conţin cel puţin 5×10³ celule caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie sînt considerate ca fiind potenţial contaminate. Trebuie continuate testele. Eşantioanele care conţin mai puţin de 5×10³ celule caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie sînt considerate ca fiind negative;

2) testul FISH este negativ în cazul în care nu se observă, prin intermediul filtrului rodamină, celule de mărimea şi cu morfologia caracteristice pentru C. m. ssp. sepedonicus care prezintă o fluorescenţă vie de culoare roşie, cu condiţia ca astfel de celule caracteristice cu o fluorescenţă vie şi de culoare roşie să fie observate cu filtrul rodamină în preparatele de martori pozitivi.

6. Testul PCR

În cazul în care testul PCR este folosit ca test principal de depistare şi rezultatul lui este pozitiv, trebuie să se efectueze un test de imunofluorescenţă ca test secundar de depistare obligatoriu. În cazul în care testul PCR este folosit ca test secundar, iar rezultatul lui este pozitiv, diagnosticul trebuie completat de teste suplimentare, astfel cum se indică în diagrama funcţională.

Exploatarea completă a metodei menţionate ca test principal de depistare nu se recomandă decît în cazul în care există o expertiză specializată în domeniu.

Testele preliminate efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită detectarea reproductibilă a 10³–10⁴ celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus adăugate extractelor de probe care au dat anterior rezultate negative. Se pot dovedi necesare experienţe de optimizare pentru a obţine niveluri maxime de sensibilitate şi de specificitate în toate laboratoarele.

Se folosesc reactivi şi protocoale PCR validate. Se alege, de preferinţă, o metodă cu control intern.

Se iau precauţiile necesare pentru a evita contaminarea probei cu ADN-ul ţintă. Pentru a reduce pe cît posibil riscul contaminării cu ADN-ul ţintă, ar trebui ca testul PCR să fie efectuat de către tehnicieni experimentaţi, în laboratoare de biologie moleculară specializate.

Martorii negativi (în ceea ce priveşte procedurile PCR şi de extragere a ADN-ului) trebuie trataţi întotdeauna ca probe finale în procedură, pentru a evidenţia apariţia unui eventual transfer de ADN.

În testul PCR trebuie incluşi următorii martori negativi:

1) extractul de probă care a dat anterior rezultate negative pentru C. m. ssp. sepedonicus;

2) tampoanele martori folosite pentru a extrage bacteria şi ADN-ul din probă;

3) amestecul reactiv pentru PCR.

De asemenea, trebuie incluşi aici şi următorii martori pozitivi:

1) alicote de extracte finale repuse în suspensie, după ce s-a adăugat C. m. ssp. sepedonicus (a se vedea anexa B la prezenta anexă) pentru preparare;

2) suspensie în mediu apos de 10⁶ celule pe mililitru dintr-un izolat virulent de C. m. ssp. sepedonicus (de exemplu NCPPB 2140 sau NCPPB 4053);

3) de asemenea, în cazul în care este posibil, pentru testul PCR se utilizează ADN extras din probe de martori pozitivi.

Pentru a evita riscurile de contaminare, martorii pozitivi se prepară într-un mediu diferit de cel în care se găsesc probele care trebuie testate.

În măsura posibilului, extractele de probe trebuie curăţate de pămînt. În anumite cazuri, este recomandabil să se prepare extracte de cartofi spălaţi, în cazul în care se prevede folosirea protocoalelor PCR.

6.1. Metode de purificare a ADN-ului

Se folosesc probe martori pozitivi şi negativi, în conformitate cu metoda descrisă anterior.

Materialul de control se prepară la fel ca probele.

Există o serie întreagă de metode pentru purificarea ADN-ului ţintă, în cazul substratelor de probe complexe, pentru a elimina inhibitorii PCR şi alte reacţii enzimatice şi a concentra ADN-ul ţintă în extractul de probă.

Următoarea metodă a fost optimizată pentru a fi utilizată cu metoda PCR validată (descrisă în anexa F la prezenta anexă).

6.1.1. Metoda Pastrik (2000)

Se pun cu pipeta 220 μl de tampon de liză (100 mM NaCl, 10mM Tri-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0] într-un tub Eppendorf de 1,5 ml.

Se adaugă 100 μl de extract de probă şi se aşază într-un bloc de încălzire sau într-o baie de aburi la 95°C timp de 10 minute.

Se aşază tubul pe gheaţă timp de 5 minute.

Se adaugă 80 μl de soluţie concentrată de lizozimă (50 mg de lizozimă pe mililitru în 10 mM Tri HCl, pH 8,0) şi se lasă la incubat la 37°C timp de 30 de minute.

Se adaugă 220 μl de Easy DNA ® soluţie A (Invitrogen), se omogenizează bine prin agitare şi se lasă la incubat la 65°C timp de 30 de minute.

Se adaugă 100 μl de Easy DNA ® soluţie B (Invitrogen), se omogenizează bine prin agitare pînă cînd precipitatul circulă liber în tub, iar proba prezintă o viscozitate uniformă.

Se adaugă 500 μl de cloroform şi se omogenizează prin agitare pînă cînd viscozitatea scade, iar amestecul devine omogen.

Se centrifughează la 15000 g timp de 20 de minute la 4°C, pentru a separa fazele şi pentru a forma interfaza.

Se varsă faza superioară într-un alt tub Eppendorf.

Se adaugă 1 mililitru de etanol la 100% (–20°C), se omogenizează rapid prin agitare şi se lasă la incubat pe gheaţă timp de 10 minute.

Se centrifughează la 15000 g timp de 20 de minute la 4°C şi se elimină etanolul din extractul concentrat.

Se adaugă 500 μl de etanol la 80% (–20°C) şi se amestecă, răsturnînd tubul.

Se centrifughează la 15000 g timp de 10 minute la 4°C, se conservă extractul concentrat şi se elimină etanolul.

Se lasă să se usuce extractul în aer liber sau într-un Speed Vac de ADN.

Se repune în suspensie extractul în concentrat în 100 μl de apă ultrapura sterilă şi se lasă la temperatura mediului timp de cel puţin 20 de minute.

Se conservă la –20°C pînă cînd se utilizează pentru PCR.

Se izolează orice precipitat alb prin centrifugare şi se utilizează 5 μl din lichidul supernatant ce conţine ADN pentru PCR.

6.1.2. Se pot aplica şi alte metode de extragere a ADN-ului (de exemplu Qiagen DNeasy Plant Kit), cu condiţia ca metodele respective să aibă o eficacitate recunoscută ca fiind echivalentă, pentru purificarea ADN-ului provenit din probele martori care conţin între 10³ şi 10⁴ celule de agent patogen pe mililitru.

6.2. Testul PCR

6.2.1. Se prepară matricele de test şi de control pentru PCR, urmînd protocoalele validate (a se vedea anexa F la prezenta anexă). Se prepară o diluţie zecimală din extractul de ADN provenit din probă (1:10 în apă ultrapură).

6.2.2. Se prepară amestecul reactiv pentru PCR într-un mediu lipsit de orice contaminare, în conformitate cu protocoalele publicate (a se vedea anexa F la prezenta anexă). Protocolul PCR validat este o reacţie multiplex care include şi un control PCR intern.

6.2.3. Se adaugă 5 μl de extract de ADN la 25 μl reactiv PCR, în tuburi PCR sterile.

6.2.4. Se constituie o probă martor negativ care nu conţine decît amestecul reactiv pentru PCR şi se adaugă în locul probei o apă pură provenind din aceeaşi sursă ca şi cea utilizată în amestecul PCR.

6.2.5. Se aşează tuburile în acelaşi termociclu folosit la testul preliminar şi se lansează programul PCR optimizat în mod corespunzător (a se vedea anexa F la prezenta anexă).

6.3. Analiza produsului reacţiei PCR

6.3.1. Se decodează amplimerii prin electroforeză pe gel de agaroză. O cantitate de cel puţin 12 μl de amestec reactiv de ADN amplificat, provenit de la fiecare probă, asociat cu 3 μl de tampon de încărcare (anexa F la prezenta anexă) se supun unei tensiuni de 5–8 V/cm pe geluri de agaroză la 2,0% într-un tampon de EDTA (TAE) triacetate (anexa F la prezenta anexă). Se utilizează un marker de ADN adecvat, precum “100 bp ladder”.

6.3.2. Pentru a scoate în evidenţă benzile de ADN se foloseşte colorarea cu bromură de etidiu (la 0,5 mg/l) timp de 30–45 minute, luînd precauţiile care se impun pentru manipularea agentului mutagen în cauză.

6.3.3. În cazul produselor PCR care au mărimea preconizată (anexa F la la prezenta anexă) se vizualizează gelul colorat prin diafanoscopie sub unde UV scurte (de exemplu λ = 302 nm) şi se notează rezultatele.

6.3.4. Pentru toate cazurile/rezultatele noi se verifică autenticitatea amplimerului, efectuînd o analiză de restricţie enzimatică pe o probă din ADN-ul amplificat rămas. În acest scop, se lasă la incubat la o temperatură optimă şi pe o durată optimă, folosind o enzimă şi un tampon corespunzătoare (a se vedea anexa F la prezenta anexă). Se decodează fragmentele digerate prin electroforeză pe gel de agaroză, în conformitate cu metoda indicată anterior şi se vizualizează prin diafanoscopie sub UV dispunerea caracteristică a fragmentelor după restricţia enzimatică şi colorarea cu bromură de etidiu. Se compară apoi cu martorii pozitivi dinainte şi de după digestie.

6.3.5. Interpretarea rezultatului testului PCR

Testul PCR este negativ, în cazul în care se observă în mod evident amplimerul PCR specific C. m. ssp. sepedonicus de mărimea preconizată pentru ansamblul probelor martori pozitivi, dar nu şi pentru proba în cauză (în cazul unui PCR multiplex cu primeri de control intern specifici plantei, un al doilea produs PCR de mărimea preconizată trebuie amplificat cu proba în cauză).

Testul PCR este pozitiv, în cazul în care se observă în mod evident amplimerul PCR specific C. m. ssp. sepedonicus de mărimea şi (în cazul în care este necesar) dispunerea postrestricţie preconizate, cu condiţia să nu fie amplificat cu una dintre probele martori negativi. De asemenea, se poate confirma cu încredere un rezultat pozitiv, repetînd testul cu o a doua serie de primeri PCR (a se vedea punctul 9.3).

Se poate suspecta o inhibiţie a PCR, în cazul în care amplimerul preconizat se obţine pe baza probei martor pozitiv care conţine C. m. ssp. sepedonicus în soluţie apoasă, atunci cînd martorii pozitivi care conţin C. m. ssp. sepedonicus în extractul de cartof dau un rezultat negativ. În protocoalele PCR multiplex cu controale PCR interne inhibiţia reacţiei este probabilă atunci cînd nu se obţine nici unul dintre cei doi amplimeri.

Se poate suspecta o contaminare, în cazul în care amplimerul preconizat este evidenţiat în cel puţin unul dintre martorii negativi.

7. Testul biologic

Testele biologice preliminare trebuie să permită detectarea reproductibilă a 10³–10⁴ celule/ml de C. m. ssp. sepedonicus care să formeze colonii, adăugate extractelor de probe care anterior au dat rezultate negative (pentru preparare, a se vedea anexa B la prezenta anexă).

Pentru a obţine o sensibilitate maximă a detecţiei este preferabil să se utilizeze un extract de probă proaspăt preparat în condiţii optime de creştere. Cu toate acestea, metoda poate fi aplicată cu succes pentru extracte conservate în soluţie de glicerol la temperaturi între –68°C şi –86°C.

Anumite varietăţi de vînătă constituie un mediu excelent de îmbogăţire selectivă pentru cultura de C. m. ssp. sepedonicus, chiar şi în absenţa simptomelor, şi permit, de asemenea, realizarea unui excelent test de confirmare pe gazdă.

Pentru a reduce riscul rezultatelor negative false, condiţiile de creştere trebuie să fie optime (pentru detalii privind cultura, a se vedea anexa H la prezenta anexă).

7.1. Se repartizează pe vinete, în conformitate cu una dintre metodele indicate în continuare (punctul 7.3 sau 7.4), tot restul de alicotă de test din extractul concentrat repus în suspensie, obţinut în conformitate cu indicaţiile din punctul 3.1.6 sau 3.2.5. Se folosesc doar plante ajunse în stadiul celei de-a doua sau a treia frunze, pînă la dezvoltarea completă a celei de-a treia frunze adevărate. Pentru a folosi integral extractul concentrat repus în suspensie şi pentru a asigura eficacitatea inoculării, sînt necesare între 15 şi 25 vinete pe eşantion pentru efectuarea procedurilor descrise în continuare.

7.2. Înainte de inoculare, vinetele nu trebuie udate timp de una sau două zile pentru a reduce presiunea turgescenţei.

7.3. Inocularea prin incizie

7.3.1. Se ţine planta între două degete şi se pune cu pipeta pe tulpină, între cotiledoane şi prima frunză, o picătură (în jur de 5–10 μl) de extract concentrat în suspensie.

7.3.2. Cu ajutorul unui scalpel steril se practică, plecînd de la picătura de extract concentrat, o incizie diagonală cu o lungime de 1,0 cm şi o adîncime aproximativ egală cu două treimi din grosimea tulpinii.

7.3.3. Se închide incizia cu vaselină sterilă, folosind o seringă.

7.4. Inocularea prin injecţie

Inocularea se practică în tulpini de vinete, chiar deasupra cotiledoanelor, cu ajutorul unei seringi dotate cu un ac hipodermic (nu mai puţin de 23 G). Eşantionul se repartizează între vinete.

7.5. Ca martori pozitivi, se inoculează cinci plante prin aceeaşi metodă (a se vedea punctul 7.3 sau 7.4) cu o suspensie apoasă care conţine între 10⁵ şi 10⁶ celule/ml dintr-o cultură cunoscută de C. m. ssp. Sepedonicu şi, în cazul în care este posibil, cu extract din tubercul infectat în mod natural (a se vedea secţiunea 4).

7.6. Ca martori negativi, se inoculează cinci plante prin aceeaşi metodă (a se vedea punctul 7.3 sau 7.4) cu o soluţie tampon sterilă de extract concentrat.

7.7. Se lasă plantele la incubat pînă la patru săptămîni la temperaturi între 18°C şi 24°C, în spaţii adaptate la condiţiile de carantină. În timpul incubaţiei se menţine o lumină suficientă şi un grad ridicat de umiditate (de la 70% la 80%), asigurînd o udare adecvată pentru a evita orice obturare hidrică sau veştejire. Celulele de C. m. ssp. sepedonicus nu rezistă la temperaturi mai mari de 30°C; temperatura ideală de cultură fiind de 21°C. Pentru a evita riscurile de contaminare, martorii pozitivi şi negativi se pun la incubat în seră sau fitotron pe etajere complet separate sau, în cazul în care spaţiul este limitat, se prevede o compartimentare riguroasă. În cazul în care plantele din eşantioane diferite trebuie să stea la incubat aproape unele de altele, plantele respective se vor separa cu ajutorul unor ecrane corespunzătoare. Se va acorda o mare atenţie evitării contaminării încrucişate în timpul fertilizării, al udării, al inspecţiilor şi în orice alt caz de manipulare. Este necesar să se evite prezenţa insectelor în sere sau fitotroane, deoarece sînt susceptibile de a răspîndi bacteria de la un eşantion la altul.

7.8. După o săptămînă, se examinează cu regularitate plantele pentru a identifica apariţia simptomelor. Se numără plantele care prezintă simptome. Agentul patogen C. m. ssp. sepedonicus provoacă la vînătă o veştejire a frunzelor, care se poate manifesta în primul rînd printr-o flaciditate pe margini sau între nervuri. La început, ţesutul veştejit poate lua o culoare verde-închis sau un aspect pestriţ, dar păleşte înainte de a se necroza. Veştejirile dintre nervuri prezintă adesea aspectul gras al ţesuturilor saturate cu apă. Ţesutul necrozat prezintă adesea o margine de culoare galben-viu. Plantele nu mor neapărat. Cu cît simptomele întîrzie să apară, cu atît şansele de supravieţuire sînt mai mari. Plantele pot învinge infecţia. Vinetele tinere sînt mult mai sensibile la populaţiile slabe de C. m. ssp. sepedonicus decît plantele mai în vîrstă, de aici apărînd necesitatea de a utiliza plante în stadiul celei de-a treia frunze sau chiar înaintea acestui stadiu.

Veştejirile mai pot fi provocate şi de populaţii de alte bacterii sau de ciuperci prezente în extractul concentrate de ţesut tubercular. Este vorba, printre altele, de Ralstonia solanacearum, de Erwinia carotovora ssp. Carotovora şi de E. carotovora ssp. atroseptica, de Erwinia chrysanthemi, de Phoma exigua var. foveata, precum şi de vaste populaţii de bacterii saprofite. Erwinia chrysanthemi, în special, poate induce la nivelul frunzelor simptome şi o veştejire foarte asemănătoare cu simptomele de C. m. ssp. sepedonicus, cu singura diferenţă că infecţiile cu Erwinia chrysanthemi provoacă o înnegrire a tulpinilor. Alte tipuri de veştejiri se disting de cele provocate de C. m. ssp. sepedonicus prin faptul că frunzele sau plantele întregi se ofilesc rapid. De asemenea, se poate recurge la o colorare Gram pentru a distinge C. m. ssp. sepedonicus de Erwinia spp.

7.9. Odată cu apariţia simptomelor la vinete, trebuie să se efectueze noi operaţiuni de izolare, pe baza segmentelor de ţesut care provin de la frunzele veştejite sau pe baza tulpinii plantei (pentru macerarea ţesuturilor, a se vedea punctul 3.1.3). Se dezinfectează suprafaţa frunzelor şi a tulpinilor de vînătă, frecîndu-le cu etanol la 70%. Se efectuează un test IF sau PCR pe seva de vînătă şi se trece la izolarea pe mediu adecvat (selectiv) (a se vedea secţiunea 8). De asemenea, este posibil să se prepare o colorare (a se vedea anexa I la prezenta anexă). Se identifică culturile pure de izolaţi presupuşi de C. m. ssp. sepedonicus şi li se confirmă patogenicitatea (a se vedea secţiunile 9 şi 10).

7.10. În anumite circumstanţe şi în special în cazul în care condiţiile de cultură nu sînt optime, C. m. ssp. sepedonicus poate fi prezent în vinete în stadiul de infecţie latentă, chiar şi după perioade de incubaţie care ajung pînă la patru săptămîni. În cazul în care după patru săptămîni nu se observă nici un simptom, se efectuează un test IF sau PCR pe o probă compozită de segmente de tulpini de 1 cm provenind de la fiecare plantă test, prelevate de deasupra punctului de inoculare. În cazul în care testul este pozitiv, se practică o nouă izolare pe un mediu adecvat (selectiv), în conformitate cu procedura expusă la secţiunea 8.

Se identifică culturile pure de izolaţi presupuşi de C. m. ssp. sepedonicus şi li se confirmă patogenicitatea (a se vedea secţiunile 9 şi 10).

7.11. Interpretarea rezultatelor testului biologic

Rezultatele testului biologic sînt valabile atunci cînd plantele care constituie martorul pozitiv prezintă simptome caracteristice, atunci cînd este posibil să se efectueze o nouă izolare a bacteriilor pe plantele în cauză şi atunci cînd nu se observă nici un simptom pe martorii negativi.

Testul biologic este negativ în cazul în care plantele test nu sînt infectate cu C. m. ssp. sepedonicus, sub rezerva ca C. m. ssp. sepedonicus să fie evidenţiat pe martorii pozitivi.

Testul biologic este pozitiv în cazul în care plantele test sînt infectate cu C. m. ssp. sepedonicus.

8. Izolarea C. m. ssp. sepedonicus

1) Diagnosticul nu poate fi confirmat decît prin izolarea şi evidenţierea C. m. ssp. sepedonicus (a se vedea secţiunea 9), urmate de o validare printr-un test al puterii patogene (a se vedea secţiunea 10). Deşi este vorba de un organism dificil de izolat, izolarea este posibilă pe baza ţesutului care prezintă simptome de infecţie.

2) Organismul poate fi sufocat de bacterii saprofite cu creştere rapidă, ceea ce îl face dificil de izolat în mod direct pe baza extractului concentrat de ţesut de tubercul sau de tulpină (obţinut la punctul 3.1.6 sau 3.2.5). Izolarea directă a C. m. ssp. sepedonicus rămîne posibilă pe mediu selectiv şi pe baza unei diluţii adecvate de extract concentrat, repus în suspensie, de conuri de cartofi prelevat de la stolonul sau tulpina de cartof.

3) Izolările trebuie practicate pe toţi tuberculii sau pe toate segmentele de tulpini de cartofi şi pe toate vinetele care nu prezintă nici un simptom, dar pentru care testul IF sau PCR efectuat pe proba compozită (a se vedea punctul 7.10) a dat un rezultat pozitiv. După caz, tulpinile de vinete trebuie să fie macerate, în conformitate cu metoda descrisă la punctul 3.1.3.

4) Ca martori pozitivi, se prepară diluţii la a zecea parte dintr-o suspensie de 10⁶ ufc/ml de C. m. ssp. Sepedonicus (de exemplu NCPPB 4053 sau PD 406). Pentru a evita orice posibilitate de contaminare, martorii pozitivi se prepară la distanţă de probele care trebuie testate.

5) În cazul fiecărui lot de mediu selectiv nou preparat, trebuie să se verifice în ce măsură este adecvat pentru cultura agentului patogen înainte de a-l utiliza pentru testarea probelor de rutină.

6) Materialul de control se testează la fel ca probele.

8.1. Efectuarea investigaţiilor pe medii selective

8.1.1. Pe baza a 100 μl de alicotă de probă de extract concentrat de cartof repus în suspensie sau de sevă de vînătă, se efectuează diluţii la a zecea parte într-un tampon de extract concentrat (a se vedea anexa C la prezenta anexă).

8.1.2. Tentativele de izolare pe bază de extract concentrat nediluat de cartof se soldează, în general, cu eşecuri din cauza dificultăţilor pe care le prezintă cultura de Cms şi a concurenţei saprofitelor. Deoarece bacteria este în general prezentă în masă în ţesuturile infectate, cel mai adesea este posibil să se evacueze saprofitele prin diluţie, păstrînd totodată agentul patogen. Prin urmare, se recomandă să se recurgă la tehnica de desfăşurare pe lamă şi să se desfăşoare, cu ajutorul unui aplicator (“crosă de hockey”), 100 μl din fiecare probă, cu diluţii de 1/100–1/10000, pe un mediu MTNA sau NCP-88 (a se vedea anexa E la prezenta anexă).

O altă strategie poate consta în desfăşurarea alicotei iniţiale de 100 μl de extract concentrat de cartof pe o primă lamă de agar cu ajutorul unui aplicator, întinderea în striuri pe o a doua lamă a restului rămas pe aplicator şi repetarea procedurii pe o a treia lamă. Aplicatorul permite astfel ca pe lame să se obţină un efect de diluţie.

8.1.3. Se incubează lamele la adăpost de lumină şi la temperaturi cuprinse între 21°C şi 23°C.

8.1.4. Prima examinare a lamelor, cu numărarea, în raport cu lamele martori, a eventualelor colonii cu aspect asemănător cu C. m. ssp. sepedonicus trebuie să se efectueze după trei zile. Numărările ulterioare se vor efectua după cinci, şapte şi, în final, zece zile.

8.2. Purificarea coloniilor suspecte

Trebuie să se efectueze o repicare în mediu YGM a coloniilor cu aspect asemănător cu C. m. ssp. sepedonicus în scopul inoculării ulterioare a vinetelor şi/sau al identificării. Operaţiunea în cauză trebuie efectuată înainte ca pe lame să se dezvolte excesiv coloniile, respectiv, de preferinţă, după trei-cinci zile.

8.2.1. Se efectuează o însămînţare în striuri a coloniilor cu aspect asemănător cu C. m. ssp. sepedonicus, pe unul dintre următoarele medii (formulele figurează în anexa E la prezenta anexă):

a) agar nutritiv cu dextroză (numai pentru repicări);

b) agar cu drojdie, peptonă şi glucoză;

c) agar cu extract de drojdie şi săruri minerale.

Se lasă la incubat pînă la 10 zile la o temperatură cuprinsă între 21°C şi 24°C.

C. m. ssp. sepedonicus se multiplică lent şi produce, în general, în zece zile, colonii de dimensiunea şi de forma unui vîrf de ac, convexe şi de culoare crem.

8.2.2. Se însămînţează din nou în striuri pentru a obţine culturi pure.

Ratele de creştere sînt mai bune pentru repicări. Coloniile caracteristice sînt de culoare crem sau de culoarea fildeşului, uneori galbene, rotunjite, netede, umflate, convexe şi avînd o consistenţă mucoid-fluidă. Coloniile au margini bine conturate, iar diametrul lor se întinde în general de la 1 la 3 mm.

O simplă colorare Gram (a se vedea anexa I la prezenta anexă) poate ajuta la selectarea coloniilor în vederea efectuării testelor suplimentare.

8.2.3. Se identifică culturile presupuse (a se vedea secţiunea 9) şi se realizează un test al puterii patogene (a se vedea secţiunea 10).

9. Identificarea C. m. ssp. sepedonicus

Se identifică culturi pure de izolaţi presupuşi de C. m. ssp. sepedonicus utilizând cel puţin două dintre testele prezentate în continuare, bazate pe principii biologice diferite.

După caz, pentru fiecare test efectuat se includ suşe de referinţă cunoscute.

9.1. Teste de identificare de nutriţie şi enzimatice

Se determină caracteristicile fenotipice menţionate în continuare, care sînt în mod sistematic prezente sau absente la C. m. ssp. sepedonicus, în conformitate cu metodele lui Lellioti Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001) şi anonim (1987).

Toate mediile trebuie să incubeze la 21°C şi să fie examinate după şase zile. În cazul în care nu se constată nici o multiplicare, se lasă la incubat pînă la 20 de zile.

Fiecare test trebuie să includă o suşă cunoscută de C. m. ssp. sepedonicus ca martor. Testele de nutriţie şi cele fiziologice trebuie să fie efectuate pe un inoculat provenit de la repicări pe agar nutritiv. Comparaţiile morfologice trebuie să se efectueze pe baza culturilor pe agar nutritiv cu dextroză.

9.2. Testul de imunofluorescenţă (IF)

Se prepară o suspensie de aproximativ 10⁶ celule pe mililitru într-un tampon de imunofluorescenţă (a se vedea anexa C la prezenta anexă).

Se prepară o diluţie la jumătate dintr-un antiser adecvat.

Se urmează procedura testului de imunofluorescenţă (a se vedea secţiunea 4).

Pentru ca un test IF să fie pozitiv, titrul obţinut cu cultura trebuie să fie echivalent cu cel obţinut cu martorul pozitiv.

9.3. Testul PCR

Se prepară o suspensie de aproximativ 10⁶ celule pe mililitru în apă ultrapură.

Într-un bloc de încălzire sau într-o baie de apă fiartă se încălzesc 100 μl de suspensie în tuburi închise la 100°C timp de 4 minute. În cazul în care este necesar, adăugarea de NaOH proaspăt preparat cu o concentraţie finală de 0,05 M poate facilita liza celulelor. Probele pot fi depozitate la temperaturi între –16°C şi –24°C, pînă în momentul utilizării.

Se aplică procedurile PCR adecvate pentru a amplifica amplimerii specifici ai C. m. ssp. sepedonicus (de exemplu: Pastrik, 2000; a se vedea anexa D la prezenta anexă; Li şi de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik şi Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).

Identificarea C. m. ssp. sepedonicus este pozitivă atunci cînd amplimerii PCR au aceeaşi dimensiune şi prezintă aceleaşi polimorfisme de lungime ale fragmentelor de restricţie ca şi pentru suşa martor pozitivă.

9.4. Testul FISH

Se prepară o suspensie de aproximativ 10⁶ celule pe mililitru în apă ultrapură.

Se urmează procedura testului FISH (a se vedea secţiunea 5).

Testul FISH este pozitiv în cazul în care obţinem aceleaşi reacţii cu cultura şi martorul pozitiv.

9.5. Testul de profil al acizilor graşi (FAP)

Cultura se dezvoltă timp de 72 de ore la 21°C (+/–1°C) pe agar de soia tripticaz (Oxoid).

Se aplică o procedură de test FAP adecvată (Janse, 1991; Stead, 1992).

Pentru ca un test FAP să fie pozitiv, profilul culturii presupuse trebuie să fie identic cu cel al martorului pozitiv. Prezenţa acizilor graşi caracteristici 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 şi 17:0. Anteiso este puternic revelatoare de C. m. ssp. sepedonicus. Bacterii de alte tipuri, ca de exemplu Curtobacterium, Arthrobacter şi Micrococcus, posedă, de asemenea, unii dintre acizii menţionaţi, dar foarte rar 15:1 Anteiso A; în schimb, acidul menţionat este prezent la toate Clavibacter spp., la niveluri cuprinse între 1% şi 5%. În cazul C. m. ssp. sepedonicus, nivelul menţionat gravitează de obicei în jurul valorii de 5%.

9.6. Testul BOX-PCR

Se prepară o suspensie de aproximativ 10⁶ celule pe mililitru în apă ultrapură.

Se efectuează testul în conformitate cu procedura (Smith et al., 2001).

10. Testul de confirmare

Testul puterii patogene trebuie efectuat atît pentru a aduce confirmarea finală a unui diagnostic de C. m. ssp. sepedonicus, cît şi pentru a evalua virulenţa culturilor identificate ca fiind C. m. ssp. sepedonicus.

10.1. Se prepară un inoculum de aproximativ 10⁶ celule/ml pe baza unei culturi de trei zile a izolatului care trebuie testat şi a unei suşe martor pozitive corespunzătoare de C. m. ssp. sepedonicus.

10.2. Se inoculează 5–10 tulpini de plante tinere de vînătă în stadiul celei de-a treia frunze (a se vedea punctul 7.3 sau 7.4).

10.3. Se incubează tulpinile de plante la temperaturi cuprinse între 18°C şi 24°C, la o umiditate relativ ridicată, asigurînd o udare adecvată pentru a preveni obturarea hidrică sau stresul cauzat de secetă (a se vedea punctul 7.7.). În cazul culturilor pure, ar trebui să apară o veştejire tipică în două săptămîni. Cu toate acestea, plantele care nu prezintă simptome (a se vedea punctul 7.8.) la sfîrşitul perioadei menţionate trebuie lăsate în continuare la incubat pînă la trei săptămîni, la temperaturi favorabile creşterii vinetelor, dar care să nu depăşească 25°C (a se vedea anexa H la prezenta anexă). În cazul în care cultura nu prezintă simptome la sfîrşitul celor trei săptămîni, nu se poate confirma că este vorba despre o formă patogenă de C. m. ssp. sepedonicus.

10.4. Se asigură izolarea faţă de plantele simptomatice, prelevînd o secţiune de tulpină la o înălţime de 2 cm deasupra punctului de inoculare. Se reduce şi se pune în suspensie într-o cantitate mică de apă distilată sterilă sau de tampon fosfatat la 50 mM (a se vedea anexa C). Se izolează de suspensie, diluînd prin însămînţare simplă sau în striuri pe MTNA şi YPGA (a se vedea anexa E la prezenta anexă), se lasă la incubat timp de trei-cinci zile la o temperatură cuprinsă între 21°C şi 23°C, apoi se observă formarea coloniilor caracteristice de C. m. ssp. sepedonicus.

Anexa A

la anexa nr.1 la Măsurile privind

combaterea veştejirii bacteriene

a cartofului în Republica Moldova

Laboratoare care practică optimizarea

şi validarea protocoalelor

Anexa B

la anexa nr.1 la Măsurile privind

combaterea veştejirii bacteriene

a cartofului în Republica Moldova

Prepararea martorilor

pozitivi şi negativi pentru aplicarea la conuri a testelor de depistare PCR/IF şi FISH

Se pune în cultură timp de 72 de ore o suşă virulentă de C. m. ssp. sepedonicus (NCPPB 4053 sau PD 406) pe un mediu de bază MTNA şi se pune în suspensie într-un tampon fosfatat la 10 mM, astfel încît să se obţină o densitate celulară de aproximativ 1–2×10⁸ UFC pe mililitru. Aceasta corespunde, în general, unei suspensii uşor turbide care prezintă o densitate optică de 0,20–600 nm.

Se prelevează un con de stolon de la 200 de tuberculi dintr-o recoltă de varietate cu coajă albă, cunoscută ca fiind lipsită de C. m. ssp. sepedonicus, solanacearum.

Se tratează stolonii urmînd metoda obişnuită şi se repune extractul concentrat în suspensie de 10 mililitri.

Se varsă 900 μl de extract concentrat repus în suspensie în zece microfiole sterile de 1,5 ml.

Se însămînţează prima microfiolă cu 100 μl din suspensia de C. m. ssp. sepedonicus. Se omogenizează prin agitare.

Se stabilesc niveluri de contaminare la a zecea parte, urmînd diluţia în următoarele cinci microfiole.

Cele şase microfiole contaminate vor fi utilizate ca martori pozitivi. Cele patru microfiole necontaminate vor fi utilizate ca martori negativi. Microfiolele se etichetează în consecinţă.

Se prepară alicote de 100 μl în microfiole sterile de 1,5 ml, astfel încît să se obţină nouă replici ale fiecărei probe martor. Se depozitează la temperaturi între –16 şi –24°C pînă în momentul utilizării.

Prezenţa şi cuantificarea C. m. ssp. sepedonicus în probele martori trebuie confirmate în primul rînd printr-un test de imunofluorescenţă.

Pentru testul PCR, se extrage ADN pe baza probelor martori pozitivi şi negativi din fiecare serie de probe.

Pentru testele IF şi FISH, se efectuează încercări pe probele martori pozitivi şi negativi ai fiecărei serii de probe.

În cazul testelor IF, FISH şi PCR, C. m. ssp. sepedonicus trebuie detectat la martorii pozitivi la cel puţin 10⁶ şi 10⁴ celule/ml şi trebuie să lipsească complet la martorii negativi.

Anexa C

la anexa nr.1 la Măsurile privind

combaterea veştejirii bacteriene

a cartofului în Republica Moldova

Tampoane pentru procedurile de testare

Tampoanele sterilizate care nu sînt deschise pot fi depozitate timp de maximum un an.

1. Tampoane pentru procedura de extragere

1.1. Tampon de extragere (tampon fosfatat la 50 mM, pH 7,0)

Tamponul menţionat este utilizat pentru extragerea, prin omogenizare sau agitare, a bacteriei prezente în ţesuturile plantei.

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează cu autoclavă timp de 15 minute la 121°C.

Următorii aditivi pot fi utili:

1.2. Tampon de extract concentrat (tampon fosfatat la 10 mM, pH 7,2)

Tamponul menţionat este utilizat pentru repunerea în suspensie şi diluţia extractelor de stoloni de tuberculi de cartofi concentraţi prin centrifugare.

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează cu autoclavă timp de 15 minute la 121°C.

2. Tampoane pentru testele de imunofluorescenţă

2.1. Tampon IF (tampon cu fosfat la 10 mM, pH 7,2)

Tamponul menţionat este utilizat pentru diluţia anticorpilor.

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează cu autoclavă timp de 15 minute la 121°C.

2.2. Tampon IF-Tween

Tamponul menţionat este utilizat pentru spălarea lamelor.

Se adaugă 0,1% Tween 20 la tamponul IF.

2.3. Glicerol tamponat cu fosfat, pH 7,6

Tamponul menţionat este utilizat ca lichid de suport pe ferestrele lamelor IF pentru a întări fluorescenţa.

Soluţiile suport antidecolorare sînt disponibile în comerţ: de exemplu Vectashield ® (Vector Laboratories) sau Citifluor ® (Leica).

Anexa D

la anexa nr.1 la Măsurile privind

combaterea veştejirii bacteriene

a cartofului în Republica Moldova

Determinarea gradului de contaminare

în cadrul testelor IF şi FISH

1. Se află numărul mediu de celule fluorescente caracteristice pe cîmp (c).

2. Se calculează celulele fluorescente caracteristice pe fereastră de lamă de microscop (C).

C = c × S/s,

unde:

S = suprafaţa (S) ferestrei unei lame cu multe godeuri;

s = suprafaţa cîmpului obiectivului

s = πi²/4G²K²,

unde:

i = coeficientul cîmpului (depinde de tipul de ocular şi variază de la 8 la 24)

K = coeficientul fiolei (1 sau 1,25);

G = mărirea obiectivului (de 100 de ori, de 40 de ori etc.).

3. Se calculează celulele fluorescente caracteristice pe mililitru de extract concentrat repus în suspensie (N)

N = C × 1000/y × F,

unde:

y = volumul de extract concentrat repus în suspensie pe fiecare fereastră;

F = factorul de diluţie al extractului concentrat repus în suspensie.

Anexa E

la anexa nr.1 la Măsurile privind

combaterea veştejirii bacteriene

a cartofului în Republica Moldova

Medii de izolare şi de cultură ale C. m. ssp. sepedonicus

1. Medii de cultură de tip general

Agar nutritiv

Se dizolvă ingredientele şi se sterilizează cu autoclavă timp de 15 minute la 121°C.

Agar nutritiv cu dextroză

Agar nutritiv Difco Bacto care conţine 1% D-glucoză (monohidrat). Se sterilizează cu autoclavă la 115°C timp de 20 de minute.

Agar cu drojdie, peptonă şi glucoză (YPGA)

Se dizolvă ingredientele şi se sterilizează cu autoclavă la 121°C timp de 15 minute.

Mediu de cultură cu extract de drojdie şi săruri minerale (YGM)

Se dizolvă ingredientele şi se sterilizează cu o jumătate de litru de autoclavă timp de 20 de minute la 115°C.

2. Medii de creştere selective validate

Mediu MTNA

Cu excepţia unor menţiuni contrare, toate ingredientele provin de la BDH.

Se dizolvă ingredientele şi se ajustează pH-ul la 7,2. După o trecere prin autoclavă (15 minute la 121°C) şi o răcire la 50°C, se adaugă antibioticele: trimetoprim 0,06 g, acid nalidixic 0,002 g, amfotericină B 0,01 g.

Soluţiile de antibiotice se depozitează după cum urmează: trimetoprimul (Sigma) şi acidul nalidixic (Sigma) (ambele la 5 mg/ml) în metanol la 96%; amfotericina B (Sigma) (1 mg/ml) în dimetilsulfoxid. Soluţiile depozitate sînt sterilizate prin filtrare.

Mediul bazal se conservă timp de trei luni. După adăugarea antibioticelor, mediul se conservă o lună în atmosferă refrigerată.

Mediu NCP-88

Se dizolvă ingredientele şi se ajustează pH-ul la 7,2. După o trecere prin autoclavă şi răcire la 50°C, se adaugă următoarele antibiotice: sulfat de polimixină B (Sigma) 0,003 g, acid nalidixic (Sigma) 0,008 g, cicloheximidă (Sigma) 0,2 g.

Antibioticele se dizolvă în soluţii-mamă: acidul nalidixic în NaOH la 0,01 M; cicloheximida în etanol la 50%, sulfatul de polimixină B în apă distilată. Soluţiile depozitate sînt sterilizate prin filtrare.

Mediul bazal se conservă timp de trei luni. După adăugarea antibioticelor, mediul se conservă o lună în atmosferă refrigerată.

Anexa F

la anexa nr.1 la Măsurile privind

combaterea veştejirii bacteriene

a cartofului în Republica Moldova

Protocol şi reactivi PCR validaţi

Testele preliminare trebuie să permită detectarea reproductibilă a cel puţin 10³–10⁴ celule de C. m. ssp. sepedonicus pe mililitru de extract de probă.

De asemenea, testele preliminare nu trebuie să arate nici un fals rezultat pozitiv cu o gamă de suşe bacteriene selecţionate.

1. Protocol PCR multiplex cu control PCR intern (Pastrik, 2000)

1.1. Oligonucleotide primeri

Dimensiunea prevăzută a amplimerului matricei de ADN de C. m. ssp. sepedonicus = 502 bp (în prezenţa primerului PSA).

Dimensiunea prevăzută a amplimerului controlului PCR intern 18S rRNA = 377 bp (în prezenţa primerului NS).

1.2. Amestec reactiv destinat PCR

1.3. Condiţii ale reacţiei PCR

Se execută următorul program:

Acest program a fost optimizat pentru o utilizare cu un termociclu MJ Research PTC 200. Poate fi necesară modificarea etapelor ciclurilor b), c), d), e), f) şi g) pentru utilizarea cu alte modele.

1.4. Analiza restricţiei enzimatice a amplimerului

Produsele PCR amplificate ale ADN-ului C. m. ssp. sepedonicus produc un polimorfism distinct al lungimii fragmentelor de restricţie cu enzima Bgl II, după incubare la 37°C timp de 30 de minute. Fragmentele de restricţie obţinute pe baza fragmentului specific de C. m. ssp. sepedonicus au o lungime de 282 bp şi 220 bp.

2. Prepararea tamponului de încărcare

2.1. Bromofenol albastru (soluţie concentrată la 10%)

2.2. Tampon de încărcare

3. 10x tampon de EDTA (TAE) triacetat, pH 8,0

Înainte de utilizare se diluează pînă la 1x.

Disponibil şi în comerţ (de exemplu Invitrogen sau echivalent).

Anexa G

la anexa nr.1 la Măsurile privind

combaterea veştejirii bacteriene

a cartofului în Republica Moldova

Reactivi validaţi pentru testul FISH

1. Oligosonde

2. Soluţie de fixare

Se încălzesc 9 ml de apă pură moleculară (de exemplu apă ultrapură) la aproximativ 60°C şi se adaugă 0,4 g de paraformaldehidă. Paraformaldehida se dizolvă după ce s-au adăugat 5 picături de 1N NaOH şi se amestecă cu un agitator magnetic.

Se ajustează pH-ul la 7,0 adăugîndu-se 1 ml de tampon fosfatat la 0,1 M (PB; pH 7,0) şi 5 picături de 1N HCl.

Se verifică pH-ul cu bandele indicatoare şi se ajustează, în cazul în care este necesar, cu HCl sau NaOH.

Soluţia se filtrează printr-un filtru cu membrană de 0,22 μm şi se protejează de praf la 4°C pînă la utilizare.

Soluţie de fixare de înlocuire: etanol la 96%.

3. Hibmix 3x

Se diluează pînă la 1x, după caz.

4. Soluţie de hibridizare

Hibmix 1x

Se prepară cantităţi de soluţie de hibridizare, respectînd calculele din tabelul de mai jos. Pentru fiecare lamă (care conţine 2 probe diferite în duplicat), sînt necesari 90 μl de soluţie de hibridizare.

Cantităţi sugerate pentru prepararea amestecului de hibridizare

5. Tampon fosfatat 0,1 M, pH 7,0

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează cu autoclavă timp de 15 minute la 121°C.

Anexa H

la anexa nr.1 la Măsurile privind

combaterea veştejirii bacteriene

a cartofului în Republica Moldova

Culturi de vinete

Se seamănă seminţe de vinete (Solanum melongena) într-un pămînt de semănat pasteurizat. Atunci cînd cotiledoanele sînt complet dezvoltate (10–14 zile), plantulele se repică într-un pămînt de replantat pasteurizat.

Vinetele trebuie cultivate în seră în următoarele condiţii:

durata zilei – 14 ore sau durata naturală a zilei, în cazul în care este mai mare;

temperatura:

ziua – 21–24°C

noaptea – 15°C.

Anexa I

la anexa nr.1 la Măsurile privind

combaterea veştejirii bacteriene

a cartofului în Republica Moldova

Procedura pentru reacţia Gram

(modificarea lui Hucker) (Doetsch, 1981)

1. Soluţia de violet cristalizat se obţine astfel:

se dizolvă 2 g de violet cristalizat în 20 ml de etanol la 95%;

se dizolvă 0,8 g de oxalat de amoniu în 80 ml de apă distilată;

se amestecă cele două soluţii.

2. Soluţia iodo-iodurată a lui Lugol se prepară din:

substanţele solide se zdrobesc împreună cu ajutorul unui pistil şi al unui mojar;

se adaugă apa şi se amestecă într-un recipient închis pentru a se dizolva.

3. Soluţia colorantă de safranină se prepară din:

soluţie-mamă:

Se amestecă şi se depozitează.

Se diluează în raport 1:10 pentru a obţine o soluţie de lucru.

4. Procedura de colorare respectă următoarele etape:

se prepară frotiurile, se usucă la aer şi se fixează la căldură;

se scufundă lama în soluţia de cristal violet timp de un minut;

se spală rapid cu apă curentă;

se scufundă în soluţia iodo-iodurată a lui Lugol timp de un minut;

se spală cu apă de robinet şi se usucă cu hîrtia sugativă;

se decolorează adăugînd picătură cu picătură etanol la 95%, pînă cînd nu îşi mai modifică culoarea sau scufundînd în etanol timp de 30 de secunde şi agitînd uşor;

se spală cu apă de robinet şi se usucă cu hîrtia sugativă;

se scufundă în soluţia de safranină timp de 10 secunde;

se spală cu apă de robinet şi se usucă cu hîrtia sugativă;

Bacteriile Gram pozitive au o culoare violet-albastră; bacteriile Gram negative au o culoare roz-roşie.

Anexa nr.2

la Măsurile privind combaterea

veştejirii bacteriene a cartofului

în Republica Moldova

1. În toate cazurile de apariţie suspectată pentru care s-a constatat, în urma testului sau testelor de depistare efectuate în conformitate cu metodele descrise în anexa nr.1 la Măsurile privind combaterea veştejirii bacteriene a cartofului în Republica Moldova, o reacţie pozitivă care trebuie infirmată sau confirmată prin aplicarea procedurilor menţionate, trebuie să se păstreze şi să se conserve în condiţii adecvate:

toţi tuberculii care fac parte din eşantion şi, în măsura posibilului, toate plantele care fac parte din eşantion;

orice extract rezidual şi material suplimentar preparat pentru testul sau testele de depistare, precum lamele preparate pentru testele de imunofluorescenţă şi orice documentaţie relevantă, pînă la încheierea respectivelor proceduri.

După caz, conservarea tuberculilor va permite testarea varietăţilor.

2. În cazul confirmării prezenţei organismului, trebuie să se păstreze şi să se conserve în condiţii adecvate:

materialul menţionat la pct.1;

o probă de vînătă infectată prin inoculare cu extract de tubercul sau de plantă;

cultura izolată a organismului timp de cel puţin o lună după procedura de notificare prevăzută la pct.11 din Măsurile privind combaterea veştejirii bacteriene a cartofului în Republica Moldova.

Anexa nr.3

la Măsurile privind combaterea

veştejirii bacteriene a cartofului

în Republica Moldova

1. Pentru a determina extinderea contaminării probabile menţionate la pct.10 subpct.2) din prezentele Măsuri trebuie să se ia în considerare următoarele elemente:

a) tuberculii sau plantele cultivate într-un loc de producţie declarat contaminat în temeiul pct.10 subpct.1 din Măsuri;

b) locul (locurile) de producţie care au în sistemul de producţie o legătură cu tuberculii sau plantele care au fost declarate contaminate în temeiul pct.10 subpunctul 1) din prezentele Măsuri, inclusiv cele care folosesc acelaşi echipament şi aceleaşi instalaţii de producţie în mod direct sau prin intermediul unui antreprenor comun;

c) tuberculii sau plantele produse în locul sau locurile de producţie menţionat(e) la lit.b) sau prezente în locul (locurile) respectiv(e) în perioada în care tuberculii sau plantele declarate contaminate în temeiul pct.10 subpct.1) din prezentele Măsuri erau prezente în locurile de producţie menţionate la lit.a);

d) instalaţiile unde sînt manipulaţi cartofii care provin din locurile de producţie menţionate anterior;

e) orice material, vehicul, recipient, antrepozit sau parte a acestora, precum şi orice alt obiect, inclusiv ambalajul, care este posibil să fi fost în contact cu tuberculii sau plantele declarate contaminate în conformitate cu pct.10 subpct.1) din prezentele Măsuri;

f) orice tubercul sau plantă depozitată în sau în contact cu unul dintre elementele sau obiectele menţionate la lit.e), înainte de curăţarea şi dezinfectarea acestora;

g) în urma testelor menţionate la pct.12 din prezentele Măsuri, tuberculii sau plantele care au o legătură clonală sau parentală cu tuberculii sau plantele declarate contaminate în conformitate cu pct.10 subpct.1) din Măsuri şi pentru care, deşi rezultatele testelor referitoare la prezenţa organismului au fost negative, se pare că este probabilă contaminarea prin intermediul unei legături clonale. Se poate efectua un test asupra varietăţilor pentru a identifica identitatea tuberculilor sau a plantelor contaminate care au o astfel de legătură clonală;

h) locul (locurile) de producţie a tuberculilor sau a plantelor menţionate la lit.g).

2. Pentru a determina posibila răspîndire menţionată la pct.10 subpct.3 din prezentele Măsuri, trebuie să se ia în considerare următoarele elemente:

a) apropierea de alte locuri de producţie unde se cultivă cartofi sau alte plante gazdă;

b) producţia şi utilizarea comună a stocurilor de cartofi de sămînţă.

3. Notificarea menţionată la pct.11 subpct.1 din prezentele Măsuri cuprinde:

imediat după confirmarea prezenţei organismului prin teste de laborator efectuate în conformitate cu metodele prevăzute în anexa nr.1 la prezentele Măsuri, minimum:

denumirea varietăţii lotului de cartofi;

tipul (păstrare, seminţe etc.) şi, după caz, categoria de seminţe de cartofi;

atunci cînd există riscul de contaminare a cartofilor proveniţi dintr-unul sau mai multe state, organul de control fotosanitar comunică imediat organului similar din statul sau statele respective informaţiile care le-a permis să acţioneze în conformitate cu pct.11 subpct.1) din prezentele Măsuri, respectiv:

denumirea varietăţii lotului de cartofi;

numele şi adresa expeditorului şi destinatarului;

data livrării lotului de cartofi;

volumul lotului de cartofi livrat;

după caz, o copie a paşaportului fitosanitar sau cel puţin numărul paşaportului fitosanitar, precum şi, după caz, numărul de înregistrare al producătorului sau al comerciantului şi o copie a bonului de livrare.

Autorităţii publice centrale în domeniul agriculturii i se notifică imediat informaţiile menţionate mai sus.

După încheierea tuturor investigaţiilor, pentru fiecare caz:

data la care s-a confirmat contaminarea;

o scurtă descriere a investigaţiilor desfăşurate în scopul de a identifica sursa şi posibila răspîndire a contaminării, precizînd nivelul de eşantionare aplicat;

informaţii privind sursa sau sursele identificate sau presupuse ale contaminării;

precizări ale întinderii contaminării declarate, inclusiv numărul de locuri de producţie şi numărul de loturi, cu indicarea varietăţii şi, în cazul în care este vorba despre cartofi de sămînţă, a categoriei;

precizări asupra delimitării zonei, inclusiv numărul de locuri de producţie nedeclarate ca fiind contaminate, dar incluse în zonă;

toate celelalte informaţii pe care autoritatea publică centrală în domeniul agriculturii le-ar putea solicita, referitoare la focarul sau focarele declarate.

Anexa nr.4

la Măsurile privind combaterea

veştejirii bacteriene a cartofului

în Republica Moldova

1. Măsurile sub control oficial, menţionate la pct.14 din prezentele Măsuri în conformitate cu art.12 alin.(4) din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară sînt următoarele:

a) utilizarea ca aliment destinat animalelor după un tratament termic de natură să elimine orice risc de supraveţuire a agentului patogen; sau

b) descărcarea într-un loc de eliminare a deşeurilor, care nu prezintă nici un risc identificabil de propagare a agentului patogen în mediu, de exemplu, prin infiltrare în terenuri agricole; sau

c) incinerarea; sau

d) transformarea industrială prin livrare directă şi imediată la o întreprindere de transformare care dispune de instalaţii de eliminare a deşeurilor, despre care s-a stabilit că nu prezintă nici un risc identificabil de propagare a organismului, precum şi de un sistem care să permită curăţarea şi dezinfectarea cel puţin a vehiculelor care părăsesc întreprinderea; sau

e) alte măsuri, în măsura în care s-a stabilit că acestea nu prezintă nici un risc identificabil de propagare a organismului.

Toate deşeurile care rămîn la încheierea operaţiilor menţionate anterior sau care rezultă din operaţiile respective sînt eliminate, urmînd metodele aprobate oficial, în conformitate cu anexa nr.5 la prezentele Măsuri.

2. Utilizarea sau eliminarea adecvată a tuberculilor sau a plantelor declarate ca fiind probabil contaminate în temeiul pct.10 subpct.2) din prezentele Măsuri şi menţionate la pct.15 din Măsuri sub controlul organului de control fitosanitar, precum şi acordul autorităţii publice centrale în domeniul agriculturii că cartofii trebuie ambalaţi sau transformaţi, cu privire la instalaţiile de eliminare a deşeurilor menţionate la lit.a) şi b) implică:

a) utilizarea cartofilor depozitaţi pentru consum, în ambalaje prevăzute pentru livrare şi utilizare directe, care nu necesită reambalare, într-un loc care dispune de instalaţii adecvate de eliminare a deşeurilor. Cartofii pentru plantare nu pot fi manipulaţi în acelaşi loc decît separat sau după curăţare şi dezinfectare; sau

b) utilizarea cartofilor pentru consum, destinaţi transformării industriale după livrare directă şi imediată la o întreprindere de transformare care dispune de instalaţii adecvate de eliminare a deşeurilor, precum şi de un sistem care permite curăţarea şi dezinfectarea cel puţin a vehiculelor care părăsesc întreprinderea; sau

c) un alt mod de utilizare sau eliminare, în măsura în care s-a stabilit că nu există nici un risc identificabil de propagare a organismului şi sub rezerva acordului organului de control fitosanitar.

3. Metodele adecvate de curăţare şi de dezinfectare a obiectelor menţionate la pct.16 din prezentele Măsuri sînt cele despre care s-a stabilit că nu prezentau nici un risc identificabil de propagare a organismului; acestea sînt aplicate sub supravegherea organului de control fitosanitar.

4. Măsurile care trebuie puse în aplicare de către organul de control fitosanitar în zona delimitată, stabilite în temeiul pct.10 subpct.3) şi menţionate la pct.17 din prezentele Măsuri cuprind următoarele acţiuni:

4.1. La locurile de producţie declarate contaminate în temeiul art.9 alin.(3) din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară şi al pct.10 subpct.1) din prezentele Măsuri:

1) într-un teren declarat contaminat în temeiul pct.10 subpct.1) din prezentele Măsuri:

a) cel puţin pe durata celor trei ani de recoltă de după anul de recoltă al contaminării declarate:

se iau măsuri în vederea eliminării culturilor spontane de cartofi şi de alte plante gazde ale organismului;

nu se plantează şi nu se seamănă nici un tubercul, plantă sau sămînţă de cartof, nici o altă plantă-gazdă a organismului şi nici o cultură pentru care există un risc identificat de propagare a organismului;

în timpul primului an de recoltă a cartofilor, ulterior perioadei indicate în alineatul anterior şi cu condiţia ca terenul să fi fost declarat lipsit de culturi spontane de cartofi şi de alte plante-gazdă ale organismului timp de cel puţin doi ani de recoltă consecutivi înainte de plantare, nu se va planta decît producţia de cartofi pentru consum, iar tuberculii recoltaţi vor fi testaţi în conformitate cu procedura detaliată de anexa nr.1 la prezentele Măsuri;

în timpul sezonului de recoltă a cartofilor, ulterior celui menţionat în alineatul anterior şi după un ciclu adecvat de rotaţie, care este de doi ani în cazul culturilor de plante de cartofi, se plantează cartofi pentru producţia de seminţe sau cartofi de consum şi se efectuează cercetări oficiale, în conformitate cu pct.3 din prezentele Măsuri, sau

b) în timpul celor patru ani de recoltă care urmează după cel al contaminării declarate:

se adoptă măsuri în vederea eliminării culturilor spontane de cartofi şi de alte plante-gazdă ale organismului;

terenul este lăsat în paragină sau este transformat în păşune permanentă, caz în care este frecvent cosit la bază sau este transformat în păşune intensivă;

în timpul primului an de recoltă a cartofilor, ulterior perioadei indicate în alineatul anterior şi cu condiţia ca terenul să fi fost declarat lipsit de culturi spontane de cartofi şi de alte plante-gazdă ale organismului timp de cel puţin doi ani de recoltă consecutivi înainte de plantare, se cultivă producţia de seminţe sau de cartofi de consum, iar tuberculii recoltaţi vor fi testaţi în conformitate cu procedura detaliată din anexa 1 la prezentele Măsuri;

2) pe toate celelalte terenuri din locul de producţie contaminat şi cu condiţia ca organul de control fitosanitar să deţină certitudinea că riscul reprezentat de culturile spontane de cartofi şi de alte plante-gazdă ale organismului prezente în mod natural a fost eliminat:

în cursul anului de recoltă ulterior celui al contaminării declarate, nu se plantează şi nu se seamănă nici un tubercul, plantă sau sămînţă veritabilă de cartof şi nici o altă plantă-gazdă a organismului prezente în mod natural; sau

se pot răsădi plante de cartofi certificate în mod oficial în baza legii (Legea nr.160 din 22 iulie 2011 privind reglementarea prin autorizare a activităţilor de întreprinzător), exclusiv în vederea producţiei de cartofi de consum;

în cursul celui de-al doilea an de recoltă, ulterior anului de recoltă al contaminării declarate, sînt plantate doar seminţe certificate sau plante de cartofi care au fost supuse unei testări oficiale privind veştejirea bacteriană şi care au fost cultivate sub control oficial în alte locuri de producţie decît cele menţionate la punctul 4.1 din prezenta anexă, în vederea producţiei de seminţe sau de cartofi de consum;

cel puţin în timpul celui de-al treilea an de recoltă, ulterior anului de recoltă al contaminării declarate, se plantează doar plante de cartofi certificate sau plante de cartofi cultivate sub control oficial, pe baza plantelor de cartofi certificate, în vederea producţiei de cartofi de sămînţă sau pentru păstrare;

în timpul fiecăruia dintre anii de recoltă menţionaţi la punctele precedente, se iau măsuri pentru eliminarea culturilor spontane de cartofi, precum şi, după caz, de plante-gazdă ale organismului şi în fiecare teren cu cartofi se efectuează teste oficiale asupra cartofilor recoltaţi, în conformitate cu procedura detaliată în anexa nr.1 la prezentele Măsuri;

3) imediat după ce s-a declarat contaminarea în conformitate cu pct.10 subpct.1) din prezentele Măsuri şi după primul an de recoltă următor, tot materialul şi toate instalaţiile de depozitare prezente la locul de producţie şi implicate în producţia de cartofi sînt curăţate şi dezinfectate, după caz, folosind metode adecvate, în conformitate cu pct.3 din prezenta anexă;

4) într-o unitate de producţie în cultură protejată care permite înlocuirea completă a mediului de cultură:

nu se plantează şi nu se seamănă nici un tubercul, plantă sau sămînţă, decît în cazul în care unitatea de producţie a fost supusă unor măsuri sub control oficial avînd ca scop eliminarea organismului şi a tuturor plantelor-gazdă, inclusiv cel puţin înlocuirea completă a mediului de cultură, precum şi curăţarea şi dezinfectarea unităţii de producţie şi a tuturor echipamentelor şi în cazul în care organul de control fitosanitar acceptă ulterior unitatea pentru producţia de cartof, şi producţia de cartofi este rezultată din plante de cartofi certificate, din minituberculi sau din microplante provenite din surse testate.

4.2. În interiorul zonei delimitate, fără a aduce atingere măsurilor enumerate la punctul 4.1, organul de control fitosanitar:

1) solicită, de îndată după declararea contaminării, ca toate maşinile şi instalaţiile de depozitare situate în locul de producţie să fie curăţate şi, în cazul în care este necesar, dezinfectate, în conformitate cu metodele adecvate menţionate la punctul 3 din prezenta anexă;

2) imediat după declararea contaminării şi timp de cel puţin trei perioade de vegetaţie:

solicită subdiviziunilor teritoriale să supravegheze instalaţiile de cultură, depozitarea şi întreţinerea tuberculilor de cartofi, precum şi sediile întreprinderilor care exploatează prin contract materialul utilizat în cultura cartofului;

solicită ca în zona respectivă să fie plantate doar seminţe certificate sau seminţe cultivate sub control oficial, pentru toate culturile de cartofi, iar cartofii de sămînţă recoltaţi din locurile de producţie declarate ca fiind probabil contaminate în temeiul pct.10 subpct.2) din prezentele Măsuri să fie testaţi;

solicită, în cazul tuturor instalaţiilor din zonă, ca stocurile de cartofi de sămînţă recoltaţi şi stocurile de plante de cartofi pentru păstrare să fie depozitate separat sau să se pună în aplicare un sistem de curăţare şi de dezinfectare între păstrarea cartofilor de sămînţă şi cea a cartofilor pentru consum;

efectuează cercetări oficiale în conformitate cu pct.3 din prezentele Măsuri;

3) stabileşte, după caz, un program de înlocuire a tuturor stocurilor de cartofi de sămînţă în decursul unei perioade corespunzătoare.

Anexa nr.5

la Măsurile privind combaterea

veştejirii bacteriene a cartofului

în Republica Moldova

Pentru a preveni orice risc identificabil de propagare a organismului, locurile de eliminare a deşeurilor menţionate în pct.1 din anexa nr.4 la prezentele Măsuri respectă următoarele dispoziţii:

1) deşeurile de cartofi (inclusiv cartofii respinşi şi cojile) şi orice alt deşeu solid care are legătură cu cartofii (inclusiv pămîntul, pietrele şi alte resturi) sînt eliminate:

a) într-un loc de eliminare a deşeurilor, coordonat cu organul de control fitosanitar, care nu prezintă nici un risc identificabil de propagare a organismului patogen în mediul înconjurător, de exemplu prin infiltrare în terenuri agricole, deşeurile fiind transportate direct la locul respectiv în condiţii de izolare, care să prevină orice risc de pierdere; sau

b) prin incinerare; sau

c) prin alte măsuri dispuse de organul de control fitosanitar în temeiul art.4 alin.4 lit.g) din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară, în măsura în care s-a stabilit că măsurile respective nu prezintă nici un risc identificabil de propagare a organismului;

2) înainte de eliminare, efluenţii lichizi care conţin solide în suspensie sînt supuşi unui procedeu de filtrare sau de decantare pentru a extrage solidele respective. Solidele sînt eliminate în conformitate cu dispoziţiile pct.1).

Apoi, efluenţii lichizi sînt:

a) încălziţi complet la o temperatură de 60°C timp de cel puţin 30 de minute înainte de a fi eliminaţi; sau

b) eliminaţi într-un alt mod, sub rezerva acordului oficial şi sub control oficial, astfel încît să nu existe nici un risc identificabil ca deşeurile să intre în contact cu terenuri agricole.

Procedurile descrise în prezenta anexă se aplică în egală măsură şi deşeurilor legate de manipularea, eliminarea şi tratarea loturilor contaminate.

Anexa nr.14

la Hotărîrea Guvernului

nr.558 din 22 iulie 2011

MĂSURILE

privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

Măsurile privind controlul bacteriei Ralstonia Solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. în Republica Moldova (în continuare – Măsuri) transpun Directiva 98/57/CE a Consiliului din 20 iulie 1998, privind controlul Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., publicată în Jurnalul Oficial L 235 din 21 august 1998, modificată şi completată prin Directiva 2006/63/CE a Comisiei din 14 iulie 2006 de modificare a anexelor II-VII la Directiva 98/57/CE a Consiliului privind combaterea Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., publicată în Jurnalul Oficial L 206 din 27 iulie 2006.

1. Prezentele Măsuri stabilesc acţiunile care trebuie întreprinse în Republica Moldova împotriva răspîndirii bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. – agentul patogen al putregaiului brun al cartofului şi al ofilirii bacteriene la cartofi şi tomate, în scopul:

1) localizării şi determinării distribuţiei;

2) prevenirii apariţiei şi răspîndirii;

3) împiedicării răspîndirii şi efectuării controlului în vederea eradicării, dacă a fost semnalată.

2. În sensul prezentelor Măsuri, noţiunile utilizate se definesc după cum urmează:

1) organism – bacteria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al;

2) material de plantare – plantele-gazdă ale organismului enumerate în secţiunea I din anexa nr.1 la prezentele Măsuri.

3. Organul de control fitosanitar, respectiv subdiviziunile teritoriale, în temeiul art.4 din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară, efectuează inspecţii oficiale sistematice anuale în scopul depistării organismului asupra materialului de plantare originar din teritoriul de activitate:

1) identifică alte posibile surse de contaminare care ameninţă producţia materialului de plantare, efectuează o evaluare a riscului şi, cu excepţia cazului în care în timpul evaluării nu se identifică nici un risc de răspîndire a organismului, desfăşoară inspecţii în zonele de producţie a materialului de plantare pentru detectarea organismului asupra altor plante decît materialul de plantare prevăzut la pct.2, inclusiv asupra plantelor-gazdă solanacee sălbatice, precum şi asupra apei de suprafaţă, utilizate la irigarea materialului de plantare, asupra deşeurilor lichide provenite din procesările industriale sau din locurile de ambalare, manipulare a materialului de plantare şi utilizate pentru irigarea sau stropirea materialului de plantare. În funcţie de riscul identificat se determină extinderea inspecţiilor prevăzute la pct.1;

2) desfăşoară inspecţii oficiale pentru detectarea organismului pe materiale, cum ar fi mediul de creştere, sol şi deşeuri solide rezultate din procesările industriale sau locurile de ambalare.

4. Inspecţiile oficiale prevăzute la pct.3 şi în temeiul articolului 9 din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară sînt efectuate:

1) asupra materialului de plantare, în conformitate cu prevederile pct.1 al secţiunii 2 din anexa nr.1 la prezentele Măsuri;

2) asupra plantelor-gazdă, altele decît materialul de plantare prevăzut la punctul 2, şi asupra apei, inclusiv asupra deşeurilor lichide, şi, dacă este cazul, sînt prelevate probe şi supuse testelor de laborator oficiale sau oficial supravegheate, în conformitate cu metodele corespunzătoare;

3) după caz, asupra altor materiale, în conformitate cu metodele corespunzătoare.

5. Detaliile suplimentare cu privire la procedurile de inspecţie, în conformitate cu art.9 din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară şi numărul, originea, stratificarea şi perioada prelevării probelor sînt elaborate de organul de control fitosanitar, pe baza principiilor ştiinţifice, statistice şi a biologiei organismului, luînd în considerare sistemul particular de producţie a materialului vegetal şi, după caz, al altor plante-gazdă ale organismului.

6. Detaliile şi rezultatele inspecţiilor oficiale prevăzute la pct.3 trebuie notificate anual autorităţii publice centrale în domeniul agriculturii, în conformitate cu prevederile pct.2 al secţiunii II din anexa nr.1 la prezentele Măsuri. Aceste notificări sînt prezentate pînă la 1 iunie, cu excepţia celor referitoare la cartofii de sămînţă obţinuţi din propria exploataţie, pentru care notificarea este prezentată pînă la 1 septembrie. Detaliile şi rezultatele recoltelor se referă la producţia anului precedent. Detaliile acestor notificări pot fi prezentate Secretariatului Organizaţiei Europene şi Mediteraneene pentru Protecţia Plantelor (OEPP).

7. Organul de control fitosanitar asigură ca apariţia suspectată sau prezenţa confirmată a organismului pe teritoriul de activitate să fie comunicată autorităţii publice centrale în domeniul agriculturii.

8. În cazul unei apariţii suspectate a organismului, organul de control fitosanitar asigură efectuarea testelor de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizînd pentru materialul de plantare metoda corespunzătoare, conform anexei nr.2 la prezentele Măsuri şi în conformitate cu condiţiile prevăzute pct.1 din anexa nr.3 la prezentele Măsuri sau, în toate celelalte cazuri, orice altă metodă aprobată oficial, în scopul confirmării sau infirmării apariţiei suspectate a organismului. În cazul confirmării prezenţei organismului, se aplică prevederile pct.2 din anexa nr.3 la prezentele Măsuri.

9. În aşteptarea confirmării sau infirmării apariţiei suspectate a organismului conform pct.8 şi în temeiul art.12 din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară, în cazurile de apariţie suspectată în care:

1) s-au constatat simptome de diagnostic cauzate de organism şi un rezultat pozitiv prin testul/testele de depistare conform pct.1 al secţiunii I şi secţiunii II din anexa nr.2 la prezentele Măsuri; sau

2) a fost identificat un rezultat pozitiv prin testul/testele de depistare conform pct.2 al secţiunii I şi secţiunii III din anexa nr.2 la prezentele Măsuri, organul de control fitosanitar:

a) interzice circulaţia plantelor şi tuberculilor din toate recoltele, loturile sau transporturile din care au fost prelevate probele, aceasta putîndu-se face doar sub control oficial şi cu condiţia să se fi stabilit că nu există nici un risc identificabil de răspîndire a organismului;

b) aplică măsurile necesare pentru identificarea originii apariţiei suspectate;

c) introduce măsuri de precauţie suplimentare adecvate, bazate pe gradul de risc estimat, în special în legătură cu producţia materialului de plantare şi cu circulaţia loturilor de cartofi de sămînţă, alţii decît cei prevăzuţi la lit.a) subpct.2), produşi la locul de producţie de unde s-au prelevat probele prevăzute la subpct.2) lit.a), în scopul prevenirii oricărei răspîndiri a organismului.

10. În cazurile apariţiilor suspectate şi existenţei unui risc de contaminare a materialului de plantare sau a apei de suprafaţă a unui alt stat vecin (state vecine) organul de control fitosanitar notifică de îndată, în conformitate cu riscul identificat, detaliile apariţiei suspectate organului similar altui stat sau altor state vecine.

11. În cazul în care în urma testelor de laborator oficiale sau oficial supravegheate efectuate pentru materialul de plantare în conformitate cu metoda prevăzută în anexa nr.2 la prezentele Măsuri sau în toate celelalte cazuri, cu orice altă metodă aprobată oficial, se confirmă prezenţa organismului într-o probă prelevată în conformitate cu prezentele Măsuri, organul de control fitosanitar, avînd în vedere principiile ştiinţifice fundamentate, biologia organismului şi producţia specifică, comercializarea şi sistemele de procesare a plantelor-gazdă ale organismului, în temeiul prevederilor arti.9 şi 12 ale Legii nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară, dispune următoarele măsuri:

1) în cazul materialului de plantare, organul de control fitosanitar:

a) deschide o investigaţie pentru determinarea extinderii şi sursei sau surselor primare de contaminare, în conformitate cu prevederile anexei nr.4 la prezentele Măsuri, cu testări suplimentare în conformitate cu pct.8, cel puţin asupra stocurilor de cartofi de sămînţă înrudiţi prin donare; şi

b) desemnează ca fiind contaminate materialul de plantare, transportul şi/sau lotul din care s-a prelevat proba şi utilajele, vehiculul, vasul, depozitul sau părţi din acestea şi orice alte obiecte, inclusiv materialul de ambalare care a venit în contact cu materialul de plantare din care a fost prelevată proba;

c) desemnează ca fiind contaminate, dacă este cazul, cîmpul sau cîmpurile, unitatea ori unităţile de producţie de culturi protejate şi locul sau locurile de producţie de unde s-a recoltat materialul de plantare şi din care a fost prelevată proba;

d) pentru probele prelevate în perioada de vegetaţie desemnează ca fiind contaminate cîmpul sau cîmpurile, locul ori locurile de producţie şi, dacă este cazul, unitatea sau unităţile de producţie de culturi protejate din care a fost prelevată proba; şi

e) determină, în conformitate cu prevederile pct.1 din anexa nr.5, extinderea contaminării probabile prin contact înainte sau după recoltare, prin legături de producţie, irigare ori stropire sau printr-o înrudire clonală cu materialul desemnat contaminat; şi

f) demarchează o zonă pe baza desemnării contaminării, în conformitate cu prevederile lit.b), c) şi d), a determinării extinderii contaminării probabile în conformitate cu lit.e) şi a răspîndirii posibile a organismului, în conformitate cu prevederile pct.2 lit.a) din anexa nr.5 la prezentele Măsuri;

2) în cazul culturilor de plante-gazdă, altele decît cele prevăzute la subpct.1), la care producţia de material de plantare este identificată ca supusă riscului, organul de control fitosanitar:

a) deschide o investigaţie în conformitate cu prevederile subpct.1) lit.a); şi

b) desemnează ca fiind contaminate plantele-gazdă ale organismului de la care a fost prelevată proba; şi

c) determină contaminarea probabilă, demarchează o zonă în conformitate cu subpct.1) lit.e) şi, respectiv, lit.f), în legătură cu producţia de material de plantare.

3) în cazul apelor de suprafaţă, inclusiv al deşeurilor lichide provenite din procesările industriale sau din locurile de ambalare a materialului de plantare, şi pentru plantele-gazdă solanacee sălbatice asociate, acolo unde producţia de material de plantare este identificată ca supusă riscului prin irigaţie, stropire sau inundare cu apă de suprafaţă, organul de control fitosanitar:

a) deschide o investigaţie, inclusiv o inspecţie în perioade corespunzătoare, pentru probele prelevate din apele de suprafaţă şi, dacă sînt prezente, pentru plantele-gazdă solanacee sălbatice, în vederea stabilirii extinderii contaminării; şi

b) desemnează ca fiind contaminată apa de suprafaţă din care au fost prelevate proba sau probele, corespunzătoare extinderii contaminării şi în baza investigaţiilor efectuate în conformitate cu lit.a); şi

c) determină contaminarea probabilă şi demarchează o zonă pe baza desemnării contaminării în conformitate cu lit.b) şi a posibilei răspîndiri a organismului, ţinînd seama de prevederile anexei nr.5, pct.1 şi pct.2 la prezentele Măsuri;

4) organul de control fitosanitar notifică imediat organele similare din statele vecine şi alte state interesate, în conformitate cu dispoziţiile pct.3 din anexa nr.5 cu privire la orice contaminare desemnată în conformitate cu subpct.1) lit.b) şi subpct.3) lit.b) şi cu privire la detaliile demarcării zonei în conformitate cu subpct.1) lit.b) şi, dacă este cazul, în conformitate cu subpct.3) lit.c). Detaliile notificării, în conformitate cu prezentul alineat, pot fi prezentate Secretariatului Organizaţiei Europene şi Mediteraneene pentru Protecţia Plantelor (OEPP).

12. Materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat conform pct.11, subpct.1) lit.b), c) şi d) nu poate fi plantat şi de aceea, sub controlul organului de control fitosanitar, este supus uneia dintre dispoziţiile pct.1 din anexa nr.4 la prezentele Măsuri, astfel încît să nu existe nici un risc identificabil de răspîndire a organismului.

13. Materialul de plantare desemnat ca fiind probabil contaminat conform pct.11 subpct.1) lit.e) şi subpct.3) lit.c), inclusiv materialul de plantare pentru care a fost identificat un risc, produs în locuri de producţie desemnate ca probabil contaminate în conformitate cu pct.11 subpct.1) lit.e), nu poate fi plantat şi, sub controlul organului de control fitosanitar şi în temeiul cu art.12 din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară, este utilizat sau eliminat în conformitate cu pct.2 din anexa nr.6 la prezentele Măsuri, astfel încît să nu existe nici un risc identificabil de răspîndire a organismului.

14. Orice utilaj, vehicul, vas, depozit sau părţi din acestea şi orice alte obiecte, inclusiv materialul de ambalare desemnat ca fiind contaminat conform pct.11 subpct.1) lit.b), c) şi d) sau desemnat ca fiind probabil contaminat în conformitate cu prevederile pct.11 subpct.1) lit.e) şi subpct.3) lit.c), în temeiul art.12 din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară, este decontaminat sau distrus, utilizîndu-se metodele prevăzute în punctul 3 din anexa nr.6 la prezentele Măsuri. După decontaminare, nici un astfel de obiect nu mai este considerat ca fiind contaminat.

15. Fără a prejudicia măsurile implementate conform prevederilor pct.12-14, organul de control fitosanitar aplică în zona demarcată conform pct.11 subpunctul 1) lit.f) şi subpct.3) lit.c) o serie de măsuri conform prevederilor pct.4.1 şi 4.2 din anexa nr.6 la prezentele Măsuri. Detaliile acestor măsuri se notifică anual autorităţii administraţiei publice centrale în domeniul agriculturii

16. Cartofii de sămînţă trebuie să îndeplinească Cerinţele speciale pentru introducerea şi circulaţia plantelor, produselor vegetale şi altor obiecte pe teritoriul Republicii Moldova, aprobate prin Hotărîrea Guvernului nr.594 din 2 august 2011 şi să provină, în linie directă, dintr-un material obţinut în cadrul unui program aprobat oficial, găsit liber de organism în urma testelor de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizîndu-se metoda corespunzătoare prevăzută în anexa nr.2 la prezentele Măsuri.

17. Testarea prevăzută la punctul 16 este efectuată:

1) în cazurile în care a fost confirmată prezenţa organismului în producţia de cartofi de sămînţă, se testează:

a) materialul timpuriu de propagare, inclusiv clonele selectate iniţial şi clonele de bază de cartofi de sămînţă;

b) toate clonele de bază de cartofi de sămînţă sau materialul timpuriu de propagare, inclusiv clonele selectate iniţial, în cazurile în care s-a stabilit că nu există nici o relaţie clonală; şi

2) în alte cazuri, pe fiecare plantă obţinută din clonele selectate iniţial sau eşantioanele reprezentative de cartofi de sămînţă de bază ori materialul timpuriu de propagare.

18. Deţinerea şi manipularea organismului sînt interzise.

19. Prevederile pct.12-16 şi 18 ale prezentelor Măsuri nu se aplică pentru testări în scopuri ştiinţifice şi lucrări pentru selecţii varietale.

20. Autoritatea administraţiei publice centrale în domeniul agriculturii notifică orice prezenţă suspectă sau confirmată a organismului imediat ce este posibil Secretariatului Organizaţiei Europene şi Mediteraneene pentru Protecţia Plantelor (OEPP).

Anexa nr.1

la Măsurile privind controlul

bacteriei Ralstonia solanacearum

(Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

Secţiunea I

Lista plantelor-gazdă ale bacteriei Ralstonia

solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Plante (inclusiv tuberculi), altele decît seminţele propriu-zise de Solanum tuberosum L. – cartofi.

Plante, altele decît fructele şi seminţele de Lycopersicon lycopersicum (L.) Karsten ex. Farw – tomate.

Secţiunea II

Inspecţii

1. Inspecţiile prevăzute la pct.3 din prezentele Măsuri se bazează pe biologia organismului şi pe sistemele de producţie specifice şi cuprind:

1) în cazul cartofului:

în perioade corespunzătoare, inspecţia vizuală a culturii în creştere şi/sau prelevarea de probe atît de cartofi de sămînţă, cît şi de alte tipuri de cartofi în perioada de vegetaţie sau de depozitare. Aceste probe sînt supuse unei inspecţii vizuale prin secţionarea tuberculilor; şi

în cazul cartofilor de sămînţă şi, dacă este cazul, pentru alte tipuri de cartofi se efectuează teste de laborator oficiale sau oficial supravegheate, utilizînd metoda stabilită în anexa nr.2 la Măsuri;

2) în cazul tomatelor:

- inspecţia vizuală, în perioade corespunzătoare, cel puţin în perioada de vegetaţie a plantelor destinate replantării în scop profesional.

2. Notificarea inspecţiilor oficiale prevăzute la pct.6 din Măsuri include:

1) în cazul inspecţiilor asupra cartofilor:

suprafaţa totală estimată cultivată, în hectare, cu cartofi de sămînţă şi alte tipuri de cartofi;

stratificarea după categorie a cartofilor de sămînţă şi de consum şi, după caz, pe regiune;

numărul şi perioada de prelevare a probelor pentru testare;

numărul inspecţiilor vizuale de pe teren;

numărul de inspecţii vizuale asupra tuberculilor şi dimensiunea probei;

2) în cazul inspecţiilor la plantele de tomate destinate replantării în scop profesional, în perioada de vegetaţie:

numărul total estimat de plante;

numărul inspecţiilor vizuale;

3) în cazul inspecţiilor asupra plantelor-gazdă, altele decît cartofi şi tomate, inclusiv plante-gazdă solanacee sălbatice:

speciile;

numărul şi perioada prelevării probelor;

zona/rîul de unde au fost prelevate probele, acolo unde este cazul;

metoda de analiză;

4) în cazul inspecţiilor asupra apei şi deşeurilor lichide deversate din procesarea industrială sau din locurile de ambalare:

- numărul şi perioada prelevării probelor;

- zona/rîul/ locul de prelevare a probelor, acolo unde este cazul;

- metoda de analiză.

Anexa nr.2

la Măsurile privind controlul

bacteriei Ralstonia solanacearum

(Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

PROTOCOLUL DE TESTARE

pentru diagnosticarea, detectarea şi identificarea bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Domeniul de aplicare al protocolului de testare

Protocolul prezentat în continuare descrie diversele proceduri implicate în:

1) diagnosticarea putregaiului brun al tuberculilor de cartof şi a veştejirii bacteriene la plantele de cartof, tomate, precum şi la alte cîteva plante-gazdă;

2) detectarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de tuberculi de cartof, plante de cartof, tomate şi în alte plante-gazdă, în apă sau în sol;

3) identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum.

Principii generale

Protocoalele optimizate pentru diversele metode, validarea reactivilor şi detaliile pregătirii materialului necesar pentru teste şi controale figurează în anexe. O listă a laboratoarelor care realizează optimizarea şi validarea protocoalelor este prevăzută în anexa A la prezenta anexă.

Dat fiind faptul că protocoalele implică detecţia unui organism dăunător care trebuie pus sub carantină şi includ utilizarea de culturi viabile de Ralstonia solanacearum, în calitate de material de control, este necesară aplicarea de proceduri de carantină corespunzătoare care prevăd instalaţii corespunzătoare de laborator de eliminare a deşeurilor.

Parametrii testelor trebuie să garanteze o detecţie coerentă şi reproductibilă a nivelurilor de Ralstonia solanacearum la pragurile stabilite prin metodele selecţionate.

Pregătirea exactă a controalelor pozitive este imperativă.

Efectuarea testelor în conformitate cu pragurile impuse implică, de asemenea, stabilirea parametrilor corecţi, întreţinerea şi calibrarea echipamentelor, manipularea şi păstrarea corectă a reactivilor şi toate măsurile menite să împiedice contaminarea între probe, de exemplu, separarea controalelor pozitive şi a probelor testate. Trebuie aplicate standarde de control de calitate pentru a se evita erori administrative şi de alt gen, în special în ceea ce priveşte etichetarea şi documentarea.

O apariţie suspectă, în sensul pct.9 din prezentele Măsuri, implică un rezultat pozitiv al testelor de diagnostic sau de detecţie realizate asupra unei probe în conformitate cu diagramele funcţionale prezentate în continuare. Un prim test de detecţie pozitiv (testul de imunofluorescenţă (IF), testul reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR), testul de hibridizare fluorescentă in situ (FISH), izolare selectivă) trebuie confirmat de un al doilea test de detecţie bazat pe un alt principiu biologic.

În cazul în care primul test de detecţie este pozitiv, se suspectează o contaminare cu Ralstonia solanacearum şi trebuie efectuat un al doilea test de detecţie. În cazul în care al doilea test de detecţie este pozitiv, presupunerea se confirmă (apariţie suspectată) şi trebuie continuate testele în conformitate cu procedura. În cazul în care al doilea test de detecţie este negativ, proba este considerată ca fiind necontaminată cu Ralstonia solanacearum.

Prezenţa confirmată, menţionată în pct.11 din Măsurile privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., implică izolarea şi identificarea unei culturi pure de Ralstonia solanacearum cu confirmarea patogenităţii.

Secţiunea I

Aplicarea protocolului de testare

1. Procedura de detecţie pentru diagnoza ofilirii bacteriene (Ralstonia solanacearum) la tuberculi de cartof, plante de cartof, plante de tomate sau alte plante-gazdă care prezintă simptome de ofilire bacteriană

Protocolul de testare este destinat tuberculilor de cartof şi plantelor cu simptome tipice sau suspecte de ofilire bacteriană. Presupune un test de detecţie rapidă, izolarea agentului patogen din ţesutul vascular infectat pe un mediu (selectiv) şi, în cazul unui rezultat pozitiv, identificarea culturii ca fiind Ralstonia solanacearum.

⁽¹⁾ Descrierea simptomelor este prevăzută la secţiunea II punctul 1.

⁽²⁾ Testele de selecţie rapidă uşurează diagnosticul prezumtiv, dar nu sînt esenţiale. Un rezultat negativ nu garantează întotdeauna absenţa agentului patogen.

⁽³⁾ Testul de eliminare a exsudatului din ţesutul vascular al tulpinii este descris în secţiunea VI partea A punctul 1.

⁽⁴⁾ Testul de detecţie a granulelor de poli-hidroxibutirat în celulele bacteriene este descris în secţiunea VI partea A punctul 2.

⁽⁵⁾ Testele de seroaglutinare asupra exsudatului bacterian sau asupra extractelor din ţesuturile simptomatice sînt descrise în secţiunea VI partea A punctul 3.

⁽⁶⁾ Testul IF asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din ţesuturi simptomatice este descris în secţiunea VI partea A punctul 5.

⁽⁷⁾ Testul FISH asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din ţesuturi simptomatice este descris în secţiunea VI partea A punctul 7.

⁽⁸⁾ Testul ELISA asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din ţesuturi simptomatice este descris în secţiunea VI partea A punctul 8.

⁽⁹⁾ Testul PCR asupra exsudatului bacterian, suspensiei de apă sau asupra extractelor din ţesuturi simptomatice este descris în secţiunea VI partea A punctul 6.

⁽¹⁰⁾ În general, agentul patogen se izolează uşor din materialul vegetal simptomatic prin însămînţare pe mediu nutritiv (secţiunea II punctul 3).

⁽¹¹⁾ Morfologia coloniei tipice este descrisă în secţiunea II punctul 3 litera d).

⁽¹²⁾ Cultivarea riscă să eşueze în stadiile avansate de infectare din cauza concurenţei sau a înmulţirii bacteriilor saprofite. În cazul în care simptomele bolii sînt caracteristice, dar testul de izolare este negativ, izolarea trebuie repetată, de preferinţă printr-un test de însămînţare pe medii selective.

⁽¹³⁾ – Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise în secţiunea VI partea B. O caracterizare subspecifică este facultativă, dar recomandată pentru fiecare caz nou.

⁽¹⁴⁾ – Testul de patogenitate este descris în secţiunea VI partea C.

2. Procedura pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de tuberculi de cartof asimptomatici

Protocolul de testare este destinat detecţiei infecţiilor latente ale tuberculilor de cartof. Un rezultat pozitiv a cel puţin două teste de detecţie bazate pe principii biologice diferite trebuie completat prin izolarea agentului patogen, urmată, în cazul izolării coloniilor caracteristice, de confirmarea unei culturi pure ca fiind Ralstonia solanacearum. Un rezultat pozitiv la un singur test de detecţie nu este suficient pentru a considera proba ca fiind suspectă.

Testele de detecţie şi testele de izolare trebuie să permită detecţia a 10³–10⁴ celule pe ml de extract concentrat în suspensie, incluse în fiecare serie de teste în calitate de controale pozitive.

⁽¹⁾ Mărimea standard a probei este de 200 de tuberculi. Cu toate acestea, protocolul poate fi aplicat probelor mai mici în cazul în care nu sînt disponibili 200 de tuberculi.

⁽²⁾ Extragerea agentului patogen şi metodele de concentrare sînt descrise în secţiunea III punctul 1.1.

⁽³⁾ În cazul în care cel puţin două teste bazate pe principii biologice diferite sînt pozitive, trebuie efectuate izolarea şi confirmarea. A se efectua cel puţin un test rapid de detecţie. În cazul în care acest test este negativ, proba este considerată ca fiind negativă. În cazul în care acest test este pozitiv, este nevoie de un al doilea sau mai multe teste de detecţie rapidă bazate pe principii biologice diferite pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau celelalte teste sînt negative, proba este considerată ca fiind negativă. Nu sînt necesare alte teste.

⁽⁴⁾ Testul IF este descris în secţiunea VI partea A punctul 5.

⁽⁵⁾ Testul de izolare selectivă este descris în secţiunea VI partea A punctul 4.

⁽⁶⁾ Testele PCR sînt descrise în secţiunea VI partea A punctul 6.

⁽⁷⁾ Testul FISH este descris în secţiunea VI partea A punctul 7.

⁽⁸⁾ Testele ELISA sînt descrise în secţiunea VI partea A punctul 8.

⁽⁹⁾ Testul biologic este descris în secţiunea VI partea A punctul 9.

⁽¹⁰⁾ Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secţiunea II punctul 3 litera d).

⁽¹¹⁾ Cultivarea sau testele biologice riscă să eşueze din cauza concurenţei sau a inhibiţiei de către bacteriile saprofite. În cazul în care se obţin rezultate pozitive clare în urma testelor rapide de detecţie, însă testele de izolare sînt negative, trebuie repetate testele de izolare din acelaşi extract concentrat sau din ţesutul vascular suplimentar prelevat de la talonul tuberculilor tăiaţi din aceeaşi proba şi, după caz, trebuie testate probele suplimentare.

⁽¹²⁾ Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise în secţiunea VI partea B.

⁽¹³⁾ Testul de patogenitate este descris în secţiunea VI partea C.

3. Procedura pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probele de plante-gazdă de cartofi şi tomate sau alte plante-gazdă asimptomatice

⁽¹⁾ Pentru mărimea recomandată a probelor a se vedea secţiunea III punctul 2.1.

⁽²⁾ Extragerea agentului patogen şi metodele de concentrare sînt descrise în secţiunea III punctul 2.1.

⁽³⁾ În cazul în care cel puţin două teste bazate pe principii biologice diferite sînt pozitive, trebuie efectuate izolarea şi confirmarea. A se efectua cel puţin un test rapid de detecţie. În cazul în care acest test este negativ, proba este considerată ca fiind negativă. În cazul în care acest test este pozitiv, este nevoie de un al doilea sau mai multe teste de detecţie rapidă, bazate pe principii biologice diferite, pentru a verifica primul rezultat pozitiv. În cazul în care al doilea test sau celelalte teste sînt negative, proba este considerată ca fiind negativă. Nu sînt necesare alte teste.

⁽⁴⁾ Testul de izolare selectivă este descris în secţiunea VI partea A punctul 4.

⁽⁵⁾ Testul IF este descris în secţiunea VI partea A punctul 5.

⁽⁶⁾ Testele PCR sînt descrise în secţiunea VI partea A punctul 6.

⁽⁷⁾ Testul FISH este descris în secţiunea VI partea A punctul 7.

⁽⁸⁾ Testele ELISA sînt descrise în secţiunea VI partea A punctul 8.

⁽⁹⁾ Testul biologic este descris în secţiunea VI partea A punctul 9.

⁽¹⁰⁾ Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secţiunea II punctul 3 litera d).

⁽¹¹⁾ Cultivarea sau testele biologice riscă să eşueze din cauza concurenţei sau a inhibiţiei de către bacteriile saprofite. În cazul în care se obţin rezultate pozitive clare în urma testelor rapide de detecţie, însă testele de izolare sînt negative, trebuie repetate testele de izolare.

⁽¹²⁾ Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolări prezumtive de Ralstonia solanacearum se obţine prin efectuarea testelor descrise în secţiunea VI partea B.

⁽¹³⁾ Testul de patogenitate este descris în secţiunea VI partea C.

Secţiunea II

1. Metode detaliate pentru detecţia bacteriei Ralstonia solanacearum la tuberculii de cartof, la plantele-gazdă de cartof şi de tomate sau la alte plante-gazdă cu simptome de veştejire bacteriană

1.1. Simptome la cartof

La plante. Stadiul incipient al infecţiei în cîmp este reprezentat de veştejirea frunzelor înspre vîrful plantei în timpul temperaturilor diurne ridicate şi de revenirea la aspect normal în timpul nopţii. În cursul primelor stadii de veştejire, frunzele rămîn verzi, dar mai tîrziu apare o îngălbenire şi o necroză brună. De asemenea, apare epinastia. Vestejirea unui lăstar sau a unor plante întregi devine repede ireversibilă şi duce la moartea plantei. Ţesutul vascular în secţiune transversală prin tulpina plantelor veştejite poate deveni brun şi un exsudat lăptos apare la suprafaţa tăieturii sau poate fi extras uşor prin presare. Dacă tulpina secţionată se aşează în poziţie verticală în apă, din ţesutul vascular se elimină un exsudat vîscos asemănător unui firicel.

La tuberculi. Se secţionează tuberculii de cartof transversal aproape de hil (punctul de inserţie cu stolonul) sau longitudinal, pînă la stolon. În stadiul incipient al infecţiei apare o decolorare galben-sticloasă spre brun-deschis a inelului vascular din care se elimină un exsudat crem-pal în mod spontan după cîteva minute. Ulterior, decolorarea vasculară devine de un brun mai distinct, iar necroza se poate extinde la ţesutul parenchimatos. În stadii avansate, infecţia se propagă la nivelul stolonilor şi al ochilor din care se elimină bacterii ce permit aderarea particulelor de sol. Coaja tuberculilor poate prezenta leziuni de culoare brun-roşcat uşor adîncite, provocate de colapsul intern al ţesutului vascular. În stadiile avansate ale bolii se dezvoltă putregaiuri fungice şi bacteriene.

1.2. Simptome la tomate

La plante. Primul simptom vizibil este veştejirea aparentă a frunzelor tinere. În condiţii favorabile agentului patogen (temperatura solului – circa 25°C, umiditate saturată), în cîteva zile apar epinastia şi veştejirea unei părţi din plantă sau a întregii plante ce duc la colapsul total al plantei. În condiţii mai puţin favorabile (temperatura solului – sub 21°C), veştejirea este mai puţin pronunţată, dar se poate dezvolta un număr mare de rădăcini adventive pe tulpină. Este posibilă observarea unei benzi subţiri unsuroase de-a lungul tulpinii, plecînd de la baza acesteia, ce dovedeşte necroza sistemului vascular. În cazul în care tulpina este secţionată transversal, din ţesuturile vasculare brun-decolorate ale tulpinii se elimină un exsudat bacterian alb sau gălbui.

1.3. Simptome la alte plante-gazdă: Solanum dulcamara şi Solanum nigrum.

În condiţii naturale rareori se observă simptome de veştejire la aceste plante-gazdă, cu excepţia cazurilor în care temperatura solului este mai mare de 25°C sau nivelurile de inoculum sînt extrem de ridicate (de exemplu, pentru Solanum nigrum care se dezvoltă în vecinătatea plantelor de cartof sau de tomate bolnave). În cazul în care intervine ofilirea, simptomele sînt identice cu cele descrise pentru tomate. Plantele de Solanum dulcamara care nu se veştejesc şi se dezvoltă cu tulpina şi rădăcina în apă pot prezenta o uşoară decolorare brună a ţesutului vascular pe partea transversală a tulpinii sau pe părţile tulpinii aflate sub apă. În cazul în care se pune o tulpină tăiată în poziţie verticală în apă, se pot observa fire de exsudat bacterian chiar în absenţa simptomelor de vestejire.

2. Teste rapide de detecţie

Testele rapide de detecţie facilitează diagnosticul prezumtiv, dar nu sînt esenţiale. Se folosesc unul sau mai multe dintre următoarele teste validate:

2.1. Testul eliminării exsudatului bacterian din tulpină (vezi secţiunea VI partea A punctul 1)

2.2.Detecţia granulelor de poli-β-hidroxibutirat (PHB)

Granulele tipice de PHB din celulele de Ralstonia solanacearum pot fi vizualizate prin colorarea cu albastru de Nil A sau cu negru de Sudan B (a se vedea secţiunea VI partea A punctul 2) a frotiurilor de exsudat bacterian din ţesutul infectat, fixate prin flacără pe o lamă de microscop.

2.3. Testul serologic de aglutinare (a se vedea secţiunea VI partea A punctul 3)

2.4. Alte teste rapide de detecţie sînt testul IF (vezi secţiunea VI.A.5), testul FISH (a se vedea secţiunea VI partea A punctul 7), testele ELISA (a se vedea secţiunea VI partea A punctul 8) şi testele PCR (a se vedea secţiunea VI partea A punctul 6).

3. Procedura de izolare

Procedura de izolare prevede următoarele acţiuni:

a) se îndepărtează exsudatul sau secţiunile de ţesut decolorat de la nivelul inelului vascular al tuberculului de cartof sau din căile vasculare ale tulpinii plantei de cartof, plantei de tomată sau de alte plante-gazdă veştejite. Se pune în suspensie, într-un volum mic de apă distilată sterilă sau într-un tampon fosfat de 50 mM (anexa D la prezenta anexă). Se lasă 5–10 minute pe masă;

b) se prepară o serie de diluţii zecimale ale suspensiei;

c) se transferă 50-100 ľl de suspensie şi de diluţii pe un mediu nutritiv general NA, YPGA sau SPA (a se vedea anexa B la prezenta anexă) şi/sau pe mediul de tetrazoliu Kelman (a se vedea anexa B la prezenta anexă) şi/sau pe un mediu selectiv validat, de exemplu SMSA (a se vedea anexa B la prezenta anexă). Se însămînţează printr-o tehnică corespunzătoare. În cazul în care se consideră util, separat, se însămînţează plăci Petri cu o suspensie diluată de celule de Ralstonia solanacearum biovar 2 drept control pozitiv;

d) se incubează plăcile timp de 2–6 zile la 28°C.

Pe mediu nutritiv general, izolatele virulente de Ralstonia solanacearum formează colonii fluide, cu margini neregulate, plate, albicioase, deseori cu verticile caracteristice în centru. Formele avirulente de Ralstonia solanacearum formează mici colonii rotunjite, nefluide, untoase, de culoare albicioasă uniformă.

Pe mediu tetrazoliu Kelman şi pe mediu SMSA, verticilele sînt de culoare roşu-sîngeriu. Formele avirulente de Ralstonia solanacearum formează colonii mici, rotunjite, untoase, nefluide de culoare roşu-închis.

4. Teste de identificare a bacteriei Ralstonia solanacearum

Testele care permit identificarea izolatelor prezumtive de Ralstonia solanacearum sînt prevăzute în secţiunea VI partea B.

Secţiunea III

1. Metode detaliate pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de tuberculi de cartof asimptomatici

1.1. Pregătirea probei

Mărimea standard a unei probe este de 200 de tuberculi. O procedură mai intensivă de prelevare implică efectuarea de teste pe mai multe probe de această mărime. O probă cu un număr mai mare de tuberculi determină o inhibiţie sau o interpretare dificilă a rezultatelor. Cu toate acestea, procedura se poate aplica în mod convenabil probelor cu mai puţin de 200 de tuberculi.

Validarea tuturor metodelor de detecţie descrise în continuare se bazează pe efectuarea unor teste pe probe de 200 de tuberculi.

Extractul de cartof descris în continuare poate fi, de asemenea, utilizat pentru detecţia prezenţei bacteriei responsabile de veştezirea bacteriană a cartofului, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Opţiunile de pretratare, care pot fi efectuate înaintea preparării probei, sînt următoarele:

a) se incubează proba la 25–30°C pe o perioadă de pînă la două săptămîni pentru a favoriza înainte de efectuarea testelor multiplicarea eventualelor populaţii bacteriene de Ralstonia solanacearum;

b) se spală tuberculii. Se utilizează dezinfectanţi (compuşi cloruraţi în cazul în care testul PCR este folosit pentru a îndepărta ADN patogen) şi detergenţi corespunzători între fiecare probă. Tuberculii se usucă la aer. Această procedură de spălare este deosebit de utilă (dar nu obligatorie) pentru probele cu particule de sol în exces şi în cazul în care se realizează un test PCR sau o procedură de izolare directă.

1.1.1. Cu un bisturiu sau un cuţit pentru legume curat şi dezinfectat se îndepărtează coaja de la nivelul hilului (punctul de inserţie cu stolonul) fiecărui tubercul, astfel încît să fie vizibil ţesutul vascular. Se taie cu atenţie un miez mic de ţesut vascular (con de ţesut vascular) de la nivelul hilului.

Cantitatea de ţesut extravascular trebuie redusă la minimum

Se separă tuberculii (în putrefacţie) cu simptome de putregai brun şi se testează separat.

În cazul în care, la îndepărtarea conului de ţesut vascular de la nivelul hilului, se observă simptome de putregai brun, trebuie să se realizeze o examinare vizuală a tuberculului respectiv şi o secţionare a acestuia lîngă hil. Orice tubercul tăiat care prezintă simptome suspecte trebuie păstrat timp de cel puţin două zile la temperatura ambiantă pentru a permite formarea unui strat de suber, iar apoi depozitat la o temperatură de refrigerare (între 4 şi 10°C) în condiţii de carantină corespunzătoare.

Toţi tuberculii, inclusiv cei cu simptome suspecte, trebuie păstraţi în conformitate cu anexa nr.3 la prezentele Măsuri.

1.1.2. Se colectează conele în recipiente de unică folosinţă neutilizate care pot fi închise şi/sau sigilate (în cazul în care recipientele sînt refolosite, ele trebuie spălate şi dezinfectate cu compuşi clorinaţi). Este preferabil ca conurile să fie prelucrate imediat. În cazul în care nu este posibil, acestea se depozitează în recipiente, fără adăugarea unui tampon, pentru cel mult 72 de ore în frigider şi cel mult 24 de ore la temperatura ambiantă.

Se prelucrează conele prin una dintre următoarele proceduri:

a) se acoperă conele cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracţie (anexa D la prezenta anexă) şi se agită pe un agitator rotativ (50–100 turaţii/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai mică de 24°C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16–24 de ore; sau

b) conele se omogenizează cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracţie (anexa D la prezenta anexă) într-un mixer (de exemplu, Waring sau Ultra Thurax) sau se mărunţesc într-un sac de macerare de unică folosinţă sigilat (de exemplu, sac Stomacher sau de tip “Bioreba strong gauge polythene” de 150 mm × 250 mm sterilizat prin radiaţii) cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare corespunzător (de exemplu, Homex).

Riscul de contaminare încrucişată a probelor este considerabil în cazul în care probele sînt omogenizate într-un mixer. Se vor lua măsuri de precauţie pentru a se evita producerea de aerosoli sau scurgeri în timpul procesului de extracţie. Se vor utiliza palete de mixer şi recipiente sterilizate pentru fiecare probă. La efectuarea testului PCR, se evită transferul de ADN pe recipientele sau dispozitivele de măcinare. În cazul în care se recurge la testul PCR, se recomandă măcinarea în saci de unică folosinţă şi utilizarea de tuburi de unică folosinţă.

1.1.3. Se decantează supernatantul. În cazul în care acesta este prea tulbure, se filtrează printr-o centrifugare la viteză mică (la 180 g maximum timp de 10 minute, la o temperatură de 4–10°C) sau printr-o filtrare în vid (40–100 ľm), spălîndu-se filtrul cu un tampon de macerare suplimentar (10 ml).

1.1.4. Bacteriile se concentrează prin centrifugare la 7000 g timp de 15 minute (sau la 10000 g timp de 10 minute) la o temperatură de 4–10°C şi se îndepărtează supernatantul fără a deranja sedimentul (extract concentrat).

1.1.5. Sedimentul se resuspendă în 1,5 ml tampon concentrat (anexa D la prezenta anexă). Se folosesc 500 ľl pentru a testa Ralstonia solanacearum, 500 ľl pentru Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus şi 500 ľl pentru referinţă. Se adaugă glicerol steril la concentraţia finală de 10–25% (volum) la 500 l de alicote de referinţă şi la alicota de testare rămasă, se omogenizează în vortex şi se depozitează la o temperatură situată între –16 şi –24°C (săptămîni) sau între –68 şi –86°C (luni). Alicotele de testare se păstrează în timpul testelor la o temperatură de 4–10°C.

Nu se recomandă congelările şi decongelările repetate. În cazul în care extractele trebuie transportate, livrarea trebuie efectuată într-o geantă frigorifică în termen de 24 de ore.

1.1.6. Este absolut necesar ca toate controalele pozitive de Ralstonia solanacearum şi probele să fie tratate separat pentru a evita orice contaminare. Această condiţie se aplică atît pentru lamele de imunofluorescenţă, cît şi pentru toate testele.

1.2. Testele

A se vedea diagrama şi descrierea testelor şi a protocoalelor optimizate în anexele corespunzătoare:

Izolare selectivă (secţiunea VI partea A punctul 4);

Testul IF (secţiunea VI partea A punctul 5);

Testele PCR (secţiunea VI partea A punctul 6);

Testul FISH (secţiunea VI partea A punctul 7);

Testele ELISA (secţiunea VI partea A punctul 8);

Testul biologic (secţiunea VI partea A punctul 9).

2. Metode detaliate pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în probe de plante de cartof şi plante de tomate sau alte plante-gazdă asimptomatice

2.1. Pregătirea probei

Pentru detecţia populaţiilor latente de Ralstonia solanacearum, se recomandă testarea unor serii de probe. Procedura poate fi aplicată cu uşurinţă probelor care conţin pînă la 200 de bucăţi de tulpini. În cazul în care se efectuează supravegheri, acestea trebuie bazate pe o probă reprezentativă din punct de vedere statistic pentru populaţia vegetală în cauză.

2.1.1. Se colectează bucăţi de tulpină de 1–2 cm într-un recipient steril închis, în conformitate cu următoarele proceduri de prelevare:

a) plantule de tomată (răsaduri): cu ajutorul unui cuţit curat şi dezinfectat se taie o bucată de 1 cm la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului solului;

b) plante de tomate cultivate în seră sau în cîmp: cu ajutorul unui cuţit curat şi dezinfectat se îndepărtează lăstarul cel mai de jos al fiecărei plante, tăind chiar deasupra joncţiunii cu tulpina principală. Se îndepărtează o bucată de 1 cm de la baza fiecărui lăstar lateral.

Alte plante-gazdă: cu ajutorul unui cuţit sau al unei foarfeci de grădină curate şi dezinfectate se taie o bucată de 1 cm de la baza fiecărei tulpini, chiar deasupra nivelului solului. În cazul buruienii Solanum dulcamara sau al altor plante-gazdă care cresc în apă, se taie bucăţi de 1–2 cm din tulpinile care se găsesc sub apă sau din stolonii cu rădăcini acvatice.

În caz de prelevare într-o anumită zonă, se recomandă să se testeze o probă reprezentativă din punct de vedere statistic de cel puţin 10 plante pe punct de prelevare pentru fiecare potenţială buruiană-gazdă. Detecţia agentului patogen se face în modul cel mai fiabil la sfîrşitul primăverii, vara şi toamna, deşi infecţiile naturale pot fi detectate pe tot parcursul anului la plantele perene de Solanum dulcamara care cresc în apă. Gazdele cunoscute sînt plantele spontane de cartof, Solanum dulcamara, Solanum nigrum, Datura stramonium şi alte specii din familia Solanaceae. Pelargonium spp. şi Portulaca oleracea sînt, de asemenea, plante-gazdă. Printre anumite buruieni europene care pot găzdui la nivelul rădăcinii şi/sau rizosferei tulpini virulente de Ralstonia solanacearum biovar 2, rasa 3, în condiţii de mediu specifice, se numără Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp., Silene alba, S. nutans, Tussilago farfarra şi Urtica dioica.

În această etapă se poate efectua examinarea vizuală a simptomelor interne (coloraţie vasculară sau exsudat bacterian). Se separă orice bucată de tulpină cu simptome şi se testează în mod separat (vezi secţiunea II).

2.1.2. Se efectuează o dezinfectare scurtă a bucăţilor de tulpină cu etanol de 70% şi se usucă de îndată cu ajutorul hîrtiei absorbante. Apoi se prelucrează bucăţile de tulpină în conformitate cu una dintre următoarele proceduri:

a) se acoperă cu un volum suficient (circa 40 ml) de tampon de extracţie (anexa D la anexa nr.2 la prezentele Măsuri) şi se agită pe un agitator rotativ (50-100 turaţii/minut) timp de 4 ore la o temperatură mai mică de 24°C sau la o temperatură de refrigerare timp de 16–24 de ore; sau

b) bucăţile de tulpină se zdrobesc de îndată într-un sac de macerare rezistent (de exemplu, Stomacher sau Bioreba) cu un volum corespunzător de tampon de extracţie (anexa D la anexa nr.2 la prezentele Măsuri), cu ajutorul unui ciocan de cauciuc sau al unui dispozitiv de măcinare corespunzător (de exemplu, Homex). În cazul în care acest lucru nu este posibil, bucăţile se păstrează, fără a depăşi 72 de ore, la temperatură de refrigerare sau 24 de ore la temperatura ambiantă.

2.1.3. Se decantează supernatantul după o sedimentare de 15 minute.

2.1.4. De obicei, nu este necesară o limpezire suplimentară a extractului sau a concentratului decantat, dar poate fi realizată prin filtrare şi/sau centrifugare în conformitate cu metoda prevăzută la pct.1.1.3–1.1.5.

2.1.5. Se împarte extractul iniţial sau concentrat în două părţi egale. Se păstrează jumătate la o temperatură de 4–10°C pe parcursul testului şi se conservă cealaltă jumătate cu 10–25% (volum) glicerol steril la o temperatură situată între –16 şi –24°C (săptămîni) sau între –68 şi –86°C (luni), în cazul în care este necesar un test suplimentar.

2.2. Teste

A se vedea diagrama şi descrierea testelor şi protocoalelor optimizate în anexele corespunzătoare la anexa nr.2 la prezentele Măsuri:

Izolarea selectivă (secţiunea VI partea A punctul 4);

Testul IF (secţiunea VI partea A punctul 5);

Testele PCR (secţiunea VI partea A punctul 6);

Testul FISH (secţiunea VI partea A punctul 7);

Testele ELISA (secţiunea VI partea A punctul 8);

Testul biologic (secţiunea VI partea A punctul 9).

Secţiunea IV

1. Procedura pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în apă

⁽¹⁾ A se vedea secţiunea IV punctul 2.1 pentru procedurile de prelevare recomandate.

⁽²⁾ Metodele de concentrare ale agentului patogen sînt descrise în secţiunea IV punctul 2.1. Concentrarea sporeşte populaţiile agentului patogen şi ale bacteriilor saprofite concurente şi este recomandată numai în cazul în care nu determină inhibarea testului de izolare.

⁽³⁾ Testul de izolare selectivă este descris în secţiunea VI partea A punctul 4.

⁽⁴⁾ Testul biologic este descris în secţiunea VI partea A punctul 9.

⁽⁵⁾ Metodele de îmbogăţire PCR sînt descrise în secţiunile VI partea A punctul 4.2 şi VI partea A punctul 6.

⁽⁶⁾ Metodele de îmbogăţire ELISA sînt descrise în secţiunile VI.A punctul 4.2 şi VI partea A punctul 8.

⁽⁷⁾ Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secţiunea II punctul 3 litera d).

⁽⁸⁾ Cultivarea riscă să eşueze din cauza concurenţei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care populaţiile mari de saprofite sînt suspectate că ar putea afecta fiabilitatea izolării, testele de izolare trebuie reîncepute după diluarea probei în apă sterilă.

⁽⁹⁾ Identificarea fiabilă a culturilor pure de izolate prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise la secţiunea VI partea B.

⁽¹⁰⁾ Testul de patogenitate este descris în secţiunea VI partea C.

2. Metode pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în apă

Procedura de detecţie validată descrisă în prezenta secţiune se aplică pentru detecţia agentului patogen în probe de apă de suprafaţă şi poate fi folosită, de asemenea, pentru a testa probele de deşeuri lichide provenite din prelucrarea cartofilor sau probele provenite din ape reziduale. Cu toate acestea, trebuie reţinut faptul că sensibilitatea de detecţie variază în funcţie de substrat. Sensibilitatea testului de izolare este afectată de populaţiile de bacterii saprofite concurente care sînt, în general, mult mai numeroase în probele provenite din prelucrarea cartofilor şi din ape reziduale decît în apele de suprafaţă. În timp ce procedura descrisă în continuare trebuie să detecteze numai 10³ celule/l în apele de suprafaţă, sensibilitatea de detecţie în deşeurile provenite din prelucrarea cartofilor sau din ape reziduale poate fi mult mai slabă. Din acest motiv, se recomandă testarea deşeurilor după eventualele tratamente de purificare (de exemplu sedimentare sau filtrare) pe parcursul cărora se reduc populaţiile de bacterii saprofite. Limitele sensibilităţii procedurii de testare trebuie luate în considerare atunci cînd se evaluează fiabilitatea rezultatelor negative obţinute, după caz. Deşi această procedură a fost efectuată cu succes în studiile destinate să stabilească prezenţa sau absenţa agentului patogen în apele de suprafaţă, limitele sale trebuie luate în considerare atunci cînd este utilizată în lucrări asemănătoare privind deşeurile provenite din prelucrarea cartofilor sau a apelor reziduale.

2.1. Pregătirea probei

Detecţia bacteriei Ralstonia solanacearum în apele de suprafaţă este mai sigură dacă se face la sfîrşitul primăverii, vara şi toamna, atunci cînd temperatura apei este mai mare de 15°C.

Reînceperea prelevării în momente diferite, pe parcursul perioadei menţionate anterior, în punctele de prelevare desemnate, va spori fiabilitatea detecţiei, reducînd consecinţele variaţiilor climatice.

Trebuie să se ţină seama de consecinţele ploilor abundente şi de geografia cursului apei pentru a evita efectele de diluare considerabile care pot ascunde prezenţa agentului patogen.

Se prelevă probe de apă de suprafaţă în apropierea plantelor-gazdă în cazul în care aceste plante-gazdă sînt prezente.

2.1.1. În punctele de prelevare selecţionate, probele de apă se colectează prin umplerea unor tuburi sau sticle sterile de unică folosinţă la o adîncime, atunci cînd este posibil, mai mare de 30 cm şi la o distanţă maximă de 2 m de la mal. Pentru deşeurile provenite din prelucrarea cartofilor sau pentru apele reziduale, se colectează probe din punctul de deversare a acestora. Mărimea recomandată a probelor poate atinge 500 ml pe punct de prelevare. În cazul în care se preferă probe mai mici, se recomandă prelevarea probelor cel puţin în 3 reprize pe punct de prelevare, fiecare probă constînd din două subprobe duplicate de cel puţin 30 ml. Pentru un studiu intensiv, se selecţionează cel puţin 3 puncte de prelevare pentru 3 km de curs al apei şi se prelevă şi din afluenţii cursului de apă.

2.1.2. Se transportă probele în condiţii de refrigerare (4°–10°C) şi la întuneric şi se testează pe parcursul a 24 de ore.

2.1.3. La necesitate, probele pot fi concentrate prin una dintre următoarele metode:

a) prin centrifugarea a 30–50 ml de subprobă la 10000 g timp de 10 minute (sau la 7000 g timp de 15 minute), preferabil la 4°–10°C, se îndepărtează supernatantul, iar sedimentul se resuspendă în 1 ml de tampon concentrat (vezi anexa D la anexa nr.2 la prezentele Măsuri);

b) prin filtrarea pe membrană (dimensiunea minimă a porilor, de 0,45 ľm), urmată de spălarea filtratului în 5–10 ml de tampon concentrat şi reţinerea soluţiilor de spălare. Această metodă este adecvată pentru volume mari de probe de apă, cu conţinut mic de organisme saprofite.

În general, concentrarea nu se recomandă pentru probele de deşeuri provenite din prelucrarea cartofilor sau din ape reziduale, dat fiind faptul că populaţiile mai mari de bacterii saprofite concurente vor avea un efect inhibitor asupra detecţiei bacteriei Ralstonia solanacearum.

2.2.Teste

A se vedea diagrama şi descrierea testelor în anexele A, B, C, D, E, F, G şi H la anexa nr.2 la Măsurile privind controlul bacteriei Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

Secţiunea V

1. Procedura pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în sol

⁽¹⁾ A se vedea partea V punctul 2.1 pentru procedurile de prelevare recomandate.

⁽²⁾ Testul de izolare selectivă este descris în secţiunea VI partea A punctul 4.

⁽³⁾ Metodele de îmbogăţire PCR sînt descrise în secţiunile VI partea A punctul 4.2 şi VI partea A punctul 6.

⁽⁴⁾ Testul biologic este descris în secţiunea VI partea A punctul 9.

⁽⁵⁾ Morfologia tipică a coloniei este descrisă în secţiunea II punctul 3 litera d).

⁽⁶⁾ Cultivarea riscă să eşueze din cauza concurenţei sau a efectului inhibitor al bacteriilor saprofite. În cazul în care populaţiile mari de bacterii saprofite sînt suspectate că ar putea afecta fiabilitatea izolării, testele de izolare trebuie reîncepute după o nouă diluţie a probei.

⁽⁷⁾ Identificarea fiabilă a culturilor pure prezumtive de Ralstonia solanacearum necesită efectuarea testelor descrise la secţiunea VI partea B.

⁽⁸⁾ Testul de patogenitate este descris în secţiunea VI partea C.

2. Metode pentru detecţia şi identificarea bacteriei Ralstonia solanacearum în sol

Procedura de detecţie validată descrisă în prezenta secţiune se aplică pentru detecţia agentului patogen în probe de sol, dar poate fi, de asemenea, utilizată pentru a testa probele de deşeuri solide provenite din prelucrarea cartofilor sau a nămolului de epurare. Cu toate acestea, trebuie remarcat faptul că aceste metode nu sînt destul de sensibile pentru a garanta detecţia populaţiilor de Ralstonia solanacearum cu densitate mică sau dispersate inegal, care ar putea apărea în probele infectate în mod natural cu aceste substraturi.

Limita de sensibilitate a acestei proceduri de testare trebuie luată în considerare la evaluarea fiabilităţii rezultatelor negative obţinute şi, de asemenea, în studiile destinate să stabilească prezenţa ori absenţa agentului patogen în soluri sau în nămol. Cel mai fiabil test de detecţie a prezenţei agentului patogen în solul unui cîmp este plantarea unei plante-gazdă sensibile şi supravegherea infectării eventuale a acesteia, însă nici această metodă nu va permite detecţia unui nivel slab de contaminare.

2.1. Pregătirea probei

2.1.1. Prelevarea solului din cîmp trebuie să respecte standardele de bază utilizate pentru prelevarea nematozilor. Se colectează 0,5–1,0 kg de sol per probă în 60 de puncte, pe o suprafaţă de 0,3 ha, la o adîncime de 10–20 cm (sau dintr-o grilă de 7×7 m). În cazul în care se suspectează prezenţa agentului patogen, se măreşte numărul de puncte de colectare la 120 pe o suprafaţă de 0,3 ha. Înainte de testare, probele se păstrează la o temperatură de 12°–15°C. Se colectează în total 1 kg de nămol provenit din prelucrarea cartofilor şi nămol de epurare în locurile care reprezintă volumul total de nămol pentru testare. Înainte de testare, fiecare probă se amestecă bine.

2.1.2. Se împart probele în subprobe de 10–25 g de sol sau de nămol cu ajutorul unui agitator rotativ (250 turaţii/minut) în tampon de extracţie de 60–150 ml (anexa D la prezenta anexă), timp de două ore cel mult. După caz, pentru a favoriza dispersia, se adaugă 0,02% de Tween 20 steril şi 10–20 g de pietriş steril.

2.1.3. Suspensia se păstrează, în timpul testului, la 40°C.

2.2. Teste

A se vedea diagrama şi descrierea testelor în anexele A-H la prezenta anexă.

Secţiunea VI

Protocoale optimizate pentru detecţia şi identificarea

bacteriei Ralstonia solanacearum

A. Diagnostic şi teste de detecţie

1. Testul eliminării exsudatului bacterian din tulpină

Prezenţa bacteriei Ralstonia solanacearum în tulpini ofilite de cartof, roşii sau de alte plante-gazdă poate fi pusă în evidenţă prin următorul test simplu prezumtiv: se secţionează tulpina chiar deasupra nivelului solului. Se pune extremitatea tăiată într-un tub cu apă curată. După cîteva minute se observă scurgeri spontane şi caracteristice de fire de exsudat bacterian din fasciculele vasculare tăiate.

2. Detecţia granulelor de poli-β-hidroxibutirat

Detecţia granulelor de poli-b-hidroxibutirat presupune următoarele acţiuni:

1) se prepară un frotiu din exsudatul bacterian scurs din ţesutul infectat pe o lamă de microscop sau se prepară un frotiu dintr-o cultură de 48 de ore de pe mediu YPGA sau SPA (anexa B la prezenta anexă);

2) se prepară frotiuri de control pozitiv din culturi de Ralstonia solanacearum biovar 2 şi, în cazul în care se consideră necesar, un frotiu de control negativ dintr-un PHB negativ cunoscut;

3) se lasă la uscat şi se trece rapid partea inferioară a fiecărei lame de cîteva ori prin flacără pînă la fixarea frotiului;

4) se colorează frotiul preparat cu albastru de Nil sau negru de Sudan şi se examinează la microscop după cum urmează.

Testul cu albastru de Nil

Pentru efectuarea testului cu albastru de Nil se respectă următoarele etape:

1) fiecare lamă se scufundă într-o soluţie apoasă de 1% de albastru de Nil A şi se incubează 10 minute la 55°C;

2) se scurge soluţia colorantă. Se spală rapid sub jet de apă. Excesul de apă se îndepărtează cu hîrtie absorbantă;

3) frotiul se scufundă într-o soluţie apoasă de acid acetic de 8% şi se incubează un minut la temperatura ambiantă;

4) se spală rapid sub jet de apă. Excesul de apă se îndepărtează cu hîrtie absorbantă;

5) se umezeşte cu o picătură de apă şi se aplică o lamelă de acoperire;

6) se examinează frotiul colorat la un microscop cu epifluorescenţă de 450 nm cu ulei de imersie, la o mărire de 600–1000, folosindu-se un obiectiv de imersie în ulei sau în apă;

7) se observă fluorescenţa portocalie strălucitoare a granulelor PHB. De asemenea, se observă la lumină albă, pentru a avea certitudinea că granulele sînt intracelulare şi că morfologia celulei este tipică pentru Ralstonia solanacearum.

Testul cu negru de Sudan

Pentru efectuarea testului cu negru de Sudan se respectă următoarele etape:

a) fiecare lamelă se scufundă într-o soluţie de 0,3% de negru de Sudan B în 70% etanol şi se incubează 10 minute la temperatura ambiantă;

b) se scurge soluţia colorantă şi se spală rapid sub jet de apă. Se îndepărtează excesul de apă cu hîrtie absorbantă;

c) lamele se trec rapid prin xilol şi se usucă cu hîrtie absorbantă;

d) se scufundă lamele în soluţie apoasă de safranină 0,5% şi se lasă 10 secunde la temperatura ambiantă;

e) se spală sub jet de apă. Se usucă cu hîrtie absorbantă şi se acoperă cu o lamelă;

f) se examinează frotiul colorat la un microscop optic, folosindu-se obiectivul de imersie la o mărire de 1000;

g) se observă granulele de PHB în celulele de Ralstonia solanacearum care se colorează în albastru-negru. Membrana celulară se colorează în roz.

3.Teste serologice de aglutinare

Aglutinarea celulelor de Ralstonia solanacearum în exsudatul bacterian sau în extractele de ţesuturi simptomatice se observă cel mai bine folosindu-se anticorpi validaţi (a se vedea anexa C la prezenta anexă), etichetaţi cu markeri coloraţi corespunzători, precum celulele de Staphylococcus aureus roşu sau particule de latex colorate. În caz de utilizare a unui material disponibil în comerţ (a se vedea anexa C la prezenta anexă), se urmează instrucţiunile producătorului, în caz contrar se urmează procedura descrisă în continuare:

1) se amestecă picăturile unei suspensii de anticorpi şi de exsudat bacterian marcate (circa 5 ľl în fiecare caz) pe ferestrele lamelor de testare cu multe godeuri;

2) se prepară suspensii de control pozitiv şi negativ din suspensii de Ralstonia solanacearum biovar 2 şi dintr-o tulpina heterologă;

3) se observă aglutinarea în probele pozitive după o omogenizare uşoară timp de 15 secunde.

4. Izolarea selectivă

4.1. Însămînţarea pe mediu selectiv

Înainte de aplicarea acestei metode pentru prima dată, se efectuează teste preliminare pentru a garanta o detecţie reproductibilă a 10³–10⁴ celule formatoare de colonii (cfu) per ml de Ralstonia solanacearum adăugată la extractele care au dat rezultate negative la testele anterioare.

Se foloseşte un mediu selectiv validat corespunzător, de exemplu SMSA (modificat de Elphinstone et al., 1996; vezi anexa B la prezenta anexă). De asemenea, trebuie diferenţiată Ralstonia solanacearum de alte bacterii care pot dezvolta colonii în mediul respectiv. În plus, coloniile de Ralstonia solanacearum pot prezenta o morfologie atipică în cazul în care plăcile sînt suprapopulate sau în cazul în care sînt, de asemenea, prezente bacterii antagoniste. În cazul în care se suspectează efectele de concurenţă sau de antagonism, proba trebuie testată din nou, utilizîndu-se o metodă de testare diferită.

Cea mai mare sensibilitate de detecţie, în cadrul acestei metode, poate fi atinsă în cazul în care se folosesc extracte de probe proaspăt preparate. Cu toate acestea, metoda se aplică, de asemenea, extractelor cu glicerol păstrate la o temperatură cuprinsă între –68° şi –86°C.

Se prepară, pentru control pozitiv, diluţii zecimale de suspensie de 10⁶ ufc/ml dintr-o tulpină virulentă biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Pentru a se evita orice risc de contaminare, controalele pozitive se prepară complet separat de probele pentru testat.

Fiecare lot de mediu selectiv proaspăt pregătit trebuie testat pentru a se vedea dacă este propice înmulţirii agentului patogen înainte de a-l utiliza pentru testarea probelor de rutină.

Materialul de control se testează în acelaşi mod ca şi probele.

4.1.1. Testul se efectuează cu ajutorul unei tehnici corespunzătoare de însămînţare cu scopul de a asigura diluarea întregii populaţii care formează colonii de saprofite. Se însămînţează 50-100 ľl din fiecare probă de extract şi fiecare diluţie.

4.1.2. Plăcile se incubează la 28°C. Citirea plăcilor se face după 48 de ore, iar apoi zilnic, pe o perioadă de pînă la 6 zile. Coloniile tipice de Ralstonia solanacearum în mediul nutritiv SMSA sînt de culoare alb-lăptos, plate, neregulate şi fluide, iar după 3 zile de incubare dezvoltă o coloraţie roz spre roşu-sîngeriu în centru, prezentînd spirale sau striaţii interne sau verticile.

Uneori, în acest mediu se formează colonii atipice de Ralstonia solanacearum. Ele pot fi mici, în întregime de culoare roşie şi nefluide sau parţial fluide, fiind, prin urmare, greu de deosebit de bacteriile saprofite care formează colonii.

4.1.3. Coloniile prezumtive de Ralstonia solanacearum se purifică după însămînţare sau diluare şi însămînţare pe mediu nutritiv general pentru a obţine colonii izolate (a se vedea anexa B la prezenta anexă).

4.1.4. Culturile pot fi păstrate pe termen scurt în apă sterilă (pH 6–8, fără clor) la temperatura ambiantă la întuneric sau pe termen lung într-un mediu crioprotector corespunzător între –68° şi –86°C sau liofilizate.

4.1.5. Se identifică culturile prezumtive (secţiunea VI partea B) şi se efectuează un test de patogenitate (secţiunea VI partea C).

Interpretarea rezultatelor testului de izolare pe mediu selectiv:

a) testul de însămînţare pe mediu selectiv este negativ atunci cînd după 6 zile nu sînt observate colonii bacteriene sau atunci cînd nu sînt observate colonii caracteristice Ralstonia solanacearum, cu condiţia să nu fie suspectată o inhibiţie datorată competiţiei sau antagonismului cu alte bacterii şi în cazul controalelor pozitive să fie observate colonii caracteristice de Ralstonia solanacearum;

b) testul de însămînţare pe mediu selectiv este pozitiv atunci cînd sînt observate colonii prezumtive de Ralstonia solanacearum.

4.2. Procedura de îmbogăţire

Se va utiliza un mediu de îmbogăţire validat precum mediul nutritiv modificat Wilbrink (anexa B la prezenta anexă).

Această procedură poate fi folosită pentru a creşte în mod selectiv populaţiile de Ralstonia solanacearum în probe şi pentru a creşte sensibilitatea detecţiei. Procedura permite, de asemenea, diluarea eficientă a inhibitorilor reacţiei PCR (1:100). Cu toate acestea, trebuie notat faptul că îmbogăţirea bacteriei Ralstonia solanacearum poate eşua din cauza concurenţei sau antagonismului organismelor saprofite care sînt de multe ori îmbogăţite simultan. În consecinţă, izolarea bacteriei Ralstonia solanacearum pe medii nutritive de cultură îmbogăţite poate fi dificilă. De asemenea, întrucît populaţiile de saprofite apropiate din punct de vedere serologic se pot înmulţi, în cazul utilizării testului ELISA se recomandă utilizarea de anticorpi monoclonali specifici în locul anticorpilor policlonali.

4.2.1. Îmbogăţirea pentru PCR presupune transferul a 100 ľl de extract de probă în 10 ml de mediu nutritiv lichid de îmbogăţire (anexa B la prezenta anexă) alicotat anterior în tuburi sau flacoane fără urme de ADN. Pentru îmbogăţirea ELISA se pot folosi proporţii mai mari de mediu nutritiv lichid (de exemplu 100 ľl în 1,0 ml de mediu nutritiv lichid de îmbogăţire).

4.2.2. Se incubează timp de 72 de ore între 27° şi 30°C într-o cultură agitată sau statică fără a închide ermetic dopul tubului, pentru a permite aerisirea.

4.2.3. Se amestecă bine înainte de a se utiliza pentru testele ELISA sau PCR.

4.2.4. În testele anterioare, mediul nutritiv lichid de îmbogăţire se tratează în acelaşi mod ca şi probele.

În cazul în care se prevede o inhibiţie a îmbogăţirii bacteriei Ralstonia solanacearum din cauza populaţiilor considerabile de anumite bacterii saprofite concurente, îmbogăţirea extractelor de probe înainte de centrifugare sau alte etape de concentrare pot determina obţinerea unor rezultate mai bune.

5. Testul de imunofluorescenţă

Ţinîndu-se cont de capacitatea recunoscută a testului de imunofluorescenţă de a atinge pragurile impuse, se recomandă utilizarea acestuia ca test principal de detecţie rapidă.

În cazul în care testul de imunofluorescenţă este utilizat ca principal test de detecţie rapidă şi rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare, un test PCR sau un test FISH drept test secundar.

În cazul în care testul de imunofluorescenţă este utilizat ca test secundar şi rezultatul lui este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare, după cum prevede diagrama funcţională.

Se utilizează o sursă validată de anticorpi de Ralstonia solanacearum. Se recomandă stabilirea titrului pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se defineşte ca fiind cea mai mare diluţie la care se obţine o reacţie optimă atunci cînd se testează o suspensie de 10⁵–10⁶ celule pe ml din tulpina omologă de Ralstonia solanacearum, folosindu-se un conjugat corespunzător de izotiocianat de fluoresceină (FITC), în conformitate cu recomandările producătorului. Toate antiserurile policlonale validate au un titru de imunofluorescenţă de cel puţin 1:2000. La efectuarea testului, diluţiile de lucru ale anticorpilor trebuie să fie aproximativ egale sau egale cu cele ale titrului.

Testul trebuie efectuat cu extracte de probe proaspăt preparate. După caz, se pot folosi şi extracte conservate în soluţie de glicerol la o temperatură cuprinsă între –68°C şi –86°C. Glicerolul poate fi separat de probă prin adăugarea a 1 ml de tampon concentrat (anexa D la prezenta anexă), recentrifugarea timp de 15 minute la 7.000 g şi resuspendarea în acelaşi volum de tampon concentrat. Acest lucru este rareori necesar, mai ales atunci cînd probele sînt fixate de lame prin flambare.

Separat se prepară lame de control pozitiv dintr-o tulpină omologă sau orice altă tulpină de referinţă de Ralstonia solanacearum în suspensie în extract de cartof, după cum prevede partea B din anexa C la prezenta anexă, şi, facultativ, în tampon.

În cazul în care este posibil, ar trebui să se folosească drept control similar pe aceeaşi lamă ţesut infectat în mod natural (conservat prin liofilizare sau congelare la o temperatură între –16° şi –24°C).

În calitate de control negativ, se pot folosi alicote de extracte de probe care au dat rezultate negative la testele anterioare de detecţie a bacteriei Ralstonia solanacearum.

Materialele de control pozitiv şi negativ standardizate, disponibile pentru acest test, sînt prevăzute în anexa C la prezenta anexă.

Se folosesc pentru microscop lame cu multe godeuri, avînd, de preferinţă, 10 ferestre cu diametru de cel puţin 6 mm.

Materialul de control se testează în acelaşi mod ca şi probele.

5.1. Lamele-test se prepară folosindu-se una dintre următoarele metode:

1) pentru extractele concentrate cu puţin amidon:

se pipetează un volum standard (15 ľl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru – volumul se măreşte pentru godeuri cu diametru mai mare) dintr-o diluţie de 1/100 de sediment resuspendat în primul godeu. Apoi se pipetează un volum similar de sediment nediluat (1/1) în godeurile rămase din primul rînd al lamei. Al doilea rînd poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele indicate în figura 1;

2) pentru alte extracte concentrate:

se pregătesc diluţii zecimale (1/10, 1/100) din sedimentul resuspendat în tampon concentrat. Se pipetează un volum standard (15 ľl este adecvat unui godeu de 6 mm diametru – volumul se măreşte pentru godeuri cu un diametru mai mare) din sedimentul resuspendat şi din fiecare diluţie pe un rînd de godeuri. Al doilea rînd poate fi folosit ca duplicat sau pentru o a doua probă, în conformitate cu cele prezentate în figura 2.

5.2. Se lasă picăturile să se usuce la temperatura ambiantă sau prin încălzire, la o temperatură de 40°– 45°C. Celulele bacteriene se fixează pe lamă prin încălzire (15 minute la 60°C), trecere prin flacără, cu 95% etanol, sau în conformitate cu instrucţiunile specifice ale furnizorilor de antiseruri.

În cazul în care este necesar, lamele fixate pot fi stocate la congelator într-o cutie uscată, atît cît este necesar (cel mult 3 luni), înainte de un nou test.

5.3. Procedura testului de imunofluorescenţă

1) în conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la pct.5.1 subpct.1), se prepară un set de diluţii de 1/2. În primul godeu diluţia ar trebui să fie de 1/2 din titru (T/2), celelalte fiind de 1/4 din titru (T/4), 1/2 din titru (T/2), titru (T) şi de două ori titrul (2T):

2) în conformitate cu metoda de pregătire a lamelor-test indicată la pct.5.1 subpct.2), se prepară diluţia de lucru a anticorpilor în tampon IF. Diluţia de lucru are efect asupra specificităţii.

Figura 1. Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct.5.1 subpct.1) şi pct.5.3 subpct.1)

Diluţii ale extractului concentrat resuspendat

Figura 2. Pregătirea lamei-test în conformitate cu pct.5.1 subpct.2) şi pct.5.3 subpct.2)

Diluţie de lucru a antiserului/anticorpilor

5.3.1. Lamele se aşază pe hîrtie absorbantă umedă. Se acoperă complet fiecare godeu de test cu diluţia sau diluţiile de anticorpi. Volumul de antiser pipetat în fiecare godeu trebuie să fie cel puţin echivalent cu volumul de extract pipetat pe lamă.

Următoarea procedură ar trebui aplicată în absenţa instrucţiunilor specifice ale furnizorilor de anticorpi.

5.3.2. Se incubează lamele pe hîrtie umedă acoperite timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18°–25°C).

5.3.3. Se îndepărtează antiserul de pe fiecare lamă şi se spală lamele cu atenţie cu tamponul IF. Se spală prin imersare în soluţie tampon IF-Tween (anexa D la prezenta anexă) timp de 5 minute şi apoi în tampon IF. Se evită formarea de aerosoli sau transferul de picături care ar putea conduce la o contaminare încrucişată. Excesul de tampon IF se îndepărtează cu grijă cu o hîrtie de filtru.

5.3.4. Lamele se aşază pe hîrtie umedă. Se acoperă godeurile lamelor-test cu diluţii ale conjugatului FITC utilizat pentru determinarea titrului. Volumul de conjugat pipetat în godeuri trebuie să fie egal cu volumul de anticorpi pipetat.

5.3.5. Se incubează lamele pe hîrtie umedă, acoperite, timp de 30 de minute la temperatura ambiantă (18–25°C).

5.3.6. Se îndepărtează conjugatul de pe lamă. Se spală în conformitate cu cele indicate anterior (pct.5.3.3.).

Se îndepărtează cu grijă excesul de tampon IF.

5.3.7. Se pipetează 5–10 ľl tampon glicerol fosfat 0,1 M (anexa D la prezenta anexă) sau o altă soluţie antidecolorare de montare comercială în fiecare godeu şi se acoperă cu o lamelă.

5.4. Citirea testului de imunofluorescenţă

5.4.1. Se examinează lamele-test la un microscop cu sursă de lumină epifluorescentă şi cu filtre adaptate pentru a lucra cu izotiocianat de fluoresceină, cu ulei de imersie sau în apă, la o mărire de 500–1000. Se examinează godeurile pe două diametre în unghi drept şi de-a lungul perimetrului. Pentru probele fără celule sau cu un număr redus de celule se examinează cel puţin 40 de cîmpuri microscopice.

Se verifică mai întîi lama de control pozitiv. Celulele trebuie să fie intens fluorescente şi colorate complet la titrul de anticorpi sau la diluţia de lucru determinată. Testul IF (pct.5) trebuie repetat în cazul în care apare o coloraţie anormală.

5.4.2. Se caută prezenţa celulelor intens fluorescente cu morfologie caracteristică bacteriei Ralstonia solanacearum în godeurile lamelor-test. Intensitatea fluorescenţei trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii de control pozitiv la aceeaşi diluţie de anticorpi. Celulele cu coloraţie incompletă sau cu fluorescentă slabă nu trebuie luate în considerare.

În cazul în care se suspectează o contaminare, testul trebuie repetat. Acest lucru se poate întîmpla atunci cînd în toate lamele unei serii de analize se observă celule pozitive din cauza unei contaminări a tamponului sau atunci cînd celulele pozitive se observă în afara godeurilor.

5.4.3. Există un anumit număr de probleme care afectează specificitatea testului de imunofluorescenţă. La nivelul conurilor de ţesut vascular şi în bucăţile de tulpini pot apărea populaţii de celule fluorescente atipice din punct de vedere morfologic, precum şi bacterii saprofite care pot conduce la reacţii încrucişate, avînd mărime şi morfologie asemănătoare cu Ralstonia solanacearum.

5.4.4. Trebuie luate în considerare numai celulele fluorescente ale căror dimensiune şi morfologie sînt caracteristice titrului sau diluţiei de lucru a anticorpilor menţionaţi la pct.5.3.

5.4.5. Interpretarea testului IF

În cazul în care se observă celule intens fluorescente cu morfologie caracteristică, se determină numărul mediu de celule tipice pe cîmp microscopic şi se calculează numărul de celule tipice pe ml de sediment resuspendat (anexa E la prezenta anexă).

Testul de imunofluorescenţă se consideră ca fiind pozitiv pentru probele care conţin cel puţin 5×10³ celule tipice pe ml de sediment resuspendat. Proba se consideră ca fiind potenţial contaminată, fiind necesare mai multe testări.

Testul de imunofluorescenţă se consideră ca fiind negativ pentru probele care conţin mai puţin de 5×10³ celule pe ml de sediment resuspendat. Proba se consideră ca fiind negativă, efectuarea altor teste nefiind obligatorie.

6. Testele PCR

În cazul în care testul PCR se foloseşte drept test principal de detecţie, iar rezultatul acestuia este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare sau un test de imunofluorescenţă drept al doilea test de detecţie obligatoriu. În cazul în care testul PCR se foloseşte ca test secundar, iar rezultatul este pozitiv, diagnoza trebuie completată cu teste suplimentare, după cum indică diagrama funcţională.

O exploatare completă a acestei metode ca test principal de detecţie se recomandă numai atunci cînd se dobîndeşte o expertiză specializată în domeniu.

Testele preliminare realizate în conformitate cu această metodă trebuie să permită detecţia reproductibilă a 10³–10⁴ celule pe ml de Ralstonia solanacearum adăugate extractelor de probe care au dat anterior rezultate negative. Poate fi necesară efectuarea unor experimente de optimizare în toate laboratoarele pentru a obţine niveluri maxime de sensibilitate şi de specificitate.

Se folosesc reactivi şi protocoale PCR validate (a se vedea anexa F la prezenta anexă). Se alege, de preferinţă, o metodă care să conţină un control intern.

Se iau măsurile de precauţie necesare pentru a se evita contaminarea probei cu ADN-ţintă. Testul PCR ar trebui realizat de tehnicieni experimentaţi în laboratoare de biologie moleculară specializate pentru a se reduce cît mai mult posibilitatea contaminării cu ADN-ţintă.

Controalele negative (pentru procedurile de extracţie de ADN şi amplificare PCR) ar trebui tratate întotdeauna ca probe finale în procedură pentru a indica o eventuală apariţie a unui transfer de ADN.

Următoarele controale negative ar trebui incluse în testul PCR:

extractul probei care a produs anterior rezultate negative pentru depistarea Ralstonia solanacearum;

tampoanele utilizate pentru extracţia ADN-ului din probă;

amestecul de reactivi pentru PCR.

Următoarele controale pozitive ar trebui incluse:

alicote de sedimente resuspendate la care s-a adăugat Ralstonia solanacearum (preparare: a se vedea partea B din anexa C la prezenta anexă);

suspensie de 10⁶ celule pe ml dintr-un izolat virulent de Ralstonia solanacearum în apă (de exemplu NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; a se vedea partea B din anexa C la prezenta anexă).

atunci cînd este posibil, se foloseşte, de asemenea, în testul PCR, ADN extras din probe de control pozitive.

Pentru a se evita o eventuală contaminare, controalele pozitive se prepară într-un mediu diferit de cel al probelor de testat.

Extractele probelor trebuie curăţate, atît cît este posibil, de particulele de sol. În anumite cazuri, atunci cînd se prevede utilizarea protocoalelor PCR, ar putea fi recomandabil să se prepare extracte de tuberculi de cartofi spălaţi.

Materialele de control pozitiv şi negativ standardizate, disponibile pentru utilizare în acest test, sînt prevăzute în anexa C la prezenta anexă.

6.1. Metode de purificare a ADN-ului

Se folosesc probe de control pozitive şi negative în conformitate cu metoda descrisă anterior (a se vedea anexa C la prezenta anexă).

Materialul de control se testează în acelaşi mod ca şi probele.

Există o serie de metode de purificare a ADN-ţintă din substraturile de probe complexe, ce permit eliminarea inhibitorilor PCR şi a altor reacţii enzimatice şi concentrează ADN-ul ţintă din probă. Următoarea metodă a fost optimizată pentru utilizare în cadrul metodelor PCR validate, indicate în anexa F la prezenta anexă.

Metoda Pastrik (2000):

1) se pipetează 220 ľl de tampon de liză [100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0)] într-un tub Eppendorf de 1,5 ml;

2) se adaugă 100 ľl de extract de probă şi se introduce într-un bloc de încălzire sau în baie de apă la 95°C timp de 10 minute;

3) se aşază tubul pe gheaţă timp de 5 minute;

4) se adaugă 80 ľl de soluţie concentrată de lizozimă (50 mg de lizozimă pe ml în 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) şi se incubează la 37°C timp de 30 de minute;

5) se adaugă 220 ľl de soluţie A de Easy DNA (Invitrogen), se amestecă bine prin vortexare şi se incubează la 65°C timp de 30 de minute;

6) se adaugă 100 ľl de soluţie B de Easy DNA (Invitrogen), se omogenizează bine prin vortexare pînă cînd precipitatul circulă liber în tub, iar proba are o consistenţă uniform-vîscoasă;

7) se adaugă 500 ľl de cloroform şi se omogenizează prin vortexare pînă cînd viscozitatea este redusă şi amestecul este omogen;

8) se centrifughează la 1000 g timp de 20 de minute la 4°C pentru a separa fazele şi a forma interfaza;

9) faza superioară se transferă într-un nou tub Eppendorf;

10) se adaugă 1 ml de etanol 100% (–20°C), se omogenizează scurt prin vortexare şi se incubează pe gheaţă timp de 10 minute;

11) se centrifughează la 15,000 g timp de 20 de minute la 4°C şi se îndepărtează etanolul din extractul concentrat;

12) se adaugă 500 ľl de etanol 80% (–20°C) şi se amestecă prin răsturnare;

13) se centrifughează la 15,000 g timp de 10 minute la 0°C, se păstrează sedimentul şi se îndepărtează etanolul;

14) sedimentul se lasă să se usuce în aer liber sau într-un SpeedVac ADN;

15) sedimentul se repune în suspensie în 100 ľl de apă ultrapură sterilă şi se lasă la temperatura ambiantă timp de cel puţin 20 de minute;

16) se depozitează la – 20°C pînă cînd extractul este necesar pentru PCR;

17) înainte de utilizare se centrifughează, pentru reacţia de amplificare prin PCR fiind necesari 5 ľl de supernatant conţinînd ADN.

Pot fi utilizate şi alte metode de extracţie a ADN-ului, de exemplu Qiagen DNeasy Plant Kit, cu condiţia ca acestea să aibă o eficacitate echivalentă de purificare a ADN-ului din probele de control pozitive cu un conţinut de 10³–10⁴ celule patogene per ml.

6.2. Amplificarea PCR

6.2.1. Se pregătesc extractele de ADN pentru testat şi controalele în conformitate cu protocoalele validate (pct.6). Se prepară o diluţie decimală din extractul de probă de ADN (1:10 în apă ultrapură).

6.2.2. Se prepară amestecul reactiv (mixul de amplificare) corespunzător pentru PCR într-un mediu necontaminat, în conformitate cu protocoalele publicate (anexa F la prezenta anexă). În cazul în care este posibil, se recomandă utilizarea unui protocol PCR multiplex care include un control intern al reacţiei PCR.

6.2.3. Se adaugă 2-5 ľl de extract de ADN pe 25 ľl mix PCR în tuburi PCR sterile, în conformitate cu protocoalele PCR (a se vedea anexa F la prezenta anexă).

6.2.4. Se include un control negativ conţinînd numai mix de amplificare şi se adaugă apă ultrapură, din aceeaşi sursă cu cea utilizată pentru mixul de amplificare PCR, în locul probei.

6.2.5. Tuburile se introduc în acelaşi termociclor utilizat la testul preliminar şi se lansează programul PCR optimizat în mod corespunzător (anexa F la prezenta anexă).

6.3. Analiza produsului reacţiei PCR

6.3.1. Fragmentele PCR sînt detectate prin electroforeză în gel de agaroză. Se pune sub tensiune la 5–8 V/cm o cantitate de cel puţin 12 ľl de ADN amplificat din fiecare probă la care se adaugă 3 ľl de tampon de încărcare (anexa F la prezenta anexă) în gel de agaroză 2% într-un tampon tris-acetat-EDTA (TAE) (anexa F la prezenta anexă). Se foloseşte un marker de ADN corespunzător mărimii aşteptate a amplimerului, precum cel de “100 bp leader”.

6.3.2. Pentru vizualizarea fragmentelor de ADN, se recurge la colorare cu bromură de etidiu (10,5 mg/l) timp de 30-60 de minute, luîndu-se măsurile de precauţie necesare pentru manipularea acestui agent mutagen.

6.3.3. În cazul unor produse PCR avînd mărimea aşteptată (a se vedea anexa F la prezenta anexă), gelul colorat se vizualizează prin iluminare ultravioletă cu unde scurte (λ = 302 nm) şi se notează rezultatele.

6.3.4. Pentru noile cazuri sau constatări se verifică autenticitatea fragmentului amplificat PCR, efectuîndu-se o analiză de restricţie enzimatică pe o probă de ADN amplificată rămasă. În acest scop, ADN-ul amplificat rămas se incubează la o temperatură optimă şi pe o perioadă optimă cu o enzimă şi un tampon corespunzător (a se vedea anexa F la prezenta anexă). Fragmentele restrictate se detectează prin electroforeză în gel de agaroză şi colorare cu bromură de etidiu în conformitate cu metoda descrisă anterior. Dispunerea tipică a fragmentelor după analiza de restricţie enzimatică se vizualizează prin iluminare ultravioletă. Fragmentele de ADN se compară cu tulpinile de control pozitiv înainte şi după restricţie.

Interpretarea rezultatului testului PCR

Testul PCR este negativ atunci cînd produsul PCR specific pentru Ralstonia solanacearum cu dimensiunea aşteptată nu este detectat pentru proba respectivă, dar pentru ansamblul de probe, în cazul unui multiplex PCR cu primeri de control intern specific plantei: un al doilea produs PCR cu dimensiunea aşteptată trebuie să fie amplificat cu probele respective.

Testul PCR este pozitiv în cazul în care produsul PCR caracteristic de Ralstonia solanacearum de dimensiunea şi tipul de restricţie (atunci cînd este restrictat) aşteptate este detectat, cu condiţia să nu existe amplificare la probele de control negativ. Se poate obţine o confirmare fiabilă a rezultatului pozitiv prin repetarea testului cu un al doilea set de primeri PCR (a se vedea anexa F la prezenta anexă).

Se poate suspecta o inhibiţie a PCR în cazul în care fragmentul amplificat prevăzut este obţinut în cazul controlului pozitiv de Ralstonia solanacearum în apă, dar se obţin rezultate negative în cazul controalelor pozitive conţinînd Ralstonia solanacearum în extractul de cartof. În protocoalele PCR compuse, cu control intern al PCR, se constată inhibiţia reacţiei atunci cînd nu se obţine nici unul dintre cele două fragmente amplificate.

Se poate suspecta o contaminare atunci cînd fragmentul amplificat prevăzut este obţinut din unul sau mai multe controale negative.

7. Testul FISH

În cazul în care testul FISH se foloseşte drept test principal de detecţie şi rezultatul lui este pozitiv, trebuie efectuat un test de izolare sau un test IF drept al doilea test obligatoriu de detecţie. În cazul în care testul IF se foloseşte ca test secundar şi rezultatul lui este pozitiv, analiza trebuie completată cu teste suplimentare, după cum indică diagrama funcţională.

Se folosesc oligosonde validate specifice pentru Ralstonia solanacearum (a se vedea anexa G la prezenta anexă). Testele preliminare efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită o detecţie reproductibilă de 10³–10⁴ celule pe ml de Ralstonia solanacearum adăugate la extractele de probe care au dat anterior rezultate negative.

Este de preferat să se aplice procedura descrisă în continuare extractelor de probe proaspăt preparate, dar se pot folosi şi extracte de probe conservate la temperaturi cuprinse între –16°C şi –24°C sau între –68° C şi –86°C.

Drept control negativ, se folosesc alicote de extracte de probe care au dat anterior rezultate negative la testele de identificare a Ralstonia solanacearum.

Drept control pozitiv, se folosesc suspensii conţinînd 10⁵–10⁶ celule pe ml de Ralstonia solanacearum biovar 2, de exemplu tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857 (a se vedea anexa C la prezenta anexă) preparate în tampon fosfat 0,01 M (PB), dintr-o cultură de 3–5 zile. Separat, se prepară lame de control pozitiv din tulpina omologă sau din orice altă tulpină de referinţă de Ralstonia solanacearum, în suspensie în extract de cartof, în conformitate cu partea B din anexa C la prezenta anexă.

Controlul procesului de hibridizare se realizează prin utilizarea unei oligosonde eubacteriene marcate cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) care colorează toate eubacteriile prezente în probă.

Materialele de control pozitiv şi negativ standardizate disponibile pentru acest test sînt prevăzute în partea A din anexa C la prezenta anexă.

Materialul de control se testează în acelaşi mod ca şi probele.

7.1. Fixarea extractului de cartof

Protocolul descris în continuare se bazează pe Wullings et al. (1998):

7.1.1. Se prepară soluţia de fixare (a se vedea anexa G la prezenta anexă).

7.1.2. Se pipetează 100 ľl din fiecare extract de probă într-un tub Eppendorf şi se centrifughează timp de 7 minute la 7,000 g.

7.1.3. Se îndepărtează supernatantul, iar sedimentul se resuspendă în 200 ľl de soluţie de fixare preparată cu mai puţin de 24 de ore înainte. Se omogenizează prin vortexare şi se incubează timp de o oră în frigider.

7.1.4. Se centrifughează timp de 7 minute la 7.000 g, se îndepărtează supranatantul, iar sedimentul se resuspendă în 75 ľl de PB 0,01 M (a se vedea anexa G la prezenta anexă).

7.1.5. Se pipetează 16 ľl din suspensiile fixate pe o lamă multitest curată, în conformitate cu figura 7.1. Pe fiecare lamă se pipetează două probe diferite, nediluate, şi 10 ľl diluţie de 1:100 ale acestora (într-un tampon fosfat 0,01 M). Restul suspensiei (49 ľl) poate fi conservată la – 20°C după ce i s-a adăugat un volum de etanol de 96%. În cazul în care testul FISH trebuie repetat, se elimină etanolul prin centrifugare şi se adaugă un volum echivalent de tampon fosfat 0,01 M (omogenizaţi prin vortexare).

Figura 7.1. Configuraţia unei lame pentru testul FISH

7.1.6. Se usucă lamele la temperatura ambiantă (sau într-un uscător, la 37°C), apoi se fixează prin Hambare.

Procedura de hibridizare poate fi întreruptă în acest stadiu şi continuată a doua zi. Lamele trebuie păstrate într-un loc uscat, la temperatura ambiantă, ferite de praf.

7.2. Hibridizare

7.2.1. Se deshidratează celulele prin băi succesive de etanol de 50%, 80% şi 96%, cu o durată de un minut fiecare. Se aranjează lamele pe un suport şi se lasă la uscat la temperatura ambiantă.

7.2.2. Se realizează o cameră de incubare umedă căptuşind fundul unei cutii ermetice cu hîrtie absorbantă sau cu hîrtie de filtru impregnată cu hibmix 1X (a se vedea anexa G la anexa nr.2 la prezentele Măsuri). Cutia se preincubează timp de cel puţin 10 minute în incubatorul de hibridizare la o temperatură de 45°C.

7.2.3. Se pipetează 10 ľl de soluţie de hibridizare (anexa G la anexa nr.2 la prezentele Măsuri) în 8 godeuri: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 şi 10 (a se vedea figura 7.1) ale fiecărei lame, lăsînd goale cele două godeuri din mijloc (3 şi 8).

7.2.4. Se acoperă cu lamele (24×24 mm) primul şi ultimele 4 godeuri, avînd grijă să nu prindă aer sub ele. Lamele se introduc în camera umedă încălzită în prealabil şi se lasă timp de 5 ore în incubator la 45°C la întuneric, pentru hibridizare.

7.2.5. Se pregătesc 3 recipiente conţinînd 1 l de apă Milli Q (biologie moleculară), 1 l de hibmix 1X în 334 ml de hibmix 3X (666 ml de apă Milli Q (biologie moleculară)) şi 1 l de hibmix 1/8X în 42 ml de hibmix 3X şi 958 ml de apă Milli Q (biologie moleculară). Se preincubează fiecare recipient în baie de apă la 45°C.

7.2.6. Se îndepărtează lamelele de pe lame şi se aşază pe un suport de lame.

7.2.7. Se elimină excesul de probă prin incubare timp de 15 minute la 45°C în recipientul cu hibmix 1X.

7.2.8. Se transferă suportul cu lame într-o soluţie de spălare cu hibmix 1/8X şi se lasă la incubat timp de încă 15 minute.

7.2.9. Lamele se introduc scurt într-o baie de apă Milli Q şi se aşază pe o hîrtie de filtru. Se îndepărtează umiditatea în exces tamponînd uşor suprafaţa umedă cu hîrtie de filtru. Se pipetează în fiecare godeu 5-10 ľl de soluţie antidecolorare (de exemplu Vectashield, produs de Vecta Laboratories CA, USA, sau altă soluţie echivalentă) şi se acoperă întreaga suprafaţă a lamei cu o lamelă (24×60 mm).

7.3. Citirea testului FISH

7.3.1. Lamele se examinează imediat cu ajutorul unui microscop cu epifluorescenţă, cu obiectivul de imersie, în ulei de imersie la o mărire de 630×1000. Cu un filtru sensibil la izotiocianat de fluoresceină (FITC), celulele eubacteriene prezente în probe (inclusiv majoritatea celulelor Gramnegative) apar colorate în verde fluorescent. Cu un filtru adaptat la tetrametil-rodamin-5-izotiocianat, celulele de Ralstonia solanacearum marcate cu Cy3 apar colorate în roşu fluorescent. Se compară morfologia celulelor din probe cu cea a celulelor din controlul pozitiv. Celulele trebuie să fie colorate complet şi intens fluorescente. Testul FISH (pct.7) trebuie repetat în cazul în care apare o coloraţie anormală. Godeurile se examinează de-a lungul a două diametre perpendiculare şi în jurul perimetrului. Pentru probele care nu conţin celule sau conţin un număr mic de celule, se examinează cel puţin 40 de cîmpuri microscopice.

7.3.2. Se observă prezenţa celulelor intens fluorescente, cu o morfologie tipică de Ralstonia solanacearum în ferestrele de test ale lamelor. Intensitatea fluorescentei trebuie să fie echivalentă cu cea a tulpinii de control pozitiv sau mai bună. Celulele cu coloraţie incompletă sau cu fluorescentă slabă nu trebuie luate în considerare.

7.3.3. La cea mai mică suspiciune de contaminare, testul trebuie repetat. Aceasta se poate întîmpla atunci cînd în toate lamele unei serii de analize se observă celule pozitive din cauza contaminării tamponului sau atunci cînd celulele pozitive se observă în afara godeurilor.

7.3.4. Există un anumit număr de probleme inerente care afectează specificitatea testului FISH. La nivelul conurilor de ţesut vascular şi tulpinii pot apărea populaţii de celule fluorescente cu morfologie atipică şi populaţii de bacterii saprofite care dau reacţii încrucişate, avînd dimensiuni şi morfologii asemănătoare cu celulele de Ralstonia solanacearum, însă într-o proporţie mult mai mică decît în cazul testului IF.

7.3.5. Se iau în considerare numai celulele fluorescente cu dimensiune şi morfologie tipice.

7.3.6. Interpretarea rezultatului testului FISH

Testul FISH este valid atunci cînd celulele intens fluorescente de culoare verde, cu dimensiuni şi morfologie tipice pentru Ralstonia solanacearum, sînt vizibile cu ajutorul filtrului FITC şi celulele intens fluorescente de culoare roşie sînt vizibile folosindu-se filtrul cu rodamină în toate controalele pozitive, iar în controlul negativ nu se observă nici o celulă. În cazul în care proba conţine celule intens fluorescente, cu o morfologie tipică, se estimează numărul mediu de celule tipice pe cîmp microscopic şi se calculează numărul de celule tipice pe ml de sediment resuspendat (anexa D la prezentă anexă). Probele ce conţin cel puţin 5×10³ celule tipice pe ml de sediment resuspendat se consideră ca fiind potenţial infectate şi se recomandă continuarea testelor. Probele ce conţin mai puţin de 5×10³ celule tipice pe ml de sediment resuspendat sînt considerate ca fiind negative.

Testul FISH este negativ în cazul în care celulele intens fluorescente de culoare roşie, avînd dimensiuni şi morfologie caracteristice pentru Ralstonia solanacearum, nu se observă cu ajutorul filtrului cu rodamină, cu condiţia ca celulele intens fluorescente de culoare roşie să fie vizibile în lamele de control pozitiv folosindu-se filtrul cu rodamină.

8. Testele ELISA

Testul ELISA nu poate fi utilizat ca test secundar pe lîngă testele IF, PCR sau FISH din cauza sensibilităţii relativ slabe. În cazul aplicării metodei DAS-ELISA, îmbogăţirea probelor şi utilizarea anticorpilor monoclonali sînt obligatorii. Îmbogăţirea probelor înainte de efectuarea testului ELISA poate fi utilă pentru creşterea sensibilităţii acestuia, dar poate să inhibe testul din cauza competiţiei cu alte organisme prezente în probă.

Se foloseşte o sursă validată de anticorpi de Ralstonia solanacearum.

Se recomandă să se determine titrul pentru fiecare lot nou de anticorpi. Titrul se defineşte ca fiind cea mai mare diluţie la care se obţine o reacţie optimă atunci cînd se testează o suspensie de 10⁵–10⁶ celule pe ml din tulpina omologă de Ralstonia solanacearum folosindu-se conjugate corespunzătoare de anticorpi secundari, în conformitate cu recomandările producătorului. La efectuarea testului, diluţia de lucru a anticorpilor trebuie să fie aproximativ egală sau egală cu cea a titrului formulei comerciale.

Se determină titrul anticorpilor pentru o suspensie de 10⁵–10⁶ celule/ml dintr-o tulpină omologă de Ralstonia solanacearum.

Drept controale negative se utilizează un extract de probă care a dat anterior rezultate negative pentru Ralstonia solanacearum şi o suspensie bacteriană preparată în tampon fosfat care nu provoacă reacţii încrucişate. Drept control pozitiv se folosesc extracte de probe care au dat anterior rezultate negative, la care s-a adăugat 10³–10⁴ celule/ml de biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu, tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857 (a se vedea părţile A şi B din anexa B la prezenta anexă). Pentru a compara rezultatele din fiecare placă se foloseşte o suspensie standard de 10⁵–10⁶ celule/ml în PBS de Ralstonia solanacearum. Controalele pozitive trebuie să fie pipetate cu grijă pe placa de microtitrare, separat de proba sau probele care fac obiectul testului. Materialele de control pozitiv şi negativ standardizate, disponibile pentru utilizare în acest test, sînt enumerate în partea A din anexa C la prezenta anexă.

Materialul de control se testează în acelaşi mod ca şi probele.

Au fost validate două protocoale ELISA:

1) ELISA indirect (Robinson-Smith et al., 1995):

a) se folosesc alicote de 100–200 ľl de sediment resuspendat (pentru a reduce rezultatele nespecifice se încălzesc timp de 4 minute la 100°C în baie de apă sau într-un bloc de încălzire);

b) se adaugă un volum egal de tampon 2X (anexa D la prezenta anexă) şi se omogenizează prin vortexare;

c) se pipetează alicote de 100 ľl de extract în cel puţin două godeuri ale plăcii de microtitrare (de exemplu Nunc-Polysorp sau echivalent) şi se incubează o oră la 37°C sau peste noapte la 4°C;

d) se îndepărtează extractele din godeuri. Se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (anexa D la prezenta anexă), lăsînd ultima soluţie de spălare în godeuri cel puţin 5 minute;

e) se prepară diluţia corespunzătoare a antiserului anti-Ralstonia solanacearum în tampon de saturaţie (anexa D la prezenta anexă). Pentru anticorpii comerciali validaţi, se folosesc diluţiile recomandate (de obicei, de două ori mai concentrate decît titrul);

f) se pipetează 100 ľl în fiecare godeu şi se incubează o oră la 37°C;

g) se îndepărtează soluţia de anticorpi din godeuri şi se spală în conformitate cu cele indicate anterior (subpunctul d));

h) se prepară diluţia corespunzătoare de conjugat secundar de anticorpi şi de fosfatază alcalină în tampon de saturaţie. Se pipetează 100 ľl în fiecare godeu şi se incubează o oră la 37°C;

i) se îndepărtează conjugatul de anticorpi din godeuri şi se spală în conformitate cu cele indicate anterior (subpunctul d));

j) se pipetează 100 ľl de soluţie de substrat de fosfatază alcalină (anexa D la prezenta anexă) în fiecare godeu. Se incubează în întuneric la temperatura ambiantă şi se măsoară absorbanta la 405 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute;

2) DAS-ELISA:

a) se prepară diluţia corespunzătoare de imunoglobuline policlonale anti-Ralstonia solanacearum în tampon concentrat cu pH 9,6 (anexa D la prezenta anexă). Se adaugă 200 ľl în fiecare godeu. Se incubează timp de 4-5 ore la 37°C sau timp de 16 ore la 4°C;

b) se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (anexa D la prezenta anexă). Se adaugă 190 ľl de extract de probă în cel puţin două godeuri. De asemenea, se adaugă controlul pozitiv şi negativ în cîte două godeuri pe fiecare placă. Se incubează timp de 16 ore la 4°C;

c) se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (anexa D la prezenta anexă);

d) se prepară o diluţie corespunzătoare de anticorpi monoclonali specifici Ralstonia solanacearum în PBS (anexa D la prezenta anexă) conţinînd, de asemenea, 0,5% seralbumină bovină (BSA) şi se pipetează 190 ľl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37°C;

e) se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (anexa D la prezenta anexă);

f) se prepară o diluţie corespunzătoare de imunoglobuline antişoarece conjugate cu fosfatază alcalină în PBS. Se adaugă 190 ľl în fiecare godeu. Se incubează două ore la 37°C;

g) se spală godeurile de 3 ori cu PBS-Tween (anexa D la prezenta anexă);

h) se prepară o soluţie de substrat de fosfatază alcalină conţinînd 1 mg de p-nitrofenil fosfat pe ml de soluţie tampon (anexa D la prezenta anexă). Se adaugă 200 ľl în fiecare godeu. Se incubează la întuneric la temperatura ambiantă şi se măsoară absorbanta la 40 nm la intervale regulate în termen de 90 de minute.

Interpretarea rezultatelor testelor ELISA

Testul ELISA este negativ atunci cînd densitatea optică (DO) medie a godeurilor probei duplicate este mai mică de două ori decît densitatea optică a godeurilor controlului negativ, cu condiţia ca densitatea optică a controlului pozitiv să fie întotdeauna mai mare de 1,0 (după 90 de minute de incubare cu substratul) şi de două ori mai mare decît densitatea optică obţinută pentru controlul negativ.

Testul ELISA este pozitiv atunci cînd densitatea optică (DO) medie a godeurilor probei duplicate este mai mare de două ori decît densitatea optică a godeurilor controlului negativ, cu condiţia ca DO pentru toate godeurile de control negativ să fie mai mică decît de două ori DO obţinută pentru godeurile de control pozitiv.

O citire negativă a testului ELISA în godeurile de control pozitiv indică faptul că testul nu a fost efectuat corect sau că a fost inhibat. O citire pozitivă a testului ELISA în godeurile de control negativ indică o contaminare încrucişată sau o reacţie nespecifică.

9. Testul biologic

Testele preliminare efectuate în conformitate cu această metodă trebuie să permită o detecţie reproductibilă a 10³–10⁴ celule formatoare de colonii (UFC) per ml de Ralstonia solanacearum adăugate la extractele de probe care au dat anterior rezultate negative (preparare: a se vedea anexa C la prezenta anexă).

Sensibilitatea cea mai mare de detecţie poate fi atinsă atunci cînd se folosesc extracte de probe proaspăt preparate şi în condiţii optime de creştere. Cu toate acestea, metoda se poate aplica cu succes extractelor păstrate în glicerol la o temperatură cuprinsă între –68° şi –86°C.

Următorul protocol se bazează pe protocolul Janse (1988):

9.1. Pentru fiecare probă se utilizează 10 plante-test ale unui soi (cultivar) de tomate sensibil (de exemplu Moneymaker sau un cultivar cu o sensibilitate echivalentă stabilită în laboratorul de testare) în stadiul celei de-a treia frunze adevărate. Pentru detalii privind cultura, vezi (a se vedea anexa H la prezenta anexă). De asemenea, se pot utiliza vinete (de exemplu Black Beauty sau cultivări cu o sensibilitate echivalentă), folosindu-se numai plante în stadiul celei de-a doua sau a treia frunze pînă la dezvoltarea completă a celei de-a treia frunze adevărate. Cu toate acestea, s-a constatat că la plantele de vinete simptomele sînt mai puţin severe şi se dezvoltă mai încet. Prin urmare, atunci cînd este posibil, se recomandă utilizarea plantulelor de tomate.

9.2. Se inoculează 100 ľl de extract în fiecare plantă-test.

9.2.1. Inocularea prin injectare: plantele-test se inoculează în tulpină chiar deasupra cotiledoanelor cu ajutorul unei seringi cu ac hipodermic (minimum 23G). Se repartizează eşantionul între plantele-test.

9.2.2. Inoculare prin incizie: se ţine planta între două degete şi se pipetează pe tulpină, între cotiledoane şi prima frunză, o picătură (circa 5–10 ľl) de extract de probă.

Cu ajutorul unui bisturiu steril, plecînd de la picătura de extract, se face o incizie diagonală pe o lungime de 1 cm şi cu o adîncime egală cu aproximativ două treimi din grosimea tulpinii. Se închide incizia aplicînd vaselină sterilă cu ajutorul unei seringi.

9.3.Prin aceeaşi tehnică se inoculează 5 plantule cu o suspensie apoasă de 10⁵–10⁶ celule per ml dintr-o cultură virulentă de 48 de ore de Ralstonia solanacearum biovar 2 drept control pozitiv şi 5 plantule cu tampon fosfat (anexa D la prezenta anexă) drept control negativ. Se separă plantele control pozitiv şi negativ de celelalte plante pentru a se evita contaminările încrucişate.

9.4. Plantele-test se cresc în încăperi de carantină pînă la 4 săptămîni la temperatura de 25–30°C şi umiditate relativ mare, fiind stropite în mod corespunzător pentru a preveni o suprasaturare hidrică au ofilirea din lipsă de apă. Pentru a se evita contaminarea, plantele control pozitiv şi negativ se incubează separat în standuri separate în mod corespunzător într-o seră ori cameră de cultivare sau, în cazul în care spaţiul este limitat, se asigură o separare strictă între metodele de tratare. Atunci cînd plantele aparţinînd unor probe diferite trebuie incubate în apropiere unele de celelalte, trebuie prevăzute între ele ecrane de separare corespunzătoare. În timpul fertilizării, stropirii, controlului sau oricărei alte manipulări, trebuie luate toate măsurile de precauţie pentru a se evita o contaminare încrucişată. Este esenţial ca în serele şi camerele de cultivare să nu fie insecte, dat fiind faptul că acestea ar putea transmite bacteria de la o probă la alta.

Se observă apariţia simptomelor de ofilire: epinastie, cloroză şi/sau pipernicire.

9.5. Se izolează plantele infectate şi se identifică culturile purificate de cele prezumtive (suspecte) de Ralstonia solanacearum (secţiunea VI partea B).

9.6. În cazul în care nu se observă nici un simptom după 3 săptămîni, se efectuează un test IF/PCR/de izolare pe o probă formată din bucăţi de tulpină de 1 cm prelevate de la fiecare plantă-test chiar deasupra punctului de inoculare. În cazul în care testul este pozitiv, se efectuează însămînţarea pe mediu de cultură (secţiunea VI partea B).

9.7. Se identifică toate culturile purificate prezumtive de Ralstonia solanacearum (secţiunea VI partea B).

Interpretarea rezultatelor testului biologic:

Rezultatele testului biologic sînt valide atunci cînd plantele de control pozitiv prezintă simptome tipice, bacteriile pot fi reizolate din aceste plante şi nu se observă nici un simptom la plantele de control negativ.

Testul biologic este negativ în cazul în care plantele-test inoculate cu extract de probă nu sînt infectate cu Ralstonia solanacearum şi cu condiţia ca Ralstonia solanacearum să fie detectată în plantele de control pozitiv.

Testul biologic este pozitiv dacă plantele-test sînt infectate cu Ralstonia solanacearum.

B. Teste de identificare

Culturile pure prezumtive de Ralstonia solanacearum se identifică prin cel puţin unul dintre următoarele teste bazate pe principii biologice diferite.

Se includ, după caz, tulpini de referinţă cunoscute, pentru fiecare test efectuat (a se vedea anexa C la prezenta anexă).

1. Teste de identificare enzimatice şi de nutriţie

Se stabilesc următoarele caracteristici fenotipice prezente sau absente sistematic la Ralstonia solanacearum, în conformitate cu metodele descrise de Lelliott şi Stead (1987), Klement et al. (1990) şi Schaad (2001).

2.Testul IF

2.1. Se prepară o suspensie de circa 10⁶ celule/ml în tampon IF (anexa D la prezenta anexă).

2.2. Se prepară o serie de diluţii de 1/2 dintr-un antiser corespunzător.

2.3. Se aplică procedura testului IF (secţiunea VI partea A punctul 5).

2.4. Pentru ca un test IF să fie pozitiv, titrul obţinut pentru cultură trebuie să fie echivalent cu cel al controlului pozitiv.

3.Testul ELISA

În cazul în care se efectuează numai două teste de identificare, nu se efectuează alte teste serologice pe lîngă această metodă.

3.1. Se prepară o suspensie de circa 10⁸ celule/ml în PBS 1X (a se vedea anexa D la prezenta anexă).

3.2. Se aplică procedura ELISA corespunzătoare cu un anticorp monoclonal specific de Ralstonia solanacearum.

3.3. Un test ELISA este pozitiv atunci cînd densitatea optică a culturii este egală cel puţin cu 1/2 din densitatea optică obţinută pentru controlul pozitiv.

4. Testul reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR)

4.1. Se prepară o suspensie de circa 10⁶ celule/ml în apă sterilă ultrapură.

4.2. Se pipetează 100 ľl din suspensie în tuburi închise şi se pun într-un bloc de încălzire sau pe baie de apă la 100°C timp de 4 minute. Apoi probele pot fi păstrate la o temperatură între –16 şi –24°C pînă în momentul în care sînt utilizate în următoarele etape ale testului PCR.

4.3. Se aplică protocoalele PCR corespunzătoare pentru amplificarea fragmentelor tipice de Ralstonia solanacearum vezi, de exemplu, Seal et al. (1993), Pastrik & Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).

4.4. O identificare pozitivă a bacteriei Ralstonia solanacearum se obţine atunci cînd fragmentele amplificate prin PCR au aceeaşi dimensiune şi aceleaşi polimorfisme ale dimensiunii fragmentelor de restricţie cu cele ale tulpinii de control pozitiv.

5. Testul de hibridizare fluorescentă in situ (FISH)

5.1. Se prepară o suspensie de circa 10⁶ celule/ml în apă ultrapură.

5.2. Se aplică procedura FISH (secţiunea VI partea A punctul 7) folosindu-se cel puţin două oligosonde specifice pentru Ralstonia solanacearum (anexa G la prezenta anexă).

5.3. Pentru ca un test FISH să fie pozitiv, cultura trebuie să prezinte aceleaşi reacţii ca şi controlul pozitiv.

6. Profilul acizilor graşi (FAP)

6.1. Se realizează o cultură de 48 de ore (28°C) pe mediu tripticaz-soia-agar (Oxoid).

6.2. Se aplică procedura FAP corespunzătoare (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Pentru ca un test FAP să fie pozitiv, profilul culturii prezumtive trebuie să fie identic cu cel al controlului pozitiv. Prezenţa acizilor graşi caracteristici 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH şi 18:1 2OH şi absenţa 16:0 3OH indică prezenţa Ralstonia solanacearum.

7. Metode de caracterizare a tulpinii

Se recomandă o caracterizare a tulpinii prin una dintre următoarele metode pentru fiecare caz nou de izolare a bacteriei Ralstonia solanacearum.

Se includ, după caz, tulpini de referinţă cunoscute pentru fiecare test efectuat (a se vedea anexa C la prezenta anexă).

7.1. Determinarea biovarului

Există diferite biovaruri de Ralstonia solanacearum în funcţie de capacitatea lor de a utiliza şi/sau oxida 3 zaharuri şi 3 hexoze alcoolice (Hayward, 1964 şi Hayward et al., 1990). Mediile de creştere pentru testul biovarului sînt descrise în anexa B la prezenta anexă. Testul poate fi realizat inoculînd prin injectare profundă a mediilor cu culturi pure de izolat de Ralstonia solanacearum şi incubare la 28°C. În cazul în care mediile sînt repartizate pe plăci de cultură cu 96 de godeuri sterile (200 ľl/godeu), se poate observa o modificare a culorii, în 72 de ore, din verde-oliv în galben, ceea ce indică un rezultat pozitiv al testului.

7.2. Amprentare genomică

Diferenţierea moleculară a tulpinilor din complexul Ralstonia solanacearum se poate face prin:

7.2.1. Analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricţie (RFLP) (Cook et al., 1989);

7.2.2. PCR realizat pe secvenţe repetitive folosindu-se primeri REP, BOX şi ERIC (Louws et al, 1995; Smith et al, 1995);

7.2.3. Analiza polimorfismului dimensiunii fragmentelor de restricţie amplificate (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. Metodele PCR

Se pot folosi primeri specifici PCR (Pastrik et al., 2002; vezi anexa F la prezenta anexă) pentru a diferenţia tulpinile aparţinînd diviziunii 1 (biovari 3, 4 şi 5) şi diviziunii 2 (biovari 1, 2A şi 2T) ale Ralstonia solanacearum, definite iniţial de analiza RFLP (Cook et al., 1989) şi analiza secvenţei 16S a ADNr (Taghavi et al., 1996).

C. Testul de confirmare

Testul de patogenitate trebuie efectuat pentru confirmarea finală a diagnosticului şi pentru evaluarea virulenţei culturilor identificate ca fiind Ralstonia solanacearum, respectînd următoarele etape:

1) se prepară un inoculum de circa 10⁶ celule/ml dintr-o cultură de 24–48 de ore dintr-o tulpină corespunzătoare de control pozitiv de Ralstonia solanacearum, de exemplu NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857 (a se vedea anexa C la prezenta anexă);

2) se inoculează 5–10 plantule de tomate sau vinete sensibile, în stadiul celei de a treia frunze adevărate (a se vedea secţiunea VI partea A punctul 9);

3) se incubează pînă la două săptămîni la 25–28°C şi umiditate relativă crescută, asigurînd o stropire corespunzătoare pentru a preveni suprasaturarea hidrică sau stresul de deshidratare. În cazul culturilor pure, în 15 zile ar trebui să intervină ofilirea. În absenţa simptomelor la sfîrşitul acestei perioade, cultura nu poate fi confirmată ca fiind o formă patogenă de Ralstonia solanacearum;

4) se observă apariţia simptomelor de ofilire şi/sau epinastie, cloroză şi de pipernicire;

5) se izolează plantele simptomatice îndepărtînd o secţiune de ţesut din tulpină la 2 cm deasupra punctului de inoculare. Se mărunţeşte şi se suspendă într-un volum mic de apă distilată sterilă sau tampon fosfat de 50 mM (anexa D la prezenta anexă). Se însămînţează suspensia pe un mediu adecvat, de preferinţă mediu selectiv (anexa B la prezenta anexă), se incubează timp de 48–72 de ore la 28°C şi se observă formarea coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum.

Anexa A

la anexa nr.2

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

Laboratoarele care efectuează optimizarea

şi validarea protocoalelor

Anexa B

la anexa nr.2

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

Medii pentru izolarea şi cultivarea

bacteriei Ralstonia solanacearum

Medii de creştere în general

Agar nutritiv (AN)

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Drojdie – peptonă – glucoză-agar (YPGA)

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Zaharoză – peptonă – agar (SPA)

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Mediul tetrazoliu Kelman

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Se răceşte la 50°C şi se adaugă o soluţie apoasă sterilizată prin filtrare de clorură de 2,3,5-trifeniltetrazoliu (Sigma) pentru obţinerea unei concentraţii finale de 50 mg la litru.

Medii de creştere selective validate

Mediu SMSA (Englebrecht, 1994, modificat de Elphinstone et al., 1996)

Mediu de bază

Se dizolvă ingredientele. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Se răceşte la 50°C şi se adaugă soluţii apoase concentrate, sterilizate prin filtrare, conţinînd următoarele ingrediente pentru obţinerea concentraţiilor finale specificate:

Observaţii

1. Utilizarea altor reactivi decît cei menţionaţi anterior poate afecta creşterea bacteriei Ralstonia solanacearum.

2. Agarul de tip oxoid nr.1 poate fi înlocuit de Bacto-agar (Difco). În acest caz, creşterea bacteriei Ralstonia solanacearum va fi mai lentă, dar şi creşterea bacteriilor saprofite concurente ar putea fi, de asemenea, redusă. Dezvoltarea coloniilor tipice de Ralstonia solanacearum poate dura o zi sau două în plus, iar coloraţia roşie poate fi mai puţin pronunţată decât pe mediu de Bacto-agar.

3. O creştere a concentraţiei de bacitracină la 2.500 de unităţi la litru poate reduce populaţiile de bacterii concurente fără a perturba creşterea bacteriei Ralstonia solanacearum.

Mediile şi soluţiile concentrate de antibiotice se păstrează la 4°C la întuneric şi timp de maximum o lună.

Trebuie asigurată absenţa condensului pe suprafaţa plăcilor înainte de utilizare.

Se va evita uscarea excesivă a plăcilor.

După prepararea fiecărui lot nou de mediu de cultură trebuie efectuat un control de calitate prin însămînţarea unei suspensii dintr-o cultură de referinţă de Ralstonia solanacearum (vezi anexa C la prezenta anexă) şi se observă formarea de colonii tipice după incubarea la 28°C timp de 2-5 zile.

Medii de îmbogăţire validate

Mediu nutritiv SMS/4 (Elphinstone et al., 1996) – se prepară ca şi pentru mediul selectiv SMSA, dar se elimină Bacto-agar şi clorura de 2-3-5-tetrazoliu.

Mediu nutritiv modificat Wilbrink (Caruso et al., 2002):

Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute şi se răceşte la 50°C.

Se adaugă soluţii concentrate de antibiotice ca şi pentru mediul nutritiv SMSA.

Anexa C

la anexa nr.2

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

A. Material de control standardizat disponibil în comerţ

Tulpini bacteriene

Următoarele tulpini bacteriene se recomandă spre utilizare în calitate de material standard de referinţă sau control pozitiv (tabelul 1) sau pe parcursul optimizării testelor pentru a evita reacţiile încrucişate (tabelul 2). Toate tulpinile sînt disponibile în comerţ la următoarele adrese:

National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK;

Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Ţările de Jos;

Collection frangaise de bacteries phytopathogenes (CFBP), INRA- Station de phytobacteriologie, Angers, Franţa.

Material de control standardizat disponibil în comerţ

Următorul material de control standardizat este disponibil în colecţia de culturi NCPPB:

granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de cartof sănătoşi în calitate de control negativ pentru ansamblul testelor;

granule liofilizate de extract din 200 tuberculi de cartofi sănătoşi conţinînd 10³–10⁴ şi 10⁴–10⁶ celule de biovar 2 de Ralstonia solanacearum (de exemplu tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) în calitate de control pozitiv pentru testele serologice şi testul PCR. Întrucît liofilizarea afectează viabilitatea celulelor, acestea nu pot fi folosite drept control standard pentru testele de izolare sau testele biologice;

suspensii fixate cu formalină de Ralstonia solanacearum biovar 2 (tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) de concentraţie 10⁶ celule/ml în calitate de control pozitiv pentru testele serologice.

B. Pregătirea controalelor pozitive şi negative pentru testele rapide

de detecţie PCR/ F şi FISH efectuate pe conuri de cartof

Se realizează o cultură de 48 de ore dintr-o tulpină virulentă de Ralstonia solanacearum biovar 2 rasa 3 (de exemplu tulpina NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) pe mediu general SMSA şi se face o suspensie în tampon fosfat 10 mM pentru a obţine o densitate celulară de circa 2×10⁸ ufc/ml. În general, aceasta se obţine printr-o suspensie uşor tulbure echivalentă cu o densitate optică de 0,15-600 nm.

Se extrag conurile de la 200 de tuberculi de cartof, varietate cu coaja albă cunoscută ca fiind neinfectată cu Ralstonia solanacearum.

Conurile se tratează după metoda obişnuită şi se resuspendă sedimentul în 10 ml.

Se pregătesc 10 microfiole sterile de 1,5 ml cu 900 ľl de sediment resuspendat.

Se transferă 100 ľl din suspensia de Ralstonia solanacearum în prima microfiolă şi se omogenizează prin vortexare.

Se realizează diluţii zecimale în următoarele 5 microfiole.

Cele 6 microfiole contaminate vor fi utilizate drept control pozitiv. Cele 4 microfiole necontaminate se vor folosi în calitate de control negativ. Se etichetează microfiolele în mod corespunzător.

Se prepară alicote de 100 ľl în microfiole sterile de 1,5 ml pentru a obţine 9 replici din fiecare control. Se conservă la –16 şi – 24°C pînă la utilizare.

Prezenţa şi concentraţia de celule de Ralstonia solanacearum în control trebuie confirmate în primul rînd prin IF.

Pentru testul PCR, se efectuează o extracţie de ADN din controale pozitive şi negative pentru fiecare serie de probe de testare.

Pentru testele IF şi FISH, se efectuează teste asupra controalelor pozitive şi negative pentru fiecare serie de probe de testare.

Pentru testele IF şi FISH, nivelul de detecţie al celulelor de Ralstonia solanacearum trebuie să fie de cel puţin 10⁶ şi 10⁴ celule/ml în controlul pozitiv, iar în controlul negativ să nu fie detectate.

Anexa D

la anexa nr.2

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

Tampoane pentru procedura de testare

Tampoanele sterilizate nedeschise pot fi păstrate pînă la un an.

1. Soluţii-tampon pentru procedura de extracţie

1.1. Tampon de extracţie (50 mM tampon fosfat, pH 7,0)

Acest tampon este utilizat pentru extracţia bacteriei din ţesuturile plantei prin omogenizare sau agitare.

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Folosirea următorilor compuşi suplimentari poate fi utilă:

1.2. Tampon de extract concentrat (10 mM tampon fosfat, pH 7,2)

Acest tampon este utilizat pentru resuspendarea şi diluţia extractelor de conuri de tuberculi de cartof ca urmare a concentrării prin centrifugare.

Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

2. Soluţii-tampon pentru testul de imunofluorescenţă

2.1. Tampon IF: 10 mM PBS, pH 7,2

Acest tampon este utilizat pentru diluţia anticorpilor.

Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

2.2. Tampon IF-Tween

Acest tampon este utilizat pentru spălarea lamelor. Se adaugă 0,1% Tween 20 la tamponul IF.

2.3. Tampon glicerol fosfat, pH 7,6

Acest tampon este utilizat pentru montarea lamei IF pentru mărirea fluorescentei.

În comerţ sînt disponibile soluţii-suport antidecolorare, de exemplu Vectashield (Vector Laboratories) sau Citifluor (Leica).

3. Soluţii tampon pentru testul ELISA indirect

3.1. Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6

Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul. Se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Poate fi adăugat sulfit de sodiu (0,2%) ca antioxidant pentru a împiedica constituirea de compuşi aromatici oxidaţi.

3.2. 10X tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,4

3.3. PBS-Tween

3.4. Tampon de blocare – anticorpi (trebuie preparat proaspăt)

3.5. Soluţie de substrat de fosfatază alcalină, pH 9,8

Se amestecă şi se ajustează la pH 9,8 cu acid clorhidric (HCl) concentrat.

Se adaugă apă distilată pînă la 1 litru.

Se adaugă 0,2 g MgCl.

Se dizolvă două tablete de 5 mg de substrat de fosfatază (Sigma) la 15 ml de soluţie.

4. Tampoane pentru testul DASI ELISA

4.1.Tampon de acoperire dublu concentrat, pH 9,6

Se dizolvă ingredientele şi se verifică pH-ul.

3.2. 10X tampon de fosfat salin (PBS), pH 7,2-7,4

4.3.PBS-Tween

4.4. Tampon de substrat, pH 9,8

Se amestecă şi se ajustează la pH 9,8 cu acid clorhidric (HCl) concentrat.

Anexa E

la anexa nr.2

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

Stabilirea gradului de contaminare în testele IF şi FISH

Se calculează numărul mediu de celule fluorescente tipice pe cîmp (c).

Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe godeul lamei de microscop (C).

C = c × S/s,

unde:

S = suprafaţa godeului lamei cu multe godeuri şi

s = suprafaţa cîmpului obiectivului

s = πi²/4²K²

unde:

i = coeficientul de cîmp (depinde de tipul ocularului şi variază de la 8 la 24)

K = coeficientul tubului (1 sau 1,25)

G = grosisment (de 100 de ori, 40 de ori etc.) obiectiv.

Se calculează numărul de celule fluorescente tipice pe ml de extract concentrat resuspendat (N).

N = C × 1000/y × F,

unde:

y = volumul de extract concentrat resuspendat per godeu şi

F = factorul de diluţie al extractului concentrat resuspendat

Anexa F

la anexa nr.2

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

Protocoale PCR şi reactivi validaţi

Testele preliminare trebuie să permită detecţia reproductibilă a 10³-10⁴ celule de Ralstonia solanacearum pe ml de extract de probă.

De asemenea, testele preliminare nu trebuie să indice rezultate fals pozitive cu o gamă de tulpini bacteriene selecţionate (vezi anexa C la anexa nr.2 la prezentele Măsuri).

1. Protocolul PCR Seal et al. (1993)

1.1. Secvenţa de oliqonucleotide a primerilor

Dimensiunea prevăzută a amplimerului de ADN-ţintă de Ralstonia solanacearum = 288 bp

1.2. Amestecul reactiv pentru PCR

1.3. Condiţiile reacţiei PCR

Se urmează procedura:

Acest program a fost optimizat pentru termociclorul PerkinElmer 9600. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor b), c) şi d) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.

1.4. Analiza restricţiei enzimatice a amplimerului

Fragmentele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 37°C cu enzima Ava II.

2. Protocolul PCR Pastrik & Maiss (2000)

2.1. Secvenţa de oligonucleotide a primerilor

Dimensiunea prevăzută a amplimerului ADN-ului-ţintă de Ralstonia solanacearum = 553 bp.

2.2. Amestecul reactiv pentru PCR

Notă. Taq polimerază de PerkinElmer este optimizată iniţial pentru termociclorul MJ Research PTC 200 cu polimerază Taq Gibco.

AmpliTaq de PerkinElmer şi tamponul pot fi utilizate, de asemenea, la aceleaşi concentraţii.

2.3. Condiţiile reacţiei PCR

Se urmează procedura:

Notă. Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor b), c) şi d) pentru o utilizare cu alte modele de termociclor.

2.4. Analiza restricţiei enzimatice a amplimerului

Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 65°C cu enzima Taq I timp de 30 de minute. Fragmentele de restricţie obţinute din fragmentul specific de ADN de Ralstonia solanacearum au o lungime de 457 bp şi de 96 bp.

3. Protocolul multiplex PCR şi cu control intern al PCR (Pastrik et al., 2002)

3.1. Secvenţa de primer de oligonucleotide.

Dimensiunea prevăzută a amplimerului ADN-ţintă de Ralstonia solanacearum = 718 bp (în prezenţa setului de primeri Rs).

Dimensiunea prevăzută a amplimerului controlului intern al PCR de 18S ARNr = 310 bp (în prezenţa setului de primeri Ns).

3.2. Amestecul reactiv pentru PCR

3.3. Condiţiile reacţiei PCR

Se urmează procedura:

Notă. Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor b), c) şi d) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.

3.4. Analiza restricţiei enzimatice a amplimerului

Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 65°C cu enzima Bsm I sau cu o enzimă izoschizomeră (de exemplu Mva 1269 I) timp de 30 de minute.

4. Protocolul PCR biovar specific de Ralstonia solanacearum (Pastrik et al., 2001)

4.1. Secvenţa de oligonucleotide a primerilor

Dimensiunea prevăzută a ampliconului ADN-ţintă de Ralstonia solanacearum:

cu Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp

cu Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.

4.2. Amestecul reactiv pentru PCR

a) PCR specific biovarului 1/2

b) PCR specific biovarului 3/4/5

4.3. Condiţiile reacţiei PCR

Se urmează procedura descrisă în continuare pentru reacţiile specifice biovarului 1/2 şi biovarului 3/4/5:

Notă. Acest program a fost optimizat pentru termociclorul MJ Research PTC 200. Poate fi necesară o modificare a duratei ciclurilor b), c) şi d) pentru utilizarea cu alte modele de termociclor.

4.4. Analiza restricţiei enzimatice a amplimerului

Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR utilizînd primerii Rs-1-F şi Rs-1-R produc un polimorfism distinct al dimensiunii fragmentelor de restricţie după incubare la 65°C cu enzima Bsm I sau cu o enzimă izoschizomeră (de exemplu Mva 1269 I) timp de 30 de minute. Produsele de ADN de Ralstonia solanacearum amplificate prin PCR utilizînd primerii Rs-1-F şi Rs-3-R nu au puncte de restricţie.

5. Prepararea tamponului de încărcare

5.1. Albastru de bromfenol (soluţie concentrată de 10%)

5.2. Tampon de încărcare

6. Tampon tris-acetat EDTA (TAE) 10x, pH 8,0

Înainte de utilizare se diluează pînă la 1 x.

De asemenea, acest tampon este disponibil în comerţ (de exemplu Invitrogen sau echivalent).

Anexa G

la anexa nr.2

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

Reactivi validaţi pentru testul FISH

1. Oligosonde

Sondă OLI-1-CY3 specifică Ralstonia solanacearum: 5-GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3′

Sondă eubacteriană EUB-338-FITC nespecifică: 5′-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3′

2. Soluţia de fixare

Atenţie! Soluţia de fixare conţine paraformaldehidă, care este toxică, de aceea se manipulează cu mănuşi şi nu se inhalează. Se recomandă să se lucreze într-o hotă chimică.

Se încălzesc 9 ml de apă pentru biologie moleculară (de exemplu apă ultrapură) la circa 60°C şi se adaugă 0,4 g de paraformaldehida. Paraformaldehidă se dizolvă după adăugarea a 5 picături de 1N NaOH şi amestecarea pe un agitator magnetic.

Se ajustează pH-ul la 7,0 prin adăugarea a 1 ml de tampon fosfat 0,1 M (PB; pH 7,0) şi 5 picături de 1N HC1. Se verifică pH-ul cu benzi indicatoare şi se ajustează, atunci cînd este necesar, cu HCl sau NaOH.

Atenţie! Nu se foloseşte pH-metrul în soluţii care conţin paraformaldehidă.

Se filtrează soluţia printr-un filtru cu membrană de 0,22 ľm şi se păstrează la 4°C pînă la utilizare ferită de praf.

3. Hibmix3x

Se diluează pînă la 1x, după cum este prevăzut.

4. Soluţie de hibridizare

Hibmix 1x

Se prepară cantităţile de soluţie de hibridizare în conformitate cu reţeta din tabel.

Pentru fiecare lamă (conţinînd două probe diferite duplicate) este nevoie de 90 ľl de soluţie de hibridizare.

Important: Formamidă este foarte toxică. Prin urmare, se poartă mănuşi şi se iau măsurile de siguranţă necesare!

Cantităţi recomandate pentru prepararea amestecului de hibridizare

5. Tampon fosfat 0,1 M, pH 7,0

Se dizolvă ingredientele, se verifică pH-ul şi se sterilizează prin autoclavare la 121°C timp de 15 minute.

Anexa H

la anexa nr.2

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

Condiţii de cultură pentru vinete şi tomate

Se seamănă seminţe de tomate (Lycopersicon esculentum) şi de vinete (Solanum melongena) în pămînt de seră pasteurizat. Se transplantează plantulele în pămînt pentru flori pasteurizat atunci cînd cotiledoanele sînt dezvoltate în totalitate (10-14 zile).

Vinetele sau tomatele trebuie cultivate în seră, înainte de inoculare, în următoarele condiţii de mediu:

Durata zilei: 14 ore sau durata naturală a zilei atunci cînd este mai mare Temperatura:

ziua: 21-24°C

noaptea: 14-18°C

Varietatea sensibilă de tomată: “Moneymaker”

Varietatea sensibilă de vînătă: “Black Beauty”

Anexa nr.3

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

1. Pentru fiecare apariţie suspectată, pentru care a fost identificat un rezultat pozitiv la testul sau testele de detecţie, în conformitate cu metodele prevăzute în anexa nr.2 la prezentele Măsuri pentru materialul de plantare şi în toate celelalte cazuri, pentru care este aşteptată confirmarea sau infirmarea, trebuie să se păstreze şi să se conserve în mod corespunzător:

a) toţi tuberculii prelevaţi şi, în măsura în care este posibil, toate plantele prelevate;

b) orice extract rămas şi material preparat suplimentar pentru testul sau testele de detecţie, de exemplu, lamele preparate pentru testele de imunofluorescenţă;

c) toată documentaţia relevantă, pînă la finalizarea metodei menţionate.

Păstrarea tuberculilor permite testarea soiului, efectuată atunci cînd este cazul.

2. În cazul confirmării organismului, trebuie să se păstreze şi să se conserve în condiţii corespunzătoare:

a) materialul specificat la pct.1;

b) o probă de tomate sau vinete infectate prin inoculare cu extract din tuberculi sau plante, după caz; şi

c) cultura izolată a organismului, timp de cel puţin o lună după procedura de notificare prevăzută la pct.11 subpct.4) la prezentele Măsuri.

Anexa nr.4

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

1. Elementele din investigaţia prevăzută la pct.11 subpct.1) lit.a) din prezentele Măsuri includ, acolo unde este cazul:

1) locurile de producţie:

a) în care se cultivă sau au fost cultivaţi cartofi care sînt înrudiţi prin clonare cu cartofii depistaţi ca fiind infectaţi cu acest organism;

b) în care se cultivă sau au fost cultivate tomate care sînt din aceeaşi sursă cu tomatele depistate ca fiind infectate cu acest organism;

c) în care se cultivă sau au fost cultivaţi cartofi ori tomate care au fost plasaţi sub control oficial datorită apariţiei suspectate a organismului;

d) în care se cultivă sau au fost cultivaţi cartofi care sînt înrudiţi prin donare cu cartofii care au fost cultivaţi în locurile de producţie depistate ca fiind infestate cu acest organism;

e) în care se cultivă cartofi sau tomate şi care sînt situate în vecinătatea unor locuri de producţie infestate, incluzînd acele locuri de producţie care utilizează echipamente şi utilaje de producţie în mod direct sau printr-un contractor comun;

f) care utilizează pentru irigare sau stropire apa de suprafaţă din orice sursă confirmată ori suspectată a fi contaminată cu acest organism;

g) care utilizează pentru irigare sau stropire apa de suprafaţă dintr-o sursă folosită în comun cu locurile de producţie confirmate sau suspectate a fi infestate cu acest organism;

h) care sînt sau au fost inundate cu apa de suprafaţă confirmată ori suspectată a fi contaminată cu acest organism;

2) ape de suprafaţă utilizate la irigare sau stropire sau care au inundat unul sau mai multe cîmpuri sau locuri de producţie confirmate a fi infestate cu acest organism.

Anexa nr.5

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

1. Elementele care trebuie luate în considerare la determinarea extinderii contaminării probabile în conformitate cu pct.11 subpct.1) lit.e) şi subpct.3) lit.c) din prezentele Măsuri includ:

a) materialul de plantare cultivat într-un loc de producţie desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu pct.11 subpct.1) lit.b), c) şi d) din prezentele Măsuri;

b) locurile de producţie care au legătură cu materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu pct.11 subpct.1) lit.b), c) şi d) din prezentele Măsuri, inclusiv cele care utilizează echipamente şi utilaje de producţie în mod direct sau printr-un contractor comun;

c) materialul vegetal enumerat sau care se află în aceste locuri de producţie în timpul perioadei în care materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu pct.11 subpct.1) lit.b), c) şi d) din prezentele Măsuri a fost prezent la locul de producţie prevăzut la lit.b) din prezentul punct;

d) spaţiile în care se manipulează materialul de plantare provenit din locurile de producţie menţionate la lit.a), b), c) din prezentul punct;

e) orice utilaj, vehicul, container, depozit sau unităţi ale acestora şi orice alt obiect, inclusiv ambalajul, care au venit în contact cu materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu pct.11 subpct.1) lit.b), c) şi d) din prezentele Măsuri;

f) orice material de plantare depozitat în sau în contact cu oricare dintre structurile sau obiectele menţionate la alineatul anterior, înainte de curăţarea şi dezinfectarea acestora;

g) ca rezultat al investigaţiei şi testării în conformitate cu pct.11 subpct.1) lit.a) din prezentele Măsuri, în cazul cartofilor, acei tuberculi sau plante cu o înrudire clonală colaterală ori parentală şi, în cazul tomatelor, acele plante cu aceeaşi sursă ca materialul de plantare desemnat ca fiind contaminat în conformitate cu pct.11, subpct.1) lit.b), c) şi d) din prezentele Măsuri şi pentru care apare probabilă contaminarea printr-o legătură clonală, deşi rezultatele testării privind prezenţa organismului pot fi negative. Testarea soiului poate fi efectuată pentru a se verifica identitatea tuberculilor sau a plantelor contaminate şi legătura clonală;

h) locul sau locurile de producţie a materialului de plantare menţionat la lit.g) din prezentul punct;

i) locul sau locurile de producţie a materialului de plantare care utilizează apă pentru irigare ori stropire, care a fost desemnată ca fiind contaminată în conformitate cu pct.11 subpct.3) lit.b) din prezentele Măsuri, materialul de plantare produs în cîmpurile inundate cu apă de suprafaţă confirmată ca fiind contaminată.

2. Elementele care trebuie luate în considerare la determinarea unei posibile răspîndiri în conformitate cu pct.11 subpct.1) lit.f) şi subpct.3) lit.c) din prezentele Măsuri includ:

1) în cazurile prevăzute la pct.11 subpct.1) lit.f) din Măsuri:

a) vecinătatea altor locuri de producţie care cultivă materialul de plantare;

b) producţia şi utilizarea în comun a stocurilor de cartofi de sămînţă;

c) locurile de producţie care utilizează apă de suprafaţă pentru irigarea sau stropirea materialului de plantare, în cazurile în care există sau a existat riscul de scurgere ori de inundare cu apă de suprafaţă din unul sau mai multe locuri de producţie desemnate ca fiind contaminate în conformitate cu pct.11 subpct.1) lit.b), c) şi d) din prezentele Măsuri;

2) în cazurile în care apa de suprafaţă a fost desemnată ca fiind contaminată în conformitate cu pct.11 subpct.3) lit.b) din prezentele Măsuri:

a) locul sau locurile de producţie învecinate care produc materialul de plantare sau care sînt în pericol de a fi inundate cu apa de suprafaţă desemnată ca fiind contaminată;

b) orice bazin de irigare delimitat, care are legătură cu apa de suprafaţă desemnată ca fiind contaminată;

c) întinderile de apă în legătură cu apa de suprafaţă desemnată ca fiind contaminată, ţinîndu-se seama de:

direcţia şi nivelul debitului apei desemnate ca fiind contaminată;

prezenţa plantelor-gazdă sălbatice solanacee.

3. Notificarea prevăzută la pct.11 din prezentele Măsuri include:

1) imediat după confirmarea prezenţei organismului prin teste de laborator, efectuate conform metodelor prevăzute în anexa nr.2 la prezentele Măsuri, cel puţin:

pentru cartofi:

a) denumirea soiului lotului;

b) tipul (consum, sămînţă etc.) şi, dacă este cazul, categoria de cartofi de sămînţă;

pentru plantele de tomate:

denumirea soiului lotului şi, dacă este cazul, categoria;

2) fără a prejudicia cerinţele de notificare a unei apariţii suspectate conform pct.11 din prezentele Măsuri, în cazul în care a fost confirmată apariţia organismului, în cazul în care există riscul de contaminare a materialului de plantare, organul de control fitosanitar comunică de îndată autorităţii administraţiei publice centrale în domeniul agriculturii, organelor similare din statele vecine şi ale altor state interesate, următoarele:

a) denumirea soiului lotului de cartofi sau tomate;

b) numele şi adresa expeditorului şi destinatarului;

c) data livrării lotului de cartofi sau de tomate;

d) mărimea lotului de cartofi sau de tomate livrat;

e) atunci cînd este cazul, o copie a paşaportului fitosanitar sau cel puţin numărul paşaportului fitosanitar sau numărul de înregistrare al producătorului sau al comerciantului şi o copie a bonului de livrare.

4. Detaliile suplimentare notificării prevăzute la pct.11 subpct.4) din prezentele Măsuri includ, după finalizarea tuturor investigaţiilor, pentru fiecare caz:

a) data la care s-a confirmat contaminarea;

b) o scurtă descriere a investigaţiilor realizate pentru identificarea sursei şi posibilei răspîndiri a contaminării, precizîndu-se intensitatea prelevării;

c) informaţii privind sursa/sursele identificate sau presupuse ale contaminării;

d) detalii ale întinderii contaminării desemnate, inclusiv numărul de locuri de producţie, şi pentru cartofi, numărul de loturi, cu indicarea soiului şi, în cazul cartofului de sămînţă, a categoriei;

e) detalii ale zonei delimitate, inclusiv numărul de locuri de producţie nedesemnate ca fiind contaminate, dar incluse în zonă;

f) detalii referitoare la apa desemnată ca fiind contaminată, inclusiv denumirea şi amplasarea apei şi întinderea desemnării/interdicţia de irigare;

g) pentru orice transport sau lot de plante de tomate desemnat ca fiind contaminat – certificatul fitosanitar, numărul paşaportului fitosanitar;

h) toate celelalte informaţii pe care autoritatea publică centrală în domeniul agriculturii le solicită, referitoare la focarul sau focarele confirmate.

Anexa nr.6

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

1. Prevederile pct.13 din prezentele Măsuri se referă la:

a) utilizarea tuberculilor de cartofi în hrana animalelor după tratamentul termic, astfel încît să nu existe nici un risc de supravieţuire a organismului; sau

b) eliminarea deşeurilor într-un loc de distrugere, în care nu există nici un risc identificabil de propagare a organismului în mediul înconjurător, de exemplu, prin infiltrare în terenuri agricole sau prin contact cu surse de apă care pot fi utilizate pentru irigarea terenurilor agricole; sau

c) incinerare; sau

d) transformarea industrială prin livrare directă şi imediată la o fabrică de procesare care dispune de instalaţii de eliminare a deşeurilor, unde s-a stabilit că nu există nici un risc identificabil de răspîndire a organismului şi că dispune de un sistem care permite curăţarea şi dezinfectarea cel puţin a vehiculelor care părăsesc fabrica; sau

e) alte măsuri, în situaţia în care s-a stabilit că nu există nici un risc identificabil de răspîndire a organismului;

Toate deşeurile asociate şi care rezultă din operaţiile menţionate anterior sînt eliminate prin metode în conformitate cu anexa nr.7 la prezentele Măsuri.

2. Utilizarea sau eliminarea corespunzătoare a materialului de plantare menţionat la pct.13 din prezentele Măsuri prevede ca, sub controlul organului de control fitosanitar, cartofii urmează să fie ambalaţi sau procesaţi la instalaţiile de eliminare a deşeurilor menţionate:

1) pentru tuberculii de cartofi:

a) utilizarea acestora drept cartofi destinaţi consumului gata ambalaţi pentru livrare şi utilizarea directă, fără reambalare, într-un loc care dispune de instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor.

Cartofii destinaţi plantării pot fi manipulaţi în acelaşi loc, numai dacă sînt manipulaţi separat sau după curăţarea şi dezinfectarea acestuia; sau

b) utilizarea acestora drept cartofi de consum destinaţi procesării industriale după livrare directă şi imediată la o fabrică de prelucrare care dispune de instalaţii corespunzătoare de eliminare a deşeurilor, precum şi de un sistem care permite curăţarea şi dezinfectarea cel puţin a vehiculelor care părăsesc fabrica; sau

c) un alt mod de utilizare sau eliminare, în măsura în care s-a stabilit că nu există nici un risc identificabil de răspîndire a organismului;

2) pentru alte părţi de plantă, inclusiv resturi de tulpini şi frunze:

a) distrugerea; sau

b) un alt mod de utilizare sau eliminare, în măsura în care s-a stabilit că nu există nici un risc identificabil de răspîndire a organismului;

3. Metodele corespunzătoare de decontaminare a obiectelor prevăzute la pct.14 din prezentele Măsuri sînt curăţarea şi, dacă este cazul, dezinfectarea, astfel încît să nu existe nici un risc identificabil de răspîndire a organismului. Aceste metode sînt aplicate sub control oficial.

4. Măsurile care trebuie puse în aplicare în zona (zonele) demarcată (demarcatete), stabilite conform pct.11 subpct.1) lit.f) şi subpct.3) lit.c) şi menţionate la pct.15 din prezentele Măsuri includ:

4.1 Atunci cînd locurile de producţie, în temeiul art.9 alin.(3) din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi la carantina fitosanitară, au fost desemnate ca fiind contaminate conform pct.11 subpct.1) lit.b), c) şi d) din prezentele Măsuri:

într-un cîmp sau într-o unitate de producţie de cultură protejată, desemnată ca fiind contaminată conform pct.11 subpct.1), lit.b), c) şi d) din prezentele Măsuri:

1) în cursul a cel puţin 4 ani de cultură care urmează contaminării desemnate:

a) sînt luate măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartof şi tomate, precum şi a altor plante-gazdă ale organismului, inclusiv a buruienilor solanacee; şi

b) nu se plantează următoarele:

tuberculi, plante sau seminţe de cartof;

plante şi seminţe de tomate, ţinîndu-se seama de biologia organismului;

alte plante-gazdă;

plante din specia Brassica pentru care există un risc identificat de supravieţuire a organismului;

culturi pentru care există un risc identificat de răspîndire a organismului;

c) în primul sezon de cultură a cartofilor sau tomatelor care urmează după perioada specificată la subpct.1) şi cu condiţia ca terenul să fi fost găsit liber de plante spontane de cartof şi tomate şi de alte plante-gazdă, inclusiv buruieni solanacee, în timpul inspecţiilor oficiale pentru cel puţin 2 ani consecutivi de cultură înainte de plantare:

în cazul cartofilor, se permite numai producţia de cartofi pentru consum;

în cazul cartofilor şi tomatelor, tuberculii de cartof sau plantele de tomate recoltate vor fi testate, după caz, în conformitate cu procedura descrisă în anexa. nr.2 la prezentele Măsuri;

d) în sezonul de cultură a cartofilor sau tomatelor care urmează celui prevăzut la lit.c) şi după un ciclu adecvat de rotaţie, care trebuie să fie de minimum 2 ani, se plantează cartofi de sămînţă şi se efectuează inspecţii oficiale conform pct.3 din prezentele Măsuri; sau

2) pe parcursul a 5 ani de cultură care urmează anului contaminării desemnate:

a) se iau măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartofi şi tomate, precum şi a altor plante-gazdă ale organismului prezente în mod spontan, inclusiv a buruienilor solanacee; şi

b) terenul trebuie menţinut, în cursul primilor 3 ani, înţelenit sau cultivat cu cereale, în conformitate cu riscul identificat sau ca păşune permanentă şi în acest caz este frecvent cosit scurt sau păşunat intensiv sau cultivat cu iarbă pentru producţia de seminţe, urmată de plantarea în următorii 2 ani cu plante care nu sînt gazdă organismului pentru care nu există un risc identificat de supravieţuire sau răspîndire a organismului;

c) în primul sezon de cultivare a cartofilor sau tomatelor care urmează după perioadă specificată la lit.b) şi cu condiţia ca terenul să fi fost găsit liber de plante spontane de cartof şi tomate şi de alte plante-gazdă, inclusiv buruieni solanacee, în timpul inspecţiilor oficiale timp de cel puţin 2 ani consecutivi înainte de plantare:

în cazul cartofilor, se cultivă cartofi de sămînţă sau de consum;

tuberculii de cartof sau plantele de tomate recoltate se testează, după caz, în conformitate cu procedura descrisă în anexa nr.2 la prezentele Măsuri;

3) în toate celelalte terenuri din locul de producţie contaminat şi cu condiţia ca organul de control fitosanitar să aibă certitudinea că riscul reprezentat de plantele spontane de cartof şi tomate şi de alte plante-gazdă ale organismului, inclusiv buruienile solanacee prezente în mod spontan, a fost eliminat:

a) în anul de cultivare care urmează anului contaminării desemnate:

fie nu se plantează nici un tubercul, plantă, sămînţă de cartof sau altă plantă-gazdă a organismului; sau

în cazul tuberculilor de cartof, cartofii de sămînţă pot fi plantaţi numai pentru producţia destinată consumului;

în cazul plantelor de tomate, răsadul de tomate obţinut din seminţe care îndeplinesc condiţiile prevăzute în Cerinţele speciale pentru introducerea şi circulaţia plantelor, produselor vegetale şi altor obiecte pe teritoriul Republicii Moldova, aprobate prin Hotărîrea Guvernului nr.594 din 2 august 2011, poate fi plantat numai pentru producţia de fructe;

b) în al doilea an de cultivare care urmează anului contaminării desemnate:

în cazul cartofilor, se plantează numai cartofi de sămînţă certificaţi sau cartofi de sămînţă testaţi oficial pentru detecţia prezenţei putregaiului brun şi cultivaţi sub control oficial în locuri de producţie, altele decît cele prevăzute la pct.4.1 pentru producţia de cartofi de sămînţă sau consum;

în cazul tomatelor, numai răsadul de tomate obţinut din seminţe care îndeplinesc condiţiile prevăzute în Cerinţele speciale pentru introducerea şi circulaţia plantelor, produselor vegetale şi altor obiecte pe teritoriul Republicii Moldova, aprobate prin Hotărîrea Guvernului nr.594 din 2 august 2011, sau, în cazul înmulţirii vegetative, plante de tomate obţinute din astfel de seminţe şi cultivate sub control oficial în locuri de producţie, altele decît cele menţionate la pct.4.1, poate fi plantat fie pentru producţia de material de înmulţire, fie pentru producţia de fructe;

c) în cel de-al treilea an de cultivare care urmează anului contaminării desemnate:

în cazul cartofilor, se plantează numai cartofi de sămînţă certificaţi sau cultivaţi sub control oficial proveniţi din cartofi de sămînţă certificaţi pentru producţia de cartofi de sămînţă sau de consum;

în cazul tomatelor, se plantează numai răsad de tomate obţinut din seminţe care îndeplinesc condiţiile prevăzute în Cerinţele speciale pentru introducerea şi circulaţia plantelor, produselor vegetale şi altor obiecte pe teritoriul Republicii Moldova, aprobate prin Hotărîrea Guvernului nr.594 din 2 august 2011, sau, plante de tomate obţinute sub control oficial din astfel de plante, fie pentru producţia de material de înmulţire, fie pentru producţia de fructe;

d) în fiecare dintre anii de cultivare prevăzuţi la literele anterioare, se iau măsuri pentru eliminarea plantelor spontane de cartofi şi a altor plante-gazdă ale organismului şi se desfăşoară inspecţii oficiale ale culturii în perioade adecvate şi, pe fiecare cîmp de cartofi, cartofii recoltaţi sînt testaţi oficial în conformitate cu procedura descrisă în anexa nr.2 la prezentele Măsuri;

4) imediat după desemnarea contaminării, în conformitate cu pct.11 subpct.1) lit.b), c) şi d) din prezentele Măsuri, şi după primul an de cultivare care urmează:

a) toate utilajele şi instalaţiile de depozitare de la locul de producţie, implicate în producţia cartofilor sau tomatelor, sînt curăţate şi, după caz, dezinfectate, utilizîndu-se metodele corespunzătoare prevăzute la pct.3 din prezenta anexă;

b) se testează apa pentru irigare şi stropire, pentru a preveni răspîndirea organismului atunci cînd este cazul;

c) într-o unitate de producţie de cultură protejată, desemnată ca fiind contaminată conform pct.11 subpct.1) lit.b), c) şi d) din prezentele Măsuri, unde este posibilă înlocuirea completă a mediului de creştere:

nu se plantează nici un tubercul, nici o plantă sau sămînţă de cartof ori alte plante-gazdă ale organismului, inclusiv plante şi seminţe de tomate, cu excepţia cazului în care unitatea de producţie respectivă a fost supusă măsurilor oficiale de control pentru eliminarea organismului şi pentru îndepărtarea întregului material vegetal-gazdă, inclusiv o schimbare completă a mediului de cultură, curăţarea şi, după caz, dezinfectarea unităţii respective, a întregului echipament, şi în care a fost acordată ulterior aprobarea pentru producţia de cartofi sau tomate din partea organului de control fitosanitar; şi

producţia de cartofi trebuie să provină din cartofi de sămînţă certificaţi sau din minituberculi ori microplante provenite din surse testate;

producţia de tomate trebuie să provină din seminţe care îndeplinesc condiţiile prevăzute în Cerinţele speciale pentru introducerea şi circulaţia plantelor, produselor vegetale şi altor obiecte pe teritoriul Republicii Moldova, aprobate prin Hotărîrea Guvernului nr.594 din 2 august 2011, sau, în cazul înmulţirii vegetative, din răsad de tomate provenit din astfel de seminţe şi cultivate sub control oficial;

se efectuează testarea apei pentru irigare şi stropire, inclusiv se stopează efectuarea acestora, pentru prevenirea răspîndirii organismului, atunci cînd este cazul.

4.2. Fără a prejudicia măsurile descrise la pct.4.1, organul de control fitosanitar în cadrul zonei demarcate:

1) imediat după contaminarea desemnată, se asigură că toate echipamentele şi instalaţiile de depozitare din astfel de locuri şi cele implicate în producţia de cartofi sau de tomate sînt curăţate şi dezinfectate corespunzător, în conformitate cu metodele descrise la pct.3 din prezenta anexă;

2) imediat după desemnarea contaminării şi timp de cel puţin 3 ani de cultivare, în cazurile în care zona demarcată a fost determinată conform pct.11 subpct.1) lit.f) din prezentele Măsuri:

a) se asigură supravegherea de către organul de control fitosanitar a locurilor de cultivare, depozitare sau de manipulare a tuberculilor de cartofi sau a tomatelor, împreună cu locurile în care funcţionează utilajele pentru prelucrarea cartofilor sau a tomatelor;

b) se solicită plantarea doar a seminţelor certificate sau a seminţelor cultivate sub control oficial pentru toate culturile de cartofi din zona respectivă şi testarea după recoltare a cartofilor de sămînţă cultivaţi în locurile de producţie desemnate ca fiind probabil contaminate în conformitate cu pct.11 subpct.1) lit.e) din prezentele Măsuri;

c) se solicită manipularea separată a stocurilor de cartofi de sămînţă recoltaţi faţă de cele destinate consumului în toate locurile din zona respectivă sau punerea în aplicare a unui sistem de curăţare şi, după caz, de dezinfecţie între procedurile de manipulare a stocurilor de cartofi de sămînţă şi a celor destinaţi consumului;

d) se solicită plantarea numai a plantelor de tomate provenite din seminţe care îndeplinesc condiţiile prevăzute în Cerinţele speciale pentru introducerea şi circulaţia plantelor, produselor vegetale şi altor obiecte pe teritoriul Republicii Moldova, aprobate prin Hotărîrea Guvernului nr.594 din 2 august 2011, în cazul înmulţirii vegetative, din răsad provenit din astfel de seminţe şi cultivate sub control oficial, pentru toate culturile de tomate din zona respectivă;

e) se desfăşoară inspecţii oficiale în conformitate cu pct.3 din prezentele Măsuri;

3) în cazurile în care apa de suprafaţă a fost declarată contaminată în conformitate cu pct.11 subpct.3) lit.b) din prezentele Măsuri sau a fost inclusă printre elementele de răspîndire posibilă a organismului în conformitate cu pct.2 din anexa nr.5 la prezentele Măsuri:

a) se desfăşoară inspecţii anuale în perioade adecvate, inclusiv prelevarea de probe de apă de suprafaţă şi, după caz, a plantelor-gazdă solanacee din sursele relevante de apă, precum şi testarea în conformitate cu metodele stabilite în anexa nr.2 la prezentele Măsuri pentru materialul de plantare şi pentru celelalte cazuri;

b) se introduc controale oficiale asupra apei pentru irigare şi stropire, inclusiv o stopare a utilizării apei desemnate ca fiind contaminată pentru irigarea şi stropirea materialului de plantare şi, după caz, a altor plante-gazdă, pentru a preveni răspîndirea organismului. Această stopare poate fi revizuită în baza rezultatelor obţinute din inspecţiile anuale şi desemnările de contaminare pot fi retrase atunci cînd organul de control fitosanitar este sigur că apele de suprafaţă nu mai sînt contaminate;

c) în cazurile în care deşeurile lichide deversate sînt contaminate, se introduc controale oficiale pentru eliminarea deşeurilor solide ori lichide din fabricile de procesare industrială sau din locurile de ambalare, manipulare a materialului de plantare;

4) se stabileşte un program, după caz, de înlocuire a tuturor stocurilor de cartofi de sămînţă într-o perioadă de timp corespunzătoare.

Anexa nr.7

la Măsurile privind controlul bacteriei

Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.

în Republica Moldova

Metodele de eliminare a deşeurilor aprobate oficial, prevăzute la pct.1) din anexa nr.6 la prezentele Măsuri, trebuie să fie în concordanţă cu următoarele prevederi, astfel încît să se evite orice risc identificabil de răspîndire a organismului:

1) deşeurile de cartofi şi tomate (inclusiv cartofii respinşi, cojile şi tomatele), precum şi orice alt deşeu solid asociat cartofilor şi tomatelor (inclusiv solul, pietrele şi alte resturi) sînt eliminate în temeiul art.4 alin.(4) litera g) din Legea nr.228 din 23 septembrie 2010 cu privire la protecţia plantelor şi carantina fitosanitară; sau

a) sînt duse într-un loc de eliminare a deşeurilor în care nu există nici un risc identificabil de propagare a organismului în mediul înconjurător, de exemplu prin infiltrare în terenurile agricole sau în contact cu surse de apă care pot fi utilizate pentru irigarea terenurilor agricole. Deşeurile sînt transportate direct în locurile respective în condiţii de izolare, astfel încît să nu existe riscul răspîndirii acestora; sau

b) sînt incinerate; sau

c) se iau alte măsuri, în situaţia în care s-a stabilit că nu există nici un risc identificabil de răspîndire a organismului;

2) deşeurile lichide care conţin particule solide în suspensie, înainte de eliminare, trebuie să fie supuse unui procedeu de filtrare sau de sedimentare pentru îndepărtarea acestora. Particulele solide vor fi eliminate conform subpct.1);

3) deşeurile lichide sînt ulterior:

a) complet încălzite la o temperatură de 60°C timp de cel puţin 30 de minute înainte de a fi eliminate; sau

b) eliminate într-un alt mod, astfel încît să nu existe nici un risc identificabil ca deşeurile să intre în contact cu terenurile agricole sau cu surse de apă care ar putea fi folosite pentru irigarea terenurilor agricole.

Procedurile descrise în prezenta anexă se aplică, de asemenea, şi deşeurilor rezultate de la manipularea, eliminarea şi prelucrarea loturilor contaminate.

Anexa nr.15

la Hotărîrea Guvernului

nr.558 din 22 iulie 2011

MĂSURILE

privind combaterea rîiei negre a cartofului în Republica Moldova

Măsurile privind combaterea rîiei negre a cartofului în Republica Moldova transpun Directiva 69/464/CEE a Consiliului din 8 decembrie 1969 privind combaterea rîiei negre a cartofului, publicată în Jurnalul Oficial L 323 din 24 decembrie 1969.

1. Măsurile privind combaterea rîiei negre a cartofului în Republica Moldova (în continuare – Măsuri) stabilesc minimul de acţiuni care trebuie întreprinse în Republica Moldova pentru combaterea rîiei negre a cartofului şi pentru prevenirea răspîndirii acestei boli criptogamice.

2. În cazul în care se constată apariţia ciupercii Synchytrium endobioticum, agentul patogen al rîiei negre a cartofului, inspectorii din cadrul organului de control fitosanitar vor delimita parcela contaminată şi o zonă de siguranţă suficient de largă pentru a se asigura protecţia suprafeţelor învecinate.

3. Parcela este considerată ca fiind contaminată atunci cînd simptomele rîiei negre a cartofului au fost găsite pe cel puţin o plantă din această parcelă.

4. Tuberculii de cartof şi tulpinile care provin din parcele contaminate vor fi trataţi astfel încît organismul dăunător să fie distrus. Dacă nu mai este posibil să se determine locul din care provin tuberculii şi tulpinile contaminate, întreaga cantitate în care au fost găsiţi tuberculii sau tulpinile contaminate trebuie tratată.

5. Pe parcelele contaminate:

1) nu se cultivă cartofi;

2) nu se cultivă şi nu se păstrează în sol sau în alte locuri plante destinate replantării.

6. În zona de siguranţă cartofii pot fi cultivaţi numai dacă sînt dintr-un soi care este rezistent la rasele de Synchytrium endobioticum, găsite în parcela contaminată.

7. Un soi de cartof este considerat ca fiind rezistent la o anumită rasă de Synchytrium endobioticum atunci cînd acesta reacţionează la contaminarea cu agentul patogen din acea rasă, astfel încît nu există nici un pericol de infecţie secundară.

8. Măsurile întreprinse pentru combaterea rîiei negre a cartofului sau pentru prevenirea răspîndirii acesteia sînt revocate în situaţia în care ciuperca Synchytrium endobioticum nu se mai constată a fi prezentă.

9. Este interzisă deţinerea culturilor de Synchytrium endobioticum.

10. Prevederile pct.4, 5 şi 9 ale prezentelor Măsuri nu se aplică în cazul unor lucrări, scopuri ştiinţifice, teste şi lucrări de selecţie, cu condiţia ca aceste derogări să nu prejudicieze combaterea rîiei negre a cartofului şi să nu creeze nici un risc de răspîndire a acestei boli.

11. Autoritatea publică centrală în domeniul agriculturi elaborează, înainte de data de 1 ianuarie a fiecărui an, o listă cu toate soiurile de cartof acceptate pentru comercializare şi descoperite prin investigaţie oficială ca fiind rezistente la Synchytrium endobioticum.

12. Autoritatea publică centrală în domeniul agriculturii va menţiona rasele de Synchytrium endobioticum la care soiurile sînt rezistente, va asigura publicarea în fiecare an a unei liste cu soiurile rezistente, pînă la data de 1 februarie.”