708/20.09.2011 Hotărîre cu privire la aprobarea Reglementării tehnice "Metode de analiză în domeniul fabricării vinurilor"

GUVERNUL REPUBLICII MOLDOVA

H O T Ă R Î R E

cu privire la aprobarea Reglementării tehnice "Metode

de analiză în domeniul fabricării vinurilor

nr. 708  din  20.09.2011

 (în vigoare 04.01.2012) 

Monitorul Oficial nr.164-165 art.804 din 04.10.2011

* * *

Abrogat: 04.05.2024

Hotărîrea Guvernului nr.245 din 03.04.2024

În conformitate cu Legea nr.420-XVI din 22 decembrie 2006 privind activitatea de reglementare tehnică (Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2007, nr.36-38, art.141), cu modificările şi completările ulterioare, precum şi în scopul realizării prevederilor Legii viei şi vinului nr.57-XVI din 10 martie 2006 (Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2006, nr.75-78, art.314), cu modificările şi completările ulterioare, Guvernul

HOTĂRĂŞTE:

1. Se aprobă Reglementarea tehnică "Metode de analiză în domeniul fabricării vinurilor" (se anexează).

2. Prezenta hotărîre întră în vigoare în termen de trei luni de la data publicării în Monitorul Oficial al Republicii Moldova.

3. Controlul asupra executării prezenţei hotărîri se pune în sarcina Agenţiei Naţionale pentru Siguranţa Alimentelor.

[Pct.3 modificat prin Hot.Guv. nr.1143 din 21.11.2018, în vigoare 18.01.2019]

Aprobată

prin Hotărîrea Guvernului

nr.708 din 20 septembrie 2011

REGLEMENTAREA TEHNICĂ

"Metode de analiză în domeniul fabricării vinurilor"

Reglementarea tehnică "Metode de analiză în domeniul fabricării vinurilor" creează cadrul necesar aplicării art.15 şi anexei IV la Regulamentul (CE) nr.606/2009 al Comisiei din 10 iulie 2009 de stabilire a anumitor norme de aplicare a Regulamentului (CE) nr.479/2008 al Consiliului în privinţa categoriilor de produse vitivinicole, a practicilor oenologice şi a restricţiilor care se aplică acestora, publicat în jurnalul Oficial al Uniunii Europene (JO) L 193 din 24 iulie 2009.

1. Reglementarea tehnică "Metode de analiză în domeniul fabricării vinurilor" stabileşte metodele de analiză pentru determinarea compoziţiei fizico-chimice a vinurilor, specificate în Reglementarea tehnică "Sistemul de organizare a pieţei vitivinicole şi trasabilitatea produselor", aprobată prin Hotărîrea Guvernului nr.356 din 11 mai 2009 (Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2009, nr.92-93, art.408).

2. În sensul prezentei Reglementări tehnice, noţiunile şi termenii utilizaţi se definesc după cum urmează:

1) repetabilitatea – valoarea sub care se situează cu o probabilitate specificată, diferenţa absolută dintre rezultatele a două teste unice obţinute pe material identic de testare şi în condiţii identice – acelaşi operator, aceeaşi aparatură, acelaşi laborator şi un interval scurt de timp;

2) reproductibilitatea – valoarea sub care se situează, cu o probabilitate specificată, diferenţa absolută dintre rezultatele a două teste unice obţinute pe material identic dar în condiţii diferite – operatori diferiţi, aparate diferite şi/sau laboratoare diferite şi/sau momente diferite;

3) rezultatul unui test unic – valoarea obţinută atunci cînd se aplică integral şi o singură dată metoda standardizată, pe o singură probă;

4) metode de referinţă criter – metode, care asigură o repetabilitate înaltă şi sînt recunoscute ca cele mai exacte; se utilizează la stabilirea valorilor acceptabile pentru principalii parametri de compoziţie a vinului – titrul volumului alcoolmetric, aciditatea titrabilă, aciditatea volatilă, extractul total şi sec, zaharurile reducătoare. Se utilizează, în caz de litigiu, la efectuarea cercetărilor ştiinţifice de talie internaţională, pentru analiza mostrelor de referinţă pentru metodele uzuale sau la etalonarea metodelor automate;

5) metode uzuale – metode, destinate pentru efectuarea analizelor uzuale la întreprinderile vinicole;

6) metode analitice automatizate – metode relative, care sînt admise pentru utilizare în cazul în care exactitatea, repetabilitatea şi reproductibilitatea rezultatelor acestor metode sînt echivalente cu rezultatele obţinute prin metodele de referinţă.

3. În sensul prezentei Reglementări tehnice abrevierile utilizate se definesc după cum urmează:

4. Metodele de analiză în domeniul fabricării vinurilor cuprinse în anexa la prezenta Reglementare tehnică se aplică de laboratoarele acreditate din ramura vitivinicolă la eliberarea certificatelor VI-1.

5. Metodele de analiză în domeniul fabricării vinurilor fac posibilă:

1) determinarea compoziţiei producţiei vitivinicole, prevăzute în Legea viei şi vinului nr.57-XVI din 10 martie 2006;

2) verificarea produselor pentru constatarea utilizării practicilor oenologice neautorizate.

6. La determinarea substanţelor, pentru care sînt prevăzute atît metode de referinţă cît şi metode uzuale, prioritate au rezultatele obţinute prin metodele de referinţă.

7. În cazuri de litigiu metodele prevăzute în anexă nu pot fi înlocuite cu metode automatizate.

8. În cazul în care nu se stabileşte altfel, eroarea de măsurare a valorii parametrului se determină cu intervalul de încredere de 95%.

9. Ori de cîte ori se face referire la apa, utilizată pentru prepararea soluţiilor, diluări sau spălare, aceasta înseamnă apă distilată sau apă demineralizată cu o puritate echivalentă. Toate substanţele chimice trebuie să fie de calitatea unui reactiv analitic.

Anexă

la Reglementarea tehnică

"Metode de analiză în

domeniul fabricării vinurilor"

1. Densitatea la 20°C şi densitatea relativă 20°C/ 20°C

1.1 MA-MD-AS 2-01-MASVOL

1. Definiţii

Densitatea reprezintă masa pe unitate de volum de vin sau must la 20°C. Se exprimă în grame pe mililitru şi este reprezentată prin simbolul ρ_20°C.

Densitatea relativă 20°C/ 20°C reprezintă raportul exprimat în număr zecimal dintre densitatea unui anumit volum de vin sau must la 20°C şi densitatea aceluiaşi volum de apă la aceeaşi temperatură. Se exprimă prin simbolul

2. Principiul metodelor

Densitatea şi densitatea relativă se determină pe o probă de testare:

- prin picnometrie: metoda de referinţă;

- prin areometrie sau densimetrie cu balanţă hidrostatică: metodele uzuale.

Pentru determinări foarte precise, densitatea trebuie corectată pentru efectul bioxidului de sulf:

ρ_20°C = ρ′_20°C – 0,0006 × S

unde:

ρ_20°C – densitatea corectată

ρ′_20°C – densitatea observată

S – cantitatea totală de bioxid de sulf, în grame pe litru, g/l.

3. Tratarea preliminară a probei

Dacă vinul sau mustul conţin cantităţi apreciabile de bioxid de carbon, acesta se elimină în cea mai mare parte prin agitarea a 250 ml de vin într-un balon de 1000 ml sau prin filtrarea la presiune redusă prin 2 g de vată plasată într-un tub prelungitor.

4. Metoda de referinţă

4.1. Aparatura

Echipament de laborator normal, în special:

4.1.1. Un picnometru Pyrex (sau orice picnometru cu caracteristici echivalente) cu o capacitate de aproximativ 100 ml, cu un termometru detaşabil cu îmbinare din sticlă şlefuită, calibrat cu mărimea diviziunii 0,1°C , de la 10 la 30°C (figura 1). Termometrul trebuie să fie etalonat.

4.1.2. O balanţă cu două talere cu o plajă de cel puţin 300 g, cu o sensibilitate de 0,1 mg sau o balanţă cu un taler cu o plajă de cel puţin 200 g şi cu o sensibilitate de 0,1 mg.

Fig.1.

Picnometrul şi tara

Picnometrul are un tub lateral de 25 mm lungime şi un diametru interior cel puţin de 1 mm, care se termină printr-o îmbinare conică şlefuită. Pe tubul lateral poate fi etanşat un "dop rezervor" format dintr-un tub conic din sticlă şlefuită şi terminat cu o secţiune ascuţită. Dopul se foloseşte drept cameră de expansiune. Ambele capete ale aparatului trebuie să fie şlefuite minuţios.

Recipientul tară cu acelaşi volum ca şi picnometrul (devierea sub 1 ml, cu aproximaţie) şi cu masa egală cu a picnometrului umplut cu un lichid cu densitatea de 1,01 (soluţie de clorură de sodiu 2,0% (m/v). Un recipient izolat termic, bine ajustat pe corpul picnometrului.

4.2. Etalonarea picnometrului

Etalonarea picnometrului implică determinarea următoarelor caracteristici:

- masa picnometrului vid;

- volumul picnometrului la 20°C;

- masa picnometrului, umplut cu apă la 20°C.

4.2.1. Metoda utilizării balanţei cu două talere

Recipientul tară, fiind aşezat pe talerul stîng al balanţei, iar picnometrul curat, uscat şi prevăzut cu "dopul rezervor" pe talerul drept, se realizează echilibrarea prin adăugarea de greutăţi, p grame, pe talerul pe care se află picnometrul.

Se umple picnometrul cu apă distilată la temperatura ambiantă şi se fixează termometrul; se şterge minuţios picnometrul şi se aşează în recipientul izolat termic; se amestecă prin rotirea recipientului, pînă cînd temperatura arătată de termometru este constantă.

Se reglează cu precizie nivelul, pînă la nivelul superior al tubului lateral. Se usucă tubul lateral, se aşează "dopul rezervor", se citeşte temperatura t°C, corectînd-o, cînd e cazul, în funcţie de imprecizia scalei termometrului. Se cîntăreşte picnometrul, umplut cu apă, notînd greutatea p′, în grame, necesară stabilirii echilibrului.

Calculare:

Tararea picnometrului vid:

Masa picnometrului vid – p + m,

unde:

m – masa aerului conţinut în picnometru, m = 0,0012 (p – p′)

Volumul la 20°C:

V_20°C = (p + m – p′) × F_t ,

unde, F _t – un factor luat din tabelul I pentru temperatura t°C.

V_20°C se determină cu precizia ±0,001 ml.

Masa apei la 20°C:

M_20°C = 0,998203 V_20°C ,

unde,

0,998203 – densitatea apei la 20°C.

4.2.2. Metoda utilizării balanţei cu un taler

Se determină:

- masa picnometrului curat şi uscat, P;

- masa picnometrului umplut cu apă la t°C, P₁,urmînd metoda descrisă la punctul 4.2.1;

- masa balonului tară, T₀.

Calculare (Exemplu de calculare în punctul 5 al prezentului capitol):

Tararea picnometrului vid:

Masa picnometrului vid – P – m, unde,

m – masa aerului din picnometru, m = 0,0012(p₁ – P)

Volumul la 20°C:

V_20°C = [P₁ – (P – m)] × F_t,,

unde:

F_t = un factor luat din tabelul I pentru temperatura t°C.

V_20°C se determină cu precizia de ±0,001 ml.

Masa apei la 20°C:

M_20°C = 0,998203 V_20°C,

unde:

0,998203 – densitatea apei la 20°C.

4.3. Metoda de determinare

4.3.1. Metoda utilizării balanţei cu două talere

Picnometrul, umplut cu proba de testare, se cîntăreşte conform procedurii de la punctul 4.2.1 .

p′′ – greutatea în grame necesară stabilirii echilibrului la t°C.

Masa lichidului, conţinut în picnometru – p + m – p′′

Densitatea aparentă la t°C:

Densitatea la 20°C se calculează, utilizînd unul din tabelele de corecţie prezentate mai jos, în funcţie de natura lichidului măsurat: vin sec (tabelul II), must natural sau concentrat (tabelul III), vin dulce (tabelul IV).

Densitatea relativă a vinului 20°C/20°C se calculează prin împărţirea la 0,998203 a densităţii lui la 20°C.

4.3.2. Metoda utilizării balanţei cu un taler.

Se cîntăreşte recipientul tară şi se notează masa cu T₁.

Se calculează dT = T₁ – T₀.

Masa picnometrului vid în momentul măsurării = P – m + dT.

Se cîntăreşte picnometrul umplut cu proba de testare, urmîndu-se procedura descrisă la punctul 4.2.1 . Se notează masa la t°C cu P₂.

Masa lichidului din picnometru la

t°C = P₂ – (P – m + dT)

Densitatea aparentă la t°C:

Se calculează densitatea la 20°C a lichidului testat – vin sec, must natural sau concentrat sau vin dulce, în conformitate cu punctul 4.3.1.

Densitatea relativă 20°C/20°C se calculează prin împărţirea densităţii la temperatura de 20°C la 0,998203.

4.3.3. Repetabilitatea determinărilor de densitate:

4.3.4. Reproductibilitatea determinărilor de densitate:

5. Exemplu de calculare a densităţii la 20°C şi densităţii relative 20°C/20°C (metoda de referinţă)

5.1. Picnometria prin utilizare a balanţei cu două talere

5.1.1. Stabilirea constantelor picnometrului.

Cîntărirea picnometrului curat şi uscat:

masa = picnometrul + p

p = 104,9454 g

Cîntărirea picnometrului umplut cu apă la t°C:

masa = picnometrul + apă + p′

p′ = 1,2396 g la t = 20,5°C

Calcularea masei aerului din picnometru:

m = 0,0012 (p –p′)

m = 0,0012 (104,9454 –1,2396)

m = 0,1244 g

Valori caracteristice necesare:

Masa picnometrului vid , p + m:

p + m = 104,9454 + 0,1244

p + m = 105,0698 g

Volumul la 20°C = (p + m – p′) F_t°C,

unde:

F_20,5°C = 1,001900

V_20°C = (105,0698 – 1,2396) × 1,001900

V_20°C = 104,0275 ml

Masa apei la 20°C,

M_20°C = V _20°C × 0,998203

M_20°C = 103,8405 g

5.1.2. Determinarea densităţii la 20°C şi a densităţii relative 20°C/20°C la vinul sec

ρ″ = 1,2622 la 17,80°C

ρ_17,8°C = 0,99788 g/ml

Tabelul II permite calcularea ρ_20°C din ρ_t°C în baza raportului:

Pentru t = 17,80°C şi pentru tăria alcoolică 11% vol. С = 0,54.

5.2. Picnometria prin utilizarea balanţei cu un singur taler

5.2.1. Stabilirea constantelor picnometrului.

Cîntărirea picnometrului curat şi uscat:

P = 67,7913 g

Cîntărirea picnometrului umplut cu apă la temperatura t°C:

P₁ = 169,2715 la 21,65°C

Determinarea masei aerului conţinut de picnometru:

m = 0,0012 (P₁ – P)

m = 0,0012 × 101,4802

m = 0,1218 g

Valori caracteristice necesare:

Tara picnometrului vid, P – m:

P – m = 67,7913 – 0,1218

P – m = 67,6695 g

Volumul la 20°C = [P₁ – (P – m)] F_t°C

F _21,65°C = 1,002140

V _20°C = 1,002140 (169,2715 – 67,6695)

V _20°C = 101,8194 ml

Masa apei la 20°C:

M _20°C = V_20°C × 0,998203

M _20°C = 101,6364 g

Masa balonului tarat, T_o:

T_o = 171,9160 g

5.2.2. Determinarea densităţii la 20°C şi a densităţii relative 20°C/ 20°C la vinul sec

T_t = 171,9178 g

dT = 171,9178 – v171,9160

dT = 0,0018 g

P – m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 g

P₂ = 169,2799 la 18°C

ρ_18°C = 0,99793 g/ml

Tabelul II permite calcularea lui ρ_20°C pe baza ρ_t°C cu ajutorul raportului :

Pentru t = 18°C şi tărie alcoolică de 11% vol., se găseşte c = 0,49.

2. Concentraţia alcoolică la 20^°C

2.1 MA-MD-AS 312-01-TALVOL

1. Definiţie

Concentraţia alcoolică este numărul de litri de etanol din 100 litri de vin, ambele volume fiind măsurate la o temperatură de 20°C. Se exprimă prin simbolul "% vol.".

Omologii etanolului, precum şi etanolul şi omologii acestuia legaţi în esteri etilici, sînt incluşi în tăria alcoolică, întrucît se regăsesc în distilat.

2. Principiul metodelor

2.1. Distilarea vinului alcalinizat cu o suspensie de hidroxid de calciu. Se determină concentraţia alcoolică a distilatului.

2.2. Metode de referinţă

2.2.1. Determinarea densităţii distilatului prin picnometrie.

2.3. Metodă uzuală.

2.3.1. Determinarea concentraţiei alcoolice a distilatului cu areometrul.

Pentru obţinerea concentraţiei alcoolice din densitatea distilatului se utilizează tabelele I, II şi III din prezentul capitol.

Acestea au fost întocmite în baza "Tabelelor Internaţionale ale Tăriei Alcoolice" publicate în 1972 de Organizaţia Internaţională de Metrologie Legală în Recomandarea nr.22 şi adoptate de OIV (Adunarea generală din 1974).

Tabelul I prezintă ecuaţia generală dintre concentraţia alcoolică şi densitatea amestecurilor hidroalcoolice, în funcţie de temperatură.

3. Obţinerea distilatului

3.1. Aparate

3.1.1. Aparat de distilare alcătuit din:

- balon cu fund rotund de 1 litru, cu gît din sticlă şlefuit;

- coloană de rectificare cu o înălţime de aproximativ 20 cm sau orice aparat, care evită pierderile;

- sursă de căldură, la utilizarea căreia nu se produce arderea vinului;

- condensator terminat cu un tub subţire, care ajunge aproape de baza balonului receptor, în care se află cîţiva mililitri de apă.

3.1.2. Aparat de distilare prin antrenare cu vapori de apă alcătuit din:

- generator de aburi;

- barbotor;

- coloană de rectificare;

- agent de refrigerare.

Se poate utiliza orice tip de aparat de distilare sau de distilare prin antrenare cu vapori de apă, dacă trece următorul test: se distilează de cinci ori consecutiv un amestec de etanol şi apă cu o tărie alcoolică de 10% vol. Distilatul trebuie să aibă o tărie alcoolică de cel puţin 9,9% vol., după a cincea distilare, adică pierderea de alcool în timpul fiecărei distilări să nu fie mai mare de 0,02% vol.

3.2. Reactivi

3.2.1. O suspensie de hidroxid de calciu 2 M, obţinută prin adăugarea cu grijă a 1l de apă la (60-70)°C pe 120 g de var nestins (CaO).

3.3. Prepararea probei

Se înlătură majoritatea bioxidului de carbon din vinul tînăr şi vinul spumant prin agitarea a 250-300 ml de vin într-un balon de 500 ml.

3.4. Metoda de lucru

Se măsoară 200 ml de vin, utilizînd un balon cotat. Se înregistrează temperatura vinului.

Se transferă vinul în balonul aparatului de distilare sau în barbatorul de antrenare cu vapori de apă. Se clăteşte balonul cotat de patru ori succesiv cu cîte 5 ml de apă adăugată balonului de distilare sau conductei de abur. Se adaugă 10 ml de hidroxid de calciu 2M (punctul 3.2.1.) şi cîteva bucăţi de material poros inert (piatră ponce etc.).

Se colectează distilatul în balonul cotat de 200 ml utilizat pentru măsurarea vinului. Se colectează un volum de trei pătrimi din volumul iniţial dacă este utilizată distilarea şi un volum de 198-199 ml de distilat, dacă este utilizată distilarea cu abur. Se completează la 200 ml prin adăugarea de apă distilată, păstrînd distilatul la o temperatură în intervalul ± 2°C faţă de temperatura iniţială. Se amestecă cu mare grijă, cu mişcări circulare.

În cazul vinurilor, care conţin concentraţii deosebit de mari de ioni amoniu, distilatul se redistilează corespunzător condiţiilor de mai sus, înlocuind suspensia de hidroxid de calciu cu 1 ml acid sulfuric diluat 10:100 (vol./vol.).

4. Metoda de referinţă. Determinarea concentraţiei alcoolice a distilatului prin picnometrie

4.1. Aparatura

Se utilizează picnometrul standard descris în metoda 1.1. MA-MD-AS 2-01-MASVOL.

4.2. Metoda de lucru

Se determină densitatea aparentă a distilatului (punctul 3.4) la t°C conform descrierii din metoda 1.1. MA-MD-AS 2-01-MASVOL, punctele 4.3.1. şi 4.3.2. Se notează densitatea cu ρ_t.

4.3. Exprimarea rezultatelor

4.3.1. Metoda de calcul

Se calculează concentraţia alcoolică la 20^°C, utilizînd tabelul 1. Pe linia orizontală a acestui tabel corespunzătoare temperaturii T (exprimată ca număr întreg), imediat sub t°C, se caută cea mai mică densitate, superioară ρ_t. Densitatea ρ la această temperatură T se calculează utilizînd diferenţa tabelară imediat de sub această densitate.

Pe linia temperaturii T se caută densitatea ρ′ imediat superioară ρ şi se calculează diferenţa dintre aceste două densităţi ρ şi ρ′. Această densitate se împarte cu densitatea tabelară din dreapta densităţii ρ′. Partea de după virgulă dă zecimalele concentraţiei alcoolice, în timp ce partea întreagă a concentraţiei este situată la începutul coloanei în care este situată densitatea ρ′.

Un exemplu de calculare a concentraţiei alcoolice este prezentat mai jos.

Corecţia de temperatură poate fi introdusă într-un program de calculator şi în aşa caz există posibilitatea efectuării automate a acesteia.

5. Metoda uzuală. Determinarea concentraţiei alcoolice a distilatului cu areometrul

5.1. Aparate

Alcoolmetrul

Alcoolmetrul trebuie să corespundă cerinţelor faţă de aparatele de clasa I sau II definite în Recomandările Internaţionale nr.44 ale O.I.M.L (Organizaţia Internaţională de Metrologie Legală) "Alcoolmetre şi aerometre pentru alcool".

Тermometrul cu scara 1/10°C, de la 0 pînă la 40°C, verificat cu precizia de 1/20 grade.

Cilindrul cu diametrul de 36 mm şi înălţimea de 320 mm, fixat vertical cu ajutorul unui suport reglat cu şuruburi speciale.

5.2. Modul de lucru

Se toarnă distilatul (punctul 3.4.) în cilindru. Se fixează strict în poziţie verticală. Se introduce termometrul şi alcoolmetrul. Ce citesc indicaţiile de pe termometru după 1 minut după amestecarea lichidului, pentru a se realiza egalitatea temperaturii termometrului, alcoolmetrului şi distilatului. Se scoate termometrul şi după 1 minut se citesc indicaţiile de pe alcoolmetru. Indicaţiile se citesc cel puţin de 3 ori, utilizînd lupa. La indicaţiile alcoolmetrului la temperatura reală t°C se face corecţie la temperatură, folosind tabelul II.

Temperatura lichidului nu trebuie să difere mult de temperatura ambiantă (cel mult cu 5°C).

6. Exemplu de calculare a concentraţiei alcoolice a unui vin

6.1. Măsurarea cu un picnometru pe o balanţă cu două talere

6.1.1. Constantele picnometrului au fost determinate şi calculate conform descrierii din metoda 1.1. MA-MD-AS 2-01-MASVOL (punctul 6.1.1.).

Densitatea aparentă la °C

2. Calcularea tăriei alcoolice

6.2. Măsurarea cu picnometrul pe o balanţă cu un taler

6.2.1. Constantele picnometrului au fost determinate şi calculate conform descrierii din metoda 1.1. MA-MD-AS 2-01- MASVOL ( punctul 6.2.1.).

1. Masa picnometrului umplut cu distilat

Masa picnometrului tară în momentul măsurării, în grame:

P₁ = 171,9178

Masa picnometrului, umplut cu distilat la 20,50°C, în grame:

P₂ = 167,8438

Variaţia în forţa de ascensiune a aerului:

dT = 171,9178 – 171,9160 = + 0,0018

Masa distilatului la 20,50°C:

L_t =167,8438 – (67,6695 + 0,0018) = 100,1725

Densitatea aparentă a distilatului:

2. Calcularea tăriei alcoolice

Formula de calcul pentru tabelele cu concentraţii alcoolice ale amestecurilor de etanol – apă

Densitatea ρ, în kilograme pe metru cub (kg/m³) ale amestecului de etanol – apă la temperatura t, în grade Celsius, este prezentată în formula de mai jos, ca funcţie a:

- tăriei alcoolice în părţi de greutate p, exprimată pînă la sutimi (exemplu: pentru concentraţia alcoolică 12% vol p= 0,12);

- temperaturii t, în grade Celsius;

- coeficienţii de mai jos.

Formula este valabilă pentru intervalul de temperaturi de la – 20 pînă la + 40°C.

  3. Extractul total şi sec nereducător

3.1. MA-MD-AS 2-03-EXTSEC

1. Definiţie

Extractul total include toată materia nevolatilă în condiţiile fizice specificate. Condiţiile fizice trebuie să fie de aşa natură, încît materia, care formează extractul, să fie alterată cît mai puţin posibil în timpul îndeplinirii testului.

Extractul sec nereducător reprezintă diferenţa dintre extractul total şi totalul zaharurilor.

Extractul sec este diferenţa între extractul total şi totalul zaharurilor care depăşesc 1 g/l, sulfatul de potasiu care depăşeşte de 1 g/l, manitolul prezent în orice concentraţie şi orice alte substanţe chimice care au fost adăugate vinului.

Extractul rezidual este extractul sec nereducător minus aciditatea fixă exprimată ca acid tartric.

Conţinutul de extract se exprimă în grame pe litru şi trebuie determinat cu o precizie de 0,5 g.

2. Principiul metodei

Metoda de măsurare cu un densimetru.

Extractul total este calculat indirect din densitatea relativă a mustului şi pentru vin din densitatea relativă a vinului dezalcoolizat.

Extractul total este exprimat prin cantitatea de zaharoză care, dizolvată în apă pînă la volumul de un litru, oferă o soluţie cu aceeaşi densitate relativă ca şi mustul sau vinul dezalcoolizat. Această cantitate este prezentată în tabelul de mai jos.

3. Metoda de calcul

Se determină densitatea relativă d_r 20/20 a mustului sau a vinului. În cazul vinului se calculează d_r , în cazul vinului dezalcoolizat se utilizează formula:

d_r = d_v – d_a + 1,000

unde,

d_v – densitatea relativă a vinului la 20°C (corectată pentru aciditatea volatilă);

d_a – densitatea relativă la 20°C a amestecului hidroalcoolic cu aceeaşi tărie alcoolică ca a vinului;

d_r poate fi calculat, de asemenea, utilizînd densităţile la 20°C, ρ_v – pentru vin şi ρ_a – pentru amestecurile de alcool şi apă cu aceeaşi tărie alcoolică ca a vinului, utilizînd formula:

d_r = 1,0018 (ρ_v – ρ_a) + 1,000

unde, coeficientul 1,0018 aproximează la 1 cînd ρ_v este sub 1,05, care este cazul cel mai frecvent.

Înainte de efectuarea acestui calcul densitatea relativă a vinului, măsurată conform specificaţiei de mai sus, trebuie corectată pentru efectul acidităţii volatile, utilizînd formula:

unde, a – este aciditatea volatilă exprimată în miliechivalenţi pe litru.

4. Exprimarea rezultatelor

Utilizînd densitatea a vinului dezalcoolizat sau a mustului din tabelul de mai jos se determină extractul total în grame pe litru.

Extractul total este exprimat în grame pe litru (g/l), cu o cifră zecimală.

4. Zaharurile

4.1 MA-MD-AS 311-01-SUCRED

1. Definiţie

Zaharuri reduse – toate zăharurile, care conţin funcţii aldehidice şi cetonice şi sînt determinate de acţiunea lor de reducere a soluţiei alcaline de sulfat de cupru.

2. Principiul metodei

2.1. Limpezirea.

2.1.1. Metoda de referinţă: după neutralizare şi înlăturarea alcoolului, vinul este trecut printr-o coloană de schimbare a ionilor în formă de acetat, urmat de limpezirea cu acetat de plumb .

2.1.2. Metode uzuale: vinul este tratat cu unul dintre următorii reactivi:

acetat neutru de plumb;

hexacianoferat (II) de zinc.

2.2. Determinarea

2.2.1. Metoda unică: vinul sau mustul reacţionează cu o cantitate determinată de soluţie alcalină de sulfat de cupru şi ionii de cupru în exces sînt determinaţi prin iodometrie.

3. Limpezirea

Conţinutul de zahăr al lichidului, în care este determinat, trebuie să fie cuprins între 0,5 şi 5,0 g/l.

Vinul sec nu trebuie diluat în timpul limpezirii; vinul dulce trebuie diluat în timpul limpezirii, în aşa fel, ca nivelul zahărului să fie cuprins în limitele precizate în tabelul următor:

3.1. Metoda de referinţă

3.1.1. Aparate şi reactivi

soluţie de acid clorhidric 1M, (HCl);

soluţie de hidroxid de sodiu 1M, (Na OH);

soluţie de acid acetic, 4M (CH₃COOH);

soluţie de hidroxid de sodiu 2M, (Na OH);

răşină de schimb anionic (Dowex 3 [20-50 mesh] sau răşină echivalentă);

pregătirea coloanei de schimb cu răşină anionică: în biuretă se fixează un dop de vată de sticlă şi se iau 15 ml de răşină de schimb anionic. Răşina se activează prin două cicluri complete de regenerare cu trecerea succesivă a soluţiilor de acid clorhidric 1M şi hidroxid de sodiu 1M. După spălarea cu 50 ml de apă distilată răşina se trece într-un vas cilindric, se adaugă 50 ml soluţie 1M de acid acetic şi se agită timp de 5 minute.

Se reumple din nou biureta şi se trece prin coloană 100 ml soluţie molară 1M de acid acetic. Este preferabil de avut un stoc de răşină în soluţie de acid acetic de 4M păstrată într-un balon cu dop rodat. Se spală coloana cu apă distilată pînă la reacţia neutră a apei de spălare.

Regenerarea răşinei: se trec 150 ml soluţie de 2M hidroxid de sodiu prin coloană pentru a înlătura acizii şi substanţele colorante reţinute pe răşină. Se clăteşte cu 100 ml de apă, se trec 100 ml soluţie de acid acetic de 4M. Se spală coloana pînă la reacţia neutră a apei de spălare.

Soluţia de acetat de plumb neutru (aproximativ saturată):

3.1.2 Metoda de lucru

Vinuri seci

50 ml de vin se toarnă într-un vas cilindric cu diametrul de 10-12 cm şi se adaugă 0,5 (n-0,5) ml soluţie 1M de hidroxid de sodiu (n-volumul de hidroxid de sodiu de 0,1M utilizat la determinarea acidităţii totale a 10 ml de vin). Se evaporă pe o baie de apă, îndreptînd un curent de aer cald, pînă volumul lichidului nu se va reduce aproximativ pînă la 20 ml.

Se face ca lichidul să traverseze o coloană cu răşină schimbătoare de anioni sub formă de acetat, cu viteza de 3 ml în 2 minute. Se culege apa de spălare într-un balon cotat de 100 ml.

Se spală de 6 ori vasul şi coloana cu cîte 10 ml de apă distilată, se adaugă agitînd 2,5 ml soluţie saturată de acetat de plumb şi 0,5g carbonat de calciu; se agită în mai multe reprize şi se lasă pentru limpezire cel puţin pe 15 minute. Se aduce la semn cu apă distilată şi se filtrează. 1 ml de filtrat corespunde cu 0,5 ml de vin.

Must, mistele, vinuri dulci şi demidulci

Produsele se diluează în felul următor:

Must şi mistele. Se diluează lichidul supus analizei de 10 ori. Din proba diluată se iau 10 ml.

Vinuri dulci alcoolizate şi nealcoolizate, cu densitatea 1,005-1,038. Se diluează lichidul supus analizei de 5 ori. Din proba diluată se iau 20 ml.

Vinuri densitatea cărora constituie 0,997-1,005. Se iau 20 ml de vin fără diluare.

Volumul de vin sau de must indicat mai sus se trece printr-o coloană cu răşină schimbătoare de anioni sub formă de acetat, cu viteza de 3 ml în 2 minute. Se culege apa de spălare într-un balon cotat de 100 ml, se spală de 6 ori vasul şi coloana cu cîte 10 ml de apă distilată.

Se adaugă 1 ml soluţie saturată de acetat de plumb şi 0,5g carbonat de calciu; se agită şi se lasă în repaus cel puţin pe 15 minute, agitînd periodic. Se aduce la semn cu apă distilată şi se filtrează.

1 ml de filtrat corespunde cu 0,01 ml de must sau mistelă;

1 ml de filtrat corespunde cu 0,04 ml de vin dulce;

1 ml de filtrat corespunde cu 0,2 ml de vin demidulce.

4. Determinarea

4.1. Reactivi

4.1.1. Soluţie alcalină de sare de cupru:

Se dizolvă sulfatul de cupru în 100 ml apă, acidul citric în 300 ml apă şi carbonatul de sodiu în 300-400 ml apă fierbinte. Se amestecă soluţia de acid citric şi soluţia de carbonat de sodiu. Se adaugă soluţia de sulfat de cupru şi se aduce volumul la un litru.

4.1.2. Soluţie de iodură de potasiu de 30g/100 ml.

Soluţia se păstrează într-un flacon de sticlă întunecată.

4.1.3. Acid sulfuric, 25g/ 100ml.

Se toarnă acidul în apă, se lasă să se răcească şi se aduce volumul la 100 ml.

4.1.4. Soluţie de amidon, 5 g/l.

Se dizolvă 5 g de amidon în aproximativ 500 ml de apă. Se fierbe agitînd timp de 10 minute. Se adaugă 200 g de clorură de sodiu. După răcire volumul se aduce la un litru.

4.1.5. Tiosulfat de sodiu, soluţie de 0,1 M.

4.1.6. Soluţie de zahăr invertit de 5 g/l, soluţia se utilizează pentru verificarea tehnicii de determinare.

Într-un balon cotat de 200 ml se iau:

Se plasează balonul pe o baie de apă cu temperatura de 60^°C, pînă cînd temperatura soluţiei atinge 50^°C şi se menţine la această temperatură exact 15 minute. Balonul se lasă timp de 30 minute la răcire lentă, apoi se răceşte prin imersie la o baie de apă rece. Se trece soluţia într-un balon cotat de 1 l şi se aduce la semn cu apă distilată. Această soluţie poate fi păstrată timp de o lună. Înainte de utilizare cantitatea necesară pentru analiză se neutralizează (aciditatea acestei soluţii este de aproximativ 0,06 M ) cu soluţie de hidroxid de sodiu.

4.2. Metoda de lucru

Într-un balon conic de 300 ml se iau 25 ml soluţie cuproalcalină, 15 ml de apă şi 10 ml soluţie limpezită. Acest volum de soluţie de zahăr nu trebuie să conţină mai mult de 60 mg zahăr invertit.

Se adaugă cîteva granule de piatră ponce. Balonul se adaptează la un frigider în reflux şi se pune la fierbere, care trebuie să se înceapă peste 2 minute. Se fierbe exact 10 minute. Îndată se răceşte sub un flux de apă rece. După răcirea completă se adaugă 10 ml soluţie de iodură de potasiu (30g/100ml), 25 ml de acid sulfuric (25g/100ml) şi 2 ml soluţie de amidon.

Se titrează cu soluţie de 0,1 M de tiosulfat de sodiu. n – numărul de ml utilizaţi. Paralel se efectuează o determinare martor în care 10 ml soluţie de zahăr sînt înlocuite cu 10 ml de apă. n' – volumul de tiosulfat utilizat.

4.3. Exprimarea rezultatelor

4.3.1. Calcule

Conţinutul de zahăr exprimat în zahăr invertit, care se conţine în soluţia luată pentru analiză conform tabelului de mai jos, unde este prezentat în funcţie de numărul n'-n mililitri de tiosulfat utilizaţi.

Conţinutul de zahăr invertit în vin se exprimă în grame la litru (g/l) cu precizie pînă la o zecimală, ţinînd cont de diluarea efectuată la limpezire şi de volumul soluţiei luat pentru analiză.

4.3.2. Repetabilitatea

r = 0,015 x_i

x_i – concentraţia de zahăr invertit, g/l de probă

4.3.3. Reproductibilitatea

R = 0,058 x_i

x_i – concentraţia de zahăr invertit, g/l de probă.

4.2. MA-MD-AS 2-02 SUCREF

1. Principiul metodei

Indicele de refracţie la 20^°C, exprimat fie ca valoare absolută, fie ca procent din masa de zaharoză se raportează pe un tabel corespunzător, pentru a obţine conţinutul zăharurilor în grame pe litru şi în grame pe kilogram pentru mustul de struguri, mustul de struguri concentrat şi mustul de struguri concentrat rectificat.

2. Aparate

2.1. Refractometru Abbe

Refractometrul utilizat trebuie să fie prevăzut cu o scară ce indică:

- procentajul din masa de zaharoză cu precizie de 0,1%;

- indicii de refracţie cu patru zecimale.

Refractometrul trebuie să fie prevăzut, de asemenea, cu un termometru pentru măsurări la temperatura de + (15 – 25)^°C şi un dispozitiv de circulaţie a apei, care să permită efectuarea determinărilor la o temperatură de (20 ± 5)^°C.

Instrucţiunea de operare a instrumentului trebuie strict respectată în special referitor la calibrare şi la sursa de lumină.

3. Pregătirea probei

3.1. Must şi must concentrat

Dacă este necesar, mustul se trece printr-un tifon împăturit în patru şi, după ce primele picături de lichid au fost eliminate, se efectuează determinarea acestuia.

3.2. Must de struguri concentrat rectificat

În funcţie de concentraţie, se utilizează fie mustul concentrat rectificat, fie o soluţie obţinută prin diluarea a 200 g must concentrat rectificat şi completarea pînă la 500 g cu apă distilată. Toate cîntăririle fiind efectuate cu exactitate.

4. Modul de operare

Se aduce proba la temperatura apropiată de 20^°C. Pe prisma inferioară a refractometrului se pune un volum mic din proba de testare, avînd grijă ca lichidul testat să acopere uniform suprafaţa sticlei. Determinările se efectuează în conformitate cu instrucţiunile de funcţionare ale instrumentului utilizat.

Se citeşte procentul de zaharoză din masă cu o precizie de 0,1% sau se citeşte indicele de refracţie cu patru zecimale.

Se efectuează cel puţin două măsurări pe aceeaşi probă pregătită. Se notează temperatura t^°C.

5. Calcule

5.1. Corecţii de temperatură

5.1.1. La utilizarea instrumentelor gradate în % pe masă de zaharoză, pentru obţinerea corecţiilor de temperatură se utilizează tabelul I.

5.1.2. La utilizarea instrumentelor gradate în indicele de refracţie se află indicele măsurat la t^°C în tabelul II (coloana I) pentru a se obţine valoarea corespunzătoare a procentului din masa de zaharoză la t^°C. Această valoare este corectată pentru temperatură şi este exprimată sub formă de concentraţie la 20^°C cu ajutorul tabelului I.

5.2. Concentraţia de zahăr din must şi must concentrat

Se află din tabelul II procentul din masa de zaharoză la 20^°C şi se determină concentraţia de zahăr în grame pe litru şi grame pe kilogram. Concentraţia de zahăr este exprimată cu o zecimală, ca zahăr invertit.

5.3 Concentraţia de zahăr din must concentrat rectificat

Se află din tabelul III procentul din masa de zaharoză la 20^°C şi se citeşte pe acelaşi rînd concentraţia de zahăr în grame pe litru şi grame pe kilogram. Concentraţia de zahăr este exprimată cu o zecimală.

În cazul în care determinarea a fost efectuată pe must concentrat rectificat şi diluat, rezultatul se înmulţeşte cu factorul de diluţie.

5.4. Indicele de refracţie al mustului, mustului concentrat şi mustului concentrat rectificat

Se află din tabelul II procentul din masa de zaharoză la 20^°C şi se citeşte pe acelaşi rînd indicele de refracţie la 20^°C. Acest indice este exprimat cu patru zecimale.

5. Aciditatea totală

5.1 MA-MD-AS 313-01-ACITOT

1. Definiţie

Prin aciditate totală a vinului se înţelege suma acizilor titrabili adusă la pH 7 prin adăugarea unei soluţii alcaline titrată. Dioxidul de carbon nu este inclus în aciditatea totală.

2. Principiul metodei

Titrarea potenţiometrică sau titrarea în prezenţa bromtimolului albastru, care serveşte ca indicator al finisării reacţiei la compararea cu un standard de culoare.

3. Reactivi

3.1. Soluţie tampon cu pH 7:

Se pot utiliza la fel soluţii tampon gata preparate.

3.2. Soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 M (NaOH).

3.3. Soluţie indicatoare de bromtimol albastru, 4 g/l:

4. Aparatura:

potenţiometru cu scală gradată pentru valori pH şi electrozi. Electrodul de sticlă trebuie păstrat în apă distilată, electrodul de calomel – în soluţie saturată de clorură de potasiu. Electrodul combinat, folosit cel mai des, trebuie păstrat în apă distilată;

cilindri gradaţi de 50 ml (pentru analiza vinului ) şi 100 ml (pentru analiza mustului concentrat rectificat).

5. Metoda de lucru

5.1. Pregătirea probei

5.1.1. Vinuri

Eliminarea dioxidulului de carbon: se iau aproximativ 50 ml de vin într-un balon de vid, se face vid în balon cu pompa de vid cu apă timp de 1-2 minute, agitînd continuu.

5.1.2. Must concentrat rectificat

Se introduc 200 g must concentrat rectificat într-un balon cotat de 500 ml. Se completează pînă la cotă cu apă. Se omogenizează.

5.2. Titrarea potenţiometrică

5.2.1. Calibrarea pH-metrului

pH-metrul este calibrat cu soluţie tampon pH 7,00 la 20^°C, conform instrucţiunilor de utilizare a aparatului.

5.2.2. Metoda de determinare

Într-un cilindru gradat se introduce o cantitate din probă, preparată în conformitate cu punctul 5.1., cantitate egală cu 10 ml (vin) şi 50 ml (must concentrat rectificat). Se adaugă circa 10 ml apă distilată şi apoi se adaugă soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 M (punctul 3.2.) din biuretă pînă cînd pH-ul este egal cu 7 la 20^°C. Hidroxidul de sodiu trebuie adăugat încet şi soluţia trebuie amestecată continuu. Se notează cu n ml volumul de NaOH 0,1 M adăugat.

5.3. Titrarea cu indicator (albastru de  bromtimol)

5.3.1. Test preliminar: determinarea culorii etalon.

Într-un cilindru gradat se iau 25 ml apă distilată fiartă, 1 ml soluţie de bromotimol albastru (punctul 3.3.) şi proba preparată în conformitate cu punctul 5.1., egală cu 10 ml (vin) şi 50 ml (must concentrat rectificat). Se adaugă soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 M (punctul 3.2.) pînă cînd culoarea devine albastru-verde. Se adaugă 5 ml soluţie tampon pH 7 (punctul 3.1).

5.3.2. Titrarea

Într-un cilindru gradat se iau 25 ml apă distilată fiartă, 1 ml soluţie de bromotimol albastru (punctul 3.3) şi proba preparată în conformitate cu punctul 5.1., egală cu 10 ml (vin) şi 50 ml (must concentrat rectificat). Se adaugă soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 M (punctul 3.2.) pînă cînd se obţine aceeaşi culoare ca în testul preliminar de mai sus (punctul 5.3.1.). Se notează cu n ml volumul de hidroxid de sodiu 0,1 M adăugat.

6. Exprimarea rezultatelor

6.1. Metoda de calcul

6.1.1. Vinuri

Aciditatea totală exprimată în miligram-echivalenţi pe litru:

A = 10 n,

se notează cu o cifră zecimală.

Aciditatea totală exprimată în grame de acid tartric pe litru este prezentată în formula:

A′ = 0,075 A

se notează cu o cifră zecimală.

6.1.2. Must concentrat rectificat

Aciditatea totală exprimată în miligram-echivalenţi pe kilogram de must concentrat rectificat,

a = 5 n;

Aciditatea totală exprimată în miligram-echivalenţi pe kilogram de zaharuri totale,

în care, P – conţinutul procentual (m/m) a zaharurilor totale. Se notează cu o cifră zecimală.

6.2. Repetabilitatea (r) pentru titrare cu indicator:

r = 0,9 meq /l

r = 0,04 g acid sulfuric/l

r = 0,07 g acid tartric / l.

6.3. Reproductibilitatea (R) pentru titrare cu indicator

Pentru vinurile albe şi roze:

R = 3,6 meq /l

R = 0,2 g acid sulfuric/l

R = 0,3 g acid tartric / l.

pentru vinurile roşii:

R = 5,1 meq /l

R = 0,3 g acid sulfuric/l

R = 0,4 g acid tartric / l.

6. Aciditatea volatilă

6.1 MA-MD-AS 313-02-ACIVOL

1. Definiţie

Acizii volatili sînt constituiţi din acizii aparţinînd seriilor acetice, în principal acidul acetic, prezenţi în vin în stare liberă şi sub formă de săruri.

2. Principiul metodei

Titrarea acizilor volatili separaţi din vin printr-o distilare cu vapori de apă. Mai întîi se elimină bioxidul de carbon din vin.

Aciditatea bioxidului de sulf liber şi combinat, a acidului sorbic distilate în aceste condiţii, se scad din aciditatea produsului rezultat în urma distilării.

Trebuie scăzută, de asemenea, aciditatea acidului sorbic, adăugat eventual în vin.

O parte din acidul salicilic, folosit în unele ţări pentru a stabiliza vinurile, este prezentă în produsul rezultat în urma distilării. Acesta trebuie determinat şi scăzut din aciditatea volatilă. Metoda de determinare este descrisă în punctul 7 din prezentul capitol.

3. Reactivi:

acid tartric cristalizat (C₄H₆O₆);

hidroxid de sodiu (NaOH), soluţie de 0,1 M;

fenolftaleină, soluţie de 1% în alcool neutru 96% vol;

acid clorhidric diluat 1/4 (v/v) (ρ₂₀ = 1,18 – 1,19 g/ml);

iod (I₂) ,soluţie de 0,005 M;

iodură de potasiu (KI) cristalizat;

amidon, soluţie de 5 g/l: se amestecă 5 g amidon cu aproximativ 500 ml apă. Se aduce la punctul de fierbere, amestecînd continuu, şi se fierbe timp de 10 minute; se adaugă 200 g clorură de sodiu. După răcire se completează pînă la un litru.

Soluţie saturată de tetraborat de sodiu (Na₂B₄O₇ × 10 H₂O), aproximativ 55 g/l la 20°C.

4. Aparatura

4.1. Aparat de distilare în vapori de apă format din generator de abur (aburul nu trebuie să conţină bioxid de carbon), barbotor de sticlă, coloană de rectificare, refrigerent.

Această instalaţie trebuie să treacă următoarele trei teste:

a) se pun în barbotor 20 ml apă fiartă. Se colectează 250 ml de produs distilat şi se adaugă 0,1 ml soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 M şi două picături de soluţie de fenolftaleină. Nuanţa roz trebuie să se păstreze cel puţin 10 secunde (aceasta indică că aburul nu conţine bioxid de carbon);

b) se pun în barbotor 20 ml soluţie de acid acetic 0,1 M. Se colectează 250 ml de distilat. Se titrează cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 M: volumul utilizat trebuie să fie de cel puţin 19,9 ml (în acest caz cel puţin 99,95% din acidul acetic a fost antrenat de vapori);

c) se pun în barbotor 20 ml soluţie de acid lactic 1 M. Se colectează 250 ml de distilat. Se titrează cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 M: volumul de soluţie de hidroxid de sodiu adăugat trebuie să fie mai mic de 1,0 ml (în acest caz nu se distilează mai mult de 0,5% din acidul lactic).

Aparatul care trece aceste teste în mod satisfăcător îndeplineşte condiţiile oficiale internaţionale.

4.2. Pompă de vid cu apă

4.3. Balon de vid

5. Metoda de lucru

5.1. Pregătirea probei

Eliminarea bioxidului de carbon: se pun circa 50 ml vin în balonul de vid; se face vid în balon cu pompa de vid cu apă timp de 1-2 minute, agitîndu-se continuu.

5.2. Distilarea cu vapori de apă

Se pun în barbotor 20 ml vin fără bioxid de carbon, se adaugă aproximativ 0,5 g acid tartric. Se colectează cel puţin 250 ml de produs distilat.

5.3. Titrarea

Se titrează cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,1M, în prezenţa a 2 picături de fenolftaleină ca indicator, se notează cu n ml cantitatea de hidroxid de sodiu folosită.

Se adaugă patru picături de acid clorhidric diluat 1/4, 2 ml soluţie de amidon şi cîteva cristale de iodură de potasiu. Se titrează dioxidul de sulf liber cu o soluţie de iod 0,005 M. Se notează cu n′ cantitatea folosită.

Se adaugă soluţie saturată de borax pînă cînd nuanţa roz reapare. Se titrează dioxidul de sulf combinat cu o soluţie de iod 0,005 M, se notează cu n′′ cantitatea soluţiei de iod folosită.

6. Exprimarea rezultatelor

6.1. Metoda de calcul

Conţinutul de acizi volatili exprimaţi cu o cifră zecimală, în miligram-echivalenţi pe litru este prezentat în formula:

A = 5(n – 0,1 n′ – 0,05 n′′).

Conţinutul de acizi volatili exprimaţi cu două zecimale, în grame de acid acetic pe litru este prezentat în formula:

A = 0,300 (n – 0,1 n′ – 0,05 n′′).

6.2. Repetabilitatea (r)

r = 0,7 mg-echv/l

r = 0,04 g acid acetic/l.

6.3. Reproductibilitatea (R)

R = 1,3 mg-echv/l

R = 0,08 g acid acetic/l.

6.4. Vin în care se conţine acid sorbic

Deoarece 96% din acidul sorbic este antrenat de vapori într-un volum distilat de 250 ml, aciditatea trebuie scăzută din aciditatea volatilă, ştiind că 100 mg acid sorbic corespunde unei acidităţi de 0,89 meg sau 0,053 g acid acetic şi cunoscînd concentraţia de acid sorbic exprimată în mg/l determinată prin alte metode.

7. Determinarea acidului salicilic, trecut în distilatul acizilor volatili

7.1. Principiul metodei

După determinarea acizilor volatili şi corecţia la dioxidul de sulf, la acidularea ulterioară a distilatului şi adăugarea unei sări de fier trivalent, apariţia culorii violete demonstrează prezenţa acidului salicilic.

Determinarea acidului salicilic, antrenat în produsul distilat cu acizii volatili, se realizează pe un al doilea produs distilat, cu acelaşi volum asupra căruia s-a făcut determinarea acidităţii volatile. În acest produs, acidul salicilic se determină printr-o metodă colorimetrică comparativă. Aciditatea obţinută în al doilea produs se scade din aciditatea volatilă a produsului.

7.2. Reactivi:

acid clorhidric (HCl) (ρ₂₀ = 1,18 – 1,19 g/ml);

tiosulfat de sodiu,(Na₂S₂O₃ × 5Н₂0), soluţie de 0,1 М;

sulfat de amoniu şi fier (III) (alaun de fier şi amoniu) [Fe₂(S0₄)₃ × (NH₄)₂S0₄ × 24Н₂0], soluţie de 10% (m/v);

salicilat de sodiu (NaC₇H₅O₃), soluţie de 0,01 М. Soluţia conţine 1,60 g/l salicilat de sodiu.

7.3. Metoda de lucru

7.3.1. Identificarea acidului salicilic în distilatul cu acizi volatili

Imediat după determinarea acidităţii volatile şi corecţia pentru dioxidul de sulf liber şi combinat, într-un balon conic se pun 0,5 ml acid clorhidric, 3 ml soluţie de tiosulfat de sodiu 0,1M şi 1 ml soluţie de alaun de fier şi amoniu. Apariţia unei culori violete demonstrează prezenţa acidului salicilic.

7.3.2. Determinarea acidului salicilic

Pe balonul conic se notează cantitatea produsului distilat printr-un semn de referinţă. Se goleşte şi se spală balonul cu apă distilată.

O nouă probă de 20 ml vin se supune distilării cu vapori de apă şi se colectează produsul distilat în balonul conic pînă la cota de referinţă. Se adaugă 0,3 ml acid clorhidric pur şi 1 ml soluţie de alaun de fier şi amoniu. Conţinutul balonului se colorează violet.

Într-un balon conic, identic cu acela care are semnul de referinţă, se pune apă distilată pînă la acelaşi nivel cu acela al produsului distilat. Se adaugă 0,3 ml acid clorhidric pur şi 1 ml soluţie de alaun de fier şi amoniu. Din biuretă se pune soluţie de salicilat de sodiu 0,01 M pînă cînd nuanţa de violet obţinută are aceeaşi intensitate cu aceea din balonul conic care conţine vinul distilat. Se notează cu n′″ cantitatea de soluţie adăugată din biuretă.

7.4. Rectificarea acidităţii volatile

Se scade volumul 0,1n′″ ml din volumul de n ml soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 M folosită pentru titrarea produsului distilat în timpul determinării acidităţii volatile.

7. Dioxidul de sulf

7.1 MA-MD-AS 323-04-DIOSU

1. Definiţii

Dioxidul de sulf liber este definit de dioxidul de sulf prezent în must sau vin în următoarele forme: H₂SO₃, HSO₃^-. Echilibrul dintre aceste forme este o funcţie a pH şi temperaturii:

H₂SO₃ reprezintă dioxidul de sulf molecular.

Dioxidul de sulf total este definit ca totalul tuturor formelor de bioxid de sulf prezente în vin, fie în stare liberă, fie combinat cu constituenţii săi.

2. Dioxidul de sulf liber şi total

2.1. Principiul metodelor

2.1.1. Metoda de referinţă

Pentru vinuri şi must

Dioxidul de sulf este extras de un curent de aer sau azot, apoi este fixat şi oxidat, fiind trecut printr-o soluţie diluată şi neutră de apă oxigenată. Acidul sulfuric format este determinat prin titrarea cu o soluţie standard de hidroxid de sodiu.

Dioxidul de sulf liber este separat de vin la o temperatură scăzută de 10°C.

Pentru mustul concentrat rectificat

Dioxidul de sulf total se extrage din mustul concentrat rectificat, preventiv diluat, prin antrenare la temperaturi înalte, pînă la 100°C.

2.1.2. Metoda rapidă de determinare (pentru vinuri şi musturi)

Dioxidul de sulf liber este determinat prin titrare iodometrică directă. Dioxidul de sulf combinat este determinat prin titrare iodometrică după hidroliza alcalină. Adunînd valorile căpătate obţinem dioxidul de sulf total.

2.2. Metoda de referinţă

2.2.1. Aparatura

Aparatul utilizat trebuie să fie conform cu schema prezentată în figura 2, în special, cu privire la refrigerator.

Tubul de alimentare cu gaz a barbotorului B se termină într-o mică sferă cu diametrul de 1 cm cu 20 de orificii şi diametrul de 0,2 mm pe circumferinţa orizontală cea mai mare. Alternativ, acest tub se poate termina cu o placă de sticlă, care produce un număr mare de bule foarte mici, care asigură contactul dintre fazele lichidă şi gazoasă.

Figura 2. Schema aparatului

Diametrele interioare ale celor patru tuburi concentrice care formează

condensatorul sînt 45, 34, 27 şi 10 mm.

Curentul de gaz ce traversează aparatele ar trebui să fie de aproximativ 40 litri pe oră. Vasul din dreapta diagramei are rolul de a limita reducerea presiunii, produse de pompa de apă, la 20-30 cm. Pentru reglarea vidului la valoarea corectă, trebuie instalat un debit – metru, cu un tub semicapilar, între barbotor şi vas .

2.2.2. Reactivi:

acid fosforic 85% (H₃PO₄, ρ₂₀ = 1,71 g/ml), soluţie de 25% (m/v);

apă oxigenată, soluţie de 9,1 g H₂O₂ /litru;

reactivul indicator:

2.2.3. Metoda de lucru

Determinarea dioxidului de sulf liber

Vinul se păstrează în sticlă plină şi închisă cu dop, la 20°C, timp de două zile înaintea determinării.

În balonul A de 250 ml a aparatului se introduc 50 ml din probă şi 15 ml de acid fosforic. Se conectează balonul la loc.

Se pun 2-3 ml de soluţie de apă oxigenată şi 2 picături din reactivul indicator în barbotorul B şi se neutralizează soluţia de apă oxigenată cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,01M. Se conectează balonul la aparat.

Se barbotează cu aer (sau azot) timp de 15 minute. Dioxidul de sulf eliberat este oxidat în acid sulfuric. Se îndepărtează barbotorul de aparat şi se titrează acidul format cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,01M. Se notează cu n ml volumul utilizat.

Exprimarea rezultatelor

Dioxidul de sulf liber este exprimat în miligrame pe litru (mg/l), rotunjit la cel mai apropiat număr întreg.

Dioxidul de sulf liber, în miligrame pe litru (mg/l), este 6,4 n.

Determinarea dioxidului de sulf total

Pentru mustul concentrat rectificat, se foloseşte soluţia obţinută prin diluarea probei analizate la 40% (m/v), conform capitolului "Aciditatea titrabilă", punctul 5.1.2. Se introduc 50 ml din această soluţie şi 5 ml de acid fosforic în balonul A de 250 ml al aparatului de antrenare. Se conectează balonul la aparat.

Pentru vinuri şi musturi cînd concentraţia estimată în probă nu depăşeşte 50 mg de SO₂ total pe litru, se iau 50 ml din probă şi 15 ml de acid fosforic în balonul de 250 ml al aparatului de antrenare. Se conectează balonul la aparat.

Pentru determinarea dioxidului de sulf în sucul de struguri trebuie să se utilizeze 5 ml de soluţie 25% (m/v) de acid fosforic .

Cînd concentraţia estimată în probă depăşeşte 50 mg de SO₂ total pe litru, se iau 20 ml din probă şi 5 ml de acid fosforic în balonul de 100 ml al aparatului de antrenare. Se conectează balonul la aparat.

În barbotorul B se pun 2-3 ml soluţie de apă oxigenată, 2 picături din reactivul indicator şi se neutralizează soluţia de perohid de oxigen, cum e descris mai sus; se aduce vinul din balon la fierbere, utilizînd o flacără mică de 4-5 cm înălţime, care trebuie să atingă direct fundul balonului. Nu se pune balonul pe o plasă de metal, ci pe un disc cu o deschizătură de aproximativ 30 mm diametru. Acest lucru este necesar pentru a evita supraîncălzirea substanţelor extractive, care se depozitează pe pereţii balonului.

Se menţine la fierbere în timp ce trece un curent de aer (sau azot). În 15 minute dioxidul de sulf total se antrenează în întregime şi se oxidează. Acidul sulfuric format se determină prin titrarea cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,01M. Se notează cu n ml volumul utilizat.

Exprimarea rezultatelor

Must şi vinuri: conţinutul de dioxid de sulf total este exprimat în miligrame pe litru (mg/l);

Must concentrat rectificat: conţinutul de dioxid de sulf total este exprimat în miligrame pe kilogram (mg/kg) din zaharurile totale, rotunjit la cel mai apropiat număr întreg.

Calculare

Pentru vinuri

Dioxidul de sulf total în miligrame per litru:

Pentru mustul concentrat rectificat

Dioxidul de sulf total în miligrame pe kilogram (mg/kg) din zaharurile totale (50ml probă testată ):

1600 × n

–––––––

P

unde,

P – procentajul concentraţiei (m/m) a zaharurilor totale.

3. Dioxidul de sulf molecular

3.1. Principiul metodei

Procentajul de bioxid de sulf molecular, H₂SO₃ în dioxidul de sulf liber, se calculează ca o funcţie a pH, a concentraţiei alcoolice şi a temperaturii.

Pentru o temperatură şi concentraţia alcoolică cunoscută:

unde,

I – puterea ionică;

A şi B – coeficienţi care variază în funcţie de temperatură şi concentraţia alcoolică;

K_T – constanta de disociere termodinamică: în tabelul I sînt date valori ale pK_T pentru diferite temperaturi şi tării alcoolice;

K_M – constanta de disociere mixtă.

Luînd o valoare medie de 0,038 pentru forţa ionică I, tabelul II prezintă valori ale lui pK_M pentru diferite temperaturi şi concentraţii alcoolice.

Conţinutul de dioxid de sulf molecular calculat, folosind expresia (1) este prezentat în tabelul III, pentru diferite valori ale pH-ului, temperaturii şi concentraţiei alcoolice.

3.2. Calculare

Dacă este cunoscut pH-ul vinului şi concentraţia alcoolică, procentul dioxidului de sulf molecular este prezentat în tabelul III, pentru o temperatură de T°C. Se notează cu X, %.

Dioxidul de sulf molecular în miligrame pe litru (mg/l) constituie: X × C,

unde C – conţinutul de dioxid de sulf liber în mg/l.

8. Determinarea zaharurilor în vinuri prin metoda HPLC

8.1. MA-MD-AS 311-03-SUCRES

1. Domeniu de aplicare

Determinarea conţinutului de fructoză, glucoză şi zaharoză în vinuri şi musturi prin metoda cromatografiei lichide de înaltă performanţă (HPLC).

2. Principiul

Zaharurile şi glicerina sînt determinate direct în vin prin metoda cromatografiei lichide de înaltă performanţă cu detector refractometric.

3. Reactivi. Prepararea soluţiilor de reactivi:

3.1. Apa demineralizată filtrată pe o membrană de celuloză 0,45 ľm cu ajutorul sistemului de filtrare.

3.2. Eluentul: cu ajutorul unui cilindru gradat se iau 800 ml de acetonitril într-un flacon de 1 litru, se adaugă 200 ml de apă, se degazează în permanenţă cu heliu. În cazul sistemelor cu circuit închis (reîntoarcerea eluentului în flacon), amestecul este reînnoit săptămînal.

4. Echipamente:

baloane conice de 100 ml;

vase cilindrice de 100 ml;

vase cilindrice de 50 ml;

pipete automate de 10 ml;

con de ajustaj;

baloane cotate de 100 ml;

cilindru cu capacitatea de 1 l;

flacon de 1 l;

seringă de 20 ml;

sistem de filtrare;

portfiltre;

membrane de 0,45 ľm din celuloză;

membrane de 0,8 ľm din celuloză;

membrane de 1,2 ľm din celuloză;

membrane de 5,0 ľm din celuloză;

prefiltre din celuloză;

cartuş de filtrare din silice grefată cu grupări de octadecil (spre exemplu: Seppack C18);

peliculă, spre exemplu, Parafilm;

baloane conice de 10 ml;

cromatograf HPLC;

coloană alchilaminică de 5 ľm şi 250 × 4 mm.

Condiţionarea coloanei: coloana este umplută şi testată cu hexan. Se spală cu 50 ml de etanol, apoi cu 50 ml metanol, înainte de trecerea amestecului acetonitril: apă 80/20. Debitul iniţial este de 0,1 ml/minută, ulterior acesta creşte progresiv pînă la 1 ml/min.

Detectorul refractometric – se clăteşte celula de referinţă odată sau de două ori în zi cu eluent, se lasă pe aproximativ un sfert de oră pentru a stabili linia de fond. Se reglează la zero refractometrul.

Baie cu ultrasunete.

5. Pregătirea probelor

Probele supuse degazării cu azot sau într-o baie cu ultrasunete.

6. Modul de lucru

6.1. Pregătirea mostrei

6.1.1. Filtrarea

Se prelevează cu ajutorul unei seringi 25 ml de produs şi se filtrează:

- vinul, printr-o membrană de 0,45 ľm;

- mustul şi vinul brut – prin prefiltru şi printr-o serie de filtre.

Mustul se diluează de 5 ori. Se iau 20 ml din vinul sau mustul filtrat (diluat) cu ajutorul unei pipete automate de 10 ml, dotată cu con de ajusaj, se transferă cantitativ într-un balon cotat de 100 ml. Se aduce volumul la cotă cu apă demineralizată, se înveleşte balonul cu peliculă, se omogenizează.

6.1.2. Eliminarea compuşilor fenolici

Proba de vin sau must este trecută printr-un cartuş de filtrare C18 .

Pregătirea cartuşului C18 pentru filtrare: se trec în contrasens 10 ml de metanol, apoi 10 ml de apă demineralizată.

Trecerea probei prin cartuşul C18: se clăteşte seringa de 10 ml cu aproximativ 2 ml de probă. Apoi se iau aproximativ 9 ml din proba de analizat, se uneşte cartuşul cu capătul îngust al seringii şi se trece proba prin cartuş; primii 3 ml se elimină, iar următorii 6 ml se plasează într-un balon conic de 10 ml.

După fiecare filtrare cartuşul se clăteşte în contrasens cu 10 ml de metanol, apoi 10 ml de apă demineralizată. În acest caz, el poate fi reutilizat.

6.1.3. Curăţarea veselei

Seringile şi acul se clătesc cu apă demineralizată după fiecare probă. Portfiltrul se clăteşte cu apă caldă, apoi cu metanol. Se usucă în condiţii de cameră.

6.2. Metoda de lucru

6.2.1. Condiţii analitice:

detectorul reglat conform instrucţiunii aparatului.

6.2.2. Etalonare externă

Se prepară un amestec etalon sintetic din:

fructoză 10 g/l ± 0,01 g/l;

glucoză 10 g/l ± 0,01 g/l;

zaharoză 10 g/l ± 0,01 g/l;

dacă este necesar de determinat şi glicerina, se adaugă:

glicerină 10 g/l ± 0,01 g/l.

Calculul factorilor de răspuns:

RF_i = S_i/C_i ,

unde S_i – este suprafaţa picului componentului în soluţia de calibrare;

C_i – concentraţia componentului în soluţia de calibrare.

7. Exprimarea rezultatelor

Calcularea concentraţiei în proba de analizat:

C_pr. = S_pr./RF_i ,

unde, S_pr. – suprafaţa picului componentului în proba de analizat. Rezultatele se exprimă în g/l. Trebuie de luat în considerare diluţiile efectuate.

8. Controlul rezultatelor

Se efectuează o testare prin metoda de referinţă, cu introducerea probelor de referinţă printre cele de analizat.

9. Performanţa metodei

Durata unei analize este de aproximativ 50 minute. Influenţa diferitor constituenţi ai vinului: glicerina se separă în aceleaşi condiţii ca şi zaharurile. Astfel, se recomandă a o doza în cadrul aceleaşi reprize. Nici unul dintre componenţii vinului nu eluează concomitent cu glucoza, fructoza şi zaharoza.

Analiza este sensibilă la variaţia temperaturii, coloanele trebuie protejate cu un înveliş.

9.1. Limite de detectare şi de cuantificare

9.2. Fidelitatea metodei

9.2.1. Repetabilitatea

Diferenţa absolută între două rezultate individuale pe acelaşi vin efectuate de acelaşi operator într-un interval scurt de timp nu va depăşi valoarea repetabilităţii în mai mult de 5% de cazuri (P = 0,95).

9.2.2. Reproductibilitatea

Diferenţa absolută între două rezultate individuale pe acelaşi vin, obţinute în două laboratoare, nu va depăşi valoarea reproductibilităţii în mai mult de 5% de cazuri (P = 0,95).

9. Glucoza şi fructoza

9.1. MA-MD-AS 311-02-GLUFRU

1. Definiţie

Glucoza şi fructoza pot fi determinate individual printr-o metodă enzimatică, avînd ca unic obiectiv calcularea raportului glucoză/fructoză.

2. Principiul metodei

Glucoza şi fructoza sînt fosforilate cu adenozin trifosfat (ATP) printr-o reacţie enzimatică catalizată de hexochinază (HK) şi produce glucoză 6-fosfat (G6P) şi fructoză 6-fosfat (F6P):

Glucoză 6-fosfat este oxidat într-o primă etapă în gluconat 6-fosfat de către nicotinamid adenin dinucleotid fosfat (NADPH) în prezenţa enzimei glucoză 6-fosfat dehidrogenază (G6PDH). Cantitatea de NADPH redus corespunde celei de glucoză 6-fosfat şi, astfel, glucozei.

Cantitatea de nicotinamid adenin denucleotid fosfat redusă se determină din absorbţia la 340 nm. La sfîrşitul acestei reacţii fructoza 6-fosfat este transformată în glucoză 6-fosfat (G6P) prin acţiunea fosfoglucozei izomerizate

Glucoza 6-fosfat reacţionează din nou cu nicotinamid adenin dinucleotid fosfat, pentru a rezulta gluconatul 6-fosfat şi nicotinamid adenin dinucleotod fosfat redus care, în cele din urmă, se determină.

3. Aparatura

Spectrofotometru pentru determinări la 340 nm, lungimea de undă la care absorbţia de NADPH redus este maximă. Deoarece sînt incluse măsurători absolute (adică nu sînt folosite diagrame de calibrare, dar standardizarea se efectuează în baza coeficientului de extincţie a NADPH redus) trebuie controlate scala lungimilor de undă şi valorile puterii de absorbţie obţinute de la aparat. În cazul în care nu este disponibil un astfel de spectrofotometru, se poate folosi un spectrofotometru cu o sursă cu spectru discontinuu pentru determinări la 334 nm sau la 365 nm.

Cuve de sticlă cu lungimea drumului optic de 1 cm sau cuve de unică folosinţă.

Pipete pentru soluţiile testului enzimatic de 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 ml.

4. Reactivi

4.1. Soluţia 1: soluţie-tampon (trietanolamină 0,3 M, pH 7,6, Mg²⁺ 4 × 10^-3 M): se dizolvă 11,2 g de clorhidrat de trietanolamină [(C₂H₅)₃N HCl] şi 0,2 g MgSO₄ × 7H₂O în 150 ml de apă bidistilată. Se adaugă aproximativ 4 ml de soluţie de hidroxid de sodiu 5 M (NaOH) pentru a obţine o valoare a pH-lui de 7,6 şi se completează pînă la 200 ml. Soluţia-tampon obţinută poate fi păstrată timp de patru săptămîni la o temperatură de +4°C.

4.2. Soluţia 2: soluţie de NADPH (aproximativ 11,5 × 10^-3 M): se dizolvă 50 mg de sare disodică de nicotinamid adenin dinucleotidfosfat în 5 ml de apă bidistilată. Această soluţie poate fi păstrată timp de patru săptămîni la o temperatură de +4°C.

4.3. Soluţia 3: soluţie adenozin – 5′ – trifosfat (aproximativ 81 × 10^-3 M): se dizolvă 250 mg de sare disodică a adenozin – 5′– trifosfat şi 250 mg bicarbonat de sodiu (NaHCO₃) în 5 ml de apă bidistilată. Această soluţie poate fi păstrată patru săptămîni la o temperatură de +4°C.

4.4. Soluţia 4: soluţie hexochinază/glucoză 6-fosfat dehidrogenază: se amestecă 0,5 ml de hexochinază (2 mg de proteină/ml) cu 0,5 ml glucoză 6-fosfat dehidrogenază (1 mg de proteină/ml). Acest amestec se poate păstra timp de patru săptămîni la o temperatură de +4°C.

4.5. Soluţia 5: soluţie fosfoglucoză-izomerază (2 mg de proteină/ml ). Suspensia este folosită nediluată. Această soluţie poate fi păstrată timp de un an la o temperatură de +4°C.

Toate soluţiile indicate mai sus sînt disponibile în comerţ.

5. Metoda de lucru

5.1. Pregătirea probei

În funcţie de cantitatea estimată (de glucoză + fructoză) gram pe litru, proba se diluează după cum urmează:

5.2. Determinarea

Cu ajutorul spectrofotometrului reglat la o lungime de undă de 340 nm se efectuează măsurări folosind aerul (fără cuvă pe drumul optic) sau apa ca referinţă. Temperatura de la 20 pînă la 25°C.

În două cuve cu drumul optic de 1 cm se introduc următoarele:

Se amestecă, se citeşte absorbţia după 10 minute şi se verifică după două minute dacă reacţia s-a oprit (A₃).

Se calculează diferenţele de absorbţii:

A₂ – A₁ corespunzătoare conţinutului glucozei,

A₃ – A₂ corespunzătoare conţinutului fructozei,

pentru cuvele de referinţă şi probe.

Se calculează diferenţele de absorbţie pentru cuva de referinţă (ΔA_T) şi cuva probă (ΔA_D) se obţine:

pentru glucoză: ΔA_G = ΔA_D – ΔA_T

pentru fructoză: ΔA_F = ΔA_D – ΔA_T

Timpul necesar pentru reacţiunea enzimelor, poate varia de la un lot la altul. Datele prezentate mai sus sînt informative. Se recomandă determinarea acestui timp pentru fiecare lot în parte .

5.3. Exprimarea rezultatelor

5.3.1. Calculul

Formula generală pentru calculul concentraţiei С:

în care V – volumul de reactiv , ml (test), v – volumul de probă, ml, РМ – masa moleculară a substanţei determinate, d – drumul optic al cuvei, cm, ε – coeficientul de absorbţie al NADPH, la 340 nm ε = 6,3 (mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1); V = 2,92 ml pentru determinarea glucozei, V = 2,94 ml pentru determinarea fructozei , v = 0,20 ml, PM = 180, d = 1.

Se obţine:

pentru glucoză: С,g/l = 0,417 ΔA_G

pentru fructoză: С, g/l = 0,420 ΔA_F

Dacă la prepararea probei s-au efectuat diluări, atunci rezultatul se multiplică cu factorul de diluţie F.

Dacă măsurările s-au efectuat la lungimea de undă 334 sau 365 nm , atunci se obţine:

- 334 nm: ε = 6,2 (mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1);

pentru glucoză С, g/l = 0,425 ΔA_G

pentru fructoză С,g/l = 0,428 ΔA_F

- 365 нм: ε = 3,4 (mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1);

pentru glucoză С, g/l = 0,773 ΔA_G

pentru fructoză С, g/l = 0,778 ΔA_F

5.3.2. Repetabilitatea (r)

r = 0,056 x_i

5.3.3. Reproductibilitatea (R)

R = 0,12 + 0,076 x_i

x_i – conţinutul de glucoză şi fructoză în grame pe litru.

10. Acizii organici

10.1. MA-MD-AS 313-04-ACIORG

Acizii organici din vinuri pot fi separaţi simultan şi determinaţi cantitativ prin cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC).

1. Principiul metodei

Acizii organici din vin pot fi separaţi pe două tipuri de faze staţionare: silice grefată cu octil şi răşini schimbătoare de ioni. Acizii sînt detectaţi cu ajutorul detectorului spectrofotometric UV/VIS.

Pentru dozarea acizilor tartric şi malic este preferabilă separarea pe coloană cu silice grefată cu octil, iar pentru separarea acizilor citric şi lactic – separarea pe o coloană cu răşini schimbătoare de ioni. Analizele se efectuează în raport cu un etalon intern, care se analizează în aceleaşi condiţii.

Metoda permite de a efectua concomitent analiza conţinutului de acizi şichimic, acetic, succinic şi fumaric.

Pentru analiză pot fi luate diferite tipuri de coloane. Condiţiile operatorii şi modul de lucru de mai jos sînt prezentate în calitate de exemplu.

2. Echipamente

2.1. Dispozitiv de filtrare pe membrană de celuloză cu diametrul porilor de 0,45 ľm

2.2. Coloană umplută cu silice grefată cu octadecil (exemplu.: Sep Pak WATERS ASS.)

2.3. Cromatograf HPLC echipat cu:

- injector cu buclă de 10ľl;

- dispozitiv de termostatare;

- detector spectrofotometric pentru măsurarea absorbanţei la 210 nm;

- sistem de înregistrare cu integrator.

Condiţii operaţionale

2.3.1. Separarea acizilor citric, lactic şi acetic:

- coloană cu răşini schimbătoare de cationit (H⁺), puternice (exemplu: HPX-87 H BIO-RAD, lungimea de 300 mm, diametrul intern 7,8 mm, particule de 9 ľm);

2.3.2. Separarea acizilor tartric, malic, lactic, şichimic, succinic şi fumaric:

- două coloane (lungimea – 250 mm; diametrul intern – 4 mm) unite în serie, umplute cu silice grefată cu octil, în formă de particule sferice cu diametrul de 5 ľm;

3. Reactivi:

apă distilată sau de calitate HPLC;

metanol distilat;

acid tartric;

acid malic;

lactat de sodiu;

acid şichimic;

acetat de sodiu;

acid succinic;

acid citric;

acid fumaric;

acid sulfuric (ρ₂₀ = 1,84 g/ml) ;

soluţie de acid sulfuric 0,0125 M;

dihidrogenofosfat de potasiu KH₂PO₄;

sulfat de amoniu (NH₄)₂SO₄;

acid ortofosforic, 85% (ρ₂₀ = 1,71 g/ml) ;

soluţie de referinţă: acid tartric (5 g/l), acid malic (5 g/l), lactat de sodiu (6,22 g/l), acid şichimic (0,05 g/l), acetat de sodiu (6,83 g/l), acid succinic (5 g/l), acid fumaric (0,01 g/l) şi acid citric (5 g/l).

4. Metoda de lucru

4.1. Prepararea probelor

Se spală în prealabil un cartuş cu 10 ml de metanol, apoi cu 10 ml de apă. Se degazează proba de vin sau must. Se filtrează pe o membrană cu diametrul porilor de 0,45 ľm.

Se prelevă 8 ml de eşantion filtrat cu o seringă clătită în prealabil cu proba de analizat; se transferă această cantitate în cartuş. Primii 3 ml se elimină, următorii 5 ml se selectează (se evită aducerea cartuşului la sec).

4.2. Cromatografierea

Se injectează succesiv în cromatograf 10 ľl soluţie de referinţă şi 10 ľl de probă, preparată conform punctului 4.1. Injectarea probelor se repetă de 3 ori în aceeaşi succesiune. Se înregistrează cromatograma.

5. Calculul

5.1. Analiza calitativă

Se determină timpii de retenţie pentru fiecare compus. Acizii organici din soluţia de referinţă sînt separaţi în următoarea ordine:

- citric, tartric, malic, succinic + şichimic, lactic, fumaric, acetic, conform metodei descrise în punctul 2.3.1.;

- tartric, malic, şichimic, lactic, acetic, citric, succinic şi fumaric conform metodei descrise în punctul 2.3.2.

5.2. Analiza cantitativă

Se măsoară suprafaţa fiecărui pic şi se calculează media din trei măsurări pentru soluţia de referinţă şi proba de analizat. Se calculează conţinutul acizilor organici în proba de analizat.

6. Exprimarea rezultatelor

Concentraţia acizilor organici se exprimă prin următoarele modalităţi:

- în g/l cu decimale pentru acizii tartric, malic, lactic şi succinic;

- în mg/l pentru acizii citric, acetic şi fumaric.

11. Acidul citric

11.1 MA-MD-AS 313-09-ACIENZ

1. Principiul metodei

Acidul citric este transformat în oxaloacetat şi acetat în rezultatul reacţiei catalizate de către citrat-liaza (CL):

În prezenţa malat-deshidrogenazei (MDH) şi a lactat-deshidrogenazei (LDH) oxaloacetatul şi derivatul său obţinut în urma decarboxilării, piruvatul, sînt reduşi în L-malat şi L-lactat de către nicotinamid adenin dinucleotidă în formă redusă (NADH):

Cantitatea de NADH oxidat în NAD⁺ în aceste reacţii este proporţională conţinutului de citrat prezent în probă. Oxidarea nicotinamid adenin dinucleotidei (NADH) este măsurată prin diminuarea absorbanţei măsurate la 340 nm.

2. Echipamente

2.1. Spectrofotometru pentru determinări la 340 nm, lungimea de undă la care absorbţia NADH este maximă. Deoarece sînt incluse măsurători absolute (adică nu sînt folosite diagrame de calibrare, dar standardizarea se efectuează în baza coeficientului de extincţie a NADH redus) trebuie controlate scala lungimilor de undă şi valorile puterii de absorbţie obţinute de la aparat. În cazul în care nu este disponibil de spectrofotometru, se poate folosi un spectrofotometru cu o sursă cu spectru discontinuu pentru determinări la 334 nm sau la 365 nm.

2.2. Cuve din sticlă cu parcursul optic de 1cm sau cuve de unică folosinţă.

2.3 Micropipete care permit prelevarea volumelor de la 0,02 pînă la 2 ml.

3. Reactivi

3.1. Soluţie tampon cu pH 7,8 (glicilglicină 0,51 M; Zn²⁺ : 0,6 × 10^-3M): se dizolvă 7,13 g de glicilglicină în 70 ml de apă bidistilată. Valoarea pH se ajustează la 7,8 cu aproximativ 13 ml soluţie de hidroxid de sodiu 5 M.

Se adaugă 10 ml soluţie de clorură de zinc ce conţine 80 mg ZnCl₂ în 100 ml şi se aduce la volumul de 100 ml cu apă bidistilată. Soluţia rămîne stabilă la o temperatură de +4°C timp de patru săptămîni.

3.2. Soluţia de nicotinamid adenin dinucleotidă în formă redusă (NADH) aproximativ 6 × 10^-3 M: se dizolvă 30 mg de NADH şi 60 mg de NaHCO₃ cu 6 ml de apă bidistilată. Soluţia este stabilă la o temperatură de +4°C timp de patru săptămîni.

3.3. Soluţie de malat-deshidrogenază/lactat-deshidrogenază (MDH/LDH), (0,5 g MDH + 2,5 mg LDH/ml): se prepară un amestec din 0,1 ml MDH (5 g MDH/ml), 0,4 ml soluţie de sulfat de amoniu (3,2 M) şi 0,5 ml LDH (5 mg/ml). Suspensia obţinută este stabilă timp de un an la o temperatură +4°C.

3.4. Soluţie de citrat-liază CL (5 mg de proteină/ml). Se dizolvă 168 mg de liofilizat în 1 ml de apă cu gheaţă. Soluţia obţinută este stabilă timp de o săptămînă la o temperatură de +4°C, iar în formă congelată poate fi păstrată 4 săptămîni.

Se recomandă de a verifica activitatea enzimei înainte de dozare.

3.5. Polivinilpolipirolidon (PVPP)

Setul de reactivi necesari pentru această dozare se poate procura din comerţ .

4. Pregătirea probelor

Determinarea conţinutului de acid citric se efectuează direct în vin, fără decolorare prealabilă şi fără diluţie, în caz dacă conţinutul total de acid citric este inferior de 400 mg/l. În caz contrar, vinul se diluează în proporţie care să asigure un conţinut de acid citric situat între 20 şi 400 mg/l (cantitatea de acid citric într-o alicuotă este cuprinsă între 5 – 80 ľg).

În cazul vinurilor roşii, bogate în polifenoli, se recomandă tratarea prealabilă a probelor cu PVPP: se prepară o suspensie amestecînd cu apă circa 0,2 g de PVPP, se lasă să se limpezească timp de 15 minute, se filtrează printr-un filtru de hîrtie.

Într-un balon conic de 50 ml , la 10 ml de vin se adaugă PVPP umed, strîns cu o spatulă de pe hîrtia de filtru. Se agită 2-3 minute. Se filtrează.

5. Metoda de lucru

Se reglează spectrofotometrul la 340 nm. Măsurarea absorbanţei se efectuează în cuve de 1 cm, cu reglarea absorbanţei la zero faţă de aer (fără a plasa cuva în calea traiectoriei luminii).

În cuvele de 1 cm se introduc:

Se agită minuţios; după 5 minute se măsoară absorbanţa soluţiei martor şi a soluţiei de analizat (A1). Apoi se adaugă:

Soluţie de citrat liaza, punctul 3.4 _______________0,02 ml_________________ 0,02 ml

Se agită minuţios, după 5 minute se măsoară absorbanţa soluţiei martor şi a soluţiei de analizat (A₂).

Se determină diferenţa absorbanţei A₂ – A₁ pentru martor (∆A_T) şi pentru probă (∆A_D) şi se calculează:

∆A = (∆A_D) – (∆A_T)

Timpul necesar pentru acţiunea enzimelor poate să varieze de la un lot de reactivi la altul, astfel indicaţiile de mai sus au titlu indicativ. Se recomandă de a determina durata de timp optimală pentru fiecare lot în parte.

6. Exprimarea rezultatelor

Conţinutul acidului citric se exprimă, de regulă, în miligrame pe litru (mg/l) fără zecimale.

6.1. Modul de calcul

Concentraţia în miligrame pe litru (mg/l) este calculată conform formulei următoare:

unde, V – volumul probei martor (aici 3,14 ml);

v – volumul probei de analizat (aici 0,2 ml);

M – masa moleculară a substanţei analizate (aici M_{acid citric} = 192,1);

δ – parcursul optic al cuvei (aici 1 cm);

ε – coeficientul molar de absorbţie al NADH la 340 nm (aici ε = 6,3mmol^-1. l.cm^-1).

Obţinem:

C = 479 ΔA

Dacă a fost efectuată vreo diluţie în timpul pregătirii probei, rezultatul se multiplică cu factorul de diluţie.

Pentru măsurările efectuate la 334 nm: C = 488 ΔA (ε = 6,3 mmol^-1.l. cm^-1)

Pentru măsurările efectuate la 365 nm: C = 887 ΔA (ε = 3,4 mmol^-1. l.cm^-1)

6.2. Repetabilitatea (r)

Pentru un conţinut de acid citric inferior de 400 mg/l r = 14 mg/l.

Pentru un conţinut de acid citric superior de 400 mg/l r = 28 mg/l.

6.3. Reproductibilitatea (R)

Pentru un conţinut de acid citric inferior de 400 mg/l R = 39 mg/l.

Pentru un conţinut de acid citric superior de 400 mg/l R = 65 mg/l.

12. Acidul tartric

12.1. MA-MD-AS 313-05- ACITAR

1. Principiul metodei

1.1. Metoda de referinţă

Acidul tartric, precipitat în formă de racemat de calciu, se determină prin metoda gravimetrică. Analiza poate fi completată printr-o dozare volumetrică de comparaţie. Condiţiile de precipitare: pH, volumul total de probă şi concentraţia ionilor precipitanţi sînt selectate astfel încît precipitarea racematului de calciu este totală, în timp ce D(-) tartratul de calciu rămîne în soluţie.

Dacă la vin a fost adăugat acidul metatartric, care cauzează precipitarea incompletă a racematului de calciu, este necesar un tratament prealabil prin hidroliză.

1.2. Metoda uzuală

Acidul tartric, separat la trecere printr-o coloană de anionit, este dozat colorimetric din eluat, în care la adăugarea acidului vanadic se formează o culoare roşie. Prezenţa în eluat a acizilor lactic şi malic nu genează dozarea acidului tartric.

2. Metoda de referinţă

2.1. Metoda gravimetrică

2.1.1. Reactivi

Soluţie de acetat de calciu care conţine 10 g/l de calciu:

apă distilată pînă la 1000 ml

Racemat de calciu cristalohidrat CaC₄O₆H₄ × 4H₂O: într-un pahar cilindric de 400 ml se introduc 20 ml soluţie de acid L(+) tartric (5 g/l), 20 ml soluţie de D(-) tartrat de amoniu (6,126 g/l ) şi 6 ml soluţie de acetat de calciu (10 g/l ). Se lasă să se precipite pentru 2 ore. Se separă precipitatul cu ajutorul unui creuzet filtrant de porozitate nr.4, se spală în trei reprize cu aproximativ 30 ml de apă distilată. Se usucă la o temperatură de 70°C pînă la o masă constantă. Masa racematului de calciu cristalizat obţinut din cantităţile de reactivi indicate este de aproximativ 340 mg. Substanţa obţinută se păstrează într-un vas de sticlă închis.

Soluţie precipitant (pH 4,75):

Se dizolvă D(-) tartratul de amoniu în 900 ml de apă; se adaugă 8,8 ml de soluţie de acetat de calciu şi se aduce la 1 litru. Se adaugă 5 mg de racemat de calciu la litru, se agită soluţia timp de 12 ore, apoi se filtrează.

2.1.2. Metoda de lucru

Pentru vinuri fără adaos de acid metatartric

Într-un vas cilindric de 600 ml se introduc 500 ml de soluţie precipitant şi 10 ml de vin. Se agită, apoi se iniţiază precipitarea prin acţiunea unei baghete de sticlă asupra pereţilor vasului. Soluţia este lăsată să se precipite pentru 12 ore (pe noapte).

Se separă precipitatul cu ajutorul unui creuzet filtrant de porozitate nr.4, preventiv cîntărit, cu spălarea minuţioasă a vasului, în care s-a efectuat precipitarea, pentru a diminua pierderile.

După uscarea pînă la o masă constantă (70°C), precipitatul se cîntăreşte (p – masa racematului de calciu cristalizat CaC₄O₆H₄ × 4H₂O).

Pentru vinuri cu adaus de acid metatartric

Pentru un vin cu un adaus de acid metatartric, sau este bănuit acest fapt, se efectuează hidroliza acestui acid în modul următor: într-un balon conic de 50 ml se introduc 10 ml de vin şi 0,4 ml acid acetic pur. Balonul este închis cu un dop traversat de un tub de evacuare a vaporilor, şi se fierbe timp de 30 minute. După răcire, lichidul se trece cantitativ în două reprize cu cîte 5 ml apă din balonul conic într-un vas cilindric şi supus analizei confom punctului 2.1.2 "Modul de lucru". Acidul metatartric este considerat în rezultatele dozării drept acid tartric.

2.1.3. Exprimarea rezultatelor

O moleculă de racemat de calciu corespunde la 0,5 molecule de acid L(+) tartric din vin.

Cantitatea de acid tartric dintr-un litru de vin, exprimată în miliechivalenţi, este egală cu 384,5 p, se exprimă cu zecimale.

Cantitatea de acid tartric dintr-un litru de vin, exprimată în grame de acid tartric, este egală cu 28,84 p, se exprimă cu zecimale.

Cantitatea de acid tartric dintr-un litru de vin, exprimată în grame de tartat acid de potasiu, este egală cu 36,15 p, se exprimă cu zecimale.

2.2. Dozarea volumetrică de comparaţie

2.2.1. Reactivi:

Acid clorhidric (НС1) (ρ₂₀ = 1,18 – 1,19 g/ml), diluat 1/5 (v/v)

Soluţie EDTA 0,05 M:

Indicator:

acid calcon carbonic sau acid 2-hydroxy-4-sulfo- 1-naftylazo-3-naphtoic (С₂₁Н₁₄Н₂0₇S × Н₂0) 1 g

sulfat de sodium anhidru (Na₂SO₄) 100 g

2.2.2. Metoda de lucru

După cîntărire se dizolvă precipitatul de racemat de calciu cu 10 ml de acid clorhidric diluat. Se spală creuzetul cu 50 ml de apă distilată. Se adaugă 5 ml soluţie de hidroxid de sodiu de 40% şi aproximativ 30 mg de indicator. Se titrează cu soluţie EDTA 0,05 M. Se notează, n numărul de ml consumaţi la titrare.

2.2.3. Exprimarea rezultatelor

Cantitatea de acid tartric dintr-un litru de vin, exprimată în miliechivalenţi : 5 n, se exprimă cu zecimale.

Cantitatea de acid tartric dintr-un litru de vin, exprimată în grame de acid tartric: 0,375 n, se exprimă cu zecimale.

Cantitatea de acid tartric dintr-un litru de vin, exprimată în grame de tartrat acid de potasiu: 0,470 n, se exprimă cu zecimale.

3. Metoda uzuală

3.1. Echipamente

3.1.1.Coloană de sticlă de 300 mm lungime cu diametrul interior de 10-11 mm cu robinet.

3.1.2. Spectrofotometru care permite măsurarea absorbanţei la 490 nm, cu cuve de 10 mm.

3.2. Reactivi

3.2.1. Pentru tratarea preliminară a vinului

Acid acetic (ρ₂₀ = 1,05 g/ml) diluat la 30% (v/v).

Anionit bazic forte în formă de acetat (de exemplu, anionit III după Merck 20-50 mes). Se prepară o suspensie de anionit (aproximativ 100g) în 200 ml de acid acetic diluat la 30% (v/v). Se lasă pentru cel puţin 24 de ore înainte de utilizare; pentru testările ulterioare anionitul se păstrează în soluţie de acid acetic de 30% (v/v).

Acid acetic (ρ₂₀ = 1,05 g/ml) diluat la 0,5% (v/v).

Soluţie de sulfat de sodiu cu un conţinut de 7,1 g/100 ml (0,5 M): se dizolvă 71 g de Na₂SO₄ anhidru în apă distilată şi se aduce la 1 l.

3.2.2. Pentru determinarea acidului tartric

Soluţie de acetat de sodiu (NaCH₃COO), de 27% (m/v): se dizolvă 270 g acetat de sodiu anhidru (NaCH₃COO) în apă distilată şi se aduce la 1 l.

Reactiv vanadic: se dizolvă 10 g metavanadat de amoniu (NH₄VO₃) în 150 ml soluţie de hidroxid de sodiu 1 M. Soluţia se transferă într-un balon cotat de 500 ml, se adaugă 200 ml acetat de sodiu de 27%. Se aduce la 500 ml cu apă distilată.

Soluţie de acid sulfuric, 1M.

Soluţie de acid sulfuric, 0,5M.

Soluţie de acid sulfuric, 0,05M.

Soluţie de acid periodic 0,05M: într-un balon cotat de 1000 ml se plasează 10,696 g de metaperiodat de sodiu NaIO₄, 50 ml de acid sulfuric 0,5 M şi se completează pînă la 1 l cu apă distilată.

Soluţie de glicerină, 10% (m/v): într-un balon cotat de 100 ml se plasează 10 g de glicerină, se completează pînă la cotă cu apă distilată.

Soluţie de sulfat de sodiu cu un conţinut de 7,1 g/100 ml (0,5 M).

Soluţie de acid tartric, 1 g/l: într-un balon cotat de 500 ml se introduc 0,5 g acid tartric, 6,66 ml soluţie de hidroxid de sodiu 1M şi se completează pînă la cota cu soluţie de sulfat de sodiu 7,1 g/100 ml (0,5 M)

Soluţie de hidroxid de sodiu, NaOH,1M.

3.3. Metoda de lucru

3.3.1. Pregătirea coloanei de anionit

Într-o coloană de sticlă se introduce un tampon din vată de sticlă. Se impregnează cu apă distilată. În coloană se toarnă 10 ml de suspensie de anionit în formă de acetat. Se decantează. Se introduce un tampon din vată de sticlă pe suprafaţa anionitului pentru a evita trecerea lui în suspensie la spălarea ulterioară. Anionitul serveşte doar pentru o singură operaţie.

3.3.2. Separarea acizilor organici

Se deschide robinetul şi se lasă să se scurgă soluţia de acid acetic pînă ce nivelul lichidului este cu 2-3 mm mai sus de tamponul din vată de sticlă superior.

Se adaugă 10 ml de soluţie de acid acetic de 0,5%. Se lasă să se scurgă lichidul pînă la nivelul indicat. Se repetă operaţia de 4 ori.

După ultima operaţie de spălare, se închide robinetul, se toarnă în coloană 10 ml de vin sau must. Se deschide robinetul şi se lasă să se scurgă lichidul (1 picătură pe secundă) pînă ce nivelul lichidului este cu 2-3 mm mai sus de nivelul anionitului. Se adaugă în coloană 10 ml 0,5% acid acetic, se lasă să se scurgă ca şi în cazul precedent, repetînd spălarea de 7 ori, utilizînd de fiecare dată cîte 10 ml apă.

După ultima spălare se închide robinetul îndată ce nivelul lichidului se află puţin mai sus de nivelul de sus al tamponului.

Se eluează acizii fixaţi pe anionit cu ajutorul soluţiei de sulfat de sodiu de 7,1%; eluatul se colectează într-un balon cotat de 100 ml pînă la cotă.

3.3.3. Determinarea acidului tartric

În două baloane conice a şi b se iau cîte 20 ml de eluat. Balonul a serveşte pentru dozarea acidului tartric, iar balonul b, în care acidul tartric se distruge cu acidul periodic, constituie martorul.

În balonul a se introduc: 2 ml de acid sulfuric 1M, 5 ml de acid sulfuric 0,05 M, 1 ml soluţie de glicerină de 10%.

În balonul b se introduc: 2 ml de acid sulfuric 1M, 5 ml soluţie de acid periodic 0,05 M. După 15 minute se adaugă 1 ml 10% glicerina pentru a distruge excesul de acid periodic. Se lasă pe 2 minute.

După 2 minute, se toarnă prin agitare, iniţial în proba b, apoi în proba a , cîte 5 ml de reactiv vanadic. Imediat se introduce cronometrul, iar soluţiile sînt plasate în cuvele spectrofotometrului. Exact peste 90 secunde se măsoară absorbanţa probei a în raport cu martorul (proba b) la 490 nm.

În cazul în care cantitatea de acid tartric este în exces şi valoarea absorbanţei este prea mare, se diluează eluatul cu soluţie de sulfat de sodiu de 7,1%, apoi se efectuează măsurările pe soluţia diluată.

Pentru vinuri cu adaos de acid metatartric

Cînd este cunoscut că la un vin s-a adăugat acid metatartric, sau este bănuit acest fapt, se efectuează hidroliza acestui acid, conform procedurii descrise în metoda de referinţă.

După răcire, proba, precum şi apa folosită la clătirea vasului (cîte 5 ml de două ori) sînt trecute cantitativ în coloana de anionit, urmînd procedura descrisă mai sus .

Acidul metatartric este considerat în rezultatele dozării drept acid tartric.

3.3.4. Trasarea curbei de etalonare

În baloane cotate de 100 ml se introduc, respectiv, 10, 20, 30, 40 şi 50 ml soluţie de acid tartric cu concentraţia de 1 g/l, se aduc la cotă cu soluţie de sulfat de sodiu de 7,1%. Concentraţiile acestor soluţii corespund eluatelor obţinute din vinuri cu conţinut respectiv de 1, 2, 3, 4 şi 5 g/l de acid tartric.

În două baloane conice a şi b se introduc cîte 20 ml de aceste soluţii şi se efectuează analiza conform procedurii descrise pentru eluatul de vin.

Curba de etalonare a dependenţei absorbanţei de conţinutul acidului tartaric prezintă o dreaptă, care poate fi extrapolată către zero. În caz de necesitate, se repetă procedura pentru probe cu un conţinut de acid tartric inferior de 1,0 g/l.

3.4. Exprimarea rezultatelor

Pentru a determina conţinutul de acid tartric se foloseşte curba de etalonare. Conţinutul de acid tartric în vin se exprimă în grame pe litru (g/l), cu o zecimală.

13. Acidul lactic

13.1. MA-MD-AS 313-07-ALAENZ

1. Principiul metodei

1.1. Metoda d  referinţă

În prezenţa nicotinamid adenin dinucleotidei (NAD) acidul lactic total (L-lactat şi D-lactat) este oxidat în piruvat în urma reacţiei catalizate de L-lactat deshidrogenază (L-LDH) şi D-lactat deshidrogenază (D-LDH). Echilibrul reacţiei este deplasat spre lactat. Eliminarea piruvatului din mediul de reacţie deplasează echilibrul în direcţia formării piruvatului.

În prezenţa L-glutamatului piruvatul este transformat în L-alanină; reacţia este catalizată de către glutamat-piruvat-transaminaza (GPT).

Cantitatea de NADH, măsurată de creşterea absorbţiei la lungimea de undă de 340 nm, este proporţională cu cantitatea de lactat prezentă iniţial.

Acidul L-lactic poate fi determinat independent utilizînd reacţiile (1) şi (3), iar acidul D-lactic poate fi determinat în mod similar, utilizînd reacţiile (2) şi (3).

1.2. Metoda uzuală

Acidul lactic se separă prin trecerea printr-o coloană cu răşină de schimb ionic, se oxidează la etanal şi se determină prin colorimetrie după reacţia cu nitroprusiat de sodiu şi piperidină.

2. Metoda de referinţă

2.1. Reactivi

Apă bidistilată.

2.1.1. Soluţie tampon, pH 10 (glicilglicină 0,6 mol/l; L-glutamat 0,1 mol/l): se dizolvă 4,75 g de glicilglicină şi 0,88 g de acid L-glutamic în aproximativ 50 ml de apă bidistilată; se ajustează pH-ul la 10 cu cîţiva mililitri de hidroxid de sodiu 10 M şi se aduce la volumul 60 ml cu apă bidistilată. Această soluţie rămîne stabilă 12 săptămîni la o temperatură de +4°C.

2.1.2. Soluţie de nicotinamid adenin dinucleotidă (NAD), aptoximativ 40 × 10^-3 M: se dizolvă 900 mg NAD în 30 ml apă bidistilată. Această soluţie rămîne stabilă 4 săptămîni la o temperatură de +4°C.

2.1.3. Soluţie de glutamat piruvat transaminază (GPT) 20 mg/ml. Suspensia rămîne stabilă un an la o temperatură de +4°C.

2.1.4. Suspensie de L-lactat dehidrogenază (L-LDH), 5 mg/ml. Această suspensie rămîne stabilă un an la o temperatură de 4°C.

2.1.5. Suspensie de D-lactat dehidrogenază (D-LDH), 5 mg/ml. Această suspensie rămîne stabilă un an la o temperatură de +4°C.

Se recomandă înainte de determinare verificarea activităţii enzimei.

Toţi reactivii sînt disponibili în comerţ.

2.2. Echipamente

2.2.1. Spectrofotometru pentru determinări la 340 nm, lungimea de undă la care absorbţia NADH redus este maximă. Deoarece sînt incluse măsurători absolute (adică nu sînt folosite diagrame de calibrare, dar standardizarea se efectuează în baza coeficientului de extincţie a NADH redus) trebuie controlate scala lungimilor de undă şi valorile puterii de absorbţie obţinute de la aparat. În cazul în care nu este disponibil spectrofotometru, se poate folosi un spectrofotometru cu o sursă cu spectru discontinuu pentru determinări la 334 nm sau la 365 nm.

2.2.2. Cuve din sticlă cu parcursul optic de 1cm sau cuve de unică folosinţă.

2.2.3. Micropipete care permit prelevarea volumelor de la 0,02 pînă la 2 ml.

2.3. Pregătirea probei

Nici o parte a sticlăriei care intră în contact cu amestecul de reacţie nu trebuie atinsă cu degetele, pentru că aceasta poate introduce acid L-lactic şi poate astfel conduce la rezultate eronate.

Determinarea lactatului este efectuată în mod normal direct pe vin, fără decolorarea prealabilă şi fără diluare în cazul în care conţinutul acidului lactic este mai mică de 100 mg/l. Dacă concentraţia acidului lactic se situează între: 100 mg/l şi 1 g/l, vinul se diluează 1/10 cu apă bidistilată; 1 g/l şi 2,5 g/l, se diluează 1/25 cu apă bidistilată; 2,5 g/l şi 5 g/l, se diluează 1/50 cu apă bidistilată.

2.4. Metoda de lucru

2.4.1 Determinarea acidului lactic total

Soluţia tampon trebuie să fie la o temperatură între 20 şi 25°C înainte de a trece la determinare.

Spectrofotometrul se reglează la lungimea de undă de 340 nm, se determină absorbţia folosind cuve cu drum optic de 1 cm, cu aerul ca standard de absorbţie zero (referinţă) (fără cuvă în drumul optic) sau cu apă .

În cuvă cu drum optic de 1 cm se pun:

Se amestecă folosind un agitator de sticlă sau o baghetă din material sintetic cu un capăt turtit; după cinci minute se măsoară absorbţia soluţiilor din cuvele de referinţă şi pentru probă (A₁).

Se adaugă 0,02 ml soluţie 2.1.4 şi 0,05 ml soluţie de la punctul 2.1.5., se omogenizează, se aşteaptă terminarea reacţiei (aproximativ 30 minute) şi se determină puterea de absorbţie a soluţiilor din cuvele de referinţă şi pentru probă (A₂).

Se calculează diferenţele (A₂ – A₁) dintre absorbţiile soluţiilor din cuvele de referinţă ΔA_T şi pentru probă Δ A_D. La final se calculează diferenţa dintre ele:

ΔA = ΔA_D – ΔA_T

2.4.2. Determinarea acidului L-lactic şi a acidului D-lactic

Determinarea acidului L-lactic şi a acidului D-lactic pot fi efectuate independent aplicînd procedura pentru determinarea acidului lactic total, numai după ce a fost determinat A₁ şi continuînd apoi după cum urmează:

Se adaugă 0,02 ml de soluţie 2.1.4., se omogenizează, se aşteaptă pînă la terminarea reacţiei (aproximativ 20 minute) şi se determină absorbţia din cuvele de referinţă şi pentru probă (A₂).

Se adaugă 0,05 ml de soluţie 2.1.5., se omogenizează, se aşteaptă pînă la terminarea reacţiei (aproximativ 30 minute) şi se determină absorbţia din cuvele de referinţă şi pentru probă (A₃).

Se calculează diferenţele (A₂ – A₁) pentru acid L-lactic şi (A₃ – A₂) pentru acid D-lactic între absorbţiile soluţiilor din cuvele de referinţă ΔA_T şi pentru probă ΔA_D

La final se calculează diferenţa:

ΔA = ΔA_D – ΔA_T.

Timpul necesar pentru finalizarea acţiunii enzimelor poate varia de la un lot la altul. Valoarea de mai sus este dată numai orientativ şi se recomandă determinarea ei pentru fiecare lot. Cînd se determină acidul L-lactic singur, timpul de incubare după adăugarea L-lactodegidroghenazei poate fi redus la 10 minute.

2.5. Exprimarea rezultatelor

Concentraţia acidului lactic se exprimă în grame la litru (g/l), cu o cifră zecimală.

2.5.1. Metoda de calcul

Formula pentru calcularea concentraţiei în grame pe litru este:

unde:

V – volumul soluţiei test în ml (V = 2,24 ml pentru acidul L-lactic, V = 2,29 ml pentru acidul D-lactic şi acidul lactic total);

ν – volumul probei în ml (aici, 0,2 ml );

M – masa moleculară a substanţei de determinat (aici, pentru acid DL-lactic, M = 90,08);

δ – drumul optic în cuvă în cm (aici, 1 cm);

ε – coeficientul de absorbţie a NADH (la 340 nm ε = 6,3 mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1);

Acidul lactic total şi acidul D-lactic

C = 0,164 × ΔA

Dacă proba a fost diluată în timpul pregătirii, rezultatul se înmulţeşte cu factorul de diluare:

- determinarea la 334 nm: С=0,167 × ΔA, (ε = 6,2 mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1);

- determinarea la 365 nm: С=0,303 Ч ΔA, (ε = 3,4 mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1);

Acidul L-lactic

С = 0,160 × ΔA

Dacă proba a fost diluată în timpul pregătirii, rezultatul se înmulţeşte cu factorul de diluare :

- determinare la 334 nm: С = 0,163 × ΔA, (ε = 6,2 mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1);

- determinare la 365 nm: С = 0,297 Ч ΔA, (ε = 3,4 mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1).

2.5.2. Repetabilitatea (r)

r = 0,02 + 0,07 x_i

x_i – este concentraţia acidului lactic în probă în g/l.

2.5.3. Reproductibilitatea (R)

R = 0,05 + 0,125 x_i

x_i – este concentraţia acidului lactic în probă în g/l.

14. Acidul malic total

14.1. MA-MD-AS 313-10-AMALTO

1. Principiul metodei

Acidul malic, separat cu ajutorul unei coloane de anionit, se determină colorimetric. Determinarea conţinutului de acid malic se efectuează după intensitatea culorii galbene, obţinute prin tratatrea eluatului cu acid sulfuric de 96% şi acid cromotropic. Pentru a exclude interferenţele posibile, o probă similară celei analizate este tratată cu amestec de acid sulfuric (86%) şi acid cromotropic, iar absorbanţa obţinută este sustrasă din absorbanţa iniţială, diferenţa fiind atribuită în exclusivitate acidului malic.

2. Echipamente

2.1. Coloană de sticlă de aproximativ 250 mm lungime şi 35 mm diametrul interior, dotată cu robinet.

2.2. Coloană de sticlă de aproximativ 300 mm lungime şi 10-15 mm diametrul interior, dotată cu robinet.

2.3. Baie de apă, 100°С.

2.4. Spectrofotometru care permite măsurarea densităţii optice la 420 nm dotat cu cuve de 10 mm.

3. Reactivi:

anionit bazic forte (spre exemplu Merck III);

hidroxid de sodiu de 5% (m/v);

acid acetic de 30% (m/v);

scid acetic de 0,5% (m/v);

soluţie de sulfat de sodiu de 10% (m/v);

acid sulfuric concentrat de 95-97% (m/m);

acid sulfuric de 86% (m/m).

Soluţia de acid cromotropic de 5% (m/v): se pregăteşte înainte de fiecare dozare prin dizolvarea a 500 mg de cromotropat de sodiu (C₁₀H₆Na₂O₈S₂ × 2H₂O) în 10 ml de apă distilată.

Soluţia de acid DL-malic ce conţine 0,5 g/l: se dizolvă 250 mg de acid malic (C₄H₆O₅) într-o cantitate suficientă de soluţie de sulfat de sodiu de 10% şi se aduce volumul la 500 ml cu această soluţie (sulfat de sodiu de 10%).

4. Metoda de lucru

4.1. Pregătirea anionitului

Se plasează în coloana de sticlă 35 × 250 mm deasupra robinetului un tampon din vată de sticlă impregnat cu apă distilată. Se toarnă anionitul în formă de suspensie în coloană astfel încît să rămînă un spaţiu liber de 50 mm deasupra anionitului.

Se clăteşte anionitul cu 1000 ml de apă distilată. Se spală coloana cu soluţie de hidroxid de sodiu de 5% şi se lasă să se scurgă pînă la 2-3 mm de la suprafaţa anionitului, se repetă cu 2 spălări ulterioare cu hidroxizi de sodiu de 5%, se lasă în contact anionitul cu soluţia pentru 1 oră. Ulterior se spală anionitul cu 1000 ml de apă distilată.

Ulterior, se umple coloana cu soluţie de acid acetic de 30%, se lasă să se scurgă lichidul pînă la 2-3 mm de la suprafaţa anionitului. Se repetă operaţia de 2 ori, apoi se lasă în contact pentru 24 ore înainte de utilizarea coloanei. Coloana utilizată se păstrează în soluţie de 30% de acid acetic pînă la dozările ulterioare.

4.2. Pregătirea coloanei de anionit

Se plasează în coloana de sticlă 11 × 300 mm deasupra robinetului un tampon din vată de sticlă impregnat cu apă distilată. Se toarnă în coloană anionit pregătit conform punctului 4.1., la o înălţime de 10 cm. Se lasă să se scurgă acidul acetic de 30% pînă la 2-3 mm deasupra anionitului, apoi se spală anionitul cu 50 ml de acid acetic de 0,5%.

4.3. Separarea acidului DL-malic

În coloana pregătită conform punctului 4.2., se toarnă 10 ml de vin sau must. Se lasă să se scurgă vinul sau mustul (debitul mediu – 1 picătură/secundă) pînă la 2-3 mm deasupra anionitului, apoi se spală anionitul cu 50 ml de acid acetic de 0,5% şi cu 50 ml de apă distilată (debitul mediu – 1 picătură/secundă).

Eluarea acizilor fixaţi pe coloană se efectuează cu soluţie de sulfat de sodiu de 10% (debitul mediu – 1 picătură/secundă). Eluatul se colectează într-un balon cotat de 100 ml, volumul fiind adus la cotă.

Regenerarea anionitului se efectuează conform procedurii descrise în punctul 4.1.

4.4. Dozarea DL – acidului malic

Se iau două eprubete de 30 ml cu dop rodat A şi B. Se introduc în fiecare din eprubete cîte 1,0 ml de eluat, cîte 1,0 ml soluţie de acid cromotropic de 5%. Se adaugă în eprubeta A 10,0 ml soluţie de acid sulfuric de 86% (martor), iar în eprubeta B – 10,0 ml de acid sulfuric concentrat (proba de analizat). Se închid şi se agită soluţiile pentru a obţine omogenitate perfectă, dar fără a înmuia rodajul.

Se plasează eprubetele pe 10 minute în baia preventiv adusă la fierbere. Se răcesc eprubetele pînă la 20°C într-un loc întunecos. Exact peste 90 minute de la începutul răcirii se măsoară absorbanţa soluţiei din eprubeta B în raport cu soluţia din eprubeta A la lungimea de undă de 420 nm în cuve de 1 cm.

4.5. Trasarea curbei de etalonare

Se iau, respectiv, 5, 10, 15 şi 20 ml soluţie de acid malic de 0,5 g/l, se plasează în baloane cotate de 50 ml şi se aduce volumul la cotă cu soluţie de sulfat de sodiu de 10%. Soluţiile astfel preparate corespund conţinutului de acid malic în vin de, respectiv, 0,5; 1,0; 1,5 şi 2,0 g/l. Analiza se efectuează conform indicaţiilor din punctul 4.4.

Valorile absorbanţei obţinute în funcţie de concentraţia acidului malic formează o dreaptă care se extrapolează la origine.

Deoarece intensitatea culorii depinde esenţial de concentraţia acidului sulfuric, este necesar de a verifica cel puţin un punct de pe curba de etalonare pentru fiecare serie de măsurări, pentru a scoate în evidenţă posibilele modificări parvenite din cauza acestui factor.

5. Exprimarea rezultatelor

Conţinutul de acid DL-malic din eluat este obţinut din curba de etalonare în g/l cu zecimale.

14.2. MA-MD-AS 313-11-ALMENZ

1. Principiul metodei

În prezenţa nicotinamid adenin dinucleotidei (NAD) acidul L-malic (L-malat) este oxidat în oxaloacetat în urma reacţiei catalizate de L- malatdeshidrogenaza (L-MDH).

Echilibrul reacţiei este deplasat spre malat. Eliminarea oxaloacetatului din mediul de reacţie deplasează echilibrul în sensul formării oxaloacetatului. În prezenţa L-glutamatului oxaloacetatul este transformat în L-aspartat, în urma reacţiei catalizată de glutamat-oxaloacetat-transaminaza (GOT):

Cantitatea de NADH format care se măsoară spectrofotometric la lungimea de undă de 340 nm este proporţională cantităţii de L-malat prezent în probă.

2. Echipamente

2.1. Spectrofotometru ce permite de a efectua măsurări la 340 nm maximum de absorbţie a NADH.

În lipsa unui asemenea echipament măsurările pot fi efectuate cu ajutorul unui fotometru cu spectru discontinuu ce permite de a efectua măsurări la 334 nm şi 365 nm.

2.2. Cuve cu drumul optic de 1 cm din sticlă sau de unică folosinţă.

2.3. Micropipete ce permit de a preleva volume cuprinse între 0,01 şi 2 ml.

3. Reactivi

Apă bidistilată

3.1. Soluţie tampon cu pH 10 (glicilglicină 0,6 mol/l, L-glutamat 0,1 mol/l): se dizolvă 4,75 g de glicilglicină şi 0,88 g de acid L-glutamic în aproximativ 50 ml de apă bidistilată; se aduce pH la 10 cu aproximativ 4,6 ml soluţie de hidroxid de sodiu 10 M, se aduce volumul la 60 ml cu apă bidistilată. Soluţia este stabilă 12 săptămîni la o temperatura de +4°C.

3.2. Soluţie de nicotinamid-adenin-dinucleotidă (NAD) aproximativ 0,047 M: se dizolvă 420 mg de NAD în 12 ml de apă bidistilată. Soluţia este stabilă 4 săptămîni la o temperatura de +4°C.

3.3. Suspensie de glutamat-oxaloacetat-transaminază (GOT) de concentraţia 2 mg/ml. Suspensia este stabilă un an la o temperatură de +4єC.

3.4. Soluţie de L-malat-dehidrogenază (L-MDH) de concentraţia 5 mg/ml. Soluţia este stabilă un an la o temperatură de +4°C.

Reactivii necesari pentru dozare sînt disponibili în comerţ.

4. Pregătirea probelor

Testarea D-malatului se efectuează direct în vin, fără decolorare prealabilă şi fără diluţie, în cazul în care conţinutul de acid L-malic este inferior de 350 mg/l (pentru măsurări efectuate la 365 nm). În cazul depăşirii acestei limite vinul se diluează cu apă bidistilată astfel încît concentraţia L-malatului să fie cuprinsă între 30 şi 350 mg/l (cantitatea de L-malat prezent în proba analizată 3-35 ľg).

În cazul în care concentraţia L-malatului în vin este mai mică de 30 mg/l, volumul probei prelevate poate fi mărit la 1 ml. Volumul apei adăugatе este astfel încît volumele totale să fie identice în ambele cuve.

5. Metoda de lucru

Spectrofotometrul se reglează la 340 nm, se măsoară absorbanţa în cuve cu drumul optic de 1 cm, absorbanţa zero fiind reglată în raport cu aerul (fără cuvă) sau în raport cu apa distilată. În cuve cu drumul optic de 1 cm se introduc:

Se omogenizează, după aproximativ 3 minute, se măsoară absorbanţa soluţiilor martor şi probă (A₁). Se adaugă în ambele probe cîte 0,01 ml soluţie 3.4. Se omogenizează; se aşteaptă sfîrşitul reacţiei (aproximativ 5-10 minute ) şi se măsoară absorbanţa soluţiilor martor şi probă (A₂).

Se determină diferenţa absorbanţelor (A₂ – A₁) pentru probă (ΔA_D) şi pentru martor (ΔA_T).

Se calculează:

ΔA = ΔA_D – ΔA_T

Timpul necesar pentru reacţionarea enzimelor poate varia de la un lot la altul. În metodă nu este dat decît ca un titru indicativ. Se recomandă de a fi determinat timpul pentru fiecare lot.

6. Exprimarea rezultatelor

Concentraţia de acid L-malic se exprimă în grame pe litru (g/l) cu o zecimală.

6.1. Modul de calcul

Concentraţia în grame pe litru este calculată cu formula generală:

V – volumul testului în ml (aici 2,22 ml);

v – volumul probei în ml (aici 0,1 ml);

M – masa moleculară a substanţei determinate (aici acidul L-malic = 134,09);

δ – drumul optic al cuvei în centimetri (aici 1 cm);

ε – coeficientul de absorbţie al NADH la 340 nm, ε = 6,3 mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1.

Astfel, se obţine pentru l-malat:

C = 0,473 × ΔA, g/l

Dacă în timpul preparării probei s-a efectuat diluţii, în acest caz, rezultatul se înmulţeşte la factorul de diluţie.

Pentru măsurări la 334 nm , ε = 6,2 ( mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1 )

C = 0,482 × ΔA

Pentru măsurări la 365 nm, ε = 3,4 (mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1)

C = 0,876 × ΔA

6.2. Repetabilitatea (r)

r = 0,03 + 0,034 x_i

unde, x_i – concentraţia de acid L-malic în probă, în g/l.

6.3. Reproductibilitatea (R)

R = 0,05 + 0,071 x_i

x_i – concentraţia de acid L-malic în probă în g/l.

14.3. MA-MD-AS 313-12-ADMENZ

1. Principiul metodei

În prezenţa D-malat-dehidrogenazei (D-MDH), acidul D-malic (D-malat) este oxidat de către nicotinamid adenin dinucleotidă (NAD) în oxaloacetat. Oxaloacetatul format se transformă în piruvat şi dioxid de carbon, conform ecuaţiei:

Cantitatea de NADH format, care se măsoară spectrofotometric la lungimea de undă de 334, 340 nm, sau 365 nm, este proporţională cantităţii de D-malat prezent în probă

2. Reactivi

Reactivii pentru efectuarea a 30 determinări se află în comerţ în formă de seturi, care includ:

flaconul 1 care conţine 30 ml de soluţie tampon Hepes (N-hidroxietil)-piperazin-N¹-2 etan sulfonic), pH = 9,0 şi stabilizatori;

flaconul 2 care conţine aproximativ 210 mg de liofilizat de NAD;

flaconul 3 (trei bucăţi), fiecare conţinînd liofilizat de D-MDH, pentru titrarea a aproximativ 8 unităţi.

Prepararea soluţiilor:

Se utilizează flaconul 1 fără diluare. Soluţia este adusă la o temperatură de (20-25)°C înainte de a fi folosită ;

se dizolvă conţinutul flaconului 2 în 4 ml de apă bidistilată;

se dizolvă conţinutul flaconului 3 (unul dintre 3 flacoane) în 0,6 ml de apă bidistilată. Înainte de a fi folosită soluţia este adusă la o temperatură de (20-25)°C.

Stabilitatea soluţiilor:

Conţinutul flaconului 1 se păstrează cel mult un an la o temperatură de + 4°C; soluţia 2 se păstrează aproximativ 3 săptămîni la o temperatură de + 4°C, iar la (–20)°C se păstrează 2 luni; soluţia 3 se păstrează 5 zile la o temperatură de + 4°C.

3. Echipamente

3.1. Spectrofotometru ce permite de a efectua măsurări la 340 nm, maximum de absorbţie a NADH.

În lipsa unui asemenea echipament, măsurările pot fi efectuate cu ajutorul unui fotometru cu spectru discontinuu la 334 nm şi 365 nm.

3.2. Cuve cu parcursul optic de 1 cm din sticlă sau de o singură folosinţă.

3.3. Micropipete ce permit de a preleva volume cuprinse între 0,01 şi 2 ml.

4. Pregătirea mostrelor

Testarea D-malatului se efectuează, de regulă, direct în vin, fără decolorare prealabilă.

Cantitatea de D-malat prezentă în cuvă trebuie să fie cuprinsă între 2 ľg şi 50 ľg deaceea este necesar de a dilua vinul astfel, încît concentraţia de D-malat să varieze între 0,02 şi 0,5 g/l sau 0,02 şi 0,3 g/l (în funcţie de echipamentul utilizat).

5. Metoda de lucru

Spectrofotometrul se reglează la lungimea de undă 340 nm, absorbanţa se măsoară în cuve cu traseul optic de 1 cm. Absorbanţa zero se reglează în raport cu aerul (nu se pune cuva) sau în raport cu apa bidistilată.

În cuvele cu traseul optic de 1 cm se introduc:

Se agită minuţios. După aproximativ 6 minute se măsoară absorbanţa soluţiei martor şi a probei (A₁).

Se adaugă:

Se agită minuţios. După aproximativ 20 minute (sfîrşitul reacţiei) se măsoară absorbanţa soluţiei martor şi a probei (A₂).

Se calculează diferenţa absorbanţelor (A₂ – A₁) martorului (ΔΑ_T) şi probei (ΔΑ_D). Se deduce diferenţa lor:

ΔΑ = ΔΑ_D – ΔΑ_T.

Timpul necesar pentru acţiunea enzimelor poate varia de la un lot la altul. Se recomandă de a fi determinat timpul pentru fiecare lot de reactivi. Acidul D-malic reacţionează rapid. O activitate suplimentară a enzimei, care poate să transforme acidul L-tartric, poate fi înregistrată, deşi viteza acestei reacţii este cu mult mai redusă. Această contribuţie poate fi corectată prin extrapolarea datelor.

6. Exprimarea rezultatelor

Concentraţia acidului D-malic în miligrame per litru (mg/l ) fără zecimale se calculează cu formula:

unde:

V este volumul testului în ml (aici 2,95 ml);

v – volumul probei în ml (aici 0,1 ml);

M – masa molară a substanţei de analizat (aici acidul D-malic, M = 134,09);

δ – lungimea drumului optic, cm (aici 1 cm);

ε – coeficientul molar de absorbţie al NADH:

la 340 nm ε = 6,3 (mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1);

la 365 nm ε = 3,4 (mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1);

la 334 nm ε = 6,18 (mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1 ).

Dacă a fost efectuată vreo diluţie la pregătirea probelor se multiplică rezultatul cu factorul de diluţie.

7. Fidelitate

7.1. Repetabilitatea (r)

Diferenţa absolută între două rezultate individuale, obţinute pe materiale identice, de către acelaşi operator, cu aceleaşi echipamente, la intervale de timp scurte, nu va depăşi valoarea repetabilităţii r în mai mult de 5% din cazuri.

r = 11 mg/l

7.2. Reproductibilitatea (R)

Diferenţa absolută între două rezultate individuale, obţinute pe materiale identice, în două laboratoare diferite, nu va depăşi valoarea reproductibilităţii R în mai mult de 5% din cazuri.

R= 20 mg/l

8. Remarcă:

Luînd în considerare precizia metodei, se recomandă pentru valori ale acidului D-malic inferioare de 50 mg/l să se confirme concentraţia printr-o altă metodă de analiză.

Valori ale acidului D-malic inferioare de 100 mg/l nu trebuie interpretate ca o adiţie a acidului D,L-malic în vin.

Volumul probei de vin prelevate în cuvă nu trebuie să depăşească 0,1ml, pentru a evita o eventuală inhibare a activităţii enzimatice de către polifenoli.

15. Acidul sorbic

15.1 MA-MD-AS 313-14-ACISOR

1. Principiul metodelor

1.1. Metoda de dozare prin spectrofotometrie cu absorbţie în ultraviolet

Acidul sorbic (acid trans-2,4-hexadionic) se extrage prin antrenarea cu vapori de apă şi se dozează în distilatul de vin prin spectrofotometrie cu absorbţie în ultraviolet. Substanţele interferente la măsurarea absorbanţei în ultraviolet sînt eliminate prin evaporare pînă la uscat a probei de distilat uşor alcanizat în o soluţie de hidroxid de calciu.

Conţinutul a mai puţin de 20 mg/l trebuie să se confirme prin metoda cromatografică în strat subţire (sensibilitatea: 1 mg/l ).

1.2. Metoda de dozare prin cromatografie gazoasă

Acidul sorbic se extrage cu eter dietilic şi se determină prin gaz cromatografie în prezenţa unui etalon intern.

1.3. Metoda de dozare cu ajutorul cromatografiei în strat subţire

Acidul sorbic se extrage cu eter dietilic; se separă prin cromatografie în strat subţire; concentraţia se evaluează semicantitativ.

2. Metoda de dozare prin spectrofotometrie cu absorbţie în ultra violet

2.1. Echipamente:

aparat de antrenate cu vapori de apă (Capitolul "Aciditatea volatilă");

baie de apă,100°C;

spectrofotometru ce permite măsurarea la lungimea de undă de 256 nm cu cuve de cuarţ cu grosimea stratului de 1 cm.

2.2. Reactivi:

acid tartric cristalic;

soluţie de hidroxid de calciu, aproximativ 0,02 M.

soluţie de referinţă de acid sorbic (C₆H₈O₂) de 20 mg/l: se dizolvă 20 mg acid sorbic în 2 ml soluţie de hidroxid de sodiu de 0,1 М; se toarnă într-un balon cotat de 1000 cm³ şi se aduce pînă la cotă cu apă distilată. La fel se poate dizolva 26,8 mg sorbat de potasiu în apă; se trec într-un balon de 1000 cm³ şi se aduce pînă la cotă cu apă distilată.

2.3. Metoda de operare

2.3.1. Distilarea

În barbotorul aparatului de antrenare cu vapori de apă se introduc 10 cm³ de vin, se adaugă aproximativ 1-2 g de acid tartric. Se recoltează 250 ml de distilat.

2.3.2. Curba de etalonare

Se prepară prin diluare cu apă patru soluţii de referinţă, cu conţinutul de acid sorbic corespunzător: 0,5; 1,0; 2,5 şi 5,0 mg/l; se măsoară absorbţia la spectrofotometru la lungimea de undă 256 nm în raport cu apa distilată. Se trasează o curbă a absorbţiei în funcţie de concentraţia soluţiilor.

2.3.3. Dozarea

Într-o capsulă cu diametrul de 55 mm se introduc 5 ml de distilat, se adaugă 1 ml de soluţie de hidroxid de calciu. Se evaporă pînă la uscat la o baie de apă . Apoi restul se trece cantitativ cu cîţiva mililitri de apă distilată într-o fiolă de 20 ml. Se clăteşte cu apă distilată pînă la cotă.

Se măsoară absorbanţia acidului sorbic, la spectrofotometru la lungimea de undă λ = 256 nm, în comparaţie cu o soluţie tampon obţinută prin diluarea pînă la 20 ml cu apă distilată a 1 ml soluţie de hidroxid de calciu. Valoarea absorbanţei se raportează pe curba de etalonare şi se determină concentraţia acidului sorbic în soluţie.

În practică evaporarea pînă la uscat poate fi neglijată. Măsurările absorbanţei se pot efectua în distilatul, diluat de ¼, în raport cu apa distilată.

2.4. Exprimarea rezultatelor

2.4.1. Calculul

Concentraţia acidului sorbic în vin, exprimată în miligrame pe litru, este egală cu:

100 × C,

unde, C – concentraţia acidului sorbic în soluţia analizată la spectrofotometru, exprimată în miligrame pe litru.

3. Metoda de dozare prin gaz-cromatografie

3.1. Echipamente

Cromatograf cu fază gazoasă, înzestrat cu detector de ionizare cu flacără şi cu o coloană de oţel inoxidabil [4 m × 1/8 ţoli (25,4 mm/8) ] tratat cu dimetildiclorosil.

Fază staţionară, constituie un amestec de deitilenglicol succinic (5%) şi acid fosforic (1%) (DEGS – H₃PO₄) sau un amestec de deitilenglicol adipos (7%) şi acid fosforic (1%) (DEGS – H₃PO₄) fixat în Gaschrom Q 80-100 mesh.

Pentru tratarea cu dimetildiclorosil (DMDCS), prin coloană se trece toluol, în care sînt dizolvate 2-3 g DMDCS. Coloana imediat se spală cu metanol, se trece un curent de azot, apoi hexan şi din nou azot, după ce se umple.

Condiţiile de operare:

Microseringă de 10 microlitri, gradată în 0,1 microlitri.

3.2. Reactivi:

eter dietilic (C₂H₅)₂ O, distilat la momentul de utilizare;

soluţie de etalon intern: soluţie de acid undecanoic, C₁₁ H₂₂ O₂ , în etanol de 95% vol.,1 g /l;

soluţie apoasă de acid sulfuric Н₂S_O4, (ρ ₂₀ = 1,84 g/ml) diluarea 1/3 (v/v).

3.3. Metoda de determinare

3.3.1. Pregătirea probei pentru analiză.

Într-un cilindru de 40 ml cu dop rodat se introduc 20 ml de vin, se adaugă 2 ml soluţie de etalon intern şi 1 ml soluţie de acid sulfuric. După ce se agită, se adaugă 10 ml eter dietilic.

Se extrage acidul sorbic prin scuturarea tubului timp de 5 minute. Se lasă să se aşeze.

3.3.2. Prepararea soluţiei de referinţă

Se selectează un vin pentru care cromatograma extractului cu eter nu arată nici un vîrf corespunzător eluţiei acidului sorbic. În vin se adaugă acid sorbic în concentraţie de 100 mg pe litru; 20 ml de mostră se tratează în conformitate cu punctul 3.3.1.

3.3.3. Cromatografierea

Se injectează succesiv în cromatograf cu microseringa 2 ľl din faza extrasă cu eter obţinută conform punctului 3.3.2. şi 2 ľl a fazei extrase cu eter, obţinută conform punctului 3.3.1.

Se înregistrează cromatogramele respective, se verifică identitatea timpilor de reţinere a acidului sorbic şi a etalotului intern. Se măsoară înălţimea (sau suprafaţa) picurilor înregistrate.

3. 4. Exprimarea rezultatelor

3.4.1. Calculul

Concentraţia de acid sorbic C în vinul analizat, exprimată în miligrame pe litru (mg/l) se calculează cu formula:

unde,

H – înălţimea picului acidului sorbic în soluţia de referinţă;

h – înălţimea picului acidului sorbic în mostra analizată;

I – înălţimea picului etalotului intern în soluţia de referinţă;

i – înălţimea picului etalonului intern în mostra analizată.

Concentraţia acidului sorbic poate fi determinată analogic în baza măsurării suprafeţelor picurilor corespunzătoare.

4. Identificarea urmelor de acid sorbic prin cromatografia în strat subţire

4.1. Echipamente:

plăci 20 × 20 cm pentru cromatografie în strat subţire, acoperite cu gel de poliamidă (grosimea 0,15 mm), cu adăugarea unui indicator fluorescent;

cuve pentru cromatografie în strat subţire;

micropipete şi microseringi cu volumul de 5 ľl ± 0,1 ľl;

lampă ultravioletă (254 nm).

4.2. Reactivi:

eter dietilic (C₂ H₅ )₂ O;

soluţie apoasă de acid sulfuric Н₂ S O₄ (ρ ₂₀ = 1,84 g/ml) diluarea 1/3 (v/v);

soluţie de referinţă a acidului sorbic într-un amestec de apă-etanol de 10% vol., aproximativ 20 mg pe litru;

faza mobilă: hexan-pentan-acid acetic (C₆H₁₄-C₅H₁₂-CH₃COOH, ρ₂₀ = 1,05 g/ml) (20:20:3).

4.3. Metoda de determinare

4.3.1. Pregătirea probei pentru analiză

Într-un tub din sticlă cu o capacitate de aproximativ 25 ml cu dop rodat se pun 10 ml de vin, se adaugă 1 ml soluţie de acid sulfuric şi 5 ml eter etilic. Se amestecă prin rotirea tubului. Se lasă să se aşeze.

4.3.2. Pregătirea soluţiilor de referinţă

Din soluţia de referinţă se prepară cinci soluţii diluate conţinînd 2, 4, 6, 8 şi 10 mg acid sorbic pe litru.

4.3.3. Cromatografierea

Folosind o microsiringă sau micropipetă, se depun 5 ľl din faza extrasă cu eter obţinut conform punctului 4.3.1 şi cîte 5 ľl din fiecare din soluţiile de referinţă diluate la 2 cm de marginea inferioară a plăcii şi 2 cm distanţă una faţă de alta.

Se pune faza mobilă în cuva pentru cromatografie la o înălţime de 0,5 cm şi se permite saturarea atmosferei din cuvă cu vaporii solventului. Se pune placa în cuvă. Se permite cromatogramei să migreze 12-15 cm (timp de migrare aproximativ 30 minute). Se usucă placa cu un curent de aer rece. Se examinează cromatograma sub o lampă cu ultraviolet de 254 nm.

Spoturile indicînd prezenţa acidului sorbic apar violet închis pe fondul galben fluorescent al plăcii.

4.4. Exprimarea rezultatelor

Compararea intensităţilor spoturilor produse de proba analizată şi de soluţiile de referinţă, permite evaluarea semicantitativă a concentraţiei acidului sorbic între 2 şi 10 mg pe litru. O concentraţie de 1 mg/l poate fi determinată cu depunerea a 10 ľl din soluţia analizată.

Concentraţii de peste 10 mg/l pot fi determinate cu depunerea a cel mult de 5 ľl din soluţia analizată (se măsoară cu ajutorul unei microseringi).

16. Acidul L-ascorbic

16.1 MA-MD-AS 313-13-ALASCO

1. Principiul metodelor

Metodele propuse permit de a determina conţinutul de acid L-ascorbic şi acid dehidroascorbic prezent în vin şi în must.

1.1. Metoda de referinţă

Acidul L-ascorbic este oxidat prin acţiunea cărbunelui activ în acid dehidroascorbic. Acesta formează un compus fluorescent prin reacţia cu ortofenilendiamina (OPDA). O probă martor în prezenţa acidului boric permite de a determina fluorescenţa de fond (prin formarea unui complex acid boric – acid dehidroascorbic) şi de a o sustrage din rezultatul dozării fluorimetrice.

1.2. Metoda uzuală

Acidul L-ascorbic este oxidat prin acţiunea iodului în acid dehidroascorbic. Acidul dehidroascorbic este precipitat cu 2,4 − dinitro-fenilhidrazină în bis (2,4 − dinitrofenilhidrazină). După separarea prin cromatografie în strat subţire şi solubilizarea în mediu acetic, acest compus colorat în roşu este dozat prin spectrofotometrie, la lungimea de undă de 500 nm.

2. Metoda de referinţă (metoda fluorimetrică)

2.1. Echipamente

Fluorimetru. Se utilizează un spectrofluorimetru, echipat cu lampă ce emite un spectru continuu, plasat la puterea minimă a lampei. Lungimile de undă de excitare şi emisie optimale se determină în prealabil în funcţie de aparatul folosit. În general, lungimea de undă pentru excitare se află în apropiere de 350 nm, iar pentru emisie – în apropiere de 430 nm.

Cuve cu drumul optic de 1 cm.

Filtre din sticlă cu gradul 3 de porozitate.

Eprubete (diametrul 10 mm).

Agitator pentru eprubete.

2.2. Reactivi:

soluţie de dihidroclorură de orto-fenilendiamină (C₆H₈N₂), de 0,02%, preparată înaintea experimentului;

soluţie de acetat de sodiu trihidrat (CH₃COONа x3H₂O), 500 g/l;

soluţie mixtă de acid boric şi acetat de sodiu: se dizolvă 3 g de acid boric (H₃BO₃) în 100 ml soluţie de acetat de sodiu de 500 g/l. Soluţia trebuie preparată înaintea experimentului;

soluţie de acid acetic CH₃COOH (ρ₂₀ = 1,05 g/ml) diluat la 56% (v/v), cu un pH aproximativ de 1,2;

soluţie de referinţă de acid L-ascorbic cu concentraţia de 1 g/l: se dizolvă, la momentul analizei, 50 mg de acid L-ascorbic, prealabil deshidratat într-un exicator ferit de lumină, în 50 ml soluţie de acid acetic;

cărbune activ extrapur pentru analiză: se plasează 100 g de cărbune activ într-un balon conic cu volumul de 2 l, se adaugă 500 ml soluţie de acid clorhidric (ρ₂₀ = 1,19 g/ml) de 10% (v/v). Se aduce la fierbere, apoi se filtrează printr-un filtru de sticlă cu gradul 3 de porozitate.

Cărbunele tratat în aşa fel se plasează într-un balon conic de 2 l, se adaugă 1 l de apă, se agită şi se filtrează prin filtrul de sticlă cu gradul 3 de porozitate. Operaţia se repetă de două ori. Ulterior cărbunele se plasează într-o etuvă ventilată la 115 ± 5°C pentru 12 ore (pentru o noapte, spre exemplu).

2.3. Metoda de lucru

2.3.1. Pregătirea probei de vin sau de must

Într-un balon cotat se prelevează o alicotă de vin sau must şi se diluează pînă la 100 ml cu soluţie de acid acetic de 56%, pentru a obţine o soluţie cu concentraţia de acid L-ascorbic în intervalul 0 – 60 mg/l.

Conţinutul balonului se omogenizează. Se adaugă 2 g de cărbune activ şi se lasă în contact pentru 15 minute, agitînd periodic. Se filtrează printr-un filtru de hîrtie, înlăturînd primii mililitri de filtrat.

În două baloane cotate de 100 ml se introduc cîte 5 ml de filtrat, apoi în primul se adaugă 5 ml soluţie mixtă de acid boric şi acetat de sodiu (proba martor), iar în al doilea – 5 ml soluţie de acetat de sodiu (proba de analizat). Se lasă în contact timp de 15 minute, agitînd periodic, apoi se aduce la cotă cu apă distilată.

Se iau cîte 2 ml din fiecare balon, se plasează în eprubete, apoi se adaugă cîte 5 ml soluţie de orto-fenilendiamină şi se amestecă cu ajutorul agitatorului, se lasă pentru ca reacţia să decurgă timp de 30 de minute într-un loc ferit de lumină, apoi se efectuează măsurările spectrofluorimetrice.

2.3.2. Curba de etalonare

În trei baloane cotate de 100 ml se plasează respectiv 2, 4 şi 6 ml soluţie de referinţă de acid L-ascorbic, se aduce la cotă cu soluţie de acid acetic. Se omogenizează minuţios.

Soluţiile de referinţă preparate conţin, respectiv, 2, 4 şi 6 mg de acid L-ascorbic în 100 ml. Se adaugă cîte 2 g de cărbune activ în fiecare balon şi se lasă în contact timp de 15 minute, agitînd periodic. Se filtrează printr-un filtru de hîrtie, înlăturînd primii mililitri de filtrat.

Se plasează, respectiv, cîte 5 ml din fiecare filtrat în trei baloane cotate de 100 ml (prima serie, martor). Se repetă operaţia pentru a doua serie. În baloanele cu soluţii din prima serie se introduc cîte 5 ml de soluţie mixtă de acid boric şi acetat de sodiu, iar în cele din seria a doua – cîte 5 ml soluţie de acetat de sodiu. Se lasă în contact timp de 15 minute, agitînd periodic, apoi se aduce la cota cu apă distilată.

Se ia cîte 2 ml din fiecare balon, se plasează în eprubete, apoi se adaugă cîte 5 ml soluţie de orto-fenilendiamină şi se amestecă cu ajutorul agitatorului, se lasă reacţia să decurgă timp de 30 minute într-un loc ferit de lumină, apoi se efectuează măsurările spectrofluorimetrice.

2.3.3. Determinările fluorimetrice

Pentru fiecare din probele, fie pentru curba de etalonare, fie pentru testări pe vin sau must, se stabileşte scara de măsurare la "zero", folosind soluţia martor respectivă. Ulterior se efectuează măsurarea intensităţii fluorescenţei.

Curba de etalonare trebuie să fie lineară şi să treacă prin origine. Concentraţia sumară a acidului L-acscorbic şi dehidroascorbic (C) în probele de analizat se determină din curba de etalonare.

2.4. Exprimarea rezultatelor

Concentraţia sumară de acid L-ascorbic şi acid dehidroascorbic în vin sau must, exprimată în miligrame pe litru, se calculează cu formula:

C × F,

unde F – factorul de diluţie.

3. Metoda uzuală (colorimetrică)

3.1. Echipamente:

centrifugă de laborator şi eprubete de 50 ml cu dop rodat;

baie de apă pentru răcire şi termostatare între 5 şi 10°C;

baie de apă pentru răcire şi termostatată la 20°C;

plăci pentru cromatografia în strat subţire de 20 × 20 cm, acoperite cu gel de silice G (grosimea 0,25 – 0,3 mm);

cuve pentru cromatografie;

micropipete cu volumul de 0,2 ml;

spectrofotometru care permite de a măsura absorbanţa la 500 nm în cuve de 1 cm.

3.2. Reactivi:

soluţie de acid metafosforic de 30% (m/v). Se cîntăresc 30 g de acid metafosforic, în prealabil mărunţit într-un mojar. Se spală rapid cu apă distilată, apoi se dizolvă într-un balon cotat de 100 ml, se duce la cotă cu apă distilată . Soluţia obţinută conţine aproximativ 30% (m/v) de acid metafosforic;

soluţie de acid metafosforic de 3% (m/v). Se prepară înaintea experienţei prin diluare 1/10 cu apă distilată a soluţiei de 30%;

soluţie de acid metafosforic de 1% (m/v). Se prepară înaintea experienţei prin diluare 1/30 cu apă distilată a soluţiei de 30%;

suspensie de poliamidă. Se prepară o suspensie din 10 g de poliamidă pentru cromatografie şi 60 ml de apă distilată, se lasă în contact pentru 2 ore. Cantitatea astfel preparată este suficientă pentru 4 determinări;

tiouree (H₂NCSNH₂);

soluţie de iod, 0,05 M;

soluţie de 2,4-dinitrofenilhidrazină de 6% (m/v). Se prepară o suspensie din 6 g de 2,4 − dinitrofenilhidrazină în 50 ml de acid acetic glacial (ρ₂₀ = 1,05 g/ml), se adaugă 50 ml de acid sulfuric (ρ₂₀ = 1,84 g/ml), 2,4 − dinitrofenilhidrazina se dizolvă prin agitare;

acetat de etil, (C₄ H₈O₂), pregătit cu acid acetic glacial de 2% (v/v) (ρ₂₀ = 1,05 g/ml);

cloroform, (CHCl₃);

soluţie apoasă de amidon de 0,5% (m/v);

faza mobilă – acetat de etil, cloroform, acid acetic glacial (50:60:5). Amestecul de solvenţi se lasă înainte de a fi utilizat pentru 12 ore;

acid acetic glacial (CH₃COOH) (ρ₂₀ = 1,05 g/ml);

soluţie de acid L-ascorbic cu concentraţia de 1,0 g pe litru de soluţie de acid metafosforic de 1%.

3.3. Metoda de lucru

3.3.1. Oxidarea acidului L-ascorbic în acid dehidro-ascorbic

Într-un balon cotat de 100 ml se plasează 50 ml de vin, se adaugă 15 ml suspensie de poliamidă şi se aduce la cotă cu soluţie de acid metafosforic de 3%. Se lasă în contact pentru o oră, agitînd periodic. Se filtrează printr-un filtru de hîrtie. Se colectează 20 ml de filtrat într-o eprubetă pentru centrifugare, se adaugă 1 ml soluţie 0,05 M de iod. Se omogenizează prin agitarea eprubetei cu dopul închis. Peste 1 minută se reduce excesul de iod prin adăugarea a aproximativ 25 mg de tiouree.

3.3.2. Formarea şi extracţia bis (2,4 − dinitrofenilhidrazinei) şi acidului dicetogulonic

Eprubeta se introduce într-o baie de apă, răcită la o temperatură de (5-10)°C, se adaugă 4 ml soluţie de 2,4 − dinitrofenilhidrazină. Se omogenizează conţinutul eprubetei, fără a înmuia dopul de sticlă. Eprubeta închisă cu atenţie este lăsată într-o baie de apă la 20°C pentru aproximativ 16 ore (pe noapte, spre exemplu). Se adaugă la conţinutul eprubetei 15 ml soluţie de acetat de etil, se închide, se agită timp de 30 secunde, apoi se centrifughează 5 minute prin aplicarea unei forţe centrifuge de 300-400 g.

Într-un balon conic cu dop rodat se iau cu ajutorul unei pipete 10 ml de acetat de etil de extracţie. Se adaugă la conţinutul eprubetei pentru centrifugare 5 ml de acetat de etil. Se închide şi se agită 30 secunde şi se centrifughează 5 minute în aceleaşi condiţii. Apoi se iau 5 ml de acetat de etil de extracţie şi se adaugă acest volum la soluţia de la prima extracţie din balonul conic. Amestecul se omogenizează prin agitare.

3.3.3. Separarea prin cromatografie a bis (2,4 − dinitrofenilhidrazinei)

Se efectuează într-un interval de timp ce nu depăşeşte 2 ore după extracţie. Se lasă o margine de 2 cm în partea de jos şi laterală a plăcii, şi se depune linear pe toată suprafaţa plăcii cîte 0,2 ml acetat de etil de extracţie.

Faza mobilă se toarnă în cuva pentru cromatografie într-un strat de 1 cm şi se lasă un timp pentru ca atmosfera din cuvă să fie saturată cu vapori de solvenţi. Se introduce placa în cuvă, se lasă să migreze solventul pînă la marginea superioară a plăcii. Placa se usucă timp de o oră într-un dulap ventilat.

Se separă substanţa cu ajutorul unei spatule cu mişcări perpendiculare zonei de migrare a solventului, zona de culoare roşie, caracteristică pentru bis (2,4 − dinitrofenilhidrazină). Substanţa este trecută cantitativ într-un balon conic cu dop rodat. Se adaugă 4 ml de acid acetic, se lasă în contact pentru 30 minute, agitînd frecvent. Se filtrează printr-un filtru de hîrtie direct în cuva spectrofotometrului. Filtratul obţinut trebuie să fie limpede.

Scara spectrofotometrului se reglează la zero cu acid acetic, apoi se măsoară absorbanţa soluţiilor supuse analizei.

3.3.4. Curba de etalonare

În trei baloane cotate de 100 ml se plasează respectiv cîte 5, 10 şi 15 ml soluţie de acid L-ascorbic de 1 g/l, se aduce la cotă cu soluţie de acid metafosforic de 1%. Soluţiile obţinute astfel conţin, respectiv, 50, 100 şi 150 mg acid L-ascorbic /litru. Se tratează cîte 50 ml din fiecare soluţie, conform modului operator descris în punctele 3.3.1., 3.3.2. şi 3.3.3. Se trasează curba de etalonare, aceasta trebuie să fie lineară şi să treacă prin origine.

3.3.5. Exprimarea rezultatelor

Conţinutul sumar de acid L-ascorbic + acid dehidroascorbic în vin sau must (C), se determină din curba de etalonare şi se exprimă în miligrame pe litru, (mg/l).

În cazul în care concentraţia sumară de acid L-ascorbic + acid dehidroascorbic depăşeşte 150 mg/l, volumul vinului se reduce la 25, 20 sau 10 ml şi se multiplică rezultatul obţinut cu factorul de diluţie F.

17. Aciditatea ionică (pH)

17.1. MA-MD-AS 313-15-pH

1. Principiul metodei

Măsurarea diferenţei de potenţial între doi electrozi cufundaţi în must sau vin. Un electrod are un potenţial în funcţie de valoarea pH în lichid, celălalt are un potenţial fix, cunoscut şi constituie un electrod de referinţă.

2. Aparate

2.1. pH metru etalonat în unităţi pH, care permite măsurarea cu o eroare de 0,05 unităţi şi mai puţin.

2.2. Electrozi:

electrod de sticlă, se păstrează în apă distilată;

electrod de referinţă, colomel-clorură de potasiu saturată, se păstrează în soluţie saturată de clorură de potasiu;

electrod combinat, se păstrează în apă distilată.

3. Reactive

3.1. Soluţii tampon

Soluţie saturată de tartrat acid de potasiu. Soluţia conţine cel puţin 5,7 g/l de hidrogenotartrat de potasiu (HOOC, C₂H₄O₂, COOK) la 20°C. Această soluţie poate fi păstrată 2 luni în prezenţa a 0,1 g timol în 200 ml.

Soluţie de ftalat acid de potasiu de 0,05 M. Soluţia conţine 10,211 g/l de hidrogenoftalat de potasiu (HOOC, C₆H₄COOK) la 20°C. Durata maximală de păstrare 2 luni.

Soluţie cu conţinut de:

Durata maximală de păstrare 2 luni

La fel pot fi utilizate soluţiile tampon de referinţă din comerţ.

4. Metoda de lucru

4.1. Pregătirea probei pentru analiză

4.1.1. Pentru must şi vin: se foloseşte must sau direct vinul

4.1.2. Pentru must concentrat rectificat

Se diluează mustul concentrat rectificat cu apă pentru a ajusta concentraţia la 25 ± 0,5% a totalului zaharurilor (25°Brix).

Dacă P reprezintă procentajul concentraţiei (m/m) a totalului zaharurilor în mustul concentrat rectificat, se măsoară o masă de 2500/P şi se completează pînă la 100 g cu apă.

Apa utilizată trebuie să aibă o conductibilitate sub 2 microsiemens pe centimetru.

4.2. Stabilirea punctului zero al aparatului

Această operaţie se realizează înaintea oricărei determinări, în conformitate cu instrucţiunile furnizate o dată cu aparatul utilizat.

4.3. Calibrarea pH – metrului

Calibrarea pH-metrului se efectuează la 20°C, utilizînd soluţii tampon cu pH 6,88 şi 3,57. Soluţia tampon cu pH 4,00 la 20°C se utilizează pentru verificarea calibrării scalei.

4.4. Determinarea

Se cufundă electrodul în proba de analiză, a cărei temperatură trebuie să se situeze între 20 şi 25°C şi cît mai aproape posibil de 20°C. Se citeşte valoarea pH direct de pe scală.

Se realizează cel puţin două determinări pentru aceeaşi probă. Media aritmetică a două determinări este considerată rezultatul final.

5. Exprimarea rezultatelor

pH-ul mustului, vinului sau al mustului concentrat rectificat de 25% (m/m) (25°Brix) este exprimat cu două zecimale.

18. Dioxidul de carbon

18.1 MA-MD-AS 314-01-DIOCAR

1. Principiul metodei

1.1. Metoda de referinţă

1.1.1. Vinuri nespumoase (CO₂ suprapresiune ≤ 0,5 × 10⁵ Pa). Volumul de vin luat din probă se aduce la temperatura de aproximativ 0°C şi se amestecă cu o cantitate suficientă de hidroxid de sodiu pentru a obţine un pH de 10-11. Se titrează cu o soluţie acidă în prezenţa anhidrazei carbonice. Conţinutul de bioxid de carbon este calculat din volumul de acid necesar schimbării pH de la 8,6 (forma bicarbonat) la 4,0 (acid carbonic). În aceleaşi condiţii se efectuează şi o titrare test, pe o probă de vin decarbonatat, în scopul de a ţine cont de volumul de soluţie de hidroxid de sodiu consumat de acizii din vin.

1.1.2. Vinuri spumante şi petiante

Proba de vin supuse analizei este răcită aproape de punctul de îngheţ. După înlăturarea unei cantităţi utilizate ca blanc după decarbonatare, restul conţinutului sticlei este alcalinizat, pentru a fixa tot CO₂ sub forma Na₂CO₃. Se titrează cu o soluţie acidă, în prezenţa anhidrazei carbonice. Conţinutul de bioxid de carbon este calculat din volumul soluţiei acide necesară pentru schimbarea pH de la 8,6 (formă bicarbonat) la 4,0 (acid carbonic). În aceleaşi condiţii se întreprinde şi o titrare blanc, pe vin decarbonatat, în scopul de a ţine cont de volumul de soluţie de hidroxid de sodiu absorbit de acizii din vin.

1.2. Metoda uzuală: pentru vinurile spumante şi petiante

Metoda manometrică – măsurarea subpresiunii bioxidului de carbon direct în sticlă cu ajutorul afrometrului.

2. Metoda de referinţă

2.1. Vinuri nespumoase (CO₂ suprapresiune ≤ 0,5 × 10⁵Pa ).

2.1.1. Aparatura

Agitator magnetic.

pH metru

2.1.2. Reactivi:

soluţie de hidroxid de sodiu NaOH, 0,1 M;

soluţie acid sulfuric, H₂SO₄ 0,05 M;

soluţie anhidrază carbonică 1 g/l.

2.1.3. Metoda de lucru

Se răceşte proba de vin la aproximativ 0°C împreună cu pipeta utilizată pentru eşantionare. Se pun 25 ml de soluţie de hidroxid de sodiu într-un pahar de laborator de 100 ml; se adaugă două picături de soluţie apoasă de anhidrază carbonică. Se introduc 10 ml de vin, utilizînd pipeta răcită la 0°C. Se pune paharul pe agitatorul magnetic, se instalează electrodul pH şi se agită moderat. Cînd lichidul a ajuns la temperatura camerei, se titrează încet cu soluţia de acid sulfuric pînă cînd pH-ul ajunge 8,6. Se notează valoarea volumului adăugat.

Se continuă titrarea pînă la pH 4,0. Se notează cu n ml volumul utilizat între pH 8,6 şi 4,0.

Se înlătură CO₂ din aproximativ 50 ml de probă de vin prin agitarea în vid timp de trei minute, încălzind balonul pe o baie de apă la aproximativ 25°C. Se repetă procedura de mai sus cu 10 ml de vin decarbonatat şi se notează cu n′ ml, volumul utilizat.

2.1.4. Exprimarea rezultatelor

1 ml de soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 M titrată corespunde la 4,4 mg de CO₂. Cantitatea de CO₂ din vin, în grame pe litru, este dată de formula:

0,44 (n – n′)

Se evaluează cu două zecimale.

Cînd vinurile conţin puţin CO₂ (CO₂ < 1 g/l) nu este necesară adăugarea anhidrazei carbonice pentru catalizarea hidratării CO₂.

2.2. Vinuri spumante şi petiante

2.2.1. Aparatura

Agitator magnetic.

pH metru

2.2.2. Reactivi:

soluţie de hidroxid de sodiu NaOH, 50% (m/m);

soluţie de acid sulfuric H₂SO₄, 0,05 M;

soluţie de anhidrază carbonică 1 g/l.

2.2.3. Metoda de lucru

Se notează nivelul vinului în sticlă şi se răceşte pînă cînd începe să îngheţe. Se lasă sticla să se încălzească uşor, agitînd-o, pînă cînd dispar cristalele de gheaţă. Se scoate dopul rapid şi se iau 45-50 ml de vin în cilindrul pentru titrarea blanc. Volumul exact luat, v ml, este determinat prin citirea pe scala cilindrului gradat după ce vinul a ajuns la temperatura camerei.

Imediat după ce proba blanc a fost luată, se adaugă 20 ml de soluţie de hidroxid de sodiu în sticla cu capacitatea de 750 ml. Se aşteaptă pînă cînd vinul ajunge la temperatura camerei.

Se iau 30 ml de apă distilată fiartă şi două picături de soluţie de anhidrază carbonică într-un pahar de laborator de 100 ml. Se adaugă 10 ml de vin care a fost alcalinizat. Se pune paharul pe agitatorul magnetic, se instalează electrodul şi tija magnetică şi se agită uşor.

Se titrează atent cu soluţie de acid sulfuric, pînă la pH şi se notează valoarea volumului adăugat. Se continuă titrarea cu acid sulfuric, pînă la pH 4,0. Se notează cu n ml, volumul utilizat între pH 8,6 şi 4,0.

Se înlătură CO₂ din v ml de vin prin agitarea 3 minute în vid, încălzind balonul la aproximativ 25°C pe o baie de apă. 10 ml de vin decarbonatat se adaugă la 30 ml de apă distilată fiartă; se adaugă 2-3 picături de soluţie de hidroxid de sodiu pentru aducerea pH la 10-11. Se urmează apoi procedura de mai sus. Se notează cu n′ ml, volumul de acid sulfuric 0,05 M adăugat.

2.2.4. Exprimarea rezultatelor

1 ml soluţie de acid sulfuric 0,05 M corespunde cu 4,4 mg de CO₂.

Se goleşte sticla de vin care a fost alcalinizat şi se determină, cu precizie de 1 ml, volumul iniţial de vin prin completarea cu apă pînă la cotă. Se notează cu V ml.

Cantitatea de CO₂, exprimată în grame pe litru (g/l) de vin, este dată de următoarea formulă:

Rezultatul obţinut se notează cu două zecimale.

2.3. Calculul suprapresiunii teoretice

Presiunea în exces la 20°C (Paph₂₀), exprimată în pascali, se determină cu formula:

unde:

Q – conţinutul de CO₂ în vin, în grame pe litru, (g/l);

A – tăria alcoolică a vinului la 20°C,% vol.;

S – conţinutul în zahăr al vinului, în grame pe litru, (g/l);

Patm – presiunea atmosferică, exprimată în pascali.

19. Metanolul

19.1 MA-MD-AS 312-03-METHAN

1. Principiul metodei

Metoda de referinţă

Metanolul se determină prin cromatografie în fază gazoasă în distilatul de vin cu adaos de etalon intern.

Metoda uzuală

Metanolul se oxidează în aldehidă formică în prezenţa permanganatului de potasiu din distilatul de vin, diluat pînă la tăria de 5% vol., acidulat cu acid fosforic. Aldehida formică se colorează în violet în prezenţa acidului sulfuric şi acidului cromotropic. Intensitatea culorii se determină la spectrofotometru la lungimea de undă de 575 nm.

2. Metoda de referinţă

2.1. Aparate:

cromatograf în fază gazoasă cu detector de ionizare în flacără;

coloane: coloană din oţel inoxidabil cu lungimea de 7,5 m şi diametrul intern 1/8 ţol cu Carbowax 1540, îmbibat cu Chromosotb W 10%, 60-80 mesh;

coloană din oţel inoxidabil cu lungimea de 7,5 m şi diametrul intern 1/8 ţol cu Carbowax 400, 5% şi Hallcomid М.18 OL, 1%, îmbibat Chromosorb W, 60-70 mesh.

În ambele cazuri Chromosorb W în prealabil se activează prin încălzire în soba de mufel pînă la 750-800°C timp de 4 ore.

Alte tipuri de coloane la fel pot asigura o separare bună. Metoda descrisă mai jos este dată în calitate de exemplu.

Condiţii de operare (ca exemplu): temperatura injectorului – 280°C, temperatura detectorului – 270°C, gaz-purtător-hidrogen; debit de hidrogen – 2 ml/minut; eşire – 30 ml/minut; injectare "splitless"; volumul probei injectate – 2 ľkl; injectare la 35°C – eşirea închisă timp de 40 secunde, programarea temperaturii – de la 120°C pînă la 170°C , 3°C/minut.

2.2. Metoda de determinare

Se prepară o soluţie de etalon intern (4-metilpentanol-2) de 1 g/l, în soluţie hidroalcoolică de 10% vol.

Se prepară o soluţie în care se adaugă 5 ml de soluţie hidroalcoolică de etalon intern în 50 ml de distilat de vin, obţinut cum este indicat în capitolul 2 "Concentraţia alcoolică la 20°C".

Se prepară o soluţie de referinţă de metanol cu concentraţia 100 mg/l în soluţie hidroalcoolică de 10% vol. Se adaugă 5 ml soluţie de etalon intern în 50 ml de soluţie de referinţă de metanol.

Apoi se injectează în cromatograf cîte 2 ľl soluţie de referinţă şi proba cu distilat.

Temperatura în cuptor – 90°C, consumul de gaz purtător este de 25 ml/minut.

2.3. Exprimarea rezultatului:

Concentraţia de metanol C, exprimată în miligrame pe litru (mg/l), se calculează cu formula:

unde,

S şi S_x – suprafaţa picului de metanol în soluţia de referinţă şi în soluţia dozată;

I şi i – suprafaţa picului de etalon intern în soluţia de referinţă şi soluţia dozată.

3. Metoda uzuală

3.1. Reactivi

Acid chromotropic: acid 4,5-dihidroxinaftalin-2,7-di-sulfuric 2,7 (C₁₀H₈O₈S₂ × 2H₂O) cu greutatea moleculară 356,34 g. Un praf alb sau cafeniu deschis, solubil în apă. Se întrebuinţează la fel şi sarea disodică a acestui acid, sub forma unui praf galben sau cafeniu deschis foarte solubil în apă.

Acidul chromotropic trebuie să formeze o coloraţie neînsemnată în proba de control cu utilizarea reactivului. În caz contrar, este necesară purificarea acestuia în felul următor: se dizolvă 10 g acid chromotropic sau sarea lui în 25 ml apă distilată. În cazul utilizării repetate a sării, se adaugă 2 ml acid sulfuric concentrat (ρ₂₀=1,84 g/ml) pentru eliberarea acidului chromotropic. Se adaugă 50 ml metanol, se încălzeşte pînă la fierbere, apoi se filtreză. Se adaugă 100 ml 2-propanol pentru precipitarea acidului liber în formă de cristale, se lasă să se usuce la frig.

Reacţie – adăugarea clorurei de fer III (1 picătură) în 10 ml de soluţie cu 0,1 g /1000 ml dă o culoare verde.

Sensibilitatea determinării – se diluează 0,5 ml soluţie farmaceutică de formaldehidă în 1000 ml şi se aduce la cotă cu apă distilată. La 5 ml soluţie cu 0,05% acid chromotropic în acid sulfuric de 75% (v/v), se adaugă 0,1 ml soluţie de formaldehidă şi se încălzeşte la 70°C timp de 20 minute. Soluţia trebuie să se coloreze în violet.

Soluţie de acid cromotropic 0,05% în acid sulfuric de 75% (v/v). Se dizolvă 50 mg acid chromotropic sau sarea de sodiu în 35 ml apă distilată. Se plasează soluţia obţinută la o baie de apă cu gheaţă şi se adaugă cu precauţie, agitînd, în mici porţii 75 ml acid sulfuric concentrat (ρ₂₀ = 1,84 g/ml). Această soluţie este necesară de a fi preparată în momentul utilizării.

Soluţie etalon de metanol de 5 g/l în alcool de 5% vol.

Soluţie de acid fosforic, 50 g/100 ml;

Soluţie de permanganat de potasiu, 5 g/100 ml;

Soluţie de sulfit de sodiu neutru, 2 g/100 ml. Soluţia se oxidează repede în aer. Se verifică titrul prin titrare cu iod.

3.2. Metoda de determinare

Distilatul de vin se diluează pînă la tăria de 5% vol. Într-un balon cu dop rodat se introduce 0,5 ml de acest distilat diluat, se adaugă o picătură de acid fosforic, două picături de soluţie permanganat de potasiu, se agită şi se lasă pentru 10 minute.

Se decolorează permanganatul de potasiu cu 4 picături de soluţie de sulfit de sodium neutru (se va evita excesul). Se adaugă 5 ml soluţie sulfurică a acidului cromotropic de 0,05%. Se încălzeşte la o baie de apă la 70°C timp de 20 minute. Se lasă să se răcească.

Se determină absorbanţa A_s la 570 nm, reglînd absorbanţa la zero cu soluţia de control, preparată cu 0,5 ml soluţie de diluare.

Construirea curbei de etalonare.

Într-o serie de baloane cotate de 50 ml se iau 2,5, 5, 10, 15, 20 şi 25 ml soluţie etalon de metanol. Se aduc la semn cu soluţie pentru diluări. Aceste soluţii etalon conţin, respectiv, 25, 50, 100, 150, 200 şi 250 mg de metanol la litru.

Se tratează 0,5 ml de soluţie de diluare şi 0,5 ml soluţie etalon de fiecare concentraţie şi se repetă tehnica ca şi la distilatul de vin, diluat pînă la conţinutul de alcool de 5% vol. Se determină absorbanţa în aceste soluţii la 570 nm.

Curba de etalonare a dependenţei absorbanţei soluţiilor etalon de concentraţie trebuie să fie liniară şi să treacă prin origine.

3.3. Calculul

Pe curba de etalonare se determină conţinutul de metanol, exprimat în miligram pe litru în distilatul de vin diluat pînă la tăria de 5% vol.

20. Glicerol, butan-2,3-diol

20.1. MA-MD-AS 312-04 GLYBUT

1. Principiul metodei

Metoda de referinţă

După tratarea prealabilă a vinului pe o coloană de anionit în scopul de a fixa zaharurile, manitolul şi sorbitolul, glicerolul şi butan-2,3-diolul sînt oxidate cu acid periodic. Compusul format prin acţiunea floroglucinei asupra aldehidei formice, formate la oxidarea glicerolului este testat colorimetric la 480 nm. Compusul piperidinei şi nitroprusiatului de sodiu cu aldehida acetică, obţinut la oxidarea butan-2,3-diolului se determină colorimetric la 570 nm.

2. Echipamente

Spectrofotometru, care permite efectuarea măsurărilor în diapazonul 300-700 nm cu cuve cu traseul optic de 1 cm.

Coloană din sticlă cu lungimea de aproximativ 300 mm şi diametrul interior de 10-11 mm, dotat cu un robinet.

3. Reactivi:

Glicerol C₃H₈O₃;

Butan-2,3-diol;

anionit puternic bazic, spre exemplu, anionit III de Merck sau Amberlit IRA 400;

polivinilpirolidon polimerizat (PVPP);

soluţie de acid periodic 0,1 M în acid sulfuric 0,05 M: se cîntăresc 10,696 g de metaperiodat de sodiu (NaIO₄); se dizolvă într-un balon cotat de 500 ml cu 50 ml de acid sulfuric 0,5 M; se aduce la cotă cu apă distilată ;

soluţie de acid periodic 0,05 M în acid sulfuric 0,025 M: se diluează soluţia precedentă cu apă distilată în proporţie (1:1);

soluţie de acid sulfuric 0,5 M;

soluţie de hidroxid de sodiu 1 M;

soluţie de hidroxid de sodiu 5% (m/v);

alcool de 96% vol.

soluţie de floroglucină de 2% (m/v), preparată înainte de utilizare;

soluţie de acetat de sodiu anhidru Na CH₃COO de 27% (m/v);

soluţie de nitropentacianoferrat II (nitroprussiat) de sodiu de 2% (m/v), preparată înainte de utilizare;

soluţie de piperidină 25% (v/v) , preparat înainte de utilizare;

soluţie etalon de glicerol: se prepară o soluţie de glicerol de 250 mg /100 ml şi se stabileşte titrul glicerol în proba astfel pregătită prin metoda enzimatică sau periodimetrică (conform punctului 6 al prezentului capitol). Ulterior se pregăteşte soluţia etalon de glicerol prin cîntărirea într-un balon cotat de 100 ml a masei m ce corespunde la 250 mg de glicerol pur, se aduce la cotă cu apă distilată;

soluţie etalon de butan-2,3-diol : se prepară o soluţie de butan-2,3-diol ce conţine 250 mg/100 ml şi se stabileşte titrul butan-2,3-diolului în proba astfel pregătită prin metoda enzimatică sau periodimetrică (conform punctului 6 al prezentului capitol). Ulterior se pregăteşte soluţia etalon de butan-2,3-diol prin cîntărirea într-un balon cotat de 100 ml a masei m ce corespunde cu 250 mg de butan-2,3-diol pur; se aduce la cotă cu apă distilată;

soluţie cupro-alcalină

soluţie cuprică A:

Soluţia cupro-alcalină se obţine prin amestecare, la momentul utilizării a soluţiilor A şi B în părţi egale.

4. Metoda de lucru

4.1. Pregătirea coloanei de anionit

Anionitul, care se află, de regulă, în forma Cl^- trebuie păstrat într-un recipient cu apă distilată decarbonizată.

Se plasează 30 ml de anionit în coloană. În partea superioară a coloanei se introduce un tampon din vată de sticlă, pentru a evita nimerirea bulelor de aer în stratul de răşină. Se trec 150 ml de hidroxid de sodiu de (5%) cu un debit de 3,5-5 ml/minută, urmat de trecerea unui debit similar de apă distilată decarbonizată pînă la reacţia neutră sau slab alcalină a fenolftaleinei. Anionitul astfel tratat este pregătit pentru lucru.

Anionitul astfel pregătit serveşte doar pentru un ciclu. Ulterior anionitul se regenerează cu soluţie de acid clorhidric de 5% timp de cîteva ore, apoi se spală cu apă pînă la înlăturarea clorurilor (filtratul se verifică la prezenţa clorurilor, cu soluţie de AgNO₃ de 1%).

4.2. Pregătirea probei

Se diluează de 5 ori 10 ml de vin – pînă la 50 ml. Pentru vinul colorat intens, se efectuează în prealabil decolorarea cu polivinilpirolidon (PVPP): se introduc 10 ml de vin într-un balon cotat de 50 ml, se diluează cu 20 ml de apă apoi se adaugă 300 mg de PVPP, agitînd periodic timp de 20 minute; se aduce la cotă apoi se filtrează printr-un filtru din hîrtie plisat.

Se prelevează 10 ml de vin diluat (tratat sau nu cu PVPP) şi se introduc în coloana de anionit. Vinul se trece prin coloană cu un debit ce nu depăşeşte 2 ml pe minută. Cînd nivelul vinului diluat atinge 5-10 mm deasupra tamponului din vată de sticlă, se adaugă apă distilată decarboxilată şi se lasă să treacă prin coloană cu un debit de 2-3 ml pe minută pînă ce volumul eluatului atinge 100 ml.

Este necesar de a verifica absenţa zaharurilor în eluat. Pentru aceasta, 5 ml de eluat se aduce rapid la fierbere cu 5 ml soluţie cupro-alcalină. Lipsa precipitatului şi a culorii atestă lipsa zaharurilor în soluţie.

4.3. Determinarea glicerolului.

4.3.1. Determinarea fotometrică

Într-un balon conic de 100 ml cu dop rodat se introduc 10 ml de eluat şi se adaugă succesiv 10 ml de apă distilată, apoi 10 ml de soluţie 0,05 M de acid periodic. Se agită atent şi se lasă pentru exact 5 minute să se oxideze, apoi se adaugă 10 ml soluţie de hidroxid de sodiu 1M şi 5 ml de alcool rectificat (96% vol.). Se agită după adăugarea fiecărui reagent, apoi se adaugă 10 ml soluţie de floroglucină. Se agită rapid şi se tranvazează soluţia în cuva spectrofotometrică cu drumul optic de 1 cm.

Culoarea violetă obţinută variază rapid, intensitatea culorii trece prin maximum la 50-60 secunde, apoi scade. Se notează valoarea maximă a absorbanţei, măsurată la 480 nm în raport cu aerul.

4.3.2. Trasarea curbei de etalonare

În baloane cotate de 100 ml se iau respectiv 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 şi 8,0 ml soluţie etalon de glicerol, se aduce la cotă cu apă distilată. Soluţiile corespund, conform condiţiilor descrise în punctul 4.2., concentraţiilor următoare: 3,75, 5,00, 6,25, 7,50, 8,75 şi 10,00 g/l de glicerol.

Se efectuează măsurările, conform punctului 4.3.1., înlocuind de fiecare dată eluatul cu soluţia etalon respectivă. Dreapta de etalonare nu trece prin origine.

4.4. Determinarea butan-2,3-diolului

4.4.1. Determinarea fotometrică

Într-un balon conic de 100 ml cu dop rodat se introduc 20 ml de eluat şi se adaugă succesiv 5 ml de soluţie de acetat de sodiu şi apoi 5 ml de soluţie 0,1M de acid periodic.

Se agită minuţios şi se lasă pentru exact 2 minute să se oxideze, apoi se adaugă 5 ml soluţie de nitroprusiat de sodiu şi 5 ml soluţie de piperidină. Se agită şi rapid se tranvazează soluţia în cuva spectrofotometrică cu traseul optic de 1 cm.

Culoarea violetă obţinută variază foarte rapid. Intensitatea culorii trece prin maximum la 30-40 secunde, apoi scade. Se notează valoarea maximă a absorbanţei, măsurată la 570 nm în raport cu aerul.

4.4.2. Trasarea curbei de etalonare

Într-un balon cotat de 100 ml se iau 10 ml soluţie etalon de butan – 2,3-diol şi se aduce la cotă cu apă distilată. Din această soluţie se prepară soluţii etalon, introducînd în baloane cotate de 100 ml respectiv: 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 şi 10,0 ml din soluţia pregătită. Se aduce la cota cu apă distilată.

Aceste soluţii corespund, conform condiţiilor descrise în punctul 4.2., concentraţiilor următoare: 0,25, 0,50, 0,75, 1,00 şi 1,25 g/l de butan-2,3-diol.

Se efectuează măsurările absorbanţei conform condiţiilor descrise în punctul 4.4.1., înlocuind eluatul de fiecare dată cu soluţia etalon respectivă. Curba de etalonare nu trece prin origine.

5. Calculul şi exprimarea rezultatelor

Valoarea conţinutului de glicerol şi butan-2,3-diol se determină din curbele de etalonare. Rezultatul se exprimă în grame pe litru (g/l) cu o zecimală pentru glicerol şi cu două zecimale pentru butan-2,3-diol.

6. Titrarea periodimetrică a glicerolului şi butan-2,3-diolului

6.1. Reactivi

Soluţii:

hidroxid de sodiu 1 M;

acid sulfuric 0,5 M;

acid periodic 0,025 M;

hidrogenocarbonat de sodiu NaHCO₃ de 8% (m/v);

arsenit de sodiu 0,025 M: într-un balon cotat de 1000 ml se dizolvă 2,473 g de anhidridă arsenoasă (As₂O₃) cu 30 ml de hidroxid de sodiu 1 M, se adaugă 35 ml de acid sulfuric 0,5 M şi se aduce la cotă cu apă distilată;

iod, 0,025 M;

iodură de potasiu, 10% (m/v);

amidon, 2% (m/v).

6.2. Modul de lucru.

Într-un balon conic de 300 ml se plasează 5 ml din soluţia probei de glicerol şi 45 ml de apă distilată sau 25 ml din soluţia probei de butan-2,3-diol şi 25 ml de apă distilată. Apoi se adaugă 20 ml soluţie de acid periodic 0,025 M, se lasă pentru 15 minute, agitînd din timp în timp; se adaugă 10-20 ml de soluţie hidrogenocarbonat de sodiu şi 20 ml de soluţie de arsenit de sodiu. Se lasă pentru 15 minute, agitînd din timp în timp. Se adaugă 5 ml soluţie de iodură de potasiu şi 2 ml soluţie de amidon. Se titrează excesul de arsenit de sodiu cu soluţia de iod 0,025 M.

În paralel se efectuează o titrare oarbă, folosind 50 ml de apă distilată şi aceleaşi cantităţi de reagenţi.

6.3. Modul de calcul

6.3.1. Glicerolul:

1 ml de acid periodic 0,025 M oxidează 1,151 mg de glicerol. Conţinutul glicerolului în grame pe litru (g/l) în soluţiile probei de glicerol va fi:

Conţinutul în procente (%) a glicerinei:

unde:

X – volumul de soluţie de iod 0,025 M, consumat pentru titrarea soluţiei probei de glicerină, ml;

B – volumul de soluţie de iod 0,025 M, consumat pentru titrarea oarbă, ml;.

α – volumul soluţiei probei de glicerină , α = 5 ml.

6.3.2. Butan-2,3-diol

1 ml de acid periodic 0,025 M oxidează 2,253 mg de butan-2,3-diol. Conţinutul de 2,3-butandiol în grame pe litru (g/l) a soluţiei probei de 2,3-butandiol va fi:

Conţinutul în procente (%) a butan-2,3-diolului:

unde:

X′ – volumul de soluţie de iod 0,025 M, consumat, pentru titrarea soluţiei probei de butan-2,3-diol, ml;

B′ – volumul de soluţie de iod 0,025 M, consumat, pentru titrarea oarbă, ml;.

b – volumul soluţiei probei de butan-2,3-diol, b = 25 ml.

20.2 MA-F-AS 312-05-GLYENZ

1. Principiul metodei

Metoda uzuală

Glicerochinaza (GK) catalizează fosforilarea glicerol în glicerol-3-fosfat cu adenozin-5^′-trifosfat (ATP) (1):

Adenozin-5^′-difosfatul (ADP) format din nou este transformat în ATP de fosfoenol-piruvat (PEP) în prezenţa piruvat-khinazei (PK) cu formarea de piruvat (2):

Piruvatul este redus în lactat de nicodinamid adenin dinucleotid redus (NADH) în prezenţa lactat-dehidrogenazei (LDH) (3):

Cantitatea formată de NAD ⁺ în timpul reacţiei este proporţională cu cantitatea de glicerol Oxidarea NADN este măsurată prin diminuarea extincţiei la lungimea de undă 334, 340 sau 365 nm.

2. Aparate

2.1. Spectrofotometru, care permite de a efectua măsurările la lungimea de undă 340 nm, maximum de absorbţie a NADH. În lipsa spectrofotometrului se poate utiliza fotometru cu spectru discontinuu, care permite de a efectua măsurările la lungimea de undă 334 nm şi 365 nm.

2.2. Cuvă de sticlă cu grosimea stratului de 1 cm sau cuve de folosinţă unică.

2.3. Micropipete cu volum de la 0,02 pînă la 2,0 ml.

3. Reactivi

3.1. Soluţie tampon (glicilglicină 0,75 M, Mg²⁺ 10^-3M, pH-7,4): se dizolvă 10,0 g de glicilglicină şi 0,25 g sulfat de magneziu, Mg SO₄ x 7H₂ O în aproximativ 80 ml de apă bidistilată; se adaugă aproximativ 2,4 ml de hidroxid de sodiu de 5M pînă a obţine un pH = 7,4 şi se aduce la volumul de 100 ml. Această soluţie poate fi păstrată pînă la trei luni la o temperatură de +4°C.

3.2. (NADH 8,2 × 10^-3M, ATP 33 × 10^-3M, PEP 46 × 10^-3 M): se dizolvă în 6 ml de apă bidistilată 42 mg de sare redusă de nicotinamid-adenin-dinucleotid-disodic, 120 mg adenozin-5′-trifosfat – Na₂ H₂, 60 mg fosfoenolpiruvat de sodiu şi 300 mg hidrogenocarbonat de sodiu (NaHCO₃). Această soluţie poate fi păstrată 2-3 zile la o temperatură de +4°C.

3.3. Piruvat-kinază/lactat-dehidrogenază (PK/LDH) (PK 3 mg/ml, LDH 1 mg/ml). Se utilizează suspensia fără diluare. Amestecul poate fi păstrat pînă la un an la o temperatura de +4°C.

3.4. Clicerochinaza (GK 1 mg/l). Suspensia poate fi păstrată pînă la un an la o temperatură de +4°C.

Toţi reactivii necesari pentru determinarea glicerolului sînt disponibili în comerţ.

4. Pregătirea probei

Determinarea glicerolului în general se efectuează direct în vinul diluat cu apă bidistilată în aşa fel ca concentraţia glicerolului să fie între 30 şi 500 mg/l. (cantitatea de glicerol luată în probă trebuie să fie în intervalul de 3-50 ľg). Factorul de diluţie 50 (2 ml în 100 ml) în general este suficient.

5. Metoda de lucru

La spectrofotometru se selectează lungimea de undă de 340 nm. Se măsoară absorbanţa în cuve din sticlă optică cu grosimea stratului de 1 cm. Absorbanţa zero se reglează în comparaţie cu aerul.

În cuvă din sticlă cu grosimea stratului de 1 cm se iau:

Se amestecă, aproximativ după 5 minute se citeşte absorbanţa (A₁). Apoi se adaugă:

Suspensie 3.4 _________0,01 ml ___________0,01 ml

Se amestecă, se aşteaptă sfîrşitul reacţiei (aproximativ 5-10 minute) şi se citeşte absorbanţa soluţiilor (A₂). Dacă reacţia nu s-a terminat după 10 minute, se citeşte absorbanţa din două în două minute pînă nu se constată o descreştere constantă timp de 2 minute.

Se determină diferenţa absorbanţei A₂ – A₁ pentru martor (∆ A_T) şi pentru probă (∆ A_D) şi se calculează:

∆A = (∆ A_D) – (∆ A_T)

6. Exprimarea rezultatelor

Concentraţia în grame pe litru (g/l) se calculează cu formula:

unde,

V – volumul martorului în ml (aici 3,12 ml);

v – volumul probei în ml (aici 0,1 ml);

PM – greutatea moleculară a substanţei determinate (aici glicerolul = 92,1);

a – grosimea stratului cuvei (aici 1 cm);

ε – coeficientul de absorbţie al NADH ls 340 nm: ε = 6,3 (mmol ^-1 ˇ l ˇ cm ^-1).

Se obţine:

C = 0,456 × ∆A × F

unde,

F – factorul de diluare

Pentru măsurările efectuate la 334 nm:

ε = 6,2 (mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1)

C = 0,463 × ∆A × F

Pentru măsurările efectuate la 365 nm:

ε = 3,4 (mmol^-1 ˇ l ˇ cm^-1)

C = 0,845 × ∆A × F

21. Fierul

21.1. MA-MD-AS 322-05-FER

1. Principiul metodei

Metoda de referinţă

După diluarea corespunzătoare a vinului şi eliminarea alcoolului, conţinutul de fier este determinat direct prin spectrofotometria de absorbţie atomică.

Metoda uzuală

După mineralizarea vinului cu apă oxigenată, fierul, aflat în stare de Fe (III) se reduce pînă la Fe (II) şi este determinat prin coloraţia roşie în prezenţa ortofenantrolinei.

2. Metoda de referinţă

2.1. Aparatura:

evaporator rotativ, cu baie de apă termostatată;

spectrometru de absorbţie atomică, înzestrat cu arzător aer-acetilenă;

lampă catodică pentru fier.

2.2. Reactivi:

soluţie standard concentrată de fier (III), 1 g/l. Se utilizează soluţie standard (1 g/l) din comerţ. Această soluţie poate fi preparată prin dizolvarea a 8,6341 g de sulfat de fier (III) şi amoniu [FeNH₄(SO₄)₂ × 12H ₂O] în apă distilată, acidifiată uşor cu acid clorhidric de 1M, şi completînd volumul pînă la 1 litru;

soluţie standard de fier diluată, 100 mg/l.

2.3. Metoda de lucru

2.3.1. Pregătirea probei

Se elimină alcoolul din vin prin concentrarea probei la jumătate din volumul iniţial, utilizînd un evaporator rotativ la o temperatură de (50-60)°C. Se readuce pînă la volumul iniţial cu apă distilată. Dacă este cazul, se diluează înainte de determinare.

2.3.2. Calibrarea

În 5 baloane cotate de 100 ml se iau 1, 2, 3, 4 şi 5 ml soluţie de fier de 100 mg/l şi se aduce pînă la 100 ml cu apă distilată. Soluţiile preparate conţin respectiv 1, 2, 3, 4 şi 5 miligrame de fier pe litru. Soluţiile preparate se păstrează în flacoane de polietilenă.

2.3.3. Modul de operare

Se selectează lungimea de undă 248,3 nm. Se reglează pe scara absorbanţei valoarea zero cu apă distilată. Se aspiră proba diluată direct în arzătorul spectrofotometrului, urmată succesiv de cele cinci soluţii standard. Se citesc valorile absorbanţei. Măsurările se efectuează în două repetări.

2.4. Exprimarea rezultatelor

2.4.1. Modul de calcul

Se trasează curba de calibrare – absorbanţa în funcţie de concentraţia de fier în soluţiile standard. Se raportează pe această curbă valoarea medie a absorbanţei vinului diluat şi se determină concentraţia de fier C.

Concentraţia de fier în miligrame pe litru (mg /l) în vin se calculează pînă la zecimale cu formula:

F × C,

unde,

F – factorul de diluare.

22. Cuprul

22.1. MA-MD-AS 322-06-CUIVRE

1. Principiul metodei

Metoda se bazează pe utilizarea spectrofotometriei de absorbţie atomică.

2. Aparatura:

capsulă de platină;

spectrofotometru de absorbţie atomică;

lampă catodică pentru cupru;

surse de gaz: aer-acetilenă sau oxid azot-acetilenă.

3. Reactivi:

cupru metalic;

acid azotic, concentrat, 65%, HNO₃, (ρ₂₀ = 1,38 g/ml);

acid azotic diluat 1:2 (v/v).

Soluţie de cupru, 1 g/l.

Se utilizează o soluţie standard de cupru. Această soluţie poate fi preparată prin cîntărirea a 1,000 g cupru metalic şi transferarea, fără pierderi, într-un balon cotat de 1000 ml. Se adaugă acid azotic diluat 1:2 în cantitate suficientă pentru dizolvarea metalului, 10 ml acid azotic concentrat şi se completează pînă la cotă cu apă bidistilată.

Soluţie de cupru, 100 mg/l.

Se introduc 10 ml de soluţie de cupru de 1 g/l într-un balon cotat de 100 ml şi se completează pînă la cotă cu apă bidistilată.

4. Metoda de lucru

4.1. Pregătirea probei şi determinarea cuprului

Dacă este necesar, se prepară soluţii diluate corespunzător, utilizînd apă bidistilată.

4.2. Calibrarea

Se pipetează 0,5; 1,0 şi 2,0 ml de soluţie de cupru 100 mg/l, în baloane cotate de 100 ml şi se completează volumul cu apă bidistilată; soluţiile astfel obţinute conţin cupru 0,5, 1,0 şi 2,0 mg/l.

4.3. Măsurările

Se măsoară absorbţia la 324,8 nm. Se reglează valoarea zero cu apă bidistilată. Se măsoară direct absorbţia soluţiilor standard. Se execută două determinări pentru fiecare soluţie.

5. Exprimarea rezultatelor

Metoda de calcul

Se trasează un grafic al variaţiilor absorbţiei în funcţie de concentraţiile de cupru în soluţiile standard.

Se raportează pe această curbă valoarea medie a absorbanţei vinului diluat şi se determină concentraţia de cupru C.

Concentraţia de cupru în miligrame pe litru (mg /l) în vin se calculează cu două zecimale cu formula:

F × C,

unde,

F – factorul de diluare.

Soluţiile pentru trasarea curbei de calibrare şi factorul de diluţie a probei se aleg în funcţie de sensibilitatea aparatului utilizat şi concentraţia cuprului în probă.

Cînd concentraţia de cupru în proba analizată este foarte scăzută, modul de operare este următorul: se pun 100 ml de probă într-o capsulă de platină şi se evaporează într-o baie de apă la 100°C pînă la consistenţă siropoasă; se adaugă 2,5 ml de acid azotic concentrat, picătură cu picătură, pînă cînd se acoperă complet fundul capsulei. Se arde cu grijă reziduul pe o placă cu încălzire electrică sau la o flacără mică; apoi capsula se pune într-o sobă de mufel, setată la o temperatură de 500 ± 25°C şi se lasă aproximativ o oră. După răcire, cenuşa se umezeşte cu 1 ml de acid azotic concentrat, se amestecă cu un mojar de sticlă; se evaporă şi se incinerează din nou, cum e indicat mai sus. Se pune din nou capsula în soba de mufel pe 15 minute, se repetă tratamentul cu acid azotic concentrat cel puţin de trei ori. Se dizolvă cenuşa prin adăugarea în capsulă a 1 ml de acid azotic concentrat şi 2 ml de apă bidistilată, apoi se transferă într-un balon cotat de 10 ml. Se spală capsula de trei ori, utilizînd de fiecare dată 2 ml de apă bidistilată, se completează pînă la cotă cu apă bidistilată.

23. Zincul

23.1. MA-MD-AS 322-08-ZINCUL

1. Principiul metodei

După înlăturarea alcoolului, zincul se determină direct în vin prin spectrofotometria de absorbţie atomică.

2. Reactivi:

apa utilizată pentru analize trebuie să fie bidistilată în aparate din sticlă borosilicat sau cu un grad echivalent de puritate;

soluţie standard de zinc, 1 g/l: se utilizează o soluţie de zinc standard din comerţ. Această soluţie poate fi preparată dizolvînd 4,3975 g de sulfat de zinc (ZnSO₄ × 7H₂O) în apă şi completînd volumul pînă la un litru;

soluţie standard de zinc diluată, 100 mg/ l.

3. Aparatura:

evaporator rotativ cu baie de apă reglată termostatic;

spectrometru de absorbţie atomică, echipat cu arzător aer-acetilenă;

lampă catodică pentru zinc.

4. Metoda de lucru

4.1. Pregătirea probei

Se înlătură alcoolul din 100 ml de vin prin reducerea volumului probei la jumătate din volumul iniţial, utilizînd un evaporator rotativ la o temperatură de (50-60)°C. Se completează volumul iniţial de 100 ml cu apă bidistilată.

4.2. Calibrarea

În 4 baloane cotate de 100 ml se iau 0,5, 1,0, 1,5 şi 2,0 ml de soluţie de zinc de 100 mg/ l şi se completează pînă la cotă cu apă bidistilată. Soluţiile preparate conţin 0,5, 1,0, 1,5 şi 2,0 mg de zinc pe litru.

4.3. Modul de operare

Se reglează lungimea de undă la 213,9 nm. Se reglează absorbţia la zero, utilizînd apă bidistilată. Se aspiră vinul direct în arzătorul spectrofotometrului, urmat succesiv de cele patru soluţii standard. Se citesc valorile absorbţiei. Se repetă fiecare măsurare.

5. Exprimarea rezultatelor

5.1. Metoda de calcul

Se trasează graficul variaţiei absorbţiei în funcţie de concentraţia de zinc din soluţiile standard. Se raportează pe grafic valoarea medie a absorbţiei obţinută cu proba de vin diluat şi se determină concentraţia de zinc în miligrame pe litru (mg/l) cu precizie de o zecimală.

24. Cadmiul

24.1. MA-MD-AS 322-10-CADMIU

1. Principiul metodei

Cadmiul se determină direct în vin prin spectrofotometrie de absorbţie atomică fără flacără.

2. Aparatura

spectrofotometru de absorbţie atomică, înzestrat cu un cuptor de grafit, corector de linie de bază şi multipotenţiometru;

lampă cu catod tubular pentru cadmiu;

micropipete de 5 ľl, dotate cu un vîrf special pentru determinarea prin metoda absorbţiei atomice.

Toată aparatura din sticlă, înainte de utilizare, trebuie spălată în acid azotic concentrat, încălzit la o temperatură de 70-80°C, şi clătită cu apă bidistilată.

2. Reactivi:

apa utilizată trebuie să fie bidistilată în aparat din sticlă borosilicată sau apă de puritate echivalentă. Toţi reactivii trebuie să aibă calitatea analitică pură şi, în special, să nu conţină cadmiu;

acid fosforic 85% (ρ₂₀ = 1,71 g/ml);

soluţie de acid fosforic, obţinută prin diluarea a 8 ml de acid fosforic cu apă, pînă la 100 ml;

soluţie de sare disodică a acidului etilendiaminotetra-acetic (EDTA) de 0,02 M;

soluţie tampon pH 9: într-un balon cotat de 100 ml, se dizolvă 5,4 g clorură de amoniu în cîţiva mililitri de apă, se adaugă 35 ml de soluţie de hidroxid de amoniu (ρ₂₀ = 0,92 g/ml) diluată la 25% (v/v) şi se aduce la semn cu apă;

eriocrom negru T: 1% (m/m) soluţie solidă în clorură de sodiu;

sulfat de cadmiu (3CdSO₄ × 8H₂O). Titrul sulfatului de cadmiu trebuie verificat în felul următor: se cîntăresc exact 102,6 mg de probă de sulfat de cadmiu, se trec cantitativ într-un vas cilindric cu puţină apă, se agită pînă la dizolvare; se adaugă 5 ml de soluţie tampon pH 9 şi aproximativ 20 mg de eriocrom negru T. Se titrează cu soluţia de EDTA pînă cînd indicatorul începe să vireze în albastru.

Volumul de EDTA adăugat trebuie să fie de 20 ml. Dacă volumul este puţin diferit, se corectează în mod corespunzător cantitatea sulfatului de cadmiu, utilizat pentru prepararea soluţiei de referinţă;

soluţie de referinţă de cadmiu, 1 g/l. Se utilizează o soluţie standard din comerţ. Această soluţie poate fi obţinută prin dizolvarea a 2,2820 g de sulfat de cadmiu în apă şi completarea pînă la un litru. Soluţia se păstrează într-un recipient de sticlă borosilicată cu dop rodat.

4. Metoda de lucru

4.1. Pregătirea probei

Se diluează vinul 1:2 (v/v) cu soluţie de acid fosforic.

4.2. Prepararea soluţiilor pentru domeniul de calibrare

Utilizînd soluţie de referinţă de cadmiu, se prepară prin diluare succesivă a soluţiilor cu concentraţia de 2,5; 5,0; 10 şi 15 ľg de cadmiu pe litru.

4.3. Determinarea

4.3.1. Program pentru cuptor (doar cu caracter informativ):

La finalul analizei se ridică temperatura la 2700°C pentru curăţirea cuptorului.

4.3.2. Determinarea prin spectrofotometrie de absorbţie atomică

Se selectează lungimea de undă 228,8 nm. Se reglează valoarea zero pe scara absorbanţiei cu apă bidistilată. Cu micropipeta se aspiră în cuptor trei alicote de 5 ľl din fiecare soluţie din domeniul de calibrare şi din soluţia de analizat. Se înregistrează valorile absorbanţei. Se calculează valoarea medie a absorbanţei din rezultatele celor trei alicote.

5. Exprimarea rezultatelor

5.1. Mod de calcul

Se trasează curba de etalonare – absorbanţa în funcţie de concentraţia de cadmiu din soluţiile din domeniul de calibrare. Variaţia este liniară. Se raportează pe curba de etalonare valoarea medie a absorbanţei soluţiei probei şi se citeşte concentraţia de cadmiu C.

Concentraţia de cadmiu, exprimată în micrograme pe litru de vin, este egală cu:

2 × C.

25. Plumbul

25.1. MA-MD-AS 322-11-PLOMB

1. Principiul metodei

Plumbul este determinat direct în vin, utilizînd spectrofotometria de absorbţie atomică fără flacără.

2. Aparatura:

spectrofotometru de absorbţie atomică, echipat cu cuptor de grafit, corector de absorbţie nespecifică şi un multi-potenţiometru;

lampă catodică pentru plumb;

micropipete de 5 ľl, dotate cu un vîrf special pentru determinarea absorbţiei atomice.

Toată aparatura de sticlă trebuie spălată înaintea utilizării cu acid azotic concentrat încălzit la 70-80°C şi clătită cu apă bidistilată.

3. Reactivi:

acid fosforic 85% (ρ₂₀ = 1,71 g/ml);

soluţie de acid fosforic, obţinută prin diluarea a 8 ml de acid fosforic cu apă, pînă la 100 ml;

acid azotic (ρ₂₀ = 1,38 g/ml);

soluţie standard de plumb 1 g/l. Se utilizează o soluţie standard în comerţ. Această soluţie poate fi obţinută prin dizolvarea a 1,600 g de nitrat de plumb (II), Pb(NO₃)₂ în acid azotic de 1% (v/v) şi completată pînă la un litru. Soluţia se păstrează într-un flacon de sticlă borosilicat, cu dop de sticlă şlefuit.

Apa utilizată trebuie să fie bidistilată în aparat din sticlă borosilicată sau apă de puritate echivalentă. Toţi reactivii trebuie să aibă calitatea analitică pură şi, în special, să nu conţină plumb.

4. Metoda de lucru

4.1. Pregătirea probei

Se diluează vinul 1:2 sau 1:3 cu soluţie de acid fosforic, în funcţie de concentraţia de plumb presupusă.

4.2. Prepararea soluţiilor pentru calibrare

Utilizînd soluţia standard de plumb, se pregătesc prin diluarea succesivă cu apă bidistilată, soluţii cu concentraţia de 2,5, 5,0, 10,0 şi 15,0 ľg plumb la litru,

4.3. Determinarea

4.3.1. Program pentru cuptor (doar cu caracter informativ):

La finalul analizei se ridică temperatura la 2700°C pentru curăţarea cuptorului.

4.3.2. Determinări

Se reglează lungimea de undă la 217 nm. Se reglează scala absorbţiei la zero cu apă bidistilată. Utilizînd o micropipetă, se introduc în cuptor trei alicote de 5 ľl de fiecare soluţie de calibrare şi de soluţie probă. Se înregistrează valorile absorbţiei. Se calculează valoarea medie a absorbţiei din rezultatele pentru cele trei alicote.

5. Exprimarea rezultatelor

5.1. Metoda de calcul

Se trasează curba variaţiei absorbţiei în funcţie de concentraţiile de plumb în intervalul de calibrare. Variaţia este liniară. Se plasează valoarea medie a absorbţiei soluţiei probă, pe curba de calibrare, derivînd din aceasta concentraţia de plumb C. Concentraţia de plumb, exprimată în micrograme pe litru de vin, este egală cu:

C × F,

unde,

F – factorul de diluare.

26. Arseniul

26.1 MA-MD-AS 323-01-ASSAA

1. Principiul metodei

După evaporarea alcoolului etilic şi reducerea arseniului V în arseniu III, arseniul din vin se transformă în hidrură şi se determină prin spectrofotometrie de absorbţie atomică.

2. Aparatura

Veselă:

- baloane cotate de 50, 100 ml;

- pipete gradate de 1, 5, 10 şi 25 ml.

Baie de apă la o temperatură de 100°C.

Filtre fără cenuşă.

Spectrofotometru de absorbţie atomică cu parametrii:

arzător aer-acetilenă;

lampă cu catod tubular pentru arseniu;

corecţia absorbţiei nespecifice cu lampă de deuterium.

2.5. Accesorii:

celulă de absorbţie, plasată pe arzător aer-acetilenă;

generator de vapori (separator gaz-lichid);

gaz neutru (argon);

generator de hidrură (figura 3).

3. Reactivi:

apă demineralizată, ultrapură;

acid azotic, 65%, ultrapur;

iodură de potasiu;

iodură de potasiu, 10% (m/v);

acid clorhidric concentrat;

acid clorhidric, 10%;

borohidrură de sodiu;

hidroxid de sodiu;

borhidrură de sodiu, 0,6% (conţinutul de hidroxid de sodiu 0,5% (m/v);

clorură de calciu (se utilizează ca deshidratant);

soluţie de arseniu pur, 1 g/l: se dizolvă 1,5339g de As₂O₅ într-un balon cotat de 1000 ml şi se aduce la semn cu apă demineralizată;

soluţie de arseniu de 10 mg/l: se ia 1 ml de soluţie de arseniu pur (1 g/l) într-un balon cotat de 100 ml; se adaugă 1% de acid azotic, se aduce la semn cu apă demineralizată;

soluţie etalon de arseniu de 100 ľg/l: se ia 1 ml de soluţie de arseniu de (10 mg/l) într-un balon cotat de 100 ml şi se aduce la semn cu apă demineralizată;

soluţie pentru etalonare: 0; 5; 10 şi 25 ľg/l: se iau succesiv 0, 5, 10 şi 25 ml soluţie de arseniu de 100 ľg/l în patru baloane cotate de 100 ml, se adaugă în fiecare balon 10 ml iodură de potasiu de 10% şi 10 ml de acid clorhidric concentrat, se lasă în repaus timp de 1 oră, se aduce la semn cu apă demineralizată.

Figura 3. Generator de hidrură

4. Pregătirea probei

25 ml de vin se evaporă pe baie de apă la o temperatură de 100°C şi se aduce la 50 ml în prezenţa a 5 ml iodură de potasiu de 10% şi 5 ml acid clorhidric concentrat, se lasă în repaus timp de 1 oră; se filtrează printr-un filtru fără cenuşă.

Paralel se pregăteşte o soluţie martor.

5. Măsurarea

Pompa peristaltică aspiră soluţia de borhidrură, soluţia de acid clorhidric de 10% şi etalonul sau proba.

Succesiv se aspiră soluţiile pentru etalonare, se citeşte absorbanţa timp de 10 secunde.

Se efectuează două repetări; se trasează curba de etalonare (absorbanţa în funcţie de concentraţia de arseniu în ľg/l ).

Se aspiră probele conform punctului 4, se determină concentraţia de arseniu în probe în ľg/l, se calculează concentraţia de arseniu în probe, luînd în considerare factorul de diluare 1:2.

27. Mercurul

27.1 MA-MD-AS 323-06-MERCUR

1. Domeniul de aplicare

Metoda se aplică pentru determinarea mercurului în vin cu concentraţia de 0-10 ľg/l

2. Descrierea metodei

2.1. Principiul metodei

Mineralizarea vinului se efectuează în mediu acid, prin încălzire în flux de argon şi se finalizează cu adăugarea de permanganat de potasiu; reducerea permanganatului de caliu în exces se efectuează cu clorghidrat-hidroxilamină; reducerea mercurului II pînă la mercur metalic – cu clorură de staniu II; antrenarea mercurului cu un curent de argon, la temperatura mediului ambiant.

Determinarea mercurului în stare de vapori monoatomici prin spectrofotometrie de fluorescenţă atomică, la lungimea de undă de 254 nm: atomii de mercur sînt excitaţi de o lampă de vapori de mercur; atomii astfel excitaţi emit o radiaţie fluorescentă, care permite determinarea mercurului cu ajutorul unui detector fotonic, situat sub un unghi de 90° în raport cu fluxul de excitare; determinarea prin metoda de fluorescenţă atomică permite de a obţine o linearitate suficientă şi exclude efectul de memorie.

2.2. Schema analizei ( figura 4)

Pompa perestaltică aspiră soluţia de clorură de staniu II, soluţia de referinţă (apă demineralizată ce conţine 1% de acid azotic) şi etalonul sau proba de vin mineralizată.

Mercurul metalic este trecut printr-un separator gaz-lichid cu ajutorul unui curent de argon. După deplasarea printr-o capsulă a unui uscător, mercurul se determină prin fluorescenţă. Apoi, pentru a antrena mercurul, curentul gazos se trece printr-o soluţie de permanganat de potasiu.

3. Reactivi:

apă demineralizată ultrapură;

acid azotic 65%, ultrapur;

blanc: apă demineralizată cu conţinut de acid azotic de 1%;

soluţie de acid azotic, 5,6 M: într-un balon cotat de 1000 ml se iau 400 ml acid azotic ultra-pur şi se completează cu apă demineralizată ;

acid sulfuric (ρ₂₀ = 1,84 g/ml);

soluţie de acid sulfuric, 9M: într-un balon cotat de 1000 ml se iau 200 ml apă demineralizată, apoi 500 ml acid sulfuric concentrat, după răcire se completează cu apă demineralizată;

permanganat de potasiu KMnO₄;

soluţie de permanganat de potasiu 5% (m/v): într-un balon cotat de 1000 ml se dizolvă în apă demineralizată 50g de permanganat de potasiu. Volumul se completează cu apă demineralizată;

clorhidrat de hidroxilamină NH₂OH, HCl;

soluţie reducătoare: se dizolvă 12 g clorhidrat de hidroxilamină în 100 ml apă demineralizată;

clorură de staniu II (SnCl₂ × 2H₂O);

acid clorhidric concentrat;

soluţie de clorură de staniu II: se dizolvă 40 g clorură de staniu II în 50 ml de acid clornidric concentrat şi se completează cu apă demineralizată;

soluţie de mercur pur, 1 g/l: se prepară dizolvînd într-un balon cotat de 1000 ml a 1,708 g de Hg(NO₃)₂ × H₂O în soluţie de acid azotic de 12%;

soluţie-etalon de mercur de 10 mg/l: într-un balon cotat de 100 ml se ia 1 ml soluţie de mercur pur, se adaugă 5 ml de acid azotic, se completează volumul cu apă demineralizată;

soluţie de mercur de 50 ľg/l: într-un balon cotat de 200 ml se ia 1 ml soluţie de mercur de 10 mg/l, se adaugă 2 ml acid azotic, se completează volumul cu apă demineralizată.

Figura 4. Schema analitică pentru determinarea mercurului

4. Echipament

4.1. Veselă:

baloane 100, 200 şi 1000 ml;

pipete gradate de 0,5, 1, 2, 5, 10 şi 20 ml.

Înainte de utilizare, vesela trebuie să fie spălată cu acid azotic de 10%, lăsată în contact pentru 24 de ore, apoi spălată cu apă demineralizată;

aparat pentru mineralizare (figura 5);

balon pentru încălzire cu temperatură controlată;

pompă peristaltică;

generator de abur rece cu separator gazolichid;

desicant: membrană hidroscopică traversată de un curent de aer de la un compresor, şi plasată înainte de detector;

spectrofluorimetru:

lampă de vapori de mercur, reglată la lungimea de undă de 254 nm;

detector specific de fluorescenţă atomică;

microcalculator: reglarea logică a parametrilor generatorului de vapori şi a detectorului de fluorescenţă atomică, calibrarea şi operarea rezultatelor;

imprimantă pentru arhivarea rezultatelor;

butelie cu gaz inert (argon).

5. Prepararea probelor şi trasarea curbei de calibrare

5.1. Curba de etalonare: 0, 0,25, 0,5 şi 1,0 mg/l

În 4 baloane de 100 ml se iau 0, 0,5, 1,0 şi 2,0 ml soluţie de mercur de 50 mg/l, se adaugă 1% de acid azotic, se completează cu apă demineralizată.

5.2. Pregătirea probelor (figura 5)

Vinul se mineralizează într-un aparat de sticlă Pyrex, format din trei elemente unite între ele prin rodaj sferic: un balon cu fund rotund de 250 ml, o cameră de recuperare a vaporilor şi un agent frigorific.

Se iau cu pipeta 20 ml de vin în balonul de reacţie de 250 ml şi se asamblează la aparatul de mineralizare. Se adaugă foarte încet 5 ml de acid sulfuric şi 10 ml de acid azotic, se lasă pe noapte.

Se încălzeşte încet, pînă la dispariţia vaporilor de azot, se lasă să se răcească. Se recuperează vaporii condensaţi în balonul de reacţie. Se clăteşte aparatul cu apă demineralizată. Se transferă conţinutul balonului de reacţie într-un balon cotat de 100 ml. Se adaugă soluţie de permanganat de potasiu pînă la o culoare persistentă.

Se dizolvă precipitatul (MnO₂) cu soluţie de reducere. Se completează cu apă demineralizată.

Se prepară o probă blanc cu apă demineralizată.

6. Metoda de lucru

6.1. Determinarea analitică

Se conectează fluorometerul: aparatul se stabilizează în timp de 15 minute. Cu pompa peristaltica se aspiră proba martor, soluţia de clorură de staniu II şi soluţiile etalon sau probele.

Se verifică dacă apare barbotarea în separatorul gaz lichid. Se introduc succesiv soluţiile de calibrare, se declanşează programa generatorului de vapori. Software-ul de la calculator stabileşte curba de etalonare (procentul de fluorescenţă, în funcţie de concentraţia de mercur în ľg / l). Apoi se introduc probele.

6.2. Autocontrolul

Toate cele cinci determinări, martorul şi standardele sînt analizate pentru a corecta o posibilă derivă a spectrofluorimetrului.

7. Exprimarea rezultatelor

Rezultatele sînt date de programele calculatorului şi exprimate în micrograme pe litru (ľg/l). Concentraţia de mercur în vin se exprimă în ľg/l , luînd în considerare diluarea 1:5.

Figura 5. Aparat pentru mineralizarea vinului

28. Sodiul

28.1 MA-MD-AS 322-03-SODIUM

1. Principiul metodelor

1.1. Metoda de referinţă: spectrofotometrie de absorbţie atomică

Sodiul se determină direct în vin prin spectrfotometrie de absorbţie atomică după adăugarea soluţiei tampon de clorură de ceziu pentru evitarea ionizării sodiului.

1.2. Metoda uzuală: fotometrie cu flacără

Sodiul se determină prin fotometrie cu flacără direct în vinul diluat nu mai puţin de 10 ori.

2. Metoda de referinţă

2.1. Aparate:

spectrofotometru de absorbţie atomică înzestrat cu arzător cu flacără aer-acetilenă;

lampă cu catod tubular pentru sodiu.

2.2. Reactivi

Soluţie de sodiu cu concentraţia 1 g/l.

Se utilizează soluţie standard de sodiu de 1 g/l din comerţ. Această soluţie se poate prepara dizolvînd 2,542 g clorură de sodiu uscată (Na Cl) într-un litru apă distilată.

Soluţia se păstrează în flacon de polietilenă.

Soluţie model:

Soluţie de clorură de ceziu 5% (recalculat în ceziu)

Se dizolvă 6,330 g clorură de ceziu (CsCl) în 100 ml apă distilată.

2.3. Metoda de lucru

2.3.1. Pregătirea probei.

Într-un balon cotat de 50 ml se iau 2,5 ml de vin, 1 ml soluţie clorură de ceziu şi se aduce la cotă cu apă distilată.

2.3.2.Calibrarea

Într-o serie de baloane cotate cu capacitatea de 100 ml se iau 5 ml soluţie model şi se adaugă 0, 2,5, 5,0, 7,5, 10,0 ml soluţie de sodiu cu concentraţia de 1 g/l în prealabil diluată 1:100. În toate baloanele se adaugă cîte 2 ml soluţie de clorură de ceziu şi se aduce volumul pînă la 100 ml cu apă distilată.

Soluţiile etalon preparate conţin respectiv 0, 0,25, 0,50, 0,75 şi 1,00 mg sodiu şi 1 g ceziu la litru. Aceste soluţii se păstrează în flacoane de polietilenă.

2.3.3. Determinarea.

Se selectează lungimea de undă de 589 nm. Pe scara absorbanţei se reglează zero cu soluţia model cu conţinutul în ceziu de 1 g/l. Se aspiră direct în arzătorul spectrofotometrului vinul diluat, apoi succesiv soluţiile etalon. Se notează absorbanţa. Determinările se repetă de două ori.

2.4. Exprimarea rezultatelor

2.4.1. Calculul

Se trasează curba de etalonare a variaţiei absorbanţei în funcţie de concentraţia de sodiu a soluţiilor etalon.

Se raportează la această curbă valoarea medie a absorbanţei obţinute pentru probă şi se determină concentraţia de sodiu C în miligrame pe litru (mg/l).

Concentraţia de sodiu exprimată în miligrame la litru de vin, fără zecimale, va fi:

20 × C

2.4.2. Repetabilitatea (r)

r = 1 + 0,024 × X_i ,

unde,

X _i – concentraţia sodiului în probă, mg/l.

2.4.3. Reproductibilitatea (R)

R = 2,5 + 0,05 × X_i ,

unde,

X_i – concentraţia sodiului în probă, mg/l.

3. Metoda uzuală

3.1. Aparate

fotometru cu flacără alimentat cu un amestec aer-butan.

3.2. Reactivi:

3.2.1. Soluţie etalon de sodiu, 20 g/l

Pentru prepararea soluţiilor 3.2.1. şi 3.2.2. se dizolvă tartratul acid de potasiu în aproximativ 500 ml de apă distilată fierbinte, se amestecă soluţia cu restul componenţilor dizolvaţi în prealabil în 400 ml apă distilată şi se aduce la volumul de 1 l.

La aceste soluţii se adaugă сîte 2 picături de izotiocianat de alil şi se păstrează în flacoane de polietilenă.

3.3. Metoda de lucru

3.3.1. Etalonarea

În 5 baloane cotate cu capacitatea de 100 ml se iau 5, 10, 15, 20 şi 25 ml soluţie de sodiu de 20 mg/l, se aduc la semn cu soluţie de diluare. În aşa fel se obţin soluţii cu conţinutul de sodiu, respectiv 1, 2, 3, 4 şi 5 mg de sodiu la litru.

3.3.2. Determinarea

Măsurările se efectuează la lungimea de undă de 589,0 nm. Se reglează emisia spectrală de 100% cu apă distilată. Se aspiră direct în arzătorul fotometrului succesiv soluţiile-etalon, apoi vinul, diluat cu apă distilată în proporţie de 1:10, şi se măsoară procentul emisiei spectrale. Dacă este necesar, vinul se diluează în proporţie de 1:10 cu soluţie de diluare.

3.4. Exprimarea rezultatelor

3.4.1. Calculul

Se trasează curba de etalonare a variaţiei procentului emisiei spectrale, în funcţie de concentraţia de sodiu a soluţiilor etalon.

Se raportează la această curbă valoarea medie a emisiei spectrale obţinute pentru probă şi se determină concentraţia de sodiu C.

Concentraţia de sodiu, exprimată în miligrame la litru de vin (mg/l), fără zecimale, va fi:

C × F ,

unde,

F – factorul de diluare

3.4.2.1. Repetabilitatea (r)

Vinuri licoroase  ________________________r = 2,0 mg/l

Cu excepţia vinurilor licoroase _____________ r = 1,4 mg/l

3.4.3. Reproductibilitatea (R)

R = 4,7 + 0,08 × X_i ,

unde,

X_i – concentraţia sodiului în probă, mg/l.

29. Potasiul

29.1 MA-MD-AS 322-02-POTAS

1. Principiul metodelor

1.1. Metoda de referinţă: spectrofotometrie de absorbţie atomică

Conţinutul de potasiul se determină direct în vinul diluat prin spectrofotometrie de absorbţie atomică după adăugarea soluţiei tampon de clorură de ceziu pentru evitarea ionizării potasiului.

1.2. Metoda uzuală: fotometrie cu flacără

Conţinutul de potasiu se determină prin fotometrie cu flacără direct în vinul diluat în proporţie cel puţin de 1:10.

2. Metoda de referinţă

2.1. Aparate:

spectrofotometru de absorbţie atomică înzestrat cu arzător cu flacără aer-acetilenă;

lampă cu catod tubular pentru potasiu.

2.2. Reactivi:

soluţie de potasiu cu concentraţia 1 g/l;

se utilizează soluţie standard de potasiu de 1 g/l din comerţ. Această soluţie se poate prepara dizolvînd 4,813 g de tartrat acid de potasiu într-un litru apă distilată. Soluţia se păstrează în flacon de polietilenă;

soluţie model:

soluţie de clorură de ceziu 5% (recalculat în ceziu):

se dizolvă 6,330 g clorură de ceziu (CsCl) în 100 ml apă distilată.

2.3. Metoda de lucru

2.3.1. Pregătirea probei

Într-un balon cotat de 50 ml se iau 2,5 ml de vin, preventiv dilat în proporţie de 1:10, se adaugă 1 ml soluţie clorură de ceziu şi se aduce la semn cu apă distilată.

2.3.2. Calibrarea

Într-o serie de baloane cotate de 100 ml se iau 5 ml soluţie model şi se adaugă 0, 2,0, 4,0, 6,0 şi 8,0 ml soluţie de potasiu cu concentraţia de 1 g/l, în prealabil diluată în proporţie de 1:10, în toate baloanele se adaugă cîte 2 ml soluţie de clorură de ceziu şi se aduce volumul pînă la 100 ml cu apă distilată.

Soluţiile etalon preparate conţin respectiv 0, 2, 4, 6 şi 8 mg de potasiu şi 1 g de ceziu la litru. Aceste soluţii se păstrează în flacoane de polietilenă.

2.3.3. Determinarea

Se selectează lungimea de undă de 769,9 nm. Pe scara absorbanţei se reglează zero cu soluţia model cu conţinutul de ceziu de 1 g/l. Se aspiră direct vinul diluat în arzătorul spectrofotometrului, apoi succesiv soluţiile etalon. Se notează absorbanţa. Toate determinările se repetă de două ori.

2.4. Exprimarea rezultatelor

2.4.1. Calculul

Se trasează curba de etalonare a variaţiei absorbanţei în funcţie de concentraţia de potasiu a soluţiilor etalon.

Se raportează la această curbă valoarea medie a absorbanţei obţinute pentru proba diluată şi se determină concentraţia de potasiu C în miligrame la litru (mg/l).

Concentraţia de potasiu, exprimată în miligrame la litru de vin fără zecimale va fi:

F × C ,

unde,

F – factorul de diluţie (aici 200)

2.4.2. Repetabilitatea (r)

r = 35 mg/l

2.4.3. Reproductibilitatea (R)

R = 66 mg/l

2.4.4. Alte exprimări ale rezultatelor

în miliechivalenţi la litru: 0,0256 × F × C

în tartrat acid de potasiu în miliechivalenţi la litru: 4,813 × F × C

3. Metoda uzuală

3.1. Aparate:

fotometru cu flacără alimentat cu un amestec aer-butan.

3.2. Reactivi

3.2.1. Soluţie etalon de potasiu, 100 mg/l:

3.2.2. Soluţie pentru diluare:

Pentru prepararea soluţiilor 3.2.1 şi 3.2.2 tartratul acid de potasiu se dizolvă în aproximativ 500 ml de apă distilată fierbinte, se amestecă soluţia cu restul componenţilor, dizolvaţi în prealabil în 400 ml apă distilată, şi se aduce la volumul de 1 l. La aceste soluţii se adaugă cîte 2 picături de izotiocianat de etil şi se păstrează în flacoane de polietilenă.

3.3. Metoda de lucru

3.3.1. Etalonarea

În 4 baloane cotate cu capacitatea de 100 ml se iau 25, 50, 75 şi 100 ml soluţie etalon de potasiu şi se aduc la semn cu soluţie de diluare. În aşa fel se obţin soluţii cu conţinutul de potasiu respectiv 25, 50, 75, 100 mg la litru.

3.3.2. Determinarea

Măsurările se efectuează la lungimea de undă 766,0 nm. Se reglează emisia spectrală de 100% cu apă distilată. Se aspiră direct în arzătorul fotometrului succesiv soluţiile etalon, apoi vinul, diluat cu apă distilată în proporţie de 1:10 şi se măsoară procentul emisiei spectrale. Dacă este necesar, vinul de acum diluat se diluează în proporţie de 1:10 cu soluţie de diluare.

3.4. Exprimarea rezultatelor

3.4.1. Calculul

Se trasează curba de etalonare a variaţiei procentului emisiei spectrale în funcţie de concentraţia de potasiu a soluţiilor etalon.

Se raportează la această curbă valoarea medie a emisiei spectrale, obţinute pentru proba de vin diluată şi se determină concentraţia de potasiu C.

Concentraţia de potasiu, exprimată în miligrame la litru (mg/l) de vin, fără zecimale, va fi:

C × F ,

unde,

F – factorul de diluare

3.4.2. Repetabilitatea (r)

r = 17 mg/l

3.4.3. Reproductubilitatea (R)

R = 66 mg/l

3.4.4. Alte exprimări ale rezultatelor:

în miliechivalenţi la litru: 0,0256 × F × C

în tartrat acid de potasiu în miliechivalenţi la litru: 4,813 × F × C

30. Calciul

30.1 MA-MD-AS 322-04-CALCIU

1. Principiul metodei

Calciul se determină direct în vinul, diluat corespunzător, prin spectrofotometrie de absorbţie atomică, după adăugarea unei soluţii tampon specială.

2. Aparate:

spectrofotometru de absorbţie atomică, înzestrat cu arzător cu flacără aer-acetilenă;

lampă cu catod tubular pentru calciu.

3. Reactivi

3.1. Soluţie etalon de calciu cu concentraţia 1 g/l

Se utilizează soluţie standard de sodiu de 1 g/l din comerţ. Această soluţie se poate prepara dizolvînd 2,5 g carbonat de calciu (Ca CO₃), într-o cantitate suficientă pentru dizolvare de acid clorhidric diluat 1/10 (v/v) şi aducerea la volumul de 1 l cu apă distilată.

Această soluţie se păstrează în flacon de polietilenă.

3.2. Soluţie etalon de calciu diluată, 50 mg/ l

Soluţia etalon de calciu se păstrează în flacoane de polietilenă.

3.3. Soluţie de clorură de lantan, 50 g/l (recalculată în lantan)

Se dizolvă 13,369 g de clorură de lantat LaCl₃ × 7H₂O în apă distilată; se adaugă 1 ml HCl diluat 1:10 (v/v) şi se aduce la 100 ml cu apă distilată.

4. Metoda de lucru

4.1. Pregătirea probei

Într-un balon cotat cu capacitatea de 20 ml se iau 1 ml de vin, 2 ml soluţie de clorură de lantan şi se aduce la semn cu apă distilată. Vinul, diluat 1:20 conţine 5 g lantan la litru.

Pentru vinurile dulci, concentraţia de 5 g la litru de lantan este suficientă cu condiţia că după diluare conţinutul de zahar constituie cel mult 2,5 g/l. Pentru vinurile cu conţinutul de zahăr mai mare este necesar de mărit conţinutul de lantan la 10 g/l.

4.2. Calibrarea

În 5 baloane cotate cu capacitatea de 100 ml se iau 0, 5, 10, 15 şi 20 ml soluţie etalon de calciu diluată, se adaugă în toate baloanele cîte 10 ml soluţie de clorură de lantan şi se aduce la semn cu apă distilată. Soluţiile etalon preparate conţin respectiv 0, 2,5, 5,0, 7,5 şi 10,0 mg calciu şi 5 g lantan la litru. Aceste soluţii se păstrează în flacoane de polietilenă.

4.3. Determinarea

Se selectează lungimea de undă de 422,7 nm. Pe scara absorbanţei se reglează zero cu soluţia model cu conţinutul de lantan de 5 g/l. Se aspiră direct în arzătorul spectrofotometrului vinul diluat, apoi succesiv soluţiile etalon, preparate conform punctului 4.2. Se notează valorile absorbanţei. Determinările se repetă de două ori.

5. Exprimarea rezultatelor

5.1. Calculul

Se trasează curba de etalonare a variaţiei absorbanţei în funcţie de concentraţia de calciu în soluţiile etalon.

Se raportează la această curbă valoarea medie a absorbanţei obţinute pentru proba de vin diluată şi se determină concentraţia de calciu C în miligrame pe litru (mg/l).

Concentraţia de calciu exprimată în miligrame la litru de vin fără zecimale va fi:

20 × C

5.2. Repetabilitatea (r)

conţinut < 60 mg/l _______________r = 2,7 mg/l

conţinut > 60 mg/l _______________r = 4,0 mg/l

5.3. Reproductibilitatea (R)

R, mg/l = 0,114 × X_i – 0,5 ,

unde,

X_i – concentraţia de calciu în probă, mg/l.

31. Magneziul

31.1 MA-MD-AS 322-07-MAGNES

1. Principiul metodei

Magneziul se determină prin spectrofotometrie de absorbţie atomică direct în vinul diluat.

2. Aparate:

spectrofotometru de absorbţie atomică, înzestrat cu arzător cu flacără aer-acetilenă;

lampă cu catod tubular pentru magneziu.

3. Reactivi

3.1. Soluţie etalon de magneziu cu concentraţia 1 g/l.

Se utilizează soluţie etalon de magneziu de 1 g/l din comerţ. Această soluţie se poate prepara prin dizolvarea a 8,3646 g clorură de magneziu (MgCl₂ × 2H₂O) în apă distilată şi aducerea volumului la 1 l.

3.2. Soluţie etalon de magneziu, diluată, cu concentraţia 5 mg/l.

Soluţia etalon de magneziu se păstrează în flacoane de polietilenă.

4. Metoda de lucru

4.1. Pregătirea probei

Vinul se diluează în proporţie de 1:100 cu apă distilată.

4.2. Calibrarea

Într-o serie de baloane cotate cu capacitatea de 100 ml se iau 5, 10, 15 şi 20 ml soluţie 3.2. şi se aduce la semn cu apă distilată. Soluţiile etalon preparate conţin, respectiv, 0,25, 0,50, 0,75 şi 1,0 mg magneziu la litru. Aceste soluţii se păstrează în flacoane de polietilenă.

4.3. Determinarea

Se selectează lungimea de undă de 285 nm. Pe scara absorbanţei se reglează zero cu apă distilată. Se aspiră direct în arzătorul spectrofotometrului vinul diluat, apoi succesiv soluţiile etalon preparate, conform punctului 4.2. Se notează valorile absorbanţei. Determinările se repetă de două ori.

5. Exprimarea rezultatelor

5.1. Calculul

Se trasează curba de etalonare a variaţiei absorbanţei în funcţie de concentraţia de magneziu în soluţiile etalon.

Se raportează la această curbă valoarea medie a absorbanţei obţinute pentru proba de vin diluată şi se determină concentraţia de magneziu C în miligrame pe litru (mg/l).

Concentraţia de magneziu exprimată în miligrame la litru de vin va fi:

100 × C

5.2. Repetabilitatea (r) ____________r = 2,7 mg/l

5.3. Reproductibilitatea (R) ________R = 8 mg/l

32. Acetaldehidă

32.1. MA-MD-AS 315-01-ETHANA

1. Principiul metodei

Acetaldehida se determină din vinul, decolorat cu cărbune activ, datorită culorii, care variază de la verde la violet, care ea o formează cu nitropentacianoferatul (II) de sodiu şi cu piperidina. Intensitatea culorii se măsoară la 570 nm.

2. Aparatura

Spectrofotometru care permite măsurarea absorbanţei la lungimea de undă la 570 nm în cuve cu drumul optic de 1 cm.

3. Reactivi:

Soluţie de piperidină (C₅H₁₁N), 10% (v/v).

Se prepară înaintea fiecărei determinări, amestecînd 2 ml de piperidină cu 18 ml apă distilată.

Soluţie de nitropentacianoferat (II) de sodiu, 0,4% (m/v).

Într-un balon cotat de 250 ml se dizolvă 1 g de praf nitropentacianoferatul (II) de sodiu Na₂ [Fe (CN)₅ NO]×2H₂O. Se completează pînă la cota cu apă distilată.

Cărbune activ

Acid clorhidric diluat, 25% (v/v), (aproximativ 102 g/l).

Soluţie alcalină: se dizolvă 8,75 g acid boric în 400 ml soluţie de 1M de hidroxid de sodiu. Se completează pînă la 1 l cu apă distilată.

4. Metoda de lucru

4.1. Determinarea

Într-un balon conic de 100 ml se iau aproximativ 25 ml de vin, se adaugă 2 g de cărbune activ. Se amestecă timp de cîteva secunde, se lasă în repaus 2 minute, se filtrează printr-un filtru gofrat pentru a obţine un filtrat limpede.

Într-un balon conic de 100 ml se iau 2 ml de filtrat incolor, agitînd se adaugă 5 ml de nitroprusiat de sodiu şi 5 ml soluţie de piperidină, se amestecă şi imediat se trece în cuva spectrofotometrului cu drumul optic de 1 cm. Culoarea obţinută variază de la verde la violet; intensitatea culorii se măsoară în raport cu un drum echivalent de aer la lungimea de undă de 570 nm. Intensitatea culorii mai întîi repede creşte, iar apoi brusc scade. Se ia ca valoare finală a absorbanţei, valoarea maximală obţinută după aproximativ 50 secunde.

Conţinutul de acetaldehidă în lichidul analizat se citeşte de pe curba de etalonare.

În cazuri excepţionale, dacă în lichidul analizat se conţine acetaldehidă liberă e necesar de a o combina cu dioxid de sulf, înainte de determinarea acetaldehidei totale. În acest scop într-o parte de lichid de analizat se adaugă un mic surplus de dioxid de sulf şi se lasă pe cîteva ore înainte de determinare.

4.2. Trasarea curbei de etalonare

4.2.1. Soluţie etalon de bază de acetaldehidă combinată cu dioxid de sulf.

Se prepară o soluţie de 5-6% de dioxid de sulf şi i se determină concentraţia exactă titrînd cu o soluţie de iod de 0,05M.

Într-un balon cotat de 1 l se ia un volum de această soluţie, care corespunde la 1500 mg de dioxid de sulf. Se introduce în balon cu ajutorul unei pîlnii apoximativ 1 ml de acetaldehidă, proaspăt distilată şi colectată într-un amestec răcit. Volumul se completează pînă la un litru şi se lasă în repaus pe o noapte.

Conţinutul exact de acetaldehidă combinată în soluţia etalon de bază se determină în felul următor: într-un balon conic de 500 ml se iau 50 ml soluţie etalon de bază de acetaldehidă, se adaugă 20 ml acid clorhidric diluat şi 100 ml de apă. Se oxidează dioxidul de sulf liber cu soluţie de iod de 0,05 M în prezenţa amidonului pînă la apariţia culorii albastru deschis.

Se adaugă 100 ml de soluţie alcalină pînă dispare culoarea albastră. Dioxidul de sulf combinat cu acetaldehida se titrează pînă la culoarea albastru deschis cu soluţie de iod de 0,05 M. Se notează cu n mililitrii folosiţi la titrare.

Soluţia de acetaldehidă combinată cu SO₂ conţine 44,05 n mg de acetaldehidă la litru.

4.2.2. Prepararea soluţiilor etalon de acetaldehidă de diferite concentraţii

În baloane cotate de 100 ml se iau succesiv 5, 10, 15, 20 şi 25 ml de soluţie etalon de acetaldehidă. Se aduc la cotă cu apă distilată. În aceste soluţii concentraţia de acetaldehidă corespunde 40, 60, 120,160 şi 200 mg/l. Concentraţia exactă de acetaldehidă în soluţiile etalon se calculează în funcţie de concentraţia ei în soluţia etalon de bază.

Se determină conţinutul de acetaldehidă în 2 ml din fiecare soluţie, după cum e descris mai sus. Reprezentarea grafică a dependenţei absorbanţei acestor soluţii de concentraţia acetaldehidei este o dreaptă care trece prin origine.

33. 5-Hidroximetulfurfural (oximetilfurfural)

33.1 MA-MD-AS 315-05-HYDMFF

1. Principiul metodelor

1.1. Metoda colorimetrică

Aldehidele, derivate ale furanului, principala fiind 5-hidroximetilfurfuralul, reacţionează cu acidul barbituric şi p-toluidina, formînd compuşi de culoare roşie, care se determină prin colorimetrie la 550 nm.

Acidul sulfuros liber împiedică determinarea dacă conţinutul lui depăşeşte 10 mg/l de aceea este necesară eliminarea lui prin combinarea cu aldehida acetică, excesul căreia nu împiedică determinarea.

1.2. Metoda prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă

Separarea se efectuează cu coloană cu fază inversă şi se determină la 280 nm. Condiţiile de operare descrise mai jos sînt date în calitate de exemplu.

2. Metoda colorimetrică

2.1. Aparatura:

spectrofotometru, care permite măsurări între 300 şi 700 nm;

cuve de sticlă, cu drumul optic de 1 cm.

2.2. Reactivi

2.2.1. Acid barbituric, soluţie, 0,5% (m/v).

Se dizolvă 500 mg de acid barbituric C₄O₃N₂H₄ în apă distilată, încălzită pe o baie de apă la o temperatură de 100°C, se aduce la volumul de 100 ml cu apă distilată. Soluţia se poate păstra aproximativ 1 săptămînă.

2.2.2. p-toluidină, soluţie, 10% (m/v).

10 g de p-toluidină, C₆H₄ (CH₃) NH₂ sînt plasate într-un balon de 100 ml, se adaugă 50 ml izopropanol şi 10 ml de acid acetic glacial, (ρ₂₀ = 1,05 g/ml), se completează pînă la 100 ml cu izopropanol. Soluţia se prepară în fiecare zi.

2.2.3. Acetaldehidă, soluţie apoasă, 1% (m/v). Se prepară imediat înaintea analizei.

2.2.4. Soluţia de bază de 5-hidroximetilfurfural, C₆O₃H₆, 1 g/l.

Într-un balon de 1000 ml se dizolvă în apă distilată 1 g de 5-hidroximetilfurfural şi se aduce la cotă cu apă distilată.

Din soluţia de bază de 1 g/l prin diluare se prepară succesiv soluţii etalon care conţin 5, 10, 20, 30 şi 40 mg/l.

Toate soluţiile trebuie să fie proaspăt preparate.

2.3. Metoda de lucru

2.3.1. Prepararea probei

Dacă conţinutul de dioxid de sulf liber este mai mic de 10 mg/l, determinarea se efectuează direct în 2 ml de vin sau must, dacă este necesar probele se filtrează.

Dacă conţinutul de dioxid de sulf liber depăşeşte 10 mg/l, atunci 15 ml de probă de analizat sînt plasate într-un balon cotat de 25 ml, se adaugă 2 ml soluţie de acetaldehidă. Se amestecă. Se lasă pe 15 minute. Se completează pînă la semn cu apă distilată, se filtrează, dacă este necesar. Pentru determinare se iau 2 ml soluţie.

2.3.2. Măsurări colorimetrice

În 2 baloane de 25 ml cu dop rodat a şi b se iau cîte 2 ml de probă preparată cum e descris în punctul 2.3.1. În fiecare balon se adaugă cîte 5 ml soluţie de p-toluidină, se amestecă. Se adaugă în balonul b (de control) 1 ml de apă distilată, iar în balonul a – 1 ml soluţie de acid barbituric, se amestecă. Se trece conţinutul baloanelor în cuvele spectofotometrului cu drumul optic de 1 cm. Se reglează pe scara de absorbanţă valoarea zero cu soluţia din balonul b la lungime de undă de 550 nm, variaţia absorbanţei – cu soluţia din balonul a, se notează valoarea maximă a absorbanţei A în intervalul de 2 – 5 minute.

Probele cu conţinutul de 5-hidroximetilfurfural mai mare de 30 mg/l, înainte de analiză, se diluează.

2.3.3. Trasarea curbei de calibrare

În 2 baloane a şi b de 25 ml se iau cite 2 ml de fiecare dintre soluţiile de 5-hidroximetilfurfural cu concentraţia de 5, 10, 20, 30 şi 40 mg/l şi se tratează conform punctului 2.3.2.

Reprezentarea grafică a absorbanţei în funcţie de conţinutul de 5-hidroximetilfurfural în soluţiile standard, în mg/l, este o dreaptă care trece prin origine.

2.4. Calculul

Se raportează la această curbă valoarea medie a absorbanţei obţinute pentru proba de vin diluată şi se determină concentraţia 5-hidroximetilfurfural C în miligrame pe litru (mg/l), cu o zecimală. După necesitate se ţine cont de factorul de diluare.

3. Metoda prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă

3.1. Aparatura:

cromatograf în fază lichidă de înaltă performanţă, echipat cu:

- injector cu buclă de 5 sau 10 ľl;

- detector spectrofotometric, care permite măsurători la 280 nm;

- coloană umplută cu silice sferice, modificată cu octadecil;

- sistem de înregistrare cu integrator;

- debitul fazei mobile – 1,5 ml/minut;

dispozitiv pentru filtrare cu membrane de 0,45 ľm.

3.2. Reactivi:

apă bidistilată;

metanol distilat sau de calitate HPLC.;

acid acetic (ρ₂₀ = 1,05 g/ml);

faza mobilă: apă-metanol-acid acetic 40:9:1 (v/v), în prealabil filtrată prin membrană (0,45 ľm). Faza mobilă se pregăteşte în fiecare zi şi se degazează înainte de utilizare;

soluţie etalon de 5-hidroximetilfurfural, 25 mg/l: într-un balon de 100 ml se iau 25 mg de 5-hidroximetil furfural, cîntărite cu precizie şi se completează volumul cu metanol. Soluţia preparată se diluează în proporţie de 1:10 cu metanol şi se filtrează printr-o membrană (0,45 ľm). Soluţia se păstrează în frigider într-o sticlă brună 2-3 luni.

3.3. Metoda de lucru

Se injectează succesiv în cromatograf 5 (sau 10) ľl de probă de analizat şi 5 (sau 10) ľl de soluţie etalon de 5-hidroximetilfurfural. Se înregistrează cromatograma. Timpul de reţinere al 5-hidroximetilfurfuralului este aproximativ de 6-7 minute.

3.4. Exprimarea rezultatelor

Conţinutul de 5-hidroximetilfurfural este exprimat în miligrame pe litru (mg/l), cu zecimale.

34. Derivaţii cianici

34.1 MA-MD-AS 315-06-DERCYA

1. Principiul metodei

Acidul cianhidric liber şi total în vin este eliberat prin hidroliza acidă şi separat prin distilare. După reacţia cu cloramina T şi piridina, dialdehidele glutaconice formate se determină prin colorimetrie după culoarea albastră, care o formează cu acidul dimetil –1,3 barbituric.

2. Aparate:

aparat de distilare, descrierea căruia este prezentată în capitolul "Concentraţia alcoolică la 20°C";

balon cotat cu capacitatea de 500 ml;

baie de apă, termostată la 20°C;

spectrofotometru ce permite măsurarea absorbanţei la lungimea de undă 590 nm;

cuve de sticlă sau cuve de unică folosinţă, cu lungimea drumului optic de 20 mm.

3. Reactive:

acid fosforic (H₃PO₄), 25%, (m/v).

soluţie de cloramin T(C₇H₇CINNa O₂S × 3H₂O), 3%, (m/v);

soluţie de acid 1,3-dimetilbarbituric: se diluează 3,658 g de acid 1,3-dimetilbarbituric (C₆H₈N₂O₃) în 15 ml piridină şi 3 ml acid clorhidric (ρ₂₀ = 1,19 g/ml), apoi se trece într-un balon cotat cu capacitatea de 50 ml şi se aduce pînă la cota cu apă distilată;

cianură de potasiu, (KCN);

soluţie de iodură de potasiu, (KI) 10%, (m/v);

soluţie de azotat de argint (AgNO₃), 0,1 M.

4. Metoda de determinare

4.1. Distilarea

Într-un balon cotat cu capacitatea de 500 ml se iau 25 ml vin, 50 ml apă distilată, 1 ml acid fosforic şi cîteva bile de sticlă. Apoi balonul se aşează imediat pe aparatul de distilare. Distilatul se colectează printr-un tub de sticlă conic şi capătul scufundat într-un balon cotat de 50 ml, care conţine 10 ml apă. Balonul cotat se scufundă în apă cu gheaţă. Se colectează 30-35 ml de distilat (sau aproximativ 45 ml de lichid total în balonul cotat). Capătul tubului de sticlă al condensatorului se clăteşte cu cîţiva mililitri de apă distilată, se aduce distilatul la temperatura de 20°C şi se umple cu apă distilată pînă la cotă.

4.2. Măsurarea

Se introduc 25 ml de distilat într-un balon conic de 50 ml cu dop rodat, se adaugă 1 ml soluţie de cloramin T şi se închide ermetic. După exact 60 secunde se adaugă 3 ml soluţie de acid dimetil-1,3 barbituric , se închide ermetic şi se lasă pe 10 minute. Apoi se măsoară absorbanţa în raport cu martorul (25 ml de apă distilată în loc de 25 ml de distilat) la lungimea de undă de 590 nm în cuvă cu drumul optic de 20 mm.

5. Trasarea curbei de etalonare

5.1. Titrare argentimetrică a cianurii de potasiu.

Într-un balon de 300 ml se dizolvă aproximativ 0,2 g, cîntărite precis, de KCN în 100 ml de apă distilată. Se adaugă 0,2 ml soluţie de iodură de potasiu şi se titrează cu o soluţie de azotat de argint de 0,1 M pînă se obţine o culoare galbenă stabilă.

1 ml soluţie de azotat de argint corespunde cu 13,2 mg KCN. Se calculează titrul soluţiei de cianură de potasiu.

5.2. Curba de etalonare

5.2.1. Prepararea soluţiilor etalon

Cunoscînd titrul soluţiei etalon de bază de KCN, determinat conform punctului 5.1., se prepară soluţia etalon de lucru, care conţine 30 mg/l acid cianhidric (30 mg HCN ≈ 72,3 mg KCN). Soluţia etalon de bază se diluează cu apă distilată 1:10.

Etaloanele se pregătesc în 5 baloane cotate de 100 ml, în care se adaugă următoarele volume din soluţia etalon de lucru: 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 şi 5,0 ml. Se aduc pînă la cotă cu apă distilată. Soluţiile preparate conţin 30, 60, 90, 120 şi 150 ľg/l acid cianhidric.

5.2.2. Determinarea

Se prelevează cîte 25 ml soluţii obţinute conform punctelor 4.1. şi 4.2. În baza valorilor absorbanţelor şi a concentraţiilor cunoscute ale acidului cianhidric din fiecare etalon se trasează curba de etalonare, care trece prin origine.

6. Exprimarea rezultatelor

Acidul cianhidric se exprimă în micrograme pe litru (ľg/l) fără zecimale.

6.1. Calculul

Absorbanţa probei de vin se raportează la curba de etalonare şi se stabileşte conţinutul în acid cianhidric total. Se ia în considerare factorul de diluţie, cînd e cazul.

Repetabilitatea (r) şi reproductibilitatea (R):

Vinurile albe:

repetabilitatea

r = 3,1 ľg/l ______________HCN,______________respectiv 6% × X_i ;

reproductibilitatea

R = 12 ľg/l______________HCN,______________respectiv 25% × X_i

Vinurile roşii:

repetabilitatea

r = 6,4 ľg/l ______________HCN,_____________  respectiv 8% × X_i ;

reproductibilitatea

R = 23 ľg/l______________HCN,______________respectiv 29% × X_i.

X_i – concentraţia medie de HCN din vin.

35. Diglucozidul malvidolului

35.1 MA-F-AS 315-03-DIGMAL

1. Principiul metodei

Diglicozidul malvidolului se oxidează în prezenţa acidului azotic şi se transformă într-o substanţă, care în mediul amoniacal la lumina ultravioletă, formează o fluorescenţă de culoare verde. Intensitatea fluorescenţei compusului format se măsoară prin compararea cu fluorescenţa soluţiei titrate de sulfat de chinină, care corespunde etalonului de diglicozid al malvidolului.

Întrucît dioxidul de sulf liber atenuează intensitatea fluorescenţei, el trebuie în prealabil combinat cu acetaldehidă în exces.

2. Determinarea calitativă

2.1. Aparate:

lampă de radiaţie ultravioletă de 365 nm.

2.2. Reactive:

soluţie de acetaldehidă:

paraldehidă cristalizată ______________10 g;

alcool etilic de 96% vol. ______________100 ml;

soluţie de acid clorhidric, _____________1 M

soluţie de azotat de sodiu, ____________10 g/l

alcool de 96% vol., ce conţine 5% amoniac concentrat (ρ₂₀ = 0,92 g/ml);

vin martor, care conţine 15 mg/l diglicozid malvidol.

2.3. Metoda de determinare

Într-un balon se iau 10 ml de vin şi 1,5 ml soluţie de aldehidă acetică. Se agită şi se lasă pe 20 minute.

Într-o eprubetă de centrifugat de 20 ml se iau 1 ml de vin, tratat cu acetaldehidă, o picătură de acid clorhidric de 1 M şi 1 ml soluţie de azotat de sodiu. Se agită conţinutul eprubetei şi se lasă pe 2 minute (maximum 5 minute), apoi se adaugă 10 ml de alcool cu amoniac.

Într-o altă eprubetă de centrifugat se tratează 10 ml de vin martor care conţine 15 mg/l diglicozid malvidol. Se agită, se lasă pe 10 minute şi se centrifughează.

Se decantează lichidul limpede din cele două eprubete în două eprubete calibrate cu dop rodat. Se compară fluorescenţa în lumina ultravioletă la 365 nm, a probei de vin analizate cu fluorescenţa vinului martor.

Pentru vinurile roze, care conţin mai puţini antociani, se poate mări sensibilitatea metodei, luînd:

5 ml de vin tratat cu acetaldehidă;

0,2 ml de acid clorhidric 1 M;

1 ml soluţie de nitrit de sodiu;

5,8 ml alcool cu amoniac;

Se tratează în paralel proba de vin martor.

2.4. Interpretare

Vinul, care nu dă fluorescenţă sau dă o fluorescenţă inferioară vinului martor, este considerat ca fiind lipsit de diglicozid malvidol, în cazul unei fluorescenţe uşor inferioare, egale sau superioare celei a vinului martor, se impune determinarea cantitativă a diglicozid malvidolului.

3. Determinarea cantitativă

3.1. Aparate

Aparat pentru măsurarea fluorescenţei:

lungimea de undă de excitaţie 365 nm;

lungimea de undă a radiaţiei fluorescente 490 nm;

cuve de cuarţ cu drumul optic de 1 cm.

3.2. Reactivi:

martor cantitativ;

soluţie de sulfat de chinină, 2 mg/l: 10 mg de sulfat de chinină se dizolvă în 100 ml de acid sulfuric de 0,1 M. Se diluează 20 ml de această soluţie într-un balon cotat cu capacitatea de 1 litru şi se aduce la semn cu soluţie de 0,1 M acid sulfuric.

3.3. Modul de determinare

Proba de vin se pregăteşte în acelaşi mod ca la punctul 2 al prezentului capitol, în toate cazurile (vinuri roşii sau roze), se tratează 1 ml de probă de vin cu acetaldehidă.

Se introduce soluţie de sulfat de chinină (2 mg/l) în cuva de cuarţ, pentru reglarea fluorimetrului şi acţionînd asupra fantei sau a sensibilităţii, se reglează transmisia T egală cu 100%. Apoi cuva se înlocuieşte cu cuva care conţine proba de vin şi se citeşte valoarea transmisiei T₁.

Dacă valoarea T₁ este mai mare de 35%, proba de vin trebuie diluată cu un vin lipsit de diglicozid malvidol, fluorescenţa căruia nu depăşeşte 6% (se determină pe o probă preliminară).

Acidul salicilic (sau salicilatul de sodiu), adăugat pînă la analiză în proba de vin, pentru stabilizare, produce o fluorescenţă suplimentară. Aceasta se elimină prin extracţia acidului salicilic din vin cu eter.

O fluorescenţă suplimentară poate apărea în cazul în care în vin a fost adăugat caramelul.

3.4. Calculul

Intensitatea fluorescenţei egală cu 1 pentru un vin lipsit de SO₂, în condiţiile de determinare descrise mai sus, cu excepţia tratării cu aldehidă acetică, corespunde 0,426 mg de diglicozid malvidol într-un litru de vin.

Vinurile roşii şi roze, care nu conţin diglicozid malvidol, pot da o fluorescenţă ce corespunde Т= 6%.

Conţinutul de diglicozid malvidol C în vinuri, în miligrame pe litru (mg/l):

în care, T₁ – transmisia citită pentru proba de vin, %;

0,426 – constanta intensităţii fluorescenţei, egală cu 1 (corespunde 0,426 mg diglicozid malvidol pe litru);

6 – transmisia T а vinului roz sau roşu, lipsit de diglicozid malvidol, %.

Dacă proba de vin a fost diluată, rezultatul se înmulţeşte cu factorul de diluţie.

3.5. Exprimarea rezultatelor

Conţinutul diglicozid malvidolului este exprimat în miligrame pe litru (mg/l) de vin, fără zecimale.

35.2. MA-MD-AS315-11-ANCYAN

Metoda analitică include determinarea conţinutului relativ al antocianilor din vinuri roşii şi roze. Separarea este realizată pe o coloană (cromatografia lichidă de înaltă performanţă – HPLC) în fază inversată şi detector UV-VIS. Deoarece compoziţia antocianilor din vinuri este complexă, metoda prevede o procedură simplă, care permite identificarea şi determinarea a nouă compuşi principali ai antocianilor din vinuri.

1. Principiul metodei

Metoda este bazată pe separarea directă a antocianilor în formă neesterificată de antocianii în formă de esteri acilici prin metoda HPLC pe coloană în fază inversată, prin eluţie cu gradient apă/acid formic/acetonitril cu detectare spectrofotometrică la 518 nm (figura 6).

2. Reactivi şi materiale:

acid formic, 98%;

apă (grad de puritate HPLC);

acetonitril (grad de puritate HPLC);

solvenţi HPLC:

A – apă/acid formic/acetonitril _______87 : 10 : 3 (v/v/v);

B – apă/acid formic/acetonitril _______40 : 10 : 50 (v/v/v);

filtru cu membrană pentru degazarea solvenţilor HPLC şi pentru prepararea probelor de analizat;

materiale de referinţă pentru identificarea picurilor:

Cianidol-3-glucozid; M = 484,84 g/mol.

Peonidol-3-glucozid; M = 498,84 g/mol.

Malvidol-3-glucozid; M = 528,84 g/mol.

Malvidol-3,5-diglucozid; M = 691,04 g/mol.

3. Echipamente

Pentru efectuarea testărilor sunt necesare următoarele echipamente:

sistemul HPLC dotat cu:

pompă binară cu gradient;

sistem de injectare a probelor în volume de la 10 pînă la 200 ľl;

detector UV-VIS;

integrator sau calculator cu program special;

termostat pentru coloane (40°C);

sistemă de degazare a solvenţilor;

coloană de separare, de exemplu: LiChrospher 100 RP 18 (5ľm) sau LiChroCart 250-4;

precoloană: de exemplu, RP18 (30-40 mm) cu diametrul cartuşului de 2 mm şi lungimea de 20 mm.

4 . Metoda de determinare

4.1. Pregătirea probelor

Vinurile limpezi pot fi testate direct, iar probele tulburi necesită filtrare preventivă cu ajutorul unui filtru cu membrană de 0,45 ľm. Prima parte a filtratului se înlătură.

Deoarece intervalul de linearitate a absorbţiei în funcţie de concentraţia antocianilor este foarte larg, volumul de probă injectată poate varia de la 10 pînă la 200 ľl, în funcţie de intensitatea culorii vinului. Nici o diferenţă semnificativă nu este înregistrată pentru volume diferite de probe injectate.

4.2. Determinarea

Separarea antocianelor se efectuează în următoarele condiţii HPLC:

volumul probei injectată:

50 ľl (vin roşu) pînă la 200 ľl (vin roz);

debitul:____________________________0,8 ml/minut;

temperatura coloanei:_________________40°C;

durata de tranziţie: ___________________45 minute;

revenirea la condiţiile iniţiale: ___________5 minute;

detectare la lungimea de undă __________518 nm.

gradienţii de eluţie:

Pentru a asigura eficacitatea coloanei, numărul de talere teoretice (N), calculat în raport cu malvidol-3-glicozid nu trebuie să fie inferior de 20000, iar rezoluţia (Rs) între peonidol-3-cumaril glicozid şi malvidin-3-cumaril glicozid nu trebuie să fie mai mică de 1,5. Sub limita acestor valori se utilizează altă coloană.

În figura 6 este prezentată o cromatogramă tipică, unde sînt separaţi antocianii:

5. Exprimarea rezultatelor

Valorile sînt exprimate în unităţi relative în raport cu totalitatea antocianilor, determinaţi prin această metodă.

Figura 6. Separarea a 9 antociane în vin roşu

36. Dietilenglicolul

36.1 MA-MD-AS 315-09-DIEGLY

1 . Principiul metodei

Dietilenglicolul se separă prin cromatografie în fază gazoasă pe coloană capilară după extragerea cu ester. Metoda permite determinarea dietilenglicolului în vinuri cu o concentraţie egală sau mai mare decît 10 mg/l.

2. Aparate:

cromatograf în fază gazoasă dotat cu:

detector cu ionizare în flacără,

coloană capilară de separare cu polietilenglicol (Carbowax 20M), lungimea de 50 m şi diametrul de 0,32 mm.

Condiţiile de lucru:

injectarea la 35°C ieşirea închisă timp de 40 secunde;

programarea temperaturii 120°C -170°C, 3°C/minută.

3. Reactivi:

soluţie de propan – 1,3-diol, 1 g/l în alcool de 20% vol. (etalon intern);

soluţie apoasă de dietilenglicol, НOСН₂СН₂OСН₂СН₂OН, 20 mg/l.

4. Metoda de determinare

Într-un balon cotat de 50 ml se iau 10 ml vin, 1 ml de soluţie de propan – 1,3-diol şi 25 ml ester. Se agită şi se adaugă o cantitate de carbonat de potasiu neutru suficientă pentru saturarea amestecului. Se agită. Se separă în două faze prin centrifugare.

Se efectuează a doua extracţie. Se elimină eterul prin evaporare şi se dizolvă sedimentul cu 5 ml de etanol.

Randamentul extragerii trebuie să fie nu mai puţin de 90%.

Cromatografierea se efectuează în condiţiile descrise mai sus.

5. Exprimarea rezultatelor

Identificarea dietilenglicolului se face după timpul de reţinere comparativ cu soluţia de referinţă, analizată în aceleaşi condiţii ca şi vinul.

Determinarea se efectuează comparativ cu soluţia etalon prin metoda utilizării etalonului intern.

Cînd conţinutul de dietilenglicol este egal sau mai mic de 20 mg/l se recomandă confirmarea prezenţei acestuia prin spectrometria în masă.

37. Indicile Folin-Ciocalteu

37.1. MA-MD-AS 2-10 INDFOL

1. Definiţie

Indicele Folin-Ciocalteu este rezultatul obţinut din aplicarea metodei descrise mai jos.

2. Principiul metodei

Toţi compuşii fenolici, conţinuţi în vin se oxidează de reactivul Folin-Ciocalteu. Acest reactiv este format dintr-un amestec de acid fosfowolframic (H₃PW₁₂O₄₀) şi acidul fosfomolibdinic (H₃PMo₁₂O₄₀) care, după oxidarea fenolilor, se reduc la un amestec de oxizi de tungsten (W₈O₂₃) şi molibden (Mo₈O₂₃), coloraţi în culoare albastră.

Coloraţia albastră are o absorbţie maximă la 750 nm şi este proporţională cu totalul cantităţii de compuşi fenolici prezenţi iniţial.

3. Reactivi

Reactivii trebuie să fie de calitate analitică. Se utilizează apă distilată sau apă de puritate echivalentă.

Reactivul Folin-Ciocalteu

Se utilizează reactivul disponibil în comerţ. Acest reactiv poate fi preparat după cum urmează: se dizolvă 100 g de wolframat de sodiu (Na₂WO₄ × 2H₂O) şi 25 g de molibdat de sodiu (Na₂MoO₄ × 2H₂O) în 700 ml de apă distilată. Se adaugă 50 ml de acid fosforic 85% (ρ₂₀ = 1,71 g/ml) şi 100 ml de acid clorhidric concentrat (ρ₂₀ = 1,19 g/ml). Se aduce la temperatura de fierbere şi se fierbe 10 ore la reflux, apoi se adaugă 150 g de sulfat de litiu (Li₂SO₄ × H₂O) şi cîteva picături de brom şi se fierbe din nou 15 minute. Se lasă să se răcească şi se completează pînă la un litru cu apă distilată.

Carbonat de sodiu anhidru, Na₂CO₃, soluţie de 20% (m/v).

4. Aparatura:

baloane cotate de 100 ml;

spectrofotometru, care permite măsurări la 750 nm.

5. Metoda de lucru

5.1. Vinuri roşii

Într-un balon cotat de 100 ml se introduc succesiv 1 ml de vin, diluat în prealabil 1:5, 50 ml apă distilată, 5 ml reactiv Folin-Ciocalteu şi 20 ml de soluţie de carbonat de sodiu. Se completează pînă la 100 ml cu apă distilată. Se amestecă. Se lasă 30 minute pentru stabilizarea reacţiei. Se determină absorbţia la 750 nm în cuvă cu drumul optic de 1 cm faţă de un blanc pregătit cu apă distilată în locul vinului.

Dacă absorbţia radical diferă de 0,3, trebuie efectuată o diluare corespunzătoare.

5.2. Vinuri albe

Toate procedurile se efectuează în aceleaşi condiţii, luînd ca probă 1 ml de vin alb nediluat.

5.3. Must concentrat rectificat

5.3.1. Pregătirea probei

Se utilizează soluţia cu o concentraţie a zaharurilor de 25% (m/m) (25°Brix), pregătită conform descrierii din capitolul "17. Aciditatea ionică (pH)" punctul 4.1.2.

5.3.2. Determinarea

Toate măsurările se efectuează în aceleaşi condiţii ca şi în cazul vinului roşu (punctul 5.1. din prezentul capitol), dar se utilizează 5 ml de probă preparată conform descrierii de la punctul 5.3.1. Se măsoară absorbţia faţă de blanc, pregătit cu 5 ml de soluţie de zahăr invertit 25% (m/m).

6. Exprimarea rezultatelor

6.1. Metoda de calcul

Rezultatul este exprimat sub forma unui indice, obţinut prin înmulţirea absorbţiei cu 100 pentru vinurile roşii diluate 1:5 (sau cu factorul corespunzător pentru alte diluţii) şi cu 20 pentru vinurile albe. Pentru mustul concentrat rectificat, absorbţia se înmulţeşte cu 16.

6.2. Repetabilitatea

Diferenţa dintre rezultatele a două determinări întreprinse simultan sau foarte repede una după cealaltă, de acelaşi analist, nu trebuie să depăşească 1.

O bună repetabilitate a rezultatelor este asigurată de curăţenia corespunzătoare a veselei de laborator (baloanele cotate şi cuvele spectrometrice).

38. Ochratoxina-A

38.1 MA-F-AS 315-10-OCHRAT

1. Domeniu de aplicare

Metoda se aplică la determinarea ochratoxinei-A (OTA) în vinurile roşii, roze şi albe (inclusiv în vinurile speciale), la concentraţii de pînă la 10 ľg/l, folosind o coloană de "immunoaffinite" şi cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPCL).

Metoda poate fi aplicată la vinurile spumante şi la vinurile petiante, cu condiţia că probele vor fi preventiv degazate.

2. Principiul metodei

Proba de vin se diluează cu o soluţie, care conţine polietilenglicol şi bicarbonat de sodiu, se filtrează şi se trece prin coloana "immunoaffinite". OTA se eluează cu metanol şi se separă prin metoda HPLC cu detector fluorimetric.

3. Reactivi:

clorură de sodiu (NaCl);

hidrogenocarbonat de sodiu (NaHCO₃);

polietilenglicol (PEG 8000);

metanol (CH₃OH);

acetonitril (CH₃CN);

apă purificată de laborator, calitatea EN ISO 3696;

acid acetic, 85% (CH₃COOH);

soluţie diluată (1% PEG + 5% NaHCO₃): se dizolvă 10 g de PEG şi 50 g NaHCO₃ în 950 ml apă şi se aduce pînă la un 1 litru cu apă distilată;

soluţie de spălare (2,5% Na Cl + 0,5% NaHCO₃): se dizolvă 25 g de NaCl şi 5 g NaHCO₃ în 950 ml apă şi se aduce pînă la un 1 litru cu apă distilată;

faza mobilă HPLC (apă: acetonitril: acid acetic glacial, 99:99:2, v/v/v): se amestecă 990 ml apă cu 990 ml de acetonitril şi 20 ml de acid acetic glacial. Se filtrează printr-un filtru cu membrană cu diametrul porilor de 0,45 ľm şi se degazează (de exemplu, cu heliu);

toluen;

amestec de solvenţi (toluen: acid acetic glacial _____________ 99:1, v/v ): se amestecă 99 părţi în volum de toluen cu o parte de volum de acid acetic glacial;

soluţie etalon de OTA: se dizolvă 1 mg de OTA sau conţinutul unei fiole (în cazul în care OTA este obţinut sub forma unei pelicule după evaporare) în amestecul de solvenţi pentru a obţine o soluţie cu conţinutul de aproximativ 20 sau 30 ľg/l de OTA.

Pentru determinarea concentraţiei exacte, se înregistrează spectrul de absorbţie al soluţiei între 300 şi 370 nm, în cuva de cuarţ cu drumul optic de 1 cm, folosind amestecul de solvenţi ca blanc . Se identifică absorbanţa maximă şi se calculează concentraţia de OTA (C) în ľg/ml cu ecuaţia:

C = A_max × M × 100/ ε × δ

unde, A_max – absorbanţa la lungimea de undă maximă (aproximativ 333 nm);

M – masa moleculară a OTA = 403,8 g/mol;

ε – coeficientul de extincţie molară a OTA în amestecul de solvenţi, ε = 544/mol;

δ – drumul optic (cm).

Această soluţie este stabilă la o temperatură de -18°C timp de 4 ani;

soluţie standard de OTA (2 ľg/ml în amestec toluen: acid acetic – 99:1, v/v): se diluează soluţia etalon cu amestecul de solvenţi pentru a obţine o soluţie standard de OTA cu concentraţiea de 2 ľg/ml.

Soluţia se păstrează la o temperatură de +4°C în frigider. Stabilitatea trebuie să fie testată cu regularitate.

4. Echipament:

flacoane din sticlă (4 ml);

pompă în vid pentru pregătirea coloanelor "immunoaffinite";

rezervor şi tub de scurgere adaptate la coloanele "immunoaffinite";

filtre cu fibre de sticlă (de exemplu, Whatman GE/A);

coloana "immunoaffinite" specială pentru OTA. Coloana trebuie să aibă o capacitate totală de legare de cel puţin 100 ng de OTA şi să permită ca randamentul de purificare să fie egal cu 85%, atunci cînd se face să treacă o soluţie diluată de vin ce conţine 100 ng OTA;

evaporator rotativ;

cromatograf lichid, dotat cu pompă capabilă de a atinge un flux constant de 1 ml/minut;

sistemă de injectare de 100 ľl;

coloană analitică HPCL din oţel inoxidabil 150 × 4,6 mm, umplută cu fază staţionară C₁₈(5 ľm), cu precoloană sau prefiltru (0,5 ľm), care conţine o fază corespunzătoare. Coloanele de alte dimensiuni pot fi folosite dacă asigură o bază bună şi zgomotul de fundal pentru a detecta picul de OTA, printre alte picuri;

detector de fluorescenţă cu lungimea de undă de excitaţie, fixată la 333 nm şi lungimea de undă de emisie 460 nm;

sisteme Acquisition;

spectrometru Ú.V.

5. Modul de determinare

5.1. Pregătirea probelor

Se toarnă 10 ml de vin într-un balon conic de 100 ml. Se adaugă 10 ml de soluţie diluată. Se amestecă bine. Se filtrează prin filtru cu fibră de sticlă (filtrarea este necesară pentru vinuri tulburi sau cu precipitat).

5.2. Purificarea în coloana "immunoaffinite"

Se montează coloana " immunoaffinity" la pompa în vid şi se fixează rezervorul de scurgere. Se adaugă 10 ml (echivalentul a 5 ml de vin) de soluţie diluată în balon şi se trece prin coloana "immunoaffinity" cu un debit de aproximativ 1 picătură pe secundă. Se spală coloana "immunoaffinity" cu 5 ml de soluţie de spălare, apoi cu 5 ml de apă cu un debit de 1 pînă la 2 picături pe secundă.

Se usucă coloana cu aer uscat. Se eluează OTA într-un balon de sticlă cu 2 ml de metanol cu un debit de 1 picătură pe secundă. Eluatul se evaporă pînă la sec la o temperatură de 50°C cu azot. Se dizolvă imediat în 250 ľl fază mobilă HPLC şi se păstrează la 4°C pînă la analiza prin HPLC.

5. 3. Metoda HPLC

Se injectează 100 ľl de extract (echivalent a 2 ml de vin) în bucla de injectare a cromatografului.

Condiţii de operare:

6. Determinarea cantitativă a ochratoxinei – A (OTA)

Calculul conţinutului OTA trebuie să se efectueze prin măsurarea ariei sau înălţimii picului corespunzător timpului de retenţie a OTA, utilizînd curba de calibrare preventiv trasată.

6.1. Curba de calibrare

Se trasează curba de etalonare în fiecare zi înainte de analiză şi ori de cîte ori se schimbă condiţiile de cromatografiere. Într-un flacon de sticlă se iau 0,5 ml soluţie standard de OTA cu concentraţia de 2 ľg/ml, şi se evaporă solventul cu azot. Se dizolvă în 10 ml de fază mobilă HPLC, anterior filtrată prin filtru cu diametrul porilor 0,45 ľm. Aceasta asigură concentraţia de OTA a soluţiei de 100 ľg/ml.

Se prepară 5 soluţii de calibrare pentru HPLC în 5 baloane de 5 ml conform tabelului de mai jos. Se completează fiecare standard pînă la 5 ml cu faza mobilă HPCL. Se injectează în HPLC cîte 100 ľl din fiecare soluţie.

Dacă cantitatea de OTA în probe este în afara intervalului de calibrare, se face o diluţie corespunzătoare sau se injectează volume mai mici. În acest caz, calculul final (7) trebuie să fie reanalizat de la caz la caz.

Se recomandă, ca curba de calibrare să treacă prin zero, pentru evaluarea cantitativă precisă a concentraţiei OTA mai puţin de 0,1 ľg/l.

7. Calculul

Calcularea conţinutului de OTA se efectuează cu curbele de calibrare, trasate preventiv cu ajutorul soluţiilor standard.

Se calculează concentraţia de OTA (C_ota), în ng/ml (echivalent cu ľg/l), cu formula:

C_ota = M_a × 2/V₁ × V₃/V₂

unde:

M_a – masa de ochratoxină – A (ng) în conformitate cu matricea, injectată în coloană, şi determinată pe curba de calibrare;

2 – factorul de diluţie;

V₁ – volumul de probă (10 ml);

V₂ – volumul soluţiei testate, injectate în coloană (100 ľl);

V₃ – volumul de soluţie, folosită pentru dizolvarea eluatului uscat (250 ml).

39. Prezenţa coloranţilor sintetici

39.1 MA-MD-AS 315-08-COLSYN

1. Principiul metodei

Vinul se concentrează pînă la 1/3 din volumul iniţial, se alcalinizează cu o soluţie de hidroxid de sodiu şi se supune extracţiei cu eter. Faza eterică, spălată cu apă se supune extracţiei cu soluţie de acid acetic. Această soluţie acetică se alcalinizează cu amoniac, se aduce la fierbere în prezenţa unor fibre proteice, tratate cu sulfat de aluminiu şi tartrat acid de potasiu. Colorantul posibil prezent se fixează pe fibra proteică. Colorantul este readus în soluţie prin tratarea fibrei cu soluţie de acid acetic. După evaporarea soluţiei de acid acetic, reziduul se dizolvă într-o soluţie hidroalcoolică şi se analizează prin cromatografie în strat subţire pentru a identifica coloranţii.

Faza apoasă, rămasă după extracţia în eter, posibil conţine coloranţi cu caracter acid. Extracţia coloranţilor se bazează pe afinitatea lor cu fibrele de origine animală, pe care ei le colorează puternic: se tratează cu acizi minerali şi se fixează pe fibre proteice.

Pentru a concentra coloranţii, se efectuează o dublă sau o multiplă fixare succesivă a coloranţilor pe fibrele proteice, care se iau din ce în ce mai mici. Dacă fibrele se colorează, rezultă că în vin a fost adăugat un colorant sintetic, care poate fi determinat ulterior prin cromatografia în strat subţire.

2. Aparataj:

plăci de sticlă 20 × 20 cm acoperite cu praf de celuloză;

cuve pentru cromatografie.

3. Reactivi:

eter sulfuric;

soluţie de hidroxid de sodiu de 5%;

acid acetic (glacial) (ρ₂₀ = 1,05 g/ml);

acid acetic glacial diluat cu apă distilată în proporţie de 1:18;

acid clorhidric (ρ₂₀ = 1,19 g/ml) diluat cu apă distilată în proporţie de 1:10;

amoniac (ρ₂₀ = 0,92 g/ml) ;

fibre proteice albe, în prealabil spălate, degresate în eter şi uscate;

fibre proteice albe, în prealabil spălate, degresate în eter, uscate şi îmbibate în felul următor: se dizolvă 1 g de sulfat de aluminiu cristalic Al₂(SO₄)₃ × 18H₂O şi 1,2 g de tartrat acid de potasiu în 500 ml de apă. Se plasează în soluţia obţinută 10 g de fibre proteice albe, în prealabil spălate, degresate în eter şi uscate, se agită timp de 1 oră, apoi se lasă pe 2-3 ore, după ce se usucă la temperatură ambiantă;

solventul nr.1 pentru analiza cromatografică a coloranţilor cu caracter bazic:

4. Metoda de lucru

4.1. Analiza coloranţilor sintetici de origine alcalină

4.1.1. Extracţia coloranţilor

Într-un balon conic de 500 ml se iau 200 ml de vin, se fierb pînă ce volumul se reduce la 1/3 din volumul iniţial. După răcire, vinul concentrat se neutralizează cu o soluţie de hidroxid de sodiu de 5% pînă la modificarea culorii naturale a vinului.

Se efectuează extracţia în eter în două reprize, a cîte 30 ml de eter. Fazele cu eter, care posibil conţin coloranţi de origine alcalină se combină; reziduul vinului după extragere trebuie păstrat pentru determinarea coloranţilor sintetici de origine acidă.

Extractul eteric este spălat de două ori cu 5 ml de apă, pentru a elimina hidroxidul de sodiu, apoi se agită atent cu 5 ml soluţie de acid acetic diluat.

Dacă faza apoasă acidă obţinută este colorată, acest lucru atestă prezenţa în vin a unui colorant sintetic de origine alcalină.

Prezenţa colorantului sintetic cu caracter alcalin poate fi confirmată prin fixarea lui pe fibre proteice îmbibate. Pentru aceasta, faza apoasă acidă, obţinută conform procedurii sus-indicate este alcalinizată cu soluţie de amoniac de 5%, apoi se adaugă 0,5 g fibre proteice îmbibate şi se fierbe 5 minute. Fibrele se clătesc sub un get de apă curgătoare. Dacă fibrele se colorează, atunci vinul conţine colorant sintetic de origine alcalină.

4.1.2. Determinarea cromatografică în strat subţire

Faza acidă apoasă, care conţine colorant sintetic de origine alcalină, se concentrează pînă la 0,5 ml. Dacă colorantul a fost fixat pe fibrele proteice, acestea sînt tratate la fierbere cu 10 ml de apă distilată şi 10 picături de acid acetic (ρ₂₀ = 1,05 g/ml). După înlăturarea fibrelor, soluţia este concentrată pînă la un volum de 0,5 ml.

Pe suprafaţa unei plăci de sticlă, acoperită cu celuloză, se depun 20 ľl de această soluţie concentrată la 3 cm de marginea laterală şi la 2 cm de marginea inferioară a plăcii. Placa se introduce în cuvă cu solventul nr.1, în aşa mod, încît marginea inferioară a plăcii să fie scufundată în solvent de 1 cm. Cînd frontul solventului migrează la 15-20 cm de înălţime, placa se retrage şi se lasă să se usuce la aer.

Colorantul se identifică după soluţiile coloranţilor sintetici de origine alcalină, depuse succesiv pe placa cromatografică.

4.2. Analiza coloranţilor sintetici  de origine acidă

4.2.1. Extracţia coloranţilor

Pentru testare se foloseşte reziduul de vin rămas de la determinarea coloranţilor de origine alcalină. În cazul în care testarea coloranţilor de origine alcalină nu a fost efectuată, într-un balon conic de 500 ml se iau 200 ml de vin, se fierb şi se concentrează pînă la 1/3 din volumul iniţial.

În ambele cazuri, după răcirea reziduului sau a vinului concentrat, se adaugă 3 ml soluţie diluată de acid clorhidric şi 0,5 g de fibre proteice albe, se fierbe timp de 5 minute. Lichidul se decantează, iar fibrele se spală sub un get de apă.

Fibrele spălate sînt plasate într-un balon conic, se adaugă 100 ml de apă şi 2 ml de acid clorhidric diluat, se fierb timp de 5 minute. Se decantează lichidul acid, apoi procedura se repetă pînă ce se obţine un lichid incolor.

Fibrele după ce au fost bine spălate, pentru a elimina complet lichidul acid, se plasează într-un balon conic cu 50 ml de apă distilată şi 10 picături de amoniac (ρ₂₀ = 0,92 g/ml), se fierb lent 10 minute, pentru dizolvarea coloranţilor sintetici de origine acidă, care posibil au fost fixaţi pe fibră. Apoi se înlătură fibrele, volumul se aduce pînă la 100 ml şi se fierbe lichidul pentru a evaporarea amoniacul. După răcire se acidulează cu 2 ml de acid clorhidric diluat (se verifică cu ajutorul indicatorului – 1 picătură de lichid se plasează pe hîrtia indicator).

În lichidul acidulat se plasează 60 mg (aproximativ 20 cm) de fibră proteică albă şi se fierbe timp de 5 minute, se extrage firul şi se clăteşte minuţios sub un get de apă. În cazul în care fibrele s-au colorat în roşu (vin roşu) sau în galben (vin alb), se consideră demonstrată prezenţa colorantului sintetic de origine acidă.

Dacă coloraţia fibrei nu este clară, se efectuează tratamentul cu amoniac şi se repetă procedura cu altă fibră de 30 mg (aproximativ 10 cm de fibră). Apariţia unei culori slabe, dar clare, demonstrează prezenţa colorantului sintetic de origine acidă.

Dacă este necesară o fixare mai completă, se repetă procedura de fixare-eluţie de 4-5 ori, pînă cînd coloraţia roză nu va fi distinctă.

Fibrele proteice colorate se tratează la fierbere cu 10 ml de apă distilată şi 10 picături de amoniac (ρ₂₀ = 0,92 g/ml). Se scot fibrele, iar soluţia amoniacală se concentrează pînă la volumul de 0,5 ml.

4.2.2. Analiza cromatografică în strat subţire

Pe o placă de sticlă, acoperită cu celuloză, se depun 20 ľl de această soluţie concentrată la 3 cm de marginea laterală şi la 2 cm de marginea inferioară a plăcii. Se introduce placa în cuva cu solventul nr.2 în aşa mod, încît marginea inferioară a plăcii să fie scufundată în solvent de 1 cm. Cînd frontul solventului migrează la 15-20 cm de înălţime, se scoate placa şi se lasă să se usuce la aer.

Colorantul este identificat după soluţiile coloranţilor sintetici de origine acidă, depuse succesiv pe placa cromatografică.

40. Prezenţa îndulcitorilor sau edulcoranţilor sintetici

40.1. MA-MD-AS 315-07 EDUSYN

1 . Principiul metodelor

1.1. Metoda de referinţă

Determinarea saharinei (sulfamidei benzoice) a dulcinei (p-etoxifenilureei), a ciclamatului (ciclohexilsulfamatului) şi a P-4000 (2N propoxi-2-amino-4-nitrobenzenului).

După concentrarea vinului, saharina, dulcina şi P-4000 sînt extrase în mediu acid cu benzol; apoi este extras ciclamatul din vin cu acetat de etil (este necesar de a respecta ordinea extracţiei). Reziduurile după evaporarea solvenţilor se analizează prin cromatografia în strat subţire.

Saharina şi ciclamatul sînt identificate prin cromatografia cu placa de celuloză (solvent: acetonă-acetat de etil-amoniac), prima în extract benzonic, al doilea în extract de acetat de etil după purificare cu eter.

Aceşti îndulcitori se evidenţiază după pulverizarea cu o soluţie de benzidin-anilin-acetat de cupru şi separarea la următoarele valori Rf: 0,29 pentru ciclamat, 0,46 pentru saharină.

P-4000 şi dulcina se identifică prin cromatografia în strat de poliamidă, în extract benzenic (solvent: toluen-metanol-acid acetic glacial). Aceşti îndulcitori, puşi în evidenţă prin pulverizarea cu soluţie de p-dimetilaminobenzaldehidă, se separă la următoarele valori Rf: 0,60 pentru dulcină, 0,80 pentru P-4000.

1.2. Metoda uzuală

Determinarea saharinei, dulcinei şi a ciclamatului.

Aceşti îndulcitori se extrag din vin cu un schimbător de ioni lichid, apoi din nou se extrag cu amoniac diluat, se identifică prin cromatografia în strat subţire de un amestec de praf de celuloză şi praf de poliamidă (solvent: xilen-propanol- n-acid acetic glacial-acid formic). Ei se manifestă datorită fluorescenţei lor albastre pe fon galben, care se observă în raze ultraviolete după pulverizare cu soluţie de 2,7-diclorfluorosceină.

O pulverizare ulterioară cu soluţie de 1,4-dimetilaminobenzaldehidă permite diferenţierea dulcinei, care dă un spot oranj spre deosebire de vanilină şi esterii acidului p-hidroxibenzoic care migrează la acelaşi Rf.

2. Metoda de referinţă

Determinarea saharinei, ciclamatului, dulcinei şi P-4000

2.1. Utilaj:

cuvă cromatografică;

seringi micrometrice sau micropipete;

pîlnie de decantare cu diametrul de 15 mm şi înălţimea de 180 mm, înzestrată cu un robinet.

baie de apă la 100°C ;

etuvă cu temperatura reglabilă, pînă la 125°C .

2.2. Reactivi:

solvenţi de extracţie:

benzen;

acetat de etil.

solvenţi pentru cromatografie:

solventul nr.1 – acetonă: acetat de etil: amoniac concentrat (ρ₂₀= 0,92 g/ml), 60:30:10;

solventul nr.2 – toluen: metanol: acid acetic glacial (ρ₂₀= 1,05 g/ml) 90:10:10;

plăci pentru cromatografie 20 × 20 cm:

cu strat de praf de celuloză (exemplu Watman CC 41 sau Macherey-Nagel MN300);

cu strat de praf de poliamidă (de exemplu Merck);

reactiv de developare a saharinei şi ciclamatului: se prepară soluţie alcoolică de benzidină: 250 mg la 100 ml etanol; soluţie săturată de acetat de cupru şi anilină recent distilată. Se amestecă 15 ml soluţie de benzidină, 1 ml anilină şi 0,75 ml soluţie saturată de acetat de cupru. Această soluţie trebuie să fie pregătită imediat înaintea analizei. Ea corespunde volumului necesar pentru developarea unei plăci de 20 × 20 cm;

acid clorhidric diluat, 1:1 (v/v);

soluţie de acid azotic, 25%;

reactiv pentru developarea P-4000 şi a dulcinei: se dizolvă 1 g de 1,4-p-dimetilaminobenzaldehidă în 50 ml de metanol, se adaugă 10 ml de de acid azotic, se aduce nivelul la 100 ml cu metanol. Pentru o placă de 20 × 20 cm se utilizează 15 ml de reactiv;

soluţie hidroalcoolică de ciclamat, 0,1%: se dizolvă 100 mg de sare de sodiu sau de calciu a acidului ciclohexilsulfamic în 100 ml de amestec din părţi egale de apă şi etanol;

soluţie apoasă de saharină, 0,05%;

soluţie de dulcină, 0,05 g în 100 ml de metanol;

soluţie de P-4000, 0,05 g în 100 ml de metanol.

2.3. Metoda de lucru

2.3.1 Extracţia

100 ml de vin se toarnă într-un vas cilindric, se evaporă rapid la fierbere pînă la volumul de 30 ml, permanent îndreptînd un jet de aer rece la suprafaţa recipientului. Se lasă să se răcească.

Se acidulează cu 3 ml de acid сlorhidric diluat la 1:2. Se transvazează într-un balon conic de 500 ml cu dop rodat, se adaugă 40 ml benzen şi se agită cu un agitator mecanic timp de 30 minute. Se trece într-o pîlnie de decantare pentru a separa faza organică, care se centrifughează în caz de formare a emulsiei.

Faza organică se pune într-un balon conic cu dop rodat. Vinul extras cu benzen, care corespunde stratului inferior în pîlnia de decantare, se toarnă într-un balon conic de 500 ml cu dop rodat, în care preventiv se iau 40 ml de acetat de etil. Se agită 30 minute şi se separă faza organică în modul descris anterior. Se va avea grijă să fie separată doar faza organică fără vin.

Pe o baie de apă la 100°C se evaporă fiecare solvent de extracţie, în cantităţi mici, în capsule de 50-60 mm în diametru, trecînd un curent de aer rece pe suprafaţa capsulelor. Se continuă evaporarea pînă ce reziduul va avea o consistenţă siropoasă.

Se dizolvă reziduul din capsula, unde s-a evaporat extractul benzenic, cu 0,5 ml soluţie etanol-apă (1:1). (0,25 ml de soluţie sînt suficiente pentru dizolvarea reziduului, restul 0,25 ml – pentru spălarea capsulei). Extractul hidroalcoolic obţinut se trece într-o eprubetă mică cu dop rodat (extractul B).

Reziduul din capsulă după evaporarea extractului de acetat de etil (care conţine ciclamatul), se dizolvă cu 0,5 ml de apă şi se trece într-o pîlnie de decantare. Se spală capsula cu 10 ml eter etilic, apoi eterul se adaugă la conţinutul din pîlnia de decantare. Se agită energic timp de 2 minute şi se separă stratul inferior într-o eprubetă în care în prealabil au fost luate 0,5 ml etanol. Se obţine în total 1 ml soluţie hidroalcoolică, care posibil conţine ciclamat (extractul A).

2.3.2. Cromatografierea.

Saharina şi ciclamatul

Pentru a determina saharina şi ciclamatul se utilizează o placă de celuloză: o jumătate din placă pentru a determina ciclamatul, cealaltă jumătate pentru saharină.

Pentru aceasta pe o jumătate din placă se depun 5-10 ľl extract A şi 5 ľl soluţie etalon de ciclamat, pe a doua parte a plăcii se depun 5-10 ľl extract B şi 5 ľl soluţie etalon de saharină. Placa astfel pregătită se pune în cuva cromatografică, conţinînd solventul nr.1 (acetonă-acetat de etil-amoniac), se lasă să migreze pînă la o înălţime de 10-12 cm.

Se scoate placa din cuvă şi se usucă cu aer cald, cu atenţie şi uniform se pulverizează, cu reactiv cu benzidină (17-18 ml pentru fiecare placă). Se usucă placa cu aer rece. Apoi placa se pune într-o etuvă la 120-125°C timp de 3 minute. Spoturile apar cenuşiu închis pe fon maro deschis; culoarea spoturilor se intensifică în timp.

P-4000 şi dulcina

Se depun 5 ľl de extract B şi cîte 5 ľl de soluţii etalon de dulcină şi P-4000 pe placa de poliamidă. Placa astfel pregătită se plasează în cuva cromatografică, care conţine solventul nr.2 (toluen-metanol-acid acetic). Se lasă să migreze pînă la o înălţime de 10-12 cm.

Se scoate placa din cuvă, se usucă cu aer rece, se pulverizează cu 15 ml de reactiv cu p-dimetilaminobenzaldehidă, după aceea se usucă cu aer rece pînă ce apar spoturile de culoare galben-oranj care corespund dulcinei şi P-4000.

Sensibilitate

Reactivul cu benzidină permite de a developa spoturile, care corespund la 2 ľg de saharină şi la 5 ľg de ciclamat.

Reactivul cu p-dimetilaminobenzaldehidă permite de a developa spoturile, care corespund 0,3 ľg de dulcină şi 0,5 ľg de P-4000.

Această metodă permite de a determina, ţinînd cont de randamentul anumitor tipuri de extracţii:

3. Metoda uzuală

3.1. Aparate:

dispozitiv pentru expunerea în strat subţire;

plăci de sticlă 20 × 20 cm: se amestecă uşor 9 g praf de celuloză şi 6 g praf de poliamidă. Se adaugă agitînd 60 ml de metanol. Se expune pe plăci un strat cu grosimea de 0,25 mm. Se usucă timp de 10 minute la 70°C. Această cantitate este suficientă pentru a pregăti 5 plăci;

baie de apă cu temperatură reglabilă sau evaporator rotativ;

lampă UV pentru examinarea plăcilor cromatografice.

3.2. Reactive:

ester de petrol (40-60°);

schimbător de ioni în formă lichidă, de exemplu, amberlite LA-2;

acid acetic diluat, 1:5 (v/v);

soluţie de schimbător de ioni: 5 ml de schimbător de ioni sînt amestecaţi minuţios cu 95 ml eter de petrol şi 20 ml acid acetic diluat la 1:5 (v/v). Se utilizează stratul de sus;

acid azotic în soluţie, 1 M;

acid sulfuric, 10%. (v/v);

amoniac diluat, 1:4 (v/v);

praf de poliamidă, de exemplu, Macherey-Nagel sau Merck;

praf de celuloză, de exemplu, Macherey-Nagel MN 300AC;

solvent pentru cromatografie: xilen: n-propanol: acid acetic glacial (ρ₂₀= 1,05 g/ml): acid formic (98-100%) în proporţie 45:6:7:2;

soluţie pentru developare:

soluţie de 0,2% de 2,7-diclorfluorosceină în etanol;

soluţie de p-dimetilaminobenzaldehidă: se dizolvă 1 g de p-dimetilaminobenzaldehidă plasat într-un balon cotat de 100 ml cu aproximativ 50 ml etanol. Se adaugă 10 ml acid azotic de 25% şi se aduce la cotă cu etanol;

soluţii etalon:

soluţie de dulcină, 0,1% în metanol;

soluţie de saharină, 0,1% în amestec de metanol şi apă în proporţie de 1:1;

soluţie de ciclamat: soluţia conţine 1 g de sare de sodiu sau de calciu al acidului

ciclohexilsulfamic în 100 ml de amestec de metanol şi apă în proporţie 1:1;

soluţie de vanilină , 1% într-un amestec de metanol şi apă în proporţie de 1:1;

soluţie de ester al acidului p-hidroxibenzoic, 1% în metanol.

3.3. Metoda de lucru

50 ml de vin se trec într-o pîlnie de decantare, se acidulează cu 10 ml acid sulfuric diluat şi se extrage în 2 reprize cu cîte 25 ml de soluţie de schimbător de ioni lichid. 50 ml soluţie obţinută se spală în 3 etape cu cîte 50 ml de apă distilată, care se lasă să se scurgă, apoi în 3 etape cu cîte 15 ml de amoniac diluat. Soluţiile amoniacale se unesc, apoi se evaporă atent pînă la sec la 50°C pe o baie de apă sau într-un evaporator rotativ. Reziduul se dizolvă cu 5 ml acetonă şi două picături de acid azotic, se filtreză şi din nou se evaporă la sec la o temperatură de 70°C pe baie de apă. Se evită încălzirea îndelungată şi la temperaturi mai mari de 70°C. Reziduul se dizolvă cu 1 ml metanol; 5-10 ľl de această soluţie şi 2 ľl de soluţii etalon sînt depuse pe placă. Se lasă să migreze solventul (xilen-n-propanol-acid acetic-acid formic) la o înălţime în jur de 15 cm (aproximativ 1 oră).

După uscarea la aer, placa se pulverizează cu soluţie de diclorfluorosceină. Saharina şi ciclamatul apar imediat sub formă de spoturi deschise pe un fond roz. La examenul în raze UV (254 sau 360 nm), cei trei îndulcitori se manifestă în culoare albastră pe fon galben.

Îndulcitorii se separă, de jos în sus, în ordinea următoare: ciclamat, saharină, dulcină.

Vanilina şi esterii acidului p-hidroxibenzoic au aceeaşi valoare a Rf ca şi dulcina. Pentru a identifica dulcina în prezenţa acestor compuşi, placa trebuie pulverizată cu o soluţie de p-dimetilaminobenzaldehidă. Dulcina apare sub forma de spot oranj, în timp ce ceilalţi compuşi nu reacţionează.

Sensibilitatea – cantitatea limită determinată pe placa cromatografică este de 5 ľg pentru toate trei substanţe.

Această metodă permite a determina: saharina 10 mg/l, ciclamat 50 mg/l şi dulcină 10 mg/l.

41. Analiza microbiologică a musturilor şi vinurilor

41.1. MA-MD-AS4-01-ANMICR

Scopul

Analiza microbiologică are ca scop urmărirea fermentării alcoolice şi/sau malolactice, depistarea riscurilor de contaminare microbiană, ceea ce permite a detecta toate anomaliile nu numai în produsul finit, dar şi pe parcursul diferitelor etape de fabricare.

Toate operaţiile se execută cu respectarea condiţiilor aseptice obişnuite la lucrările de microbiologie, utilizînd materiale sterilizate, în apropierea flăcării unui arzător Bunsen sau într-o cameră cu flux laminar şi prin flamarea orificiilor pipetelor, ţăvilor, flacoanelor etc.

Înainte de a efectua analiza microbiologică, este necesar a preleva corect probele pentru analiză.

Domeniul de aplicare

Analiza microbiologică poate fi aplicată vinurilor, musturilor, mistelelor şi în cazurile în care aceste produse sînt alterate de o activitate microbiană.

Tehnicile de analiză microbiologică

În funcţie de informaţia necesară să o obţinem, analiza microbiologică se efectuează, recurgînd la următoarele tehnici:

1. Analize cu menţinere:

analize cu menţinere la aer;

analize cu menţinere în etuve.

2. Identificarea microorganismelor şi numărarea directă a drojdiilor:

examenul microscopic al lichidului şi al sedimentului;

colorarea cu albastru de metilen;

colorarea Gram;

cercetarea catalazelor;

numărarea directă a drojdiilor la microscop.

3. Numărarea microorganismelor

3.1. Culturi în/şi pe mediu solid sau pe suport solid:

culturi pe placă;

culturi pe membrane filtrante.

3.2. Culturi în medii lichide – "Numărul Probabil" (NPP).

Materiale:

cameră cu flux laminar;

microscop;

etuvă pentru incubare la o temperatură 20-35°C, echipată cu un termometru;

etuvă pentru sterilizare la uscat la o temperatură de 180°C, echipată cu un termometru;

incubator de CO₂ sau vase, închise ermetic, echipate cu un generator de CO₂, sau alte dispozitive care asigură o atmosferă îmbogăţită de CO₂;

pH-metru, etalonat în unităţi de pH, care permite măsurări cu ±0,1 unităţi;

autoclavă, care permite sterilizarea potrivită cu vapori a materialelor şi a mediilor de cultură;

centrifugă;

baie de apă;

aragaz;

balanţă cu exactitatea de zecime de miligrame;

hematimetru-numărător de celule Neubauer sau echivalent;

dispozitiv pentru filtrare sterilă cu membrane filtrante cu diametru de 13 sau 25 mm, porozitate de 0,22 ľm, din esteri de celuloză sau fluorid de polivinilidină sau echivalente cu margini hidrofobe;

arzător Bunzen;

baloane cotate de 100 şi de 1000 ml;

baloane Erlenmeier de 100, 150, 300 şi 1000 ml închise cu dop din vată de bumbac sterilizat.

eprubete de 50, 100, 300, 500 şi 1000 ml;

pipete de 1, 10, 15, 20 şi 25 ml, sterilizate;

eprubete sterile pentru centrifugă;

eprubete din sticlă pentru autoclave, fără margine, cu dimensiunile 160 × 16 mm şi 180 × 18 mm, închise cu dop din vată de bumbac, în prealabil sterilizate, sau dispozitiv echivalent;

lame;

lamele;

pipete Pasteur, sterilizate;

ansă sterilizată;

hîrtie de filtru;

ulei de imersiune;

alcool de 70 şi 95% vol.

Se pot folosi şi alte echipamente cu condiţia că ele vor avea caracteristici echivalente.

Tehnici de prelevare a probelor

Este necesar ca probele să fie reprezentative. Se utilizează pipete pentru butoi şi tuburi lungi de sticlă pentru putini. Trebuie efectuate prelevările în locuri în prealabil sterilizate, pentru a evita contaminările exterioare, care ar da rezultate fals pozitive. Pentru a efectua prelevările cu "robinetul degustător" din butoaie, este necesar de a lăsa să curgă cîţiva litri de probă. Trebuie de dezinfectat suprafeţele de contact, de exemplu, cu alcool de 70% vol. sau cu flacără de gaz.

Analiza probelor trebuie efectuată cît e posibil de rapid după prelevare. În timpul transportării şi stocării probele trebuie plasate la rece (4 – 5)°C, pentru a stabiliza flora microbiană.

1. Experienţe cu menţinere

Scopul

Aceste experienţe se efectuează cu scopul de a preîntîmpina riscurile de alterare microbiană.

Principiul

Această tehnică este bazată pe modificările vizuale (tulbureli, opalescenţă, sedimente, culori nedorite) în vin care au loc sub acţiunea oxigenului din aer sau a temperaturii. Natura modificărilor verificate trebuie confirmată printr-un examen microscopic.

Metoda de lucru

1.1. Probe cu menţinere la aer

O mostră de 50 ml de vin după filtrare grosieră prin hîrtie de filtru sterilă este plasată într-un balon Erlenmeyer steril de 150 ml, astupat cu dop din vată de bumbac şi se lasă la o temperatură ambiantă în decurs de 3 zile. Limpezimea, culoarea, prezenţa unei tulbureli, a unui sediment, a unei opalescenţe sînt examinate în funcţie de timp. Un examen microscopic este efectuat în cazul unei tulbureli, unui sediment, unei opalescenţe sau unei culori nedorite.

1.2. Probe cu menţinere în etuvă

O mostră de 100 ml de vin după filtrare grosieră prin hîrtie de filtru sterilă este plasată într-un balon Erlenmeyer steril, astupat cu dop din vată de bumbac, este plasată într-o etivă la 30°C şi se examinează după cel puţin 72 ore. Modificările organoleptice pot servi ca indice de alterare microbiană. În aşa caz este necesar de efectuat un examen microscopic.

2. Identificarea microorganismelor şi numărarea directă a drojdiilor

2.1. Examenul microscopic al lichidelor şi al sedimentelor

Scopul

Examenul microscopic este necesar de efectuat cu scopul de a detecta şi de a diferenţia drojdiile de bacteriile eventual prezente.

Totodată, examenul microscopic nu permite a deosebi microorganismele vii de cele moarte. Cu o colorare vitală se poate de efectuat o estimare a drojdiilor vii.

Principiul

Această tehnică este bazată pe mărirea efectuată la microscop, care permite de a observa microorganismele, mărimea cărora este de ordinea micronilor.

Metoda de lucru

Examenul microscopic poate fi efectuat direct asupra lichidelor sau a sedimentelor.

Examinarea directă a lichidelor prezintă interes doar cînd populaţia microbiană este suficient de mare (mai mult de 5 × 10⁵ celule/ml).

Cînd în vin este prezentă o populaţie de microorganisme mai mică, este necesar de efectuat o concentrare. Astfel, se centrifughează circa 10 ml de vin la 3000 – 5000 rotaţii pe minută timp de 5 – 15 minute. Apoi se decantează lichidul de la suprafaţă şi se efectuează o omogenizare a sedimentului cu lichidul care a rămas la fundul tubului de centrifugă.

Pentru a realiza examenul microscopic, pe o lamă de sticlă se plasează, cu o pipetă Pasteur sterilă, o picătură de lichid sau de sediment omogenizate, se acoperă cu o lamelă şi se plasează sub platina microscopului. Se examinează în cîmp clar sau faze contraste, care permit observarea elementelor de structură a microorganismelor. Ca regulă, se utilizează o mărire de 400-1000 ori.

2.2. Colorarea microorganizmelor cu albastru de metilen

Scopul

Colorarea microorganizmelor cu albastru de metilen permite diferenţierea drojdiilor vii de cele moarte.

Principiul

Această colorare este bazată pe prezenţa în celulele vii a enzimelor, care reduc colorantul. Drept exemplu, albastrul de metilen este redus de celulele vii, care rămîn incolore. Celulele moarte absorb colorantul şi se colorează în albastru.

Reactivi:

soluţie de albastru de metilen, 0,1%: într-un balon Erlenmeyer se dizolvă 0,1 g de albastru de metilen în 100 ml de apă distilată. Se filtrează prin filtru de hîrtie. Soluţia trebuie să fie proaspăt preparată.

Metoda de lucru

Se plasează pe o lamă o picătură de probă şi o picătură de colorant. Se amestecă cu ajutorul ansei şi după 5 minute se studiază la microscop în cîmp luminos.

Rezultatele

Celulele vii rămîn incolore, iar celulele moarte se colorează în albastru.

Aceste metode de colorare nu sînt cu siguranţă şi se utilizează doar pentru numărări aproximative, ele nu sînt recomandate pentru bacterii. Pentru efectuarea diferenţierilor între microorganisme – drojdii şi bacterii – vii şi moarte, se aplică tehnici mai avansate, de exemplu, microscopie depifluorescenţă.

2.3. Colorare după metoda Gram

Scopul

Colorarea după metoda Gram se efectuează în scopul diferenţierii bacteriilor lactice (Gram-pozitive) de bacteriile acetice (Gram-negative) şi studierea morfologiei acestora.

Trebuie ţinut cont de faptul că colorarea după metoda Gram nu este concluzivă, deoarece în sedimentele cu bacterii lactice şi bacterii acetice pot fi prezente şi alte bacterii.

Principiul

Această colorare se bazează pe diferenţa între bacteriile Gram-pozitive şi Gram-negative, datorată structurii şi compoziţiei chimice diverse a pereţilor celulari. La bacteriile Gram-negative pereţii celulari sînt bogaţi în lipide şi au o cantitate foarte redusă de peptidoglucane, ceea ce permite pătrunderea alcoolului şi dizolvarea complexului violet de genţiană-iod format, lăsînd celulele incolore, care apoi se recolorează în roşu de către safranine, pe cînd, pereţii celulelor de bacerii Gram-pozitive au o cantitate mare de peptidoglucane şi o concentraţie mică de lipide. Grosimea pereţilor de peptidoglucane şi dehidratarea produsă de alcool nu permite pătrunderea alcoolului în celulă, de aceea colorarea violetă sau albastru-închis a complexului violet de genţiană-iod se păstrează.

Există mai multe modificări ale tehnicii de colorare după Gram. Colorarea după metoda Gram pierde semnificaţia sa, dacă este realizată pe o cultură prea veche. Tulpina analizată trebuie să se afle în faza de creştere exponenţială în decurs de 24-48 ore.

Soluţii

Se utilizează doar apa distilată.

1. Soluţie de violet de genţiana: 2 g de violet de genţiana se trec într-un balon Erlenmeyer de 100 ml şi se dizolvă în 20 ml de alcool de 95% vol.; 0,8 g oxalat de amoniu se dizolvă în 80 ml de apă distilată. Se amestecă aceste două soluţii şi se utilizează după 24 ore. Se filtrează prin hîrtie înaintea utilizării. Se păstrează la întuneric într-un flacon închis.

2. Soluţie de lugol: 2 g de iodură de potasiu se dizolvă într-o cantitate mică de apă (4-5 ml) şi în această soluţie saturată se dizolvă 1 g de iod. Volumul se completează pînă la 300 ml cu apă distilată. Se păstrează la întuneric într-un flacon închis.

3. Soluţie de safranine: 0,5 g de safranine se trec într-un balon Erlenmeyer de 100 ml, se dizolvă în 10 ml de alcool de 95% vol. şi se adaugă 90 ml de apă. Se agită. Se păstrează la întuneric într-un flacon închis.

Metoda de lucru

Pregătirea preparatelor microscopice.

Se efectuează o însămînţare de bacterii pe mediu lichid sau solid. Se colectează cu ansa sau cu o sîrmă cultura tînără de bacterii din sediment (după centrifugarea culturii lichide) sau direct din mediul solid şi se amestecă cu o picătură de apă sterilizată.

Se prepară pe o placă un frotiu, întinzîndu-se o picătură de suspensie microbiană într-un strat subţire şi uniform. Se lasă să se usuce frotiul. Apoi, pentru fixarea frotiului , se plasează repede placa de 3 ori în interiorul unui arzător Bunsen sau printr-o tehnică echivalentă. După răcire se efectuează colorarea.

Colorarea:

se picură pe frotiul fixat cîteva picături de soluţie violet de genţiana. Se lasă să reacţioneze 2 minute şi se spală cu apă;

se picură una sau două picături de soluţie de lugol. Se lasă să reacţioneze 30 secunde. Se spală cu apă şi se usucă pe hîrtie de filtru;

se picură alcool de 95% vol., se lasă să reacţioneze 15 secunde. Se spală cu apă şi se usucă pe hîrtie de filtru;

se picură cîteva picături de soluţie de safranine, se lasă să reacţioneze 10 secunde. Se spală cu apă şi se usucă pe hîrtie de filtru;

pe frotiul colorat se picură o picătură de ulei de imersie. Se examinează la microscop cu obiectivul de imersie în cîmp luminos.

Rezultatele:

bacteriile lactice rămîn colorate în violet sau în albastru-închis (Gram-pozitive);

bacteriile acetice se colorează în roşu (Gram-negative).

2.4. Examinarea catalazei

Scopul

Scopul examinării este de a diferenţia bacteriile acetice de cele lactice. Levurile şi bacteriile acetice au o reacţie pozitivă la catalază, bacteriile lactice – negativă.

Trebuie ţinut cont de faptul că cercetarea catalazei nu este concludentă, deoarece în afara bacteriilor lactice şi acetice pot fi prezente şi alte bacterii.

Principiul

Reacţia cu catalaza este bazată pe proprietatea microorganismelor aerobe de a descompune peroxidul de hidrogen cu eliberarea de oxigen:

Reactivi

Soluţie de peroxid de hidrogen, 3%: se iau 10 ml de peroxid de hidrogen de 30% într-un balon cotat de 100 ml şi se completează volumul cu apă distilată proaspăt pregătită. Se agită şi se păstrează în frigider într-un flacon închis. Soluţia trebuie să fie proaspăt preparată.

Metoda de lucru

Pe o lamă se ia o picătură de soluţie de peroxid de hidrogen de 3% vol., apoi pe această picătură se adaugă puţină colonie tînără. Dacă se eliberează gaze, deducem că cultura conţine catalze. Uneori este dificil de a observa degajarea de gaze, îndeosebi de coloniile de bacterii, de aceea, în acest caz, este necesar de a examina preparatul la microscop (obiectiv × 10).

2.5. Numărarea directă a levurilor la microscop

Scopul

Numărarea directă la microscop are drept scop evaluarea populaţiei totale de levuri (vii şi moarte). Această tehnică este indicată numai pentru numărarea levurilor.

Numărarea bacteriilor este dificilă şi aproximativă din cauza dimensiunilor lor mici şi, în principal, din cauza prezenţei de particule coloidale. Se poate de folosit această tehnică pentru estimarea aproximativă a celulelor vii, recurgînd la colorarea vitală cu albastru de metilen.

Principiul

Tehnica este bazată pe numărarea cu ajutorul microscopului a microorganismelor într-un volum de probă cunoscut. Dispozitivele de măsurare a acestui volum sînt lamelele speciale de tipul hematimetre sau numărătoare de celule. Lamelele includ o suprafaţă delimitată, care, acoperită cu o lamelă groasă plată, reţine un volum cunoscut de probă.

Există diverse numărătoare de celule. Ca exemplu, numărătoare de celule Neubauer, care include o cavitate centrală de 0,1 mm adîncime şi o suprafaţă de 1 mm². Fundul cavităţii este împărţit în 400 mici pătrate. Astfel, volumul probei care corespunde unui pătrat mic este de 1/400 mm³.

Metoda de lucru

Pe planul central al lamelei se plasează, evitînd revărsarea, o picătură de probă omogenizată. Se acoperă cu o lamelă groasă cu evitarea formării bulelor de gaz. Se lasă în repaus cîteva minute pentru a se fixa.

Concentraţia trebuie să fie nici prea concentrată şi nici prea diluată. Cînd este vorba de o concentraţie foarte densă, proba trebuie diluată. Din contra, cînd numărul celulelor este mic, trebuie de efectuat o concentrare prin centrifugare.

Numărarea cu microscopul a microorganismelor se efectuează cînd numărul acestora este cuprins între 200 şi 500 de celule. Trebuie de evitat numărarea aceloraşi celule de două ori. În scopul obţinerii unei cifre mai precise, , trebuie de efectuat numărarea în diferite cîmpuri. Drept exemplu se poate de numărat 5 pătrate mari (fiecare conţinînd 16 pătrate mici), 1 din centru şi 4 din extremităţile planului cadrilat sau 5 pătrate mari pe diagonală. Se recomandă efectuarea numărării de 2 ori. Se calculează media aritmetică a două numărări, rezultatul se împarte la 400 pătrate mici şi se înmulţeşte la 10⁴ pentru a-l exprima în celule pe mililitru. Dacă, eventual au fost efectuate diluări sau concentrări, se ţine cont de factorul de diluare sau de concentrare.

3. Numărarea microorganismelor în cultură

Scopul

Numărarea microorganismelor în cultură are ca scop evaluarea nivelului de contaminare a probei, adică de a estima stabilitatea ei microbiană, deoarece microorganismele vii sînt capabile să altereze produsul.

În funcţie de mediul de cultură utilizat şi condiţiile de cultură, se poate de evidenţiat trei tipuri de microorgamisme: levuri, bacterii lactice şi bacterii acetice.

3.1. Cultură în mediul solid

Principiul

Această metodă este bazată pe presupunerea că un microorganism viu, cultivat în/sau pe mediu sau suport solid nutritiv specific şi în condiţii convenabile, se multiplică formînd o colonie vizibilă cu ochiul liber.

3.1.1. Cultură pe suport

Scopul

Această tehnică de numărare a microorganismelor se utilizează cînd concentraţia microbiană este mare şi se efectuează diluări.

Materiale

Pe lîngă materialele precedent indicate se utilizează:

cutia Petri (plăci) de 57 cm² (plastică) sau de 65 cm² (sticlă Pyrex);

diluanţi şi medii solide de cultură (vezi anexele nr.4 şi nr.5).

Metoda de lucru

Numărarea coloniilor în cutia Petri poate fi realizată prin incorporare în masă sau pe suprafaţa mediului corespunzător a probei după incubarea convenabilă.

Diluarea

Deoarece nu se ştie concentraţia microbiană preventivă, se realizează diluări succesive, decimale şi în creştere, în aşa mod, pentru a obţine numărul coloniilor cel mai favorabil (între 30 şi 300 colonii) pentru numărarea coloniilor.

Se poate de efectuat la microscop o estimare aproximativă a diluărilor. În acest scop, din lotul unei probe omogenizate, se prepară o serie de diluări zecimale (1:10) în dizolvant.

În primul tub se prelevă 1 ml de probă şi se adaugă 9 ml de dizolvant. Se omogenizează. În al doilea tub se prelevă 1 ml din diluarea precedentă şi se adaugă 9 ml de dizolvant. Se continuă diluarea pînă ce ultima diluare este convenabilă, corespunzător populaţiei microbiale presupuse, cu utilizarea de pipete sterile pentru fiecare diluare (vezi schemele din anexa nr.1).

Prepararea inoculărilor prin incorporare în agar

Se prepară cutii Petri astfel încît să putem obţine o diluare care dă un număr între 30 şi 300 colonii.

Se inoculează 1 ml de probă şi 1 ml din fiecare diluare preparată în două cutii Petri, diluările se aleg corespunzător populaţiei microbiene presupuse şi imediat se omogenizează; se utilizează diferite pipete sterile sau pipete automate cu conuri hidrofobice . Apoi, se introduc 15 ml de mediu de cultură agar, la o temperatură de aproximativ 42 – 45°C, în prealabil lichefiată pe o baie de apă în fierbere sau într-un cuptor cu microunde, cu evitarea unei încălziri îndelungate. Se omogenizează imediat şi atent, efectuînd mişcări circulare în două direcţii, cu evitarea formării bulelor de aer şi revărsărilor. Se răcesc pe o suprafaţă plată pînă la solidificare.

Prepararea inoculărilor pe o suprafaţă de mediu de agar

Se iau 0,1 – 0,2 ml de probă din diluările selectate, astfel încît pe suprafaţa de agar să nu fie o cantitate excesivă de lichid, care ar putea influenţa calitatea distribuirii. Se recomandă utilizarea diluţiilor de 10 ori mai concentrate decît în metoda de încorporare în agar. Pe suprafaţa mediului nutritiv se efectuează o distribuire omogenă a probei selectate, cu ajutorul unui distribuitor de sticlă, spălat cu alcool şi trecut prin flacără.

Cutiile Petri se incubează în etuve în poziţie inversată:

levurile – la o temperatură 20 – 25°C, timp de 3 – 10 zile, în condiţii de aerobioză (Pentru numărarea levurilor, este suficient incubarea timp de 3 zile. Dacă se presupune prezenţa de Dekkera Brettanomyces, incubarea trebuie efectuată 7 – 10 zile);

bacteriile lactice – la o temperatură de 25°C timp de 4 – 10 zile în condiţii de anaerobioză sau microaerofilie;

bacteriile acetice – la o temperatură de 25 – 30°C timp de 2-4 zile în condiţii de aerobioză.

Se efectuează numărarea coloniilor dezvoltate cu ochiul liber sau cu ajutorul unei lupe sau cu un numărător de colonii. Dacă există îndoieli, se confirmă identitatea coloniilor (levuri sau bacterii) la microscop.

Se testează sterilitatea mediului, diluantului şi a materialului, efectuînd o probă în alb cu un eşantion de apă sterilă pentru fiecare serie de probe.

Rezultatele

Rezultatele se exprimă în unităţi formătoare de colonii/ml – UFC/ml (în loc de microorganisme/ml, deoarece fiecare colonie poate fi rezultată dintr-un microorganism sau dintr-un conglomerat de microorganizme ), cu notarea ştiinţifică cu o zecimală (de exemplu, 1100 raportată cum "1,1 × 10³ UFC/ml").

Cînd numărul coloniilor este evaluat vizual rezultatele se exprimă în UFCE/ml (E – estimativ).

Se efectuează numărarea pe suporturile care conţin între 30 şi 300 colonii. Se calculează UFC/ml înmulţind media aritmetică a numărului coloniilor cu factorul de diluare. Se indică durata incubaţiei.

Reguli pentru calcularea UFC prin numărare şi estimare

1. Se efectuează numărarea precisă a coloniilor fiecărei diluări care conţine între 30 şi 300 colonii şi se calculează media aritmetică.

2. Dacă nici una din cutiile unei diluări nu conţine între 30-300 colonii, se calculează media aritmetică a numărului coloniilor din ambele cutii corespunzătoare acestei diluări.

3. Dacă două diluări consecutive conţin între 30 şi 300 colonii, se calculează media aritmetică pentru a calcula, cu condiţia că cel mai mare număr nu depăşeşte cea mai mică valoare de două ori. În cazul în care depăşeşte dubla valoare, se utilizează cea mai mică valoare. De exemplu, 150 (diluarea 10^-1) şi 350 (diluarea 10^-2), raportul 350/150 este mai mare de 2. Astfel, se utilizează cel mai mic număr, adică 150, şi se calculează UFC/ml, înmulţind cu factorul de diluare.

4. În cazul în care toate cutiile au mai puţin de 30 colonii, se ia în considerare numai cutiile unde diluarea este cea mai mică. Se determină media aritmetică şi se prezintă rezultatele cu aproximaţie.

5. În cazul în care cutiile cu toate diluările nu conţin colonii şi nu sînt prezente substanţe inhibatoare, se consideră numărul ca "< 1,0", cel mai mic factor de diluare (se înmulţeşte la factorul de diluare şi se exprimă rezultatul cu aproximaţie). De exemplu, dacă nu sînt colonii în diluarea 10^-2 (cea mai mică), rezultatele trebuie raportate ca "< 1,0 × 10^-2 UFCE/ml").

6. Dacă toate cutiile conţin mai mult de 300 colonii, se consideră numărarea mai aproape de 300. Astfel, se iau în considerare numai cutiile cu cea mai mare diluare şi se prezintă rezultatele cu aproximaţie.

7. Dacă numărul coloniilor în cutie depăşeşte cu mult 300, rezultatul nu se va raporta ca fiind "TNTC" (too numerous to count). Dacă sînt mai puţin de 10 colonii/cm², se numără 13 pătrate (cu numărătorul de colonii). Se calculează media aritmetică pentru pătrat şi se multiplică cu factorul necesar pentru a calcula coloniile cutiei. În mod similar, cînd sînt mai mult de 10 colonii/cm³, se numără 4 pătrate reprezentative, se calculează media aritmetică pentru fiecare pătrat şi se face calculul cum e indicat mai sus. Pentru cutia cu suprafaţa de 57 cm² factorul este 57, iar pentru cutia cu suprafaţa de 65 cm² – 65.

8. Cînd este o suprapopulaţie în cutii, mai mult de 100 colonii/cm², se raportează rezultatele estimativ. Pentru a calcula, se înmulţeşte 5700 sau 6500 cu cel mai mare factor de diluare. Drept exemplu, pentru o diluare de 10^-3, UFCE sînt raportate ca "> 5,7 × 10⁶ UFCE/ml" sau ca "> 6,5 × 10⁶ UFCE/ml".

3.1.2. Metode de filtrare prin membrane

Scopul

Scopul prezentei metode constă în efectuarea numărării microorganismelor cînd populaţia microbiană este mică. Se efectuează concentrarea microorganismelor care sînt reţinute pe o membrană de filtrare cu o porozitate convenabilă după filtrarea unui volum determinat de eşantion.

Materiale

Pe lîngă materialele precedent indicate:

pompă în vid sau un dispozitiv echivalent;

sistem pentru filtrare (filtru şi pîlnie) pentru membrane de 47 mm în diametru. Poate fi din oţel inox, din Pyrex, din plastic autoclavabil sau steril nonautoclavabil;

rampă pentru filtrare sau balon în vid;

capcană pentru inserare între balon şi pompa de vid;

cleşte pentru fixare;

cleşte cu margini rotunjite pentru membrane;

cleşte pentru introducerea ansamblului pentru filtrare atunci cînd se sterilizează (prin flacără, imersie în apă clocotindă);

vas din inox pentru sterilizarea în apă în fierbere a sistemului pentru filtrare;

membrane filtrante din esteri de celuloză de 47 mm în diametru, cu marginile hidrofobe, de preferinţă albe, cadrilate de 0,2 ľm, 0,45 ľm sau 0,8 ľm porozitate. De preferinţă, se utilizează membrane sterile în ambalaj individual, furnizate în comerţ. În caz contrar, se sterilizează în autoclav timp de 10 minute la 121°C; cutii Petri din sticlă Pyrex sau plastic – 60 minute;

tampoane absorbante sterile.

1. Medii de cultură (a se vedea anexa nr.5)

Metoda de lucru

1. Prepararea plăcilor

Se prepară un număr necesar de cutii Petri cu mediu de cultură potrivit. Membranele filtrante pot fi plasate pe mediu de gelatină adecvat sau pe un suport solid – tampon absorbant îmbibat cu mediu nutritiv lichid potrivit.

a) Cutii Petri cu mediu de gelatină potrivit (a se vedea anexa nr.5):

se introduc în cutiile Petri cu diametrul de 60 mm circa 6 ml de mediu solid, în prealabil lichefiat pe baia de apă şi răcit pînă la 45°C. Se lasă să se solidifice pe o suprafaţă plată. Se răstoarnă cutiile, pentru a le utiliza peste 2-3 ore. Se vor putea utiliza cutiile deja preparate cu condiţia că ele nu sînt contaminate şi nu sînt uscate.

b) Cutii Petri cu mediu lichid potrivit (a se vedea anexa nr.5):

Dacă se va utiliza mediu nutritiv lichid-membranele sînt instalate în cutiile Petri pe un tampon absorbant, îmbibat cu mediu lichid.

Pentru prepararea cutiilor cu mediu nutritiv lichid se deschide cutia Petri şi se introduce un tampon absorbant steril (sînt necesare cutii sterile şi tampoane absorbante sterile). Se utilizează, în general, fiole de 2 ml cu mediu nutritiv lichid potrivit, furnizate în comerţ, sau echivalentul acestora. Din fiola de 2 ml se toarnă aproximativ 1,8 ml pe tamponul absorbant, cu repartizare uniformă pe toată suprafaţa.

2. Filtrarea probei

Înainte de a se începe filtrarea, dispozitivele de filtrare se sterilizează în autoclave. Între filtrări, dispozitivele din oţel sau sticlă Pyrex se clătesc cu alcool şi se trec prin flacăra arzătorului Bunsen sau se scufundă în apă clocotindă timp de 5 minute. Pentru utilajele din plastic se pot utiliza mijloace de sterilizare alternative ca, de exemplu, o radiaţie ultravioletă cu o expunere de 2 minute sau alţi agenţi chimici sau fizici potriviţi.

Se instalează o capcană între balon pentru vid şi pompă de vid. Se adaptează ansamblu pentru filtrare pe balonul de vid. Se fixează pîlnia pe suportul pentru filtrare cu un cleşte de fixare. Se introduc cîţiva mililitri de apă sterilă pentru a provoca o bună aderenţă a membranei cu suportul de filtrare şi se lasă să se scurgă complet.

Cu ajutorul unei pensete, preventiv trecută prin flacără şi răcită, se retrage din ambalajul steril membrana filtrantă de porozitatea corespunzătoare. Membrana se plasează pe baza suportului de filtrare, în centru, cu cadrilajul în sus.

Se introduce un volum convenabil de probă omogenizat cu o populaţie presupusă. Cifrele considerate pentru numărarea coloniilor se găsesc între 20 şi 200. Ideal ar fi valoarea de la 60 pînă la 80 colonii, ca să fie posibilă o bună diferenţiere.

După filtrare, vidul se întrerupe cu grijă pentru a evita refluxul (Volumul de filtrare variază, în general, între 25 şi 500 ml. Trebuie de fiecare dată de turnat un volum cunoscut de probă. Dacă volumul de probă este mai mic de 20 ml, cu ajutorul unei pîlnii sterile se adaugă un volum de apă sterilă ca să acopere membrana şi apoi cu pipeta sterilă se toarnă proba pentru filtrare).

Se scoate pîlnia, cu o pensetă trecută prin flacără şi răcită se scoate membrana şi se aşează pe mediul de cultură din cutia Petri, cu cadrilajul în sus. Se evită formarea bulelor de aer între membrană şi mediu, care pot împiedica contactul omogen şi, ca urmare, dezvoltarea microbiană corectă.

Se răstoarnă cutia şi se incubează în etuvă pentru un timp şi în condiţii convenabile pentru acele microorganisme, pe care vrem să le detectăm.

Pentru drojdii

Se utilizează membrane filtrante cu porozitate 0,45 ľm sau 0,8 ľm , mediu agar YEPD (a se vedea anexa nr.5) şi se incubează în condiţii aerobioze la o temperatură de 20-25°C, timp de la 3-10 zile (Pentru numărarea drojdiilor este suficientă incubarea de 3 zile. Dacă se presupune o prezenţă de Dekkera Brettanomyces, incubarea trebuie să fie efectuată timp de 7-10 zile).

Pentru bacterii lactice

Se utilizează membrane filtrante cu porozitatea de 0,2 ľm sau 0,45 ľm, mediu de cultură de agar corespunzător (vezi anexa nr.5), se incubează în condiţii anaerobioze sau microaerofilie la 25°C. Durata incubării poate atinge 10 zile.

Pentru bacterii acetice

Se utilizează membrane filtrante cu porozitate de 0,2 ľm sau 0,45 ľm, mediu de cultură de agar corespunzător (vezi anexa nr.5), se incubează în condiţii aerobioze la 25-30°C, timp de 2-4 zile.

Se face numărarea coloniilor dezvoltate cu ochiul liber sau cu ajutorul unei lupe sau cu un numărător de colonii. Dacă sînt îndoieli, se face confirmarea identităţii coloniilor (drojdii sau bacterii) la microscop.

Se testează sterilitatea mediilor, membranelor filtrante şi materialelor, efectuînd o mostră în alb pe o probă de apă sterilă, pentru fiecare serie.

Rezultatele

Se exprimă rezultatele în unităţi formatoare de colonii/ml-UFC/ml (în loc de microorganisme/ml, deoarece fiecare colonie poate fi rezultată dintr-un microorganism sau dintr-un conglomerat de microorganisme). Cînd se filtrează un volum mare de vin şi numărul de colonii dezvoltate este foarte mic, rezultatele se pot prezenta raportate la volumul utilizat.

Dacă nu a avut loc dezvoltarea coloniilor şi dacă nu sînt prezente substanţe inhibitoare, se atribuie rezultatele ca "<1,0 UFC " către un volum de vin mai mare filtrat.

Se numără toate coloniile pe membrană, cînd pe un pătrat se regăsesc 1-2 colonii. Cînd se obţine un număr excesiv de colonii pe membrane, se repetă analiza probei cu utilizarea unei cantităţi mai mici de probă. Dacă numărul coloniilor este foarte mare, depăşeşte 200, numărările se fac cînd coloniile nu se ating şi repartizarea lor poate fi considerată reprezentativă. Dacă aceasta nu este posibil, se raportează rezultatele ca "TNTC" (too numerous tocuont).

Se face referire la porozitatea membranelor utilizate şi la durata incubaţiei.

3.2. Cultură în mediu lichid – "cel mai probabil număr" (NPP):

Scopul

Scopul metodei constă în evaluarea numărului de microorganisme viabile în vinuri, cu un conţinut mărit de particule solide în suspensie şi/sau indici măriţi de colmatare.

Principiul

Prezenta tehnică este bazată pe evaluarea numărului de microorganisme vii în mediu lichid, reieşind din principiul repartizării normale în probă.

Diluanţi şi medii lichide de cultură (vezi anexele nr.4 şi nr.5).

Metoda de lucru

Se prepară cîteva diluţii cantitative şi succesive. După incubarea acestei serii de diluări, o oarecare parte din diluări nu va da creştere microorganismelor (probe negative), o altă parte se află în stadiul de dezvoltare a microorganismelor (probe pozitive).

Dacă eşantionul şi diluţiile sînt omogene şi numărul de diluţii este suficient de mare, este posibil a face calculul statistic al rezultatelor, utilizînd tabelele corespunzătoare (tabele bazate pe calculul probabilităţilor McCrady) şi se generalizează acest rezultat la proba iniţială.

Prepararea diluţiilor

Din proba de vin omogenizată, se prepară o serie de diluţii decimale (1:10) cu un diluant. În prima eprubetă se ia 1 ml de vin şi se adaugă 9 ml de diluant. Se omogenizează. În a doua eprubetă se iau 1 ml din prima eprubetă şi 9 ml de diluant. Se continuă acest mod de diluţii pînă la ultima diluţie convenabilă, conform populaţiei microbiene dorite, utilizînd pipete sterile pentru fiecare diluţie. Diluţiile trebuie să fie realizate pînă la lipsa dezvoltării microorganismelor în ultima diluţie (vezi schema din anexa nr.2).

Prepararea inoculaţiilor

Se inoculează 1 ml de vin şi 1 ml din fiecare diluţie preparată la momentul dat, în trei eprubete cu mediu de cultură respectiv (a se vedea anexa nr.5). Se omogenizează. Se incubează eprubetele inoculate în etuvă la o temperatură de 25°C, pentru drojdii (de la 3 pînă la 10 zile), în condiţii aerobioze, pentru bacteriile lactice, în condiţii anaerobioze sau microaerofilie (de la 8 pînă la 10 zile), efectuînd observaţii periodic pînă în ultima zi de incubare.

Rezultatele

Se consideră pozitive toate eprubetele care prezintă o dezvoltare microbiană, caracteristică prin formarea unui sediment albiu şi/sau cu o tulbureală. Rezultatele se confirmă la microscop. Se face referire la durata incubaţiei.

Se notează numărul eprubetelor pozitive şi negative de fiecare combinaţie în trei eprubete (de fiecare diluţie). Ca exemplu "3-1-0" semnifică: trei eprubete pozitive în diluţia 10⁰ (vin), una în diluţia 10^-1 şi zero în diluţia 10^-2.

Pentru un număr de diluţii mai mare de trei, numai trei din aceste rezultate sînt semnificative. Pentru selectarea rezultatelor adoptate la determinarea "NPP" este necesar de a determina "numărul caracteristic", conform exemplelor din tabelul de mai jos.

Calcularea celui mai probabil număr (NPP)

Ţinînd cont de numărul caracteristic obţinut, se determină NPP cu ajutorul tabelului A (anexa nr.3), în baza teoriei probabilităţilor McCrady, luînd în considerare diluţiile efectuate. Dacă concentraţiile sînt de 10⁰, 10^-1, 10^-2, se citeşte direct. Dacă concentraţiile sînt de 10¹, 10⁰, 10^-1, rezultatul se înmulţeşte cu 0,1, dacă concentraţiile sînt de 10^-1, 10^-2, 10^-3 rezultatul se înmulţeşte cu 10.

Dacă este necesar de a mări nivelul de detecţie, se poate folosi concentraţia de 10¹ de vin. Pentru a obţine această concentraţie de microorganisme la 1 ml, se centrifughează 10 ml de vin şi se prelevă 1 ml de sediment (după extragerea a 9 ml de lichid de la suprafaţă), apoi se inoculează în modul descris mai sus.

Exprimarea rezultatelor

Conţinutul de microorganisme în vin trebuie prezentat în germeni la mililitru, cu notarea cu o zecimală. Dacă conţinutul este inferior de 1,0 germeni la mililitru, rezultatul trebuie de prezentat ca "<1,0 germeni /ml".

Anexa nr.4 – (OENO 8/95)

Diluanţi

Diluanţii sînt indicaţi în calitate de exemple.

Apa utilizată trebuie să fie distilată, bidistilată sau deionizată, fără urme de metale, inhibitori sau alte substanţe antimicrobiene.

1. Apă fiziologică: într-un balon de 1000 ml se iau 8,5 g de clorură de sodiu. După dizolvarea în apă, se ajustează pînă la volumul de referinţă. Se omogenizează. Se filtrează. Se repartizează cîte 9 ml în eprubete. Se închide cu dop de bumbac şi se autoclavează 20 minute la 121°C.

2. Soluţia de clătire de 1/4: într-un balon de 1000 ml se iau 2 250 g clorură de sodiu, 0,105 g clorură de potasiu, 0,120 g clorură de calciu (CaCl₂× 6H₂O), 0,050 g hidrogenocarbonat de sodiu. După dizolvare în apă, se ajustează pînă la volumul de referinţă. Se omogenizează. Se repartizează cîte 9 ml în eprubete. Se închide cu dop de bumbac şi se autoclavează 15 minute la 121°C.

Anexa nr.5 – (OENO 8/95)

Medii de cultură

Mediile de cultură şi antimicrobiene sînt indicate în calitate de exemplu.

Apa utilizată trebuie să fie distilată, bidistilată sau deionizată, fără urme de metale, inhibitori sau alte substanţe antimicrobiene.

1. Medii de cultură solide

1.1. Pentru drojdii:

Mediu YEPD (Extract de drojdie, peptonă, dextroză), geloze + cloramfenicol)

Preparare: într-un balon Erlenmeyer de 1000 ml se cîntăreşte 10 g extract de drojdie (Difco sau echivalent), 20 g de peptonă, 20 g de glucoză şi 100 mg de cloramfenicol. Se dizolvă în 450 ml de apă.

Separat, se dizolvă 20 g de geloză cu 500 ml de apă, într-un balon de 1000 ml, se plasează într-o baie fierbinte, agitînd frecvent şi evitînd o încălzire prelungită. După dizolvarea totală, se adaugă soluţia precedentă, volumul se completează pînă la 1000 ml cu apă şi se amestecă. Se distribuie în eprubete Boucher cîte 15 ml (pentru enumerare pe suport) şi cîte 6 ml (pentru enumerare cu filtrare prin membrane). Se închid cu dop de bumbac şi se autoclavează timp de 15 minute la 121°C.

În locul cloramfenicolului, pe suprafaţă în momentul distribuţiei mediului, se poate de adăugat penicilină 20 U/ml şi streptomicină 40 U/ml.

1.2. Pentru bacterii lactice

Mediu Lafon-Lafurcade şi al. geloză + actidion

Preparare: într-un vas Erlenmeyer de 1000 ml se cîntăresc 5 g de extract de drojdie, 10 g de extract de carne, 15 g de pepton tripsic, 5 g de acetat de sodiu, 2 g de citrat de amoniu, 0,05 g de sulfat de magneziu, 0,2 g de sulfat de mangan, 20 g de glucoză şi 50 mg de actidion. Se dizolvă în 400 ml de apă şi se corectează pH pînă la 5,4 cu o soluţie de hidroxid de sodiu 1 N sau cu o soluţie de acid clorhidric de 1 N. Se adaugă 1 ml de Tween 80.

Separat, într-un balon de 1000 ml, se dizolvă 20 g de geloză cu 500 ml de apă, se plasează într-o baie fierbinte, agitînd frecvent şi evitînd o încălzire prelungită. După dizolvarea totală, se adaugă soluţia precedentă şi volumul se completează pînă la 1000 ml cu apă. Se amestecă şi se distribuie în eprubete Boucher cîte 15 ml (pentru enumerare pe suport) şi cîte 6 ml (pentru enumerare cu filtrare prin membrane). Se închid cu dop de bumbac şi se autoclavează timp de 20 minute la 121°C.

Mediu Dubois (mediu 104), geloză + actidion

Preparare: într-un balon Erlenmeyer de 1000 ml se cîntăresc 5 g de extract de drojdie (Difco), 5 g de peptonă, 3 g de acid L-malic, 0,05 g de sulfat de magneziu, 0,05 g de sulfat de mangan, 50 mg de actidion. Se dizolvă în 200 ml de apă. Se adaugă 250 ml de suc de tomate şi se corectează pH la 4,8 cu o soluţie de hidroxid de sodiu 1 N sau de acid clorhidric de 1N. Se adaugă o picătură de Tween 80.

Separat, într-un balon de 1000 ml se dizolvă 20 g de geloză cu 500 ml de apă, se plasează într-o baie fierbinte, agitînd frecvent, evitînd o încălzire prelungită. După dizolvarea totală, se adaugă soluţia precedentă şi se completează pînă la 1000 ml cu apă. Se amestecă şi se distribuie în eprubete Boucher cîte 15 ml (pentru enumerare pe suport) şi cîte 6 ml (pentru enumerare cu filtrare prin membrane). Se închid cu un dop de bumbac şi se autoclavează timp de 20 minute la 121°C.

Mediu TJB (Tomato Luice Broth), geloză + actidion

Preparare: într-un balon Erlenmeyer de 1000 ml se cîntăresc, 5 g de glucoză, 2 g de triptonă (Difco), 5 g de peptonă (Difco), 5 g extract de drojdie (Difco), 1 g de extract de ficat şi 50 mg de actidion. Se dizolvă în 400 ml de suc de tomate. Se corectează pH la 5,5 cu o soluţie de hidroxid de sodiu 1 N sau cu acid clorhidric de 1 N. Se adaugă o picătură de Tween 80.

Separat, într-un balon de 1000 ml se dizolvă 20 g de geloză cu 500 ml de suc de tomate, se plasează într-o baie fierbinte, agitînd frecvent şi evitînd o încălzire prelungită. După dizolvarea totală, se adaugă soluţia precedentă şi se completează pînă la 1000 ml cu suc de tomate.

Se amestecă şi se distribuie în eprubete Boucher cîte 15 ml (pentru enumerare pe suport) şi cîte 6 ml (pentru enumerare cu filtrare prin membrane). Se închid cu dop de bumbac şi se autoclavează timp de 20 minute la 121°C.

Sucul de tomate se diluează de 4,2 ori şi se filtrează prin Watman nr.1 (1000 ml).

1.3. Pentru bacteriile acetice

Mediu G2, geloză + actidion

Preparare: într-un balon Erlenmeyer 1000 ml se cîntăresc 1,2 g de extract de drojdie, 2 g de fosfat de amoniu, 50 mg de actidion. Se adaugă 500 ml de cidru şi se corectează pH pînă la 5 cu o soluţie de hidroxid de sodiu 1 N sau cu o soluţie de acid clorhidric de 1 N.

Separat, într-un balon de 1000 ml, se dizolvă 20 g de geloză cu 450 ml de apă, se plasează într-o baie fierbinte, agitînd frecvent şi evitînd o încălzire prelungită. După dizolvarea totală se adaugă soluţia precedentă şi se completează pînă la 1000 ml cu apă. Se amestecă şi se distribuie în eprubete Boucher cîte 15 ml (pentru enumerare pe suport) şi cîte 6 ml (pentru enumerare cu filtrare prin membrane). Se închid cu dop de bumbac şi se autoclavează timp de 20 minute la 121°C.

Mediu Carr, geloză + actidion

Preparare: într-un balon Erlenmeyer de 1000 ml se cîntăresc 30 g de extract de drojdie (Difco), 50 mg de actidion. Se dizolvă în 500 ml de apă, se adaugă 1 ml de verde de bromcrezol de 2,2%.

Separat, într-un balon de 1000 ml, se dizolvă 20 g de geloză cu 450 ml de apă, se plasează într-o baie fierbinte, agitînd frecvent şi evitînd o încălzire prelungită. După dizolvarea totală, se adaugă soluţia precedentă şi se completează pînă la 1000 ml cu apă. Se amestecă şi se distribuie în eprubete Boucher cîte 15 ml (pentru enumerare pe suport) şi cîte 6 ml (pentru enumerare cu filtrare prin membrane). Se închid cu dop de bumbac şi se autoclavează timp de 20 minute la 121°C.

După lichefiere şi răcire pînă la 45°C, la mediu se adaugă 20 ml de alcool la litru, se sterilizează prin filtrare (membrană de fluorură de poliviniliden) şi se amestecă.

2. Medii lichide de cultură

2.1. Pentru levuri

Mediu YEPD (Extract de drojdie, Peptonă, Dextroză) + cloramfenicol

Preparare: într-un balon Erlenmeer de 1000 ml se cîntăresc 10 g de extract de drojdie (Difco sau echivalent), 20 g de peptonă, 20 g de glucoză şi 100 mg de cloramfenol. Se dizolvă, se completează pînă la 1000 ml cu apă şi se amestecă.

Se distribuie cîte 5 ml în eprubete şi se autoclavează timp de 15 minute la 121°C.

2.2. Pentru bacterii lactice

Mediu MTJ (50% mediu MRS "Lactobacilli Man Rogosa and Sharpe Broth" + 50% mediu TJB "Tomato Luice Broth") + actidion

Preparare: într-un balon Erlenmeer de 1000 ml se cîntăresc 27,5 g de MRS "Lactobacilli Man Rogosa and Sharpe Broth", se adaugă 500 ml de apă, se încălzeşte pînă la fierbere pentru dizolvarea totală, se adaugă 20,5 g de mediu TJB "Tomato Luice Broth" şi 50 mg de actidion. Se completează cu apă pînă la 1000 ml şi după ce se corectează pH pînă la 5,5 cu soluţie de acid clorhidric de 1N, se amestecă. Se distribuie în eprubete cîte 10 ml şi se autoclavează timp de 15 minute la 121°C.

Se utilizează 10 ml în loc de 5 ml (în cazul drojdiilor) din cauza sensibilităţii mai mari a bacteriilor lactice la oxigen.

42. Izotiocianat de alil

42. 1. Izotiocianat de alil

1. Principiul metodei

Izotiocianatul de alil, posibil prezent în vin, este separat prin distilare şi identificat prin gaz cromatografie.

2. Reactivi:

etanol absolut;

soluţie standard: soluţie de izotiocianat de alil în alcool absolut, conţinînd 15 mg de izotiocianat de alil pe litru;

amestec de răcire, constînd din etanol şi gheaţă carbonică, temperatura (- 60°C).

3. Aparatura:

aparat de distilare, figura 7. Prin aparat trece un flux continuu de azot;

manta de încălzire, controlată termostatic;

debitmetru;

gaz-cromatograf cu detector spectrofotometric, echipat cu filtru-selector pentru compuşi sulfuroşi (lungimea de undă λ = 394 nm) sau orice detector potrivit;

coloană cromatografică din oţel inoxidabil cu diametrul intern de 3 mm şi lungimea de 3 m, umplută cu Carbowax 20 M 10% pe Cromosorb WHP, 80-100 mesh;

microseringă de 10 ľl.

4. Metoda de lucru

Se pun 2 litri de vin în balonul de distilare, se introduc cîţiva mililitri de etanol în cele două tuburi colectoare, astfel încît părţile poroase ale inelelor dispersoare de gaz să fie complet scufundate. Se răcesc cele două tuburi din exterior, utilizînd amestecul de răcire. Se conectează balonul la tuburile colectoare şi se alimentează aparatul cu azot la un debit de trei litri pe oră. Se încălzeşte vinul la 80°C stabilind temperatura cu manta de încălzire, se distilează şi se colectează 45-50 ml de distilat.

Este recomandată utilizarea următoarelor condiţii:

temperatura injectorului – 200°C;

temperatura coloanei – 130°C;

fluxul gazului purtător de heliu – 20 ml /minut.

Se introduce, cu microseringa, un volum de soluţie standard suficient pentru identificarea uşoară pe cromatogramă a picului corespunzător izotiocianatului de alil. În acelaşi mod se introduce în cromatograf proba de distilat. Se verifică dacă timpul de retenţie al picului obţinut corespunde cu acela al picului soluţiei standard de izotiocianat de alil.

În condiţiile descrise mai sus, nici unul din compuşii prezenţi în vin în mod natural nu vor produce picuri cu timpul de reţinere, analogic timpului de reţinere al izotiocianatului de alil.

Figura 7. Aparat pentru distilare cu curent de azot

43.1. Metode speciale pentru analiza mustului concentrat rectificat

Conţinutul de cationi totali

1. Principiul metodei

Proba este tratată cu un schimbător de cationi puternic acid. Cationii sînt schimbaţi cu H⁺. Cationii totali sînt exprimaţi de diferenţa dintre aciditatea totală a efluentului şi a probei.

2. Aparatura:

coloană de sticlă avînd diametrul intern 10-11 mm şi lungimea de aproximativ 300 mm, cu robinet;

pH metru, cu scala gradată cel puţin în unităţi 0,1 pH;

Electrozi:

electrod din sticlă, ţinut în apă distilată;

electrod de referinţă calomel/clorură de potasiu, ţinut în soluţie saturată de clorură de potasiu;

electrod combinat, ţinut în apă distilată.

3. Reactivi:

răşină de schimb cationic puternic acidă, în formă H⁺ umflată prin scufundarea în apă în timpul nopţii;

soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 M;

hîrtie indicatoare pH.

4. Metoda de lucru

4.1. Pregătirea probei

Se utilizează soluţia obţinută prin diluarea mustului concentrat rectificat la 40% (m/v), în conformitate cu capitolul "Aciditatea totală" punctul 5.1.2.

4.2. Pregătirea coloanei de schimbarea ionilor

Se introduc în coloană aproximativ 10 ml de răşină schimbătoare de ioni în formă H⁺. Se clăteşte coloana cu apă distilată pînă cînd aciditatea a fost înlăturată, utilizînd hîrtia indicator.

4.3. Schimbul de ioni

Se trece prin coloană 100 ml soluţie de must concentrat rectificat, pregătită în conformitate cu punctul 4.1., cu un flux de o picătură pe secundă. Se colectează efluentul într-un pahar de laborator. Se spală coloana cu 50 ml de apă distilată. Se titrează aciditatea din efluent (incluzînd apa de clătire) cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,1 M, pînă cînd pH este 7 la 20°C. Soluţia alcalină trebuie adăugată încet cu agitare continuă. Se notează cu n ml volumul de hidroxid de sodiu 0,1 M utilizat.

5. Exprimarea rezultatelor

Conţinutul de cationii totali sînt exprimaţi în miliechivalenţi pe kilogram de zahăr total, cu o cifră zecimală.

5.1. Calculare

Aciditatea efluentului se exprimă în miliechivalenţi pe kilogram de must concentrat rectificat:

E = 2,5 n

Aciditatea totală a mustului concentrat rectificat, în miliechivalenţi pe kilogram (vezi "Aciditatea totală" punctul 6.1.2):

cationii totali, în miliechivalenţi pe kilogram de zaharuri totale:

(2,5 n-a) / P × 100 ,

unde,

P – concentraţia procentuală de zaharuri totale (m/m).

Conductivitatea

1. Principiul metodei

Conductivitatea electrică a coloanei de lichid definită de doi electrozi din platină paraleli este măsurată la capete prin încorporarea într-o punte Wheatstone. Conductivitatea variază cu temperatura. Mai jos conductivitatea se exprimă la 20°C.

2. Aparatura:

conductimetru pentru determinarea conductivităţii într-un interval de 1-1000 micro-siemens pe centimetru (ľS /cm^-1);

baie de apă pentru termostatarea probelor de analizat la aproximativ 20°C (20 ± 2°C).

3. Reactivi:

apă demineralizată, cu o conductivitate specifică sub 2 ľS /cm^-1 la 20°C;

soluţie de referinţă de clorură de potasiu: se dizolvă 0,581 g de clorură de potasiu (KC1), uscată în prealabil pînă la o masă constantă la o temperatură de 105°C, în apă demineralizată. Se completează volumul pînă la un litru cu apă demineralizată. Această soluţie are o conductivitate de 1000 ľS/cm^-1 la 20°C. Soluţia nu trebuie păstrată mai mult de 3 luni.

4. Metoda de lucru

4.1. Pregătirea probei de analizat

Se utilizează soluţia cu o concentraţie totală a zahărului de 25% (m/m) (25° Brix), conform descrierii din capitolul "Aciditatea ionică (pH)" punctul 4.1.2.

4.2. Determinarea conductivităţii

Se aduce proba analizată la 20°C prin scufundare în baia de apă. Se menţine temperatura în intervalul ±0,1°C. Se clăteşte de două ori celula conductimetrului cu soluţia care trebuie analizată. Se măsoară conductivitatea şi se exprimă rezultatul în ľS/cm^-1.

5. Exprimarea rezultatelor

Rezultatul pentru soluţia de must concentrat rectificat 25% (m/m) (25° Brix) se exprimă în micro-siemens pe centimetru (ľS/cm^-1) la 20°C, rotunjit pînă la cel mai apropiat număr întreg.

5.1. Calculare

Dacă aparatul nu este prevăzut cu mijloace pentru controlul temperaturii, se corectează conductivitatea măsurată utilizînd tabelul de mai jos. Dacă temperatura este sub 20°C, corecţia se adună, dacă temperatura este peste 20°C, corecţia se scade.

Hidroximetilfurfural (HMF)

1. Principiul metodelor

1.1. Metoda colorimetrică

Aldehidele derivate din furan, componenta principală fiind hidroximetilfurfuralul, reacţionează cu acidul barbituric şi paratoluidina şi dau un compus roşu, care este determinat prin colorimetrie la 550 nm.

1.2. Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC)

Se separă într-o coloană cromatografică de fază inversă şi se determină la 280 nm.

2. Metoda colorimetrică

2.1. Aparatura:

spectrofotometru care permite efectuarea de măsurători între 300 – 700 nm;

cuve din sticlă, cu drum optic de 1 cm.

2.2. Reactivi:

soluţie de acid barbituric 0,5% (m/v): se dizolvă 500 mg de acid barbituric (C₄O₃N₂H₄) în apă distilată şi se încălzeşte uşor deasupra unei băi de apă la 100°C. Se completează volumul pînă la 100 ml cu apă distilată. Soluţia se păstrează aproximativ o săptămînă;

soluţie de paratoluidină, 10% (m/v): se iau 10 g de paratoluidină, C₆H₄(CH₃)NH₂, într-un balon cotat de 100 ml; se adaugă 50 ml de izopropanol CH₃CH(OH)CH₃ şi 10 ml de acid acetic glacial CH₃COOH (ρ₂₀ = 1,05 g/ml). Se completează volumul pînă la 100 ml cu izopropanol. Această soluţie trebuie reînnoită zilnic;

soluţie apoasă de acetaldehidă, CH₃CHO, 1% (m/v). Se prepară imediat înainte de utilizare.

soluţie etalon apoasă de hidroximetilfurfural C₆O₃H₆, 1 g/l.

Se prepară diluţii succesive, conţinînd 5, 10, 20, 30 şi 40 mg/l prin diluarea soluţiei de 1 g/l. Toate soluţiile trebuie să fie proaspăt preparate.

2.3. Metoda de lucru

2.3.1. Pregătirea probei

Se utilizează soluţia obţinută prin diluarea mustului concentrat rectificat la 40% (m/v), conform descrierii din capitolul "Aciditatea totală". Pentru determinare se utilizează 2 ml din această soluţie.

2.3.2. Determinarea colorimetrică

Se iau în două baloane cotate a) şi b) de 25 ml fiecare, prevăzute cu dopuri rodate, 2 ml de probă preparată în conformitate cu punctul 2.3.1. Se iau în fiecare balon cîte 5 ml de soluţie de paratoluidină; se amestecă. Se adaugă 1 ml de apă distilată în balonul b) (control) şi 1 ml de acid barbituric în balonul a) (proba de analizat). Se agită pentru omogenizare. Se transferă conţinutul baloanelor în cuvele spectrofotometrului cu drumuri optice de 1 cm. Se reglează scala absorbţiei la zero, utilizînd conţinutul balonului b), la lungimea de undă de 550 nm. Se urmăreşte variaţia puterii de absorbţie a conţinutului balonului a); se înregistrează valoarea maximă A, care este atinsă după 2-5 minute.

Probele cu un conţinut de hidroximetilfurfural de peste 30 mg/l trebuie diluate înainte de analiză.

2.3.3. Curba de calibrare

Se iau 2 ml din fiecare soluţie de hidroximetilfurfural cu 5, 10, 20, 30 şi 40 mg/l în două seturi de baloane de 25 ml a) şi b) şi se tratează conform descrierii de la punctul 2.3.2. Curba de calibrare reprezentînd variaţia absorbţiei, în funcţie de concentraţia hidroximetilfurfuralului în miligrame pe litru (mg/l), este o linie dreaptă ce trece prin origine.

2.4. Exprimarea rezultatelor

Conţinutul de hidroximetilfurfural în mustul concentrat rectificat este exprimat în miligrame per kilogram (mg/kg) de zaharuri totale.

2.4.1. Metoda de calcul

Concentraţia de hidroximetilfurfural C în miligrame pe litru (mg/l) în proba analizată este concentraţia de pe curba de calibrare corespunzătoare absorbţiei A, măsurată pe probă.

Concentraţia de hidroximetilfurfural, în miligrame pe kilogram (mg/kg) de zaharuri totale:

250 × C/P,

unde,

P – concentraţia procentuală (m/m) de zaharuri totale în mustul concentrat rectificat.

3. Cromatografнa lichidă de înaltă performanţă (HPLC)

3.1. Aparatura:

cromatograf lichid, echipat cu:

injector cu buclă de 5 sau 10 ľl;

detector spectrofotometru pentru efectuarea măsurătorilor la 280 nm;

coloană de silice cu octodecil legat (de exemplu Bondapak C18 – Corasil, Waters Ass.).

Debitul fazei mobile, 1,5 ml/minut;

Aparat cu membrană filtrantă, diametrul porilor 0,45 ľm.

3.2. Reactivi:

apă bidistilată;

metanol distilat CH₃OH sau de calitate HPLC;

acid acetic CH₃COOH (ρ₂₀ = 1,05 g/ml);

faza mobilă: apă-metanol - acid acetic (40:9:1 v/v), filtrată în prealabil printr-o membrană filtrantă (0,45 ľm). Faza mobilă trebuie preparată zilnic şi degazată înainte de utilizare;

soluţie de referinţă de hidroximetilfurfural, 25 mg/l: într-un balon cotat de 100 ml se iau 25 mg de hidroximetilfurfural (C₆H₃O₆), cîntărite cu precizie, şi se completează pînă la cotă cu metanol. Se diluează această soluţie 1:10 cu metanol şi se filtrează printr-o membrană filtrantă (0,45 ľm). Soluţia se păstrează 2-3 luni într-o sticlă maro în frigider.

3.3. Metoda de lucru

3.3.1. Pregătirea probei

Se utilizează soluţia obţinută prin diluarea mustului concentrat rectificat la 40% (m/v), conform descrierii din capitolul "Aciditatea totală" şi se filtrează cu o membrană filtrantă de 0,45 ľm.

3.3.2. Determinarea cromatografică

Se injectează în cromatograf 5 (sau 10) ľl din proba preparată în conformitate cu punctul 3.3.1. şi 5 (sau 10) ľl soluţie etalon de hidoximetilfurfural. Se înregistrează cromatograma. Timpul de retenţie al hidroximetilfurfuralului este de aproximativ 6-7 minute.

3.4. Exprimarea rezultatelor

Conţinutul de hidroximetilfurfural în mustul concentrat rectificat este exprimată în miligrame pe kilogram (mg/kg) de zaharuri totale.

3.4.1. Metoda de calcul

Se notează cu C concentraţia de hidroximetilfurfural în soluţie de 40% (m/v) din mustul concentrat rectificat. Concentraţia de hidroximetilfurfural, în miligrame pe kilogram (mg/kg) de zaharuri totale, este dată de:

250 × C/P,

unde,

P – concentraţia procentuală (m/m) de zaharuri totale din mustul concentrat rectificat.

Metale grele

1. Principiul metodelor

1.1. Metoda rapidă de evaluare a metalelor grele

Prezenţa metalelor grele în mustul concentrat rectificat, diluat corespunzător, se stabileşte de coloraţia produsă la formarea de sulfuri. Conţinutul metalelor grele se evaluează prin compararea cu o soluţie standard de plumb, corespunzînd concentraţiei maxime admisibile.

1.2. Determinarea conţinutului de plumb prins pe sctrofotometria de absorbţie atomică

Chelatul format de plumb cu pirolidinditiocarbamat de amoniu este extras cu metilizobutilcetonă şi absorbţia măsurată la 283,3 nm. Conţinutul de plumb se determină, utilizînd soluţii de referinţă.

2. Metoda rapidă de evaluare a metalelor grele

2.1. Reactivi:

acid clorhidric diluat, 70% (m/v): se iau 70 g de acid clorhidric HC1 (ρ₂₀ = 1,16 – 1,19 g/ml) şi se completează pînă la 100 ml cu apă;

acid clorhidric diluat, 20% (m/v): se iau 20 g de acid clorhidric HC1 (ρ₂₀ = 1,16 – 1,19 g/ml) şi se completează pînă la 100 ml cu apă;

amoniac diluat: se iau 14 g de amoniac NH₃ (ρ₂₀ = 0,931 – 0,934 g/ml) şi se completează pînă la 100 ml cu apă;

soluţie tampon pH 3,5: se dizolvă 25 g de acetat de amoniu CH₃COONH₄ în 25 ml de apă şi se adaugă 38 ml de acid clorhidric diluat (70%). Se ajustează pH-ul necesar cu acid clorhidric diluat (20%) sau amoniac diluat şi se completează pînă la 100 ml cu apă;

soluţie de tioacetamidă C₂H₅SN, 4%, (m/v);

soluţie de glicerol C₃H₈O₃, 85%, (m/v), (n_D^20°C = 1,449 – 1,455);

reactiv de tioacetamidă: la 0,2 ml de soluţie de tioacetamidă se adaugă 1 ml de amestec de 5 ml apă, 15 ml de soluţie de hidroxid de sodiu 1 M şi 20 ml de glicerol. Se încălzeşte 20 de secunde într-o baie de apă la 100°C. Se prepară imediat înainte de utilizare;

soluţie de plumb cu concentraţia de 0,002 g/l: se prepară o soluţie de plumb de 1 g/l dizolvînd 0,400 g de nitrat de plumb Pb(NO₃)₂ în apă şi completînd volumul pînă la 250 ml cu apă. Se diluează această soluţie cu apă imediat înaintea utilizării: 2 ml la 1000 ml în scopul obţinerii unei soluţii de 0,002 g/l.

2.2. Metoda de lucru

În 10 ml de apă se dizolvă 10 g de must concentrat rectificat. Se adaugă 2 ml de soluţie tampon pH 3,5, se amestecă. Se adaugă 1,2 ml de reactiv de tioacetamidă. Se amestecă din nou. Se prepară martorul în aceleaşi condiţii, utilizînd 10 ml de soluţie de plumb 0,002 g/l. După 2 minute, soluţia de must concentrat rectificat se colorează în maro. Coloraţia nu trebuie să fie mai intensă decît cea a martorului.

2.3. Calculul 

În condiţii analogice celor descrise mai sus, proba martor corespunde unei concentraţii maxime admisibile de metale grele, exprimată ca plumb – 2 mg/kg de must concentrat rectificat.

3. Determinarea conţinutului de plumb prin spectrofotometria de absorbţie atomică

3.1. Aparatura:

spectrofotometru de absorbţie atomică, echipat cu arzător cu aer-acetilenă;

lampă catodică pentru plumb.

3.2. Reactivi:

acid acetic diluat: se iau 12 g de acid acetic glacial (ρ₂₀ = 1,05 g/ml) şi se completează pînă la 100 ml cu apă;

soluţie de pirolidinditiocarbamat de amoniu C₅H₁₂N₂S₂, 1% (m/v);

metilizobutilcetonă (CH₃)₂CHCH₂COCH₃;

soluţie de plumb, 0,010 g/l: soluţia de plumb de 1 g/l se diluează în proporţie 1:100 (v/v).

3.3. Metoda de lucru

3.3.1. Pregătirea soluţiei de analiză

Se diluează 10 g de must concentrat rectificat într-un amestec de volume egale de acid acetic diluat şi apă şi se completează pînă la 100 ml cu acest amestec. Se adaugă 2 ml de soluţie de pirolidinditiocarbamat de amoniu şi 10 ml de metilizobutilcetonă. Se agită 30 de secunde, se protejează de lumina puternică. Se lasă pînă la separarea în două straturi. Se utilizează stratul de metilizobutilcetonă.

3.3.2. Pregătirea soluţiilor de referinţă

Se prepară trei soluţii de referinţă care conţin, în plus faţă de 10 g de must concentrat rectificat, 1, 2 şi 3 ml de soluţie de plumb de 0,010 g/l. Se tratează identic ca soluţia analizată.

3.3.3. Martorul

Martorul se pregăteşte în aceleaşi condiţii ca şi la punctul 3.3.1. pentru soluţia de analizat, dar fără adăugarea mustului concentrat rectificat.

3.3.4. Determinarea

Se reglează lungimea de undă la 283,3 nm. Se atomizează la flacără metilizobutilcetonă din proba martor şi se aduce scala absorbţiei la zero.

Se determină absorbanta soluţiei analizate şi a soluţiilor de referinţă, utilizînd soluţii de extracţie corespunzătoare.

3.4. Exprimarea rezultatelor

Conţinutul de plumb se exprimă în miligrame pe kilogram (mg/kg) de must concentrat rectificat, cu o zecimală.

3.4.1. Calculare

Se trasează curba variaţiei absorbţiei în funcţie de concentraţia de plumb adăugată în soluţiile de referinţă, concentraţia zero corespunzînd soluţiei examinate.

Determinarea chimică a etanolului

Această metodă se utilizează pentru determinarea tăriei alcoolice a lichidelor slab alcoolizate, cum sînt mustul, mustul concentrat şi mustul concentrat rectificat.

1. Principiul metodei

Simpla distilare a lichidului. Oxidarea etanolului în distilat cu dicromat de potasiu. Titrarea excesului de dicromat cu o soluţie de fier (II).

2. Aparatura

Se utilizează aparatura de distilare descrisă în capitolul 2 "Concentraţia alcoolică la 20°C".

3. Reactivi:

soluţie de dicromat de potasiu: se dizolvă 33,600 g de dicromat de potasiu K₂Cr₂O₇ într-o cantitate suficientă de apă pentru prepararea unui litru de soluţie la 20°C. Un mililitru de soluţie oxidează 7,8924 mg de alcool;

soluţie de sulfat de fier (II) şi amoniu: se dizolvă 135 g de sulfat de fier (II) şi amoniu FeSO₄ ×  (NH₄₂S0₄ × 6H₂O într-o cantitate suficientă de apă pentru a obţine un litru de soluţie şi se adaugă 20 ml de acid sulfuric concentrat H₂SO₄ (ρ₂₀= 1,84 g/ml). Ulterior, soluţia se oxidează încet;

soluţie de permanganat de potasiu: se dizolvă 1,088 g de permanganat de potasiu KMnO₄ într-o cantitate suficientă de apă pentru a prepara un litru de soluţie;

acid sulfuric diluat: la 500 ml de apă se adaugă treptat, agitînd continuu, 500 ml de acid sulfuric H₂SO₄ (ρ₂₀ = 1,84 g/ml);

reactiv feros de ortofenantrolină: se dizolvă 0,695 g de sulfat feros FeSO₄ × 7H₂O în 100 ml de apă şi se adaugă 1,485 g de monohidrat de ortofenantrolină C₁₂H₈N₂ × H₂O. Se încălzeşte pentru a accelera dizolvarea. Această soluţie de culoare roşu-aprins se păstrează bine.

4. Metoda de lucru

4.1. Distilarea

Se iau 100 g de must concentrat rectificat şi 100 ml de apă în balonul de distilare. Se colectează distilatul într-un balon cotat de 100 ml şi se completează pînă la cotă cu apă.

4.2. Oxidarea

Se ia un balon de 300 ml cu dop rodat şi cu gît larg, care permite clătirea lui fără pierderi. Se iau în balon 20 ml de soluţie de titrare de dicromat de potasiu şi 20 ml de acid sulfuric diluat şi se agită. Se adaugă 20 ml de distilat. Se astupă balonul şi se aşteaptă cel puţin 30 de minute, agitînd din cînd în cînd (balonul "pentru măsurat".) Se titrarează soluţia de sulfat de fier (II) şi amoniu ţinînd cont de soluţia de dicromat de potasiu, prin punerea într-un balon identic a aceloraşi cantităţi de reactivi, dar înlocuind cei 20 ml de distilat cu 20 ml de apă distilată (balonul "martor").

4.3. Titrarea

Se adaugă patru picături de reactiv de ortofenantrolină conţinutului balonului "pentru măsurat". Se titrează excesul de dicromat de potasiu prin adăugarea de soluţie de sulfat de fier (II) şi amoniu. Titrarea se opreşte cînd amestecul îşi schimbă culoarea din gri-albăstrui în maro. Pentru a avea o precizie mai mare asupra punctului final, se schimbă culoarea din maro în gri-albăstrui cu permanganat de potasiu. Se scade o zecime din volumul soluţiei utilizate din volumul soluţiei de fier (II) adăugate. Se notează diferenţa cu n ml. Se procedează analogic cu balonul "martor". Se notează diferenţa cu n′  ml.

5. Exprimarea rezultatelor

Etanolul se exprimă în grame pe kilogram (g/kg) de zahăr total şi se notează cu o zecimală.

5.1. Metoda de calcul

n′, ml de soluţie ferică reduc 20 ml de soluţie de dicromat, care oxidează 157,85 mg de etanol pur. Un mililitru de soluţie ferică (II) are aceeaşi putere de reducere ca şi 157,85/n′  mg de etanol, (n - n′) ml de soluţie ferică (II) are aceeaşi putere reducătoare ca şi 157,85 (n - n′)/n′  mg de etanol. Concentraţia de etanol, în g/kg de must concentrat rectificat:

7,892 × (n′- n)/ n

concentraţia de etanol, în grame pe kilogram (g/kg) de zaharuri totale:

789,2 × (n′- n)/ n′ P,

unde:

P – concentraţia procentuală (m/m) de zaharuri totale.

Mezoinozitolul, scilo-inozitolul şi zaharoza

1. Principiul

Cromatografia gazoasă a derivaţilor silanizaţi.

2. Reactivi:

etalon intern: xilitol (soluţie apoasă de aproximativ 10 g/l, la care se adăugă un vîrf de spatulă de azid de sodiu),

Bi(trimetilsilil) triflueroacetamidă-BSTFA- (C₈H₁₈F₃NOSi₂);

trimetilclorosilan (C₃H₉CISi);

piridină analitic pură, (C₅H₅N);

mezoinozitol (C₆H₁₂O₆).

3. Aparatura:

gaz-cromatograf;

coloană capilară (de exemplu, din silice topită, învelit cu OV 1, grosimea peliculei de 0,15 pm, lungimea 25 m şi diametrul intern de 0,3 mm).

Condiţii de lucru:

gaz purtător: hidrogen sau heliu;

debitul gazului purtător: în jur de 2 ml/minut;

temperatura injectorului şi detectorului: 300°C;

programarea temperaturii: 1 minut la 160°C, 4°C per minut pînă la 260°C, temperatură constantă de 260°C timp de 15 minute;

raportul de divizare: în jur de 1:20;

integrator;

microseringă de 10 ľl;

micropipete de 50, 100 şi 200 ľl;

balon de 2 ml cu dop din teflon;

etuvă.

4. Metoda de lucru

Se pun într-un balon de 50 ml aproximativ 5 g de must concentrat rectificat, cîntărite cu precizie. Se adaugă 1 ľl de soluţie standard de xilitol şi se completează pînă la cotă cu apă. După amestecare se iau 100 ľl de soluţie şi se pun în balonul cu dop de tiflon şi se usucă sub un curent uşor de aer. Pentru facilitarea evaporării se pot adăuga, dacă este cazul, 100 ľl de alcool etilic pur. Se dizolvă cu grijă reziduul în 100 ľl de piridină şi se adaugă 100 ľl de bi(trimetilsilil) trifluoroacetamidă şi 10 ľl de trimetilclorosilan, se închide balonul cu dopul din teflon şi se încălzeşte timp de o oră, la 60°C. Se extrag 0,5 ľl de lichid limpede şi se injectează utilizînd un ac încălzit, în conformitate cu raportul de divizare specificat.

5. Calcularea rezultatelor

Se prepară o soluţie conţinînd: 60 g/l glucoză, 60 g/l fructoză, 1 g/l mezoinozitol şi 1 g/l zaharoză. Se cîntăresc 5 g de soluţie şi se urmează procedura de la punctul 4. Rezultatele pentru mezoinozitol şi zaharoză, ţinînd cont de xilitol, sînt calculate din cromatogramă. În cazul scilo-inozitolului, care nu este disponibil în comerţ şi are un timp de retenţie între ultimul pic al formei anomerice a glucozei şi vîrful mezoinozitolului, este considerat acelaşi rezultat ca şi pentru mezoinozitol.

6. Exprimarea rezultatelor

Mezoinozitolul şi scilo-inozitolul sînt exprimate în miligrame per kilogram de zahăr. Zaharoza este exprimată în grame per kilogram de must.