Постановление № 708 от 20.09.2011

ПРАВИТЕЛЬСТВО РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА

ПОСТАНОВЛЕНИЕ

об утверждении Технического регламента "Методы

анализа в области производства вин"

№ 708  от  20.09.2011

 (в силу 04.01.2012) 

Мониторул Офичиал № 164-165 ст.804 от 04.10.2011

* * *

Утратил силу: 04.05.2024

Постановление Правительства N 245 от 03.04.2024

В соответствии с Законом № 420-XVI от 22 декабря 2006 года о техническом регулировании (Официальный монитор Республики Молдова, 2007 г., № 36-38, ст.141), с последующими изменениями и дополнениями, а также в целях реализации положений Закона № 57-XVI от 10 марта 2006 года о винограде и вине (Официальный монитор Республики Молдова, 2006 г., № 75-78, ст.314), с последующими изменениями и дополнениями, Правительство

ПОСТАНОВЛЯЕТ:

1. Утвердить Технический регламент "Методы анализа в области производства вин" (прилагается).

2. Настоящее Постановление вступает в силу через три месяца после даты опубликования в Официальном мониторе Республики Молдова.

3. Контроль за выполнением настоящего Постановления возложить на Национальное агентство по безопасности пищевых продуктов.

[Пкт.3 изменен Пост.Прав. N 1143 от 21.11.2018, в силу 18.01.2019]

Утвержден

Постановлением Правительства

№ 708 от 20 сентября 2011 г.

ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕГЛАМЕНТ

"Методы анализа в области производства вин"

Технический регламент "Методы анализа в области производства вин" создает необходимую основу для применения ст.15 и Приложения IV к Регламенту Комиссии (СЕ) № 606/2009 от 10 июля 2009 г., устанавливающему определенные правила применения Регламента Совета (СЕ) № 479/2008 в отношении категорий виноградной продукции, энологических приемов и применимых ограничений, опубликованного в Официальном журнале Европейского Союза (JO) L 193 от 24 июля 2009 г.

1. Технический регламент "Методы анализа в области производства вин" (в дальнейшем – Технический регламент) устанавливает методы анализа для определения физико-химического состава вин, указанных в Техническом регламенте "Система организации виноградо-винодельческого рынка и прослеживаемость продукции", утвержденном Постановлением Правительства № 356 от 11 мая 2009 г. (Официальный монитор Республики Молдова, 2009 г., № 92-93, ст.408).

2. В настоящем Техническом регламенте используемые определения и термины означают следующее:

1) повторяемость – значение, при котором абсолютная величина разности двух отдельных результатов измерений, полученных на идентичном анализируемом материале, проведенных в одних и тех же условиях – один и тот же исполнитель, такой же прибор, в той же лаборатории и в короткий интервал времени – с определенной вероятностью будет меньше этого значения;

2) воспроизводимость – значение, ниже которого находится, с определенной вероятностью, абсолютная величина разности двух отдельных результатов измерений, полученных на идентичном анализируемом материале, проведенных в разных условиях – разные исполнители, разные приборы и/или разные лаборатории, и/или разные периоды времени;

3) отдельный результат – величина, полученная при однократном и полном применении стандартного метода испытаний на одной пробе;

4) арбитражные методы – методы, обеспечивающие высокую сходимость результатов, признанные наиболее точными; применяют для определения допустимых значений основных показателей состава вина – объемная доля этилового спирта, титруемая кислотность, летучая кислотность, общий и приведенный экстракт, редуцирующие сахара. Используют в спорных случаях, при проведении научных исследований, имеющих международное значение, для анализа эталонных проб, предназначенных для контроля методов текущих определений, или при эталонировании автоматизированных методов;

5) методы текущих определений – методы, предназначенные для проведения текущих анализов на винодельческих предприятиях;

6) автоматизированные методы анализа – относительные методы, допускаемые к применению при условии, что точность, повторяемость и воспроизводимость результатов этих методов эквивалентны результатам, полученным арбитражными методами;

3. В настоящем Техническом регламенте используемые аббревиатуры определены следующим образом:

4. Методы анализа в области производства вин, приведенные в приложении к настоящему Техническому регламенту, применяют в аккредитованных лабораториях виноградо-винодельческой отрасли при оформлении сертификата VI-1.

5. Методы анализа в области производства вина позволяют:

1) определять физико-химический состав винодельческой продукции, предусмотренной Законом № 57-XVI от 10 марта 2006 года о винограде и вине;

2) осуществлять контроль продукции с целью выявления применения незаконных технологических приемов.

6. При определении веществ, для которых разработаны как арбитражные, так и обычные методы, предпочтение отдается результатам, полученным с помощью арбитражных методов.

7. В спорных случаях методы, указанные в приложении, не могут заменяться автоматизированными методами.

8. При отсутствии других указаний погрешность измерения значения величины параметра определяется при доверительном интервале 95%.

9. Каждый раз, когда делается ссылка на воду, применяемую для приготовления растворов, разбавлений или промываний, имеется в виду дистиллированная или деминерализованная вода равнозначной чистоты. Все химические реактивы должны быть аналитического качества.

Приложение

к Техническому регламенту

"Методы анализа в области

производства вин"

1. Плотность при 20°C и относительная плотность 20°C/20°C

1.1. MA-MD-AS 2-01-MASVOL

1. Определения

Плотность – масса на единицу объема вина или сусла при 20°C. Выражается в граммах на миллилитр и обозначается ρ_20°C.

Относительная плотность 20°C/20°C – отношение массы некоторого объема вина или сусла при 20°C к массе того же объема воды при той же температуре, выраженное десятичной дробью. Обозначается .

2. Сущность методов

Плотность и относительную плотность определяют на испытуемой пробе:

пикнометрически: арбитражный метод;

ареометрически или денсиметрически с гидростатическими весами: методы текущих определений.

При особо точном определении плотности следует вводить поправку на воздействие диоксида серы:

ρ_20°C = ρ′_20°C – 0,0006 × S

где:  

ρ_20°C – скорректированная величина плотности;

ρ′_20°C – найденная величина плотности;

S – общее содержание диоксида серы в граммах на литр, г/л.

3. Предварительная обработка пробы

Если вино или сусло содержит значительное количество диоксида углерода, его следует максимально удалить, взбалтывая для этого 250 мл вина в колбе емкостью 1000 мл или фильтруя при умеренном давлении, через слой ваты весом 2 г, помещенный в аллонж.

4. Эталонный метод

4.1. Аппаратура

Применяют обычное лабораторное оборудование, а именно:

4.1.1. Пикнометр Pyrex (или любой пикнометр, имеющий эквивалентные характеристики) емкостью примерно 100 мл, с подвижным термометром с притертым соединением с пикнометром, с ценой деления 0,1°С, градуированным от 10 до 30°С (рисунок 1). Термометр должен быть откалиброван.

4.1.2 Весы с двумя чашками, рассчитанные не менее чем на 300 г, с чувствительностью до 0,1 мг или весы с одной чашкой, рассчитанные не менее чем на 200 г, с чувствительностью до 0,1 мг.

Рис.1

Пикнометр с тарировочной колбой

Пикнометр имеет боковую трубку длиной 25 мм, с внутренним диаметром не менее 1 мм, со шлифованным коническим концом. На боковую трубку может надеваться "колпачок-приемник", состоящий из притертой конической трубки с заостренным концом. Колпачок служит расширительной камерой. Оба конца прибора должны быть тщательно отшлифованы.

Тарировочная колба, имеющая тот же объем что и пикнометр (расхождение не должно превышать примерно 1 мл) и массу, равную массе пикнометра, заполненного жидкостью плотностью 1,01 (2%-ный раствор (m/v) хлористого натрия). Термостат точно соответствующий размеру пикнометра.

4.2. Калибровка пикнометра

Калибровка пикнометра включает определение следующих характеристик:

масса пустого пикнометра;

объем пикнометра при 20°C;

масса пикнометра, заполненного водой, при 20°C.

4.2.1. Использование весов с двумя чашками.

После того, как тарировочную колбу помещают на левую чашку весов, а чистый сухой пикнометр, снабженный "колпачком-приемником", – на правую чашку, весы уравновешивают, положив на чашки с пикнометром разновесы массой р граммов.

Пикнометр наполняют дистиллированной водой, имеющей температуру окружающей среды, и фиксируют термометр; тщательно обтирают пикнометр и помещают в термостат; перемешивают поворачиванием сосуда до тех пор, пока термометр будет показывать постоянную температуру.

Доводят уровень точно до верхнего уровня боковой трубки. Обтирают боковую трубку, надевают "колпачок-приемник", снимают точное показание термометра t°C и, при необходимости, вводят поправку на погрешность шкалы термометра. Взвешивают пикнометр, наполненный водой, обозначив через p′ уравновешивающую массу в граммах.

Расчеты:

Тарирование пустого пикнометра:

Масса пустого пикнометра – p + m,

где m – масса воздуха, содержащегося в пикнометре, m = 0,0012 (p – p′).

Объем при 20°C:

V_20°C = (p + m – p′) × F_t,

где F_t – коэффициент, взятый из таблицы I для температуры t°C.

V_20°C определяют с точностью до ± 0,001 мл.

Масса воды при 20°C:

M_20°C = 0,998203 V_20°C,

где 0,998203 – плотность воды при 20°C.

4.2.2. Использование весов с одной чашкой

Определяют:

массу чистого и сухого пикнометра, Р;

массу пикнометра, заполненного водой при t°C, Р₁, в соответствии с методом, указанным в пункте 4.2.1;

массу тарировочной колбы, T₀.

Расчеты (Пример расчета приводится в пункте 5 настоящего раздела):

Тарирование пустого пикнометра:

Масса пустого пикнометра – P – m,

где m – масса воздуха, содержащегося в пикнометре, m = 0,0012 (P₁ – P).

Объем при 20°C:

V_20°C = [P₁ – (P – m)] × F_t,,

где:  

F_t – коэффициент, взятый из таблицы I для температуры t°C.

V_20°C определяется с точностью до ± 0,001 мл.

Масса воды при 20°C:

M_20°C = 0,998203 V_20°C,

где 0,998203 – плотность воды при 20°C.

4.3. Методика измерения

4.3.1. Использование весов с двумя чашками

Пикнометр, заполненный испытуемой пробой, взвешивают в соответствии с указаниями пункта 4.2.1.

 p′′ – уравновешивающая масса в граммах при t°C.

Масса жидкости, содержащейся в пикнометре – p + m – p′′

Видимая плотность при t°C:

Плотность при 20°C вычисляют с помощью одной из корректирующих таблиц, приведенных ниже, в зависимости от характера исследуемой жидкости: сухое вино (таблица II), натуральное или концентрированное сусло (таблица III), сладкое вино (таблица IV).

Относительную плотность 20°C/20°C определяют делением величины его плотности при 20°C на 0,998203.

4.3.2. Использование одночашечных весов.

Взвешивают тарировочную колбу и обозначают ее массу T₁.

Вычисляют dT = T₁ – T₀ .

Масса пустого пикнометра при измерении = P – m + dT.

Пикнометр, заполненный испытуемой пробой, взвешивают в соответствии с указаниями пункта 4.2.1. Обозначают P₂ – его масса при t°C.

Масса жидкости, содержащейся в пикнометре при

t°C = P₂ – (P – m +dT)

Видимая плотность при t°C:

Плотность исследуемой жидкости – сухого вина, натурального или концентрированного сусла или сладкого вина, при 20°C, вычисляют в соответствии с пунктом 4.3.1.

Относительную плотность 20°C/20°C определяют делением величины плотности при 20°C на 0,998203.

4.3.3. Повторяемость по плотности

4.3.4. Воспроизводимость по плотности:

5. Пример расчета плотности при 20°C и относительной плотности 20°C/20°C (эталонный метод)

5.1. Измерение с помощью пикнометра на весах с двумя чашками

5.1.1. Определение констант пикнометра

Взвешивание чистого сухого пикнометра:

масса = пикнометр + p

p' = 104,9454 г

Взвешивание пикнометра, заполненного водой, при температуре t°C:

масса = пикнометр + вода + p'

p' = 1,2396 г при t = 20,5°C

Вычисление массы воздуха, содержащегося в пикнометре:

m = 0,0012 (p – p')

m = 0,0012 × (104,9454 –1,2396)

m = 0,1244 г

Необходимые данные:

Масса пустого пикнометра = p + m:

p + m = 104,9454 + 0,1244

p + m = 105,0698 г

Объем при 20°C = (p + m – p') F_t°C,

где

F_20,5°C = 1,001900

V_20°C = (105,0698 –1,2396) × 1,001900

V_20°C = 104,0275 мл

Mасса воды при 20°C,

M_20°C = V_20°C × 0,998203

M_20°C = 103,8405 г

5.1.2. Определение плотности при 20°C и относительной плотности 20°C/20°C сухого вина

ρ″ = 1,2622 при 17,80°C

ρ_17,8 = 0,99788 г/мл

Таблица II позволяет вычислить ρ_20°C  из ρ_t°C  с помощью зависимости:

Для t = 17,80°C и для объемной доли этилового спирта 11% об. находят С = 0,54  

5.2. Измерение с помощью пикнометра на одночашечных весах

5.2.1. Установление констант пикнометра

Взвешивание чистого и сухого пикнометра:

P = 67,7913 г

Взвешивание пикнометра, заполненного водой при температуре t°C:

P₁ = 169,2715 при 21,65°C

Вычисление массы воздуха, содержащегося в пикнометре:

m = 0,0012 (P₁ – P)

m = 0,0012 × 101,4802

m = 0,1218 г

Необходимые характеристики:

Mасса пустого пикнометра, P – m:

P – m = 67,7913 – 0,1218

P – m = 67,6695 г

Объем при 20°C = [P₁ – (P – m)] F_t°C

F_21,65°C = 1,002140

V_20°C = 1,002140 (169,2715 – 67,6695)

V_20°C = 101,8194 мл

Масса воды при 20°C:

M_20°C = V_20°C × 0,998203

M_20°C = 101,6364 г

Масса тарировочной колбы, T_o:

T_o = 171,9160 г

5.2.2. Определение плотности при 20°C и относительной плотности 20°C/20°C сухого вина

T_t = 171,9178 г

dT = 171,9178 –171,9160

dT = 0,0018 г

P – m + dT = 67,6695 + 0,0018 = 67,6713 г

P₂ = 169,2799 при 18°C

ρ_18°C = 0,99793 г/мл

Таблица II позволяет вычислить ρ_20°C на основании ρ_t°C с помощью зависимости:

Для t =18°C и для крепости 11% об., находят c = 0,49

2. Объемная доля этилового спирта при 20°C

2.1. МА – MD – AS 312-01-TALVOL

1. Определение

Объемная доля этилового спирта равна количеству литров этилового спирта, содержащегося в 100 литрах вина, при измерении обоих объемов при температуре 20°C. Условное обозначение "% об.".

Гомологи этанола вместе с этанолом и его гомологами, связанными в этиловые эфиры, учитываются при определении объемной доли этилового спирта, поскольку присутствуют в дистилляте.

2. Сущность методов

2.1. Перегонка вина, подщелаченного суспензией гидроксида кальция. Определяют объемную долю этилового спирта в дистилляте.

2.2. Арбитражный метод

2.2.1. Определение плотности дистиллята с помощью пикнометра.

2.3. Метод текущих определений

2.3.1. Определение объемной доли этилового спирта в дистилляте ареометром.

Для выражения объемной доли этилового спирта, исходя из плотности дистиллята, используют таблицы I, II, III, приведенные в настоящем разделе.

Они составлены на основе Международных спиртометрических таблиц, опубликованных в 1972 году Международной организацией по законодательной метрологии в Рекомендации № 22 и принятой Международной организацией по виноградарству и виноделию (Генеральная ассамблея, 1974 г.)

В таблице I приведено общее уравнение, показывающее связь объемной доли этилового спирта и плотности водно-спиртовых смесей в зависимости от температуры.

3. Получение дистиллята

3.1. Аппаратура

3.1.1. Перегонный аппарат, включающий:

круглодонную колбу на 1 литр с притертой пробкой;

ректификационную колонну высотой около 20 см или другое устройство, предупреждающее потери;

нагревательный прибор, при использовании которого не возникает пригорания вина;

холодильник с узким концом, доходящим почти до дна приемной колбы, в которой находятся несколько миллилитров воды.

3.1.2. Аппарат для перегонки с водяным паром, включающий:

парогенератор;

барботер;

ректификационную колонну;

холодильник.

Может применяться любая модель перегонного аппарата или аппарата для перегонки с водяным паром при условии прохождения следующего испытания: пять раз последовательно перегоняют водно-спиртовую смесь крепостью 10% об. После пятой перегонки крепость в дистилляте должна составлять не менее 9,9% об., т.е. потеря спирта не должна превышать 0,02% об. за одну перегонку.

3.2. Реактивы

3.2.1. Суспензия гидроксида кальция 2M, полученная осторожным приливанием 1 л воды при (60-70)°C к 120 г негашеной извести (CaO).

3.3. Подготовка пробы

Молодое вино и игристое вино предварительно максимально освобождают от диоксида углерода, взбалтывая 250-300 мл вина в колбе емкостью 500 мл.

3.4. Методопределения

С помощью мерной колбы отбирают 200 мл вина. Фиксируют температуру вина. Переносят вино в колбу перегонного аппарата или в барботер для перегонки с водяным паром. Ополаскивают мерную колбу последовательно четыре раза, используя каждый раз по 5 мл воды, которую сливают после этого в дистилляционную колбу или барботер. Добавляют 10 мл 2М гидроксида кальция (пункт 3.2.1) и несколько кусочков пористого инертного вещества (кусковая пемза и др.) .

Дистиллят собирают в мерную колбу на 200 мл, которой отмеряли вино. При перегонке собирают объем, равный примерно трем четвертям начального объема, а в случае перегонки с водяным паром собирают 198-199 мл дистиллята. Дополняют дистиллированной водой до 200 мл, температура дистиллята при этом должна быть идентична начальной температуре с точностью ±20 С. Осторожно перемешивают круговыми движениями.

В случае повышенного содержания в вине ионов аммония дистиллят повторно перегоняют в вышеописанных условиях, заменяя суспензию гидроксида кальция на 1 мл разбавленной серной кислоты 10:100 (v/v).

4. Арбитражный метод. Определение объемной доли этилового спирта в дистилляте с помощью пикнометра

4.1. Аппаратура

Используют калиброванный пикнометр, как указано в методе 1.1. MA-MD-AS 2-01-MASVOL.

4.2. Метод определения

Определяют видимую плотность дистиллята (пункт 3.4) при t°C, как указано в методе в пунктах 4.3.1 и 4.3.2. Обозначают плотность  ρ_t.

4.3. Выражение результатов

4.3.1. Способ расчета

Определяют объемную долю этилового спирта при температуре 20°С с использованием таблицы 1. По горизонтальной линии в таблице напротив соответствующего значения температуры T (выраженной в целых числах ) сразу под t°C находят наименьшее значение плотности, превышающее ρt. Плотность ρ при этой температуре T определяют, используя табличную разницу, которая дается непосредственно под найденной величиной плотности.

По линии температуры T находят плотность ρ′, наименее превышающую ρ, и определяют разность между этими двумя значениями ρ и ρ′. Эту разность делят на табличную плотность, находящуюся справа от плотности ρ′. Частное от деления дает десятые доли спиртуозности, а целое число указано наверху столбца, в котором находится значение объемной массы ρ′.

Пример расчета объемной доли этилового спирта приводится ниже.

Поправка на температуру может быть запрограммирована и в таком случае может осуществляться автоматически.

5. Методы текущих определений. Определение объемной доли этилового спирта в дистилляте ареометром

5.1. Аппаратура

Спиртомер

Спиртомер должен соответствовать требованиям к приборам класса I или класса II, определенным в международной Рекомендации № 44 МОЗМ (Международная Организация Законной Метрологии) "Спиртомеры и ареометры для спирта".

Термометр с ценой деления 1/100 С от 0 до 40°С, проверенный с точностью до 1/20 градуса.

Цилиндр диаметром 36 мм и высотой 320 мм, закрепляемый вертикально с помощью подставки и специальных винтов.

5.2. Методика определения

Дистиллят (пункт 3.4) помещают в цилиндр. Фиксируют его в строго вертикальном положении. Вводят термометр и спиртомер. Снимают показание термометра через 1 минуту после перемешивания жидкости для выравнивания температуры цилиндра, термометра, спиртомера и дистиллята. Извлекают термометр и через 1 минуту записывают показания спиртомера. Показания снимают не менее трех раз, пользуясь лупой. В показание спиртомера при фактической температуре t°С вносится температурная поправка с использованием таблицы II.

Температура жидкости не должна значительно отличаться от температуры окружающей среды (не более чем на 5°С).

6. Пример расчета объемной доли этилового спирта в вине

6.1. Измерение с использованием пикнометра и весов с двумя чашками

6.1.1. Константы пикнометра определены и вычислены согласно методу 1.1 МА-MD-AS2-01-MASVOL (пункт 6.1.1)

  Плотность при t°C:

2. Расчет объемной доли этилового спирта

6.2. Измерение с использованием пикнометра и весов с одной чашкой

6.2.1. Константы пикнометра определены и вычислены в разделе 1.1 MA-MD-AS 2-01-MASVOL  (пункт 6.2.1).

1. Масса пикнометра, заполненного дистиллятом:

Масса эталонного пикнометра

в момент определения, в граммах: _______ P₁ = 171,9178

Масса пикнометра, заполненного

дистиллятом при 20,50°C, в граммах: _____ P₂ = 167,8438

Поправка на вытесненный воздух:_______ dT= 171,9178 – 171,9160 = + 0,0018

Масса дистиллята при 20,50 °C: _________ L_t =167,8438 – (67,6695 + 0,0018) = 100,1725

Видимая плотность дистиллята:

2. Расчет объемной доли этилового спирта

Формула расчета спиртометрических таблиц смесей этилового спирта с водой

Плотность ρ, выраженная в килограммах на кубический метр (кг/м³) смеси этилового спирта с водой, при температуре t, выраженной в градусах Цельсия, определяется по следующей формуле в зависимости от:

- массовой доли этилового спирта p, выраженной до сотых (пример: для объемной концентрации 12% ρ = 0,12);

- температуры t, выраженной в градусах Цельсия;

- нижеуказанных коэффициентов.

Формула применима для температур в диапазоне от -20 до + 40°C

3. Общий и приведенный экстракт

3.1. MA-MD-AS 2-03-EXTSEC

1. Определение

Общий экстракт включает совокупность всех нелетучих веществ в определенных физических условиях. Физические условия должны устанавливаться таким образом, чтобы вещества, входящие в состав экстракта, во время определения претерпевали минимум изменений.

Приведенный экстракт – это общий экстракт за вычетом общего количества сахаров.

Сухой экстракт – это общий экстракт за вычетом общего количества сахаров, превышающих 1 г/л сульфата калия, превышающего 1 г/л маннита, присутствующего в любой концентрации и всех химических веществ, добавленных к вину.

Остаточный экстракт – это приведенный экстракт за вычетом титруемых кислот, пересчитанных на винную кислоту.

Содержание экстракта выражается в граммах на литр и определяется с точностью до 0,5 г.

2. Сущность метода

Метод измерения с использованием денсиметра

Общий экстракт вычисляют косвенно для сусла по величине его относительной плотности, а для вина – по относительной плотности деалкоголизированного вина.

Содержание общего экстракта выражается количеством сахарозы, которая при растворении в одном литре воды дает раствор такой же относительной плотности, как у сусла или дезалкоголизированного вина. Это количество указано в таблице, приведенной ниже.

3. Метод определения

Определяют относительную плотность d_r 20/20 сусла или вина. В случае вина определяют dr, в случае деалкоголизированного вина используют формулу:

d_r = d_v – d_a + 1,000

где:

d_v – относительная плотность вина при 20°C (с поправкой на содержание летучих кислот);

d_а – относительная плотность при 20°C водно-спиртовой смеси с той же объемной долей этилового спирта, что и вино.

Можно также вычислить d_r , исходя из плотности ρ_v вина при 20°C и ρ_a водно-спиртовой смеси с той же объемной долей этилового спирта, что и вино, по формуле:

 dr = 1,0018 (ρ_v – ρ_a) + 1,000,

где коэффициент 1,0018 может быть практически принят за 1 при ρ_v меньше 1,05, что и встречается чаще всего.

Перед тем как произвести это вычисление относительную плотность (или плотность) вина, измеренную, как указано выше, корректируют с учетом воздействия летучих кислот по формуле:

где

а – содержание летучих кислот в миллиэквивалентах на литр.

4. Выражение результатов

По величине плотности дезалкоголизированного вина или виноградного сусла, указанной в таблице, определяют количество общего экстракта в граммах на литр. Количество общего экстракта выражается в граммах на литр (г/л) с точностью до одного десятичного знака.

4. Сахара

4.1. MA-MD-AS 311-01 SUCRED

1. Определение

Редуцирующие сахара – все сахара с кетоновой или альдегидной группой, определяемые по их восстанавливающему действию на медно-щелочной раствор.

2. Сущность метода

2.1. Очистка

2.1.1. Арбитражный метод: вино после нейтрализации и дезалкоголизации пропускают через колонку с ионообменной смолой в ацетатной форме с последующим осветлением уксуснокислым свинцом.

2.1.2. Методы текущих определений: вино обрабатывают одним из перечисленных ниже реактивов:

нейтральный ацетат свинца;

гексацианоферрат (II) цинка.

2.2. Определение

2.2.1. Универсальный метод: после реакции вина или сусла с определенным количеством медно-щелочного раствора избыток ионов меди определяют методом йодометрии.

3. Очистка

Жидкость, в которой будут определять сахара, должна иметь содержание сахаров от 0,5 до 5 г/л.

Сухое вино разбавлять при очистке не рекомендуется; сладкое вино в процессе очистки разбавляют таким образом, чтобы довести содержание сахаров до пределов, указанных в таблице:

3.1. Арбитражный метод

3.1.1. Реактивы:

раствор соляной кислоты, 1 M (HCl);

раствор гидроксида натрия, 1 M (NaOH);

раствор уксусной кислоты, 4 M (CH₃COOH);

раствор гидроксида натрия, 2 M (NaOH);

анионообменная смола (типа Dowex 3 [20-50 меш] или аналогичная смола).

Подготовка колонки с анионообменной смолой: в бюретку помещают небольшой тампон из стекловаты и 15 мл анионообменной смолы. Смолу подвергают двум полным циклам регенерации, последовательно пропуская через нее 1M раствор соляной кислоты и 1M раствор гидроксида натрия. После промывки 50 мл дистиллированной воды смолу перемещают в цилиндрический сосуд, приливают 50 мл 1M уксусной кислоты и перемешивают в течение 5 минут.

Снова наполняют бюретку и пропускают через колонку 100 мл раствора 1М уксусной кислоты. Рекомендуется иметь запас смолы, которая должна храниться в растворе 4М уксусной кислоты в сосуде с притертой пробкой. Колонку промывают дистиллированной водой до тех пор, пока вытекающая жидкость не станет нейтральной.

Регенерация смолы: пропускают через колонку 150 мл раствора 2М гидроксида натрия для удаления кислот и красящих веществ, сорбированных на смоле. Ополаскивают 100 мл воды, пропускают 100 мл раствора 4М уксусной кислоты. Промывают колонку до тех пор, пока вытекающая жидкость не станет нейтральной.

Раствор нейтрального ацетата свинца (близкий к насыщению):

взбалтывают до растворения.

карбонат кальция CaCO₃.  

3.1.2. Методика определения

Сухие вина

50 мл вина помещают в цилиндрический сосуд диаметром 10-12 см и добавляют 0,5 (n – 0,5) мл раствора 1М гидроксида натрия (n – объем раствора 0,1 M гидроксида натрия, используемый для определения общей кислотности 10 мл вина). Выпаривают на водяной бане, направляя струю горячего воздуха до тех пор, пока объем жидкости не сократится примерно до 20 мл.

Пропускают жидкость через колонку с анионообменной смолой в ацетатной форме со скоростью 3 мл в 2 минуты. Собирают элюат в мерную колбу емкостью 100 мл.

Промывают 6 раз сосуд и колонку в 10 мл дистиллированной воды, приливают перемешивая 2,5 мл насыщенного раствора ацетата свинца и 0,5 г карбоната кальция; несколько раз перемешивают и оставляют отстаиваться в течение не менее 15 минут. Дополняют дистиллированной водой до метки и фильтруют. 1 мл фильтрата соответствует 0,5 мл вина.

Сусло, мистель, сладкие и полусладкие вина.

Ниже указаны примеры разведения

Сусло и мистель. Разбавляют анализируемую жидкость в 10 раз. Отбирают 10 мл разбавленной пробы.

Сладкие спиртованные или неспиртованные вина с плотностью 1,005-1,038. Разбавляют анализируемую жидкость в 5 раз. Отбирают 20 мл разбавленной пробы.

Вина, плотность которых составляет 0,997-1,005. Отбирают 20 мл неразбавленного вина.

Вышеуказанный объем вина или сусла пропускают через колонку с анионообменной смолой в ацетатной форме со скоростью 3 мл в 2 минты. Собирают элюат в мерную колбу на 100 мл, промывают колонку 6 раз по 10 мл дистиллированной водой.

Добавляют 1,0 мл насыщенного раствора ацетата свинца и 0,5 г карбоната кальция; перемешивают и оставляют отстаиваться в течение не менее 15 минут, периодически перемешивая. Дополняют дистиллированной водой до метки и фильтруют.

4. Определение

4.1. Реактивы

4.1.1. Медно-щелочной раствор:

Растворяют сульфат меди в 100 мл воды, лимонную кислоту в 300 мл воды и карбонат натрия в 300-400 мл горячей воды. Смешивают вместе раствор лимонной кислоты и раствор карбоната натрия. Добавляют раствор сульфата меди и доводят объем до литра.

4.1.2. Раствор йодистого калия, 30 г/100 мл:

раствор хранят в сосуде из темного стекла.

4.1.3. Серная кислота, 25 г/100 мл:

Добавляют кислоту в воду, оставляют для охлаждения и доводят объем до 100 мл.

4.1.4. Раствор крахмала, 5 г/л.

Растворяют 5 г крахмала примерно в 500 мл воды. Кипятят, помешивая в течение 10 минут. Добавляют 200 г хлористого натрия. После охлаждения  доводят объем до одного литра.

4.1.5. Тиосульфат натрия, раствор 0,1 М

4.1.6. Раствор инвертного сахара, 5г/л; раствор применяют для проверки методики определения.

В мерную колбу на 200 мл помещают:

Погружают колбу в водяную баню при 60°C до достижения в растворе температуры 50°C и выдерживают при этой температуре точно 15 минут. Оставляют колбу для медленного охлаждения в течение 30 минут, затем охлаждают погружением в холодную водяную баню. Раствор переливают в мерную колбу на 1 л и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор может храниться в течение месяца. Перед применением необходимый объем раствора нейтрализуют (кислотность данного раствора составляет приблизительно 0,06 M) с помощью раствора гидроксида натрия.

4.2. Методика определения

В коническую колбу емкостью 300 мл помещают 25 мл медно-щелочного раствора, 15 мл воды и 10 мл осветленного раствора. В полученном объеме раствора сахара не должно содержаться более 60 мг инвертного сахара.

Добавляют несколько кусочков пемзы. Соединяют колбу с обратным холодильником, доводят до кипения, которое должно начаться через 2 минуты. Кипятят точно 10 минут. Сразу же охлаждают в проточной холодной воде. После полного охлаждения добавляют 10 мл раствора йодистого калия (30г/100 мл), 25 мл серной кислоты (25г/100 мл) и 2 мл раствора крахмала.

Титруют раствором 0,1М тиосульфата натрия, n – количество использованных миллилитров. Параллельно выполняют контрольное определение при котором вместо 10 мл раствора сахара, берут 10 мл дистиллированной воды, n' – объем использованного тиосульфата натрия.

4.3. Выражение результатов

4.3.1. Расчеты

Количество сахара, выраженное в инвертном сахаре и содержащееся во взятой для анализа пробе, определяют по таблице, приведенной ниже, в зависимости от n' – n миллилитров использованного тиосульфата натрия.

Содержание инвертного сахара в вине выражают в граммах на литр (г/л) с точностью до одного десятичного знака, с учетом проведенного разбавления и объема взятой пробы.

4.3.2. Повторяемость

r = 0,015 x_i

x_i  – концентрация инвертного сахара в г/л пробы

4.3.3. Воспроизводимость

R = 0,058 x_i

x_i  - концентрация инвертного сахара в г/л пробы

4.2. MA-MD-AS 2-02 SUCREF

1. Сущность метода

Коэффициент рефракции при 20°C, выраженный абсолютным числом или содержанием сахарозы в процентах по массе, используют в соответствующей таблице для определения содержания сахаров в граммах на литр и в граммах на килограмм виноградного сусла, концентрированного виноградного сусла и ректификованного концентрированного виноградного сусла.

2. Аппаратура

2.1. Рефрактомет  Аббе

Используемый рефрактометр должен иметь шкалу с указанием:

- содержания сахарозы в процентах по массе с точностью до 0,1%,

- коэффициентов рефракции с точностью до четырех десятичных знаков.

Рефрактометр должен иметь термометр со шкалой + (15 – 25)° C и устройство для циркуляции воды, позволяющее проводить измерения при температуре (20± 5)°C

Следует строго соблюдать инструкции по эксплуатации данного прибора, особенно в части калибровки и источника света.

 3. Подготовка пробы

3.1. Сусло и сусло концентрированное

При необходимости процедить сусло через сложенную в четыре слоя сухую марлю, удалив первые капли жидкости, фильтрат анализируют.

3.2. Сусло виноградное ректификованное концентрированное

В зависимости от концентрации используют либо ректификованное концентрированное сусло, либо раствор, полученный разбавлением 200 г ректификованного концентрированного сусла дистиллированной водой до 500 г. Все взвешивания осуществляют точно.

4. Метод определения

Пробу доводят до температуры, близкой к 20°C. Помещают навеску, взятую в небольшом количестве, на нижнюю призму рефрактометра, следя за тем, чтобы анализируемый раствор равномерно покрывал поверхность стекла. Производят измерение в соответствии с инструкциями по эксплуатации применяемого прибора.

Определяют процентное содержание сахарозы по массе с точностью до 0,1% или находят коэффициент рефракции с точностью до четырех десятичных знаков.

На подготовленной пробе выполняют не менее двух определений. Отмечают температуру t°C.

5. Расчеты

5.1. Поправка на температуру

5.1.1. При использовании приборов, градуированных в % по массе сахарозы, для введения поправки на температуру применяют таблицу I.

5.1.2. При использовании приборов, градуированных в коэффициентах рефракции, с помощью коэффициента, измеренного при t°C и таблицы II (первый столбец), получают соответствующую величину содержания сахарозы в процентах по массе при t°C. Для этой величины вводят поправку на температуру и устанавливают соответствующее значение концентрации при 20°C при помощи таблицы I.

5.2. Содержание сахаров в сусле и в концентрированном сусле.

Согласно таблице II, по содержанию сахарозы в массовых процентах при 20°C определяют концентрацию сахаров в граммах на литр и в граммах на килограмм. Концентрацию сахаров выражают с точностью до десятичного знака, как инвертный сахар.

5.3. Содержание сахаров в ректификованном концентрированном сусле.

Согласно таблице III, по содержанию сахарозы в массовых процентах при 20°C и в том же ряду считают концентрацию сахаров в граммах на литр и в граммах на килограмм. Концентрацию сахаров выражают до десятичного знака.

Если определение проводится на разбавленном ректификованном концентрированном сусле, результат умножают на коэффициент разбавления.

5.4. Коэффициент рефракции сусла, концентрированного сусла и сусла ректификованного концентрированного

Согласно таблице II, по величине содержания сахарозы в массовых процентах при 20°C определяют коэффициент рефракции при 20°C. Этот коэффициент выражается до четырех десятичных знаков.

5. Общая кислотность

5.1. MA- MD-AS 313-01-ACITOT

1. Определение

Общая кислотность представляет собой сумму титруемых кислот при приведении рН к 7 добавлением титрованного раствора щелочи. Диоксид углерода не входит в общую кислотность.

2. Сущность метода

Потенциометрическое титрование или титрование в присутствии бромтимолового синего, служащего индикатором окончания реакции при сравнении с эталонным окрашиванием.

3. Реактивы

3.1. Буферный раствор pH 7:

Могут быть также использованы готовые стандартные буферные растворы.

3.2. Раствор гидроксида натрия 0,1M (NaOH).

3.3. Индикаторный раствор бромтимолового синего, 4 г/л :

После растворения добавляют:

4. Аппаратура

Водяной вакуумный насос.

Вакуумная колба на 500 мл.

Потенциометр со шкалой, градуированной в единицах рН, и электроды. Стеклянный электрод должен храниться в дистиллированной воде, электрод, содержащий каломель, – в насыщенном растворе хлорида калия. Комбинированный электрод, которым чаще всего пользуются, следует хранить в дистиллированной воде.

Мерные цилиндры емкостью по 50 мл (для анализа вина) и 100 мл (для анализа ректификованного концентрированного сусла)

5. Техника определения

5.1. Подготовка пробы

5.1.1. Вина

Удаление диоксида углерода: помещают примерно 50 мл вина в вакуумную колбу, встряхивают 1-2 минуты и одновременно создают вакуум с помощью водяного вакуумного насоса.

5.1.2. Сусло ректификованное концентрированное

Помещают 200 г ректификованного концентрированного сусла в мерную колбу на 500 мл. Дополняют водой до метки, гомогенизируют.

5.2. Потенциометрическое титрование

5.2.1.  Калибровка рН-метра

Калибровку рН-метра производят с буферным раствором рН 7 при 20°С в соответствии с инструкциями по применению прибора.

5.2.2. Методика измерения

В цилиндрическую емкость помещают пробу, подготовленную как указано в пункте 5.1. объемом 10 мл (вино) и 50 мл (ректификованное концентрированное сусло). Добавляют около 10 мл дистиллированной воды и приливают бюреткой раствор 0,1М гидроксида натрия (пункт 3.2.) с тем, чтобы рН стал равным 7 при 20 °С. Гидроксид натрия следует приливать медленно, постоянно перемешивая раствор. Обозначают через n добавленное количество миллилитров 0,1М NаОН.

5.3. Титрование синдикатором (бромтимоловый синий)

5.3.1.  Предварительное титрование: получение эталона окраски

В мерный цилиндр помещают 25 мл кипяченой дистиллированной воды, 1 мл раствора бромтимолового синего (пункт 3.3.) и пробу, подготовленную как указано в пункте 5.1. объемом 10 мл (вино) и 50 мл (ректификованное концентрированное сусло). Приливают раствор 0,1М гидроксида натрия (пункт 3.2.) до получения сине-зеленой окраски. Добавляют 5 мл буферного раствора рН 7 (пункт 3.1.).

5.3.2. Титрование

В мерный цилиндр помещают 25 мл кипяченой дистиллированной воды, 1 мл раствора бромтимолового синего (пункт 3.3.) и пробу, подготовленную как указано в пункте 5.1. объемом 10 мл (вино) и 50 мл (ректификованное концентрированное сусло). Приливают раствор 0,1М гидроксида натрия (пункт 3.2.) до получения окраски, идентичной полученной при предварительном титровании (пункт 5.3.1.). Обозначают через n, добавленное количество миллилитров 0,1М раствора гидроксида натрия.

6. Выражение результатов

6.1.Способ вычислений

6.1.1. Вина

Общая кислотность, выраженная в миллиграмм-эквивалентах на литр:

А = 10  n,

указывается до одного десятичного знака.

Общая кислотность, выраженная в граммах винной кислоты на литр:

А' = 0,075 А

указывается с точностью до одного десятичного знака.

6.1.2. Для ректификованного концентрированного сусла

Общая кислотность, выраженная в миллиграмм-эквивалентах на килограмм ректификованного концентрированного сусла,

а = 5 п;

Общая кислотность, выраженная в миллиграмм-эквивалентах на килограмм общих сахаров:

где Р – процентное содержание (m/m) общих сахаров. Значение указывается с точностью до одного десятичного знака.

6.2. Повторяемость (r) для титрования с индикатором:

r  = 0,9 мг-экв /л;

r  = 0,04 г /л серной кислоты;

r  = 0,07 г /л винной кислоты.

6.3. Воспроизводимость (R)  для титрования с индикатором:

Для белых и розовых вин:

R = 3,6 мг-экв /л;

R  = 0,2 г /л, серной кислоты;

R =  0,3 г /л, винной кислоты.

Для красных вин:

R = 5,1 мг-экв /л;

R  = 0,3 г /л, серной кислоты;

R =  0,4 г /л, винной кислоты.

6. Летучая кислотность

6.1. MA-MD-AS 313-02-ACIVOL

1. Определение

Летучие кислоты представлены кислотами жирного ряда, главным образом уксусной кислотой, которые находятся в вине в свободном состоянии и в виде солей.

2. Сущность метода

Титрование летучих кислот в дистилляте вина, полученном отгонкой водяным паром. Из вина предварительно удаляют углекислый газ.

Кислотность диоксида серы свободного и связанного, сорбиновой кислоты, дистиллированные в этих условиях, вычитаются из кислотности продукта, полученного при дистилляции.

Необходимо вычесть также кислотность сорбиновой кислоты, предварительно добавленной в вино.

Часть салициловой кислоты, используемой в некоторых странах для стабилизации вин, присутствует в продукте, полученном при дистилляции. Необходимо определить ее содержание и вычесть из летучей кислотности. Метод определения описан в пункте 7 настоящего раздела.

3. Реактивы:

винная кислота кристаллизованная (С₄Н₆О₆);.

гидроксида натрия (NaОН), раствор 0,1 М;

фенолфталеин, раствор 1%, в нейтральном спирте, 96% об.;

соляная кислота (ρ₂₀ = 1,18–1,19 г/мл), разбавленная 1/4 (v/v);

йод (I₂), раствор 0,005 М;

йодистый калий (КI) кристаллизованный;

крахмал, раствор, 5 г/л: 5 г крахмала разводят примерно в 500 мл воды. Помешивая, доводят до кипения и кипятят в течение 10 минут; добавляют 200 г хлорида натрия. После охлаждения доводят объем до одного литра;

насыщенный раствор тетрабората натрия (Na₂B₄O₇×10Н₂О), приблизительно 55 г/л при 20°С.

4. Аппаратура

4.1. Аппарат для перегонки с водяным паром, состоящий из парообразователя (водяной пар не должен содержать углекислый газ); стеклянного барботера, ректификационной колонны, охладителя.

Этот аппарат должен пройти три следующих испытания:

а) помещают в барботер 20 мл кипяченой воды. Отбирают 250 мл дистиллята и добавляют в него 0,1 мл 0,1М раствора гидроксида натрия и две капли раствора фенолфталеина. Розовая окраска должна быть устойчивой в течение не менее 10 секунд (признак того, что водяной пар не содержит углекислый газ);

b) помещают в барботер 20 мл 0,1М раствора уксусной кислоты. Отбирают 250 мл дистиллята. Титруют 0,1М раствором гидроксида натрия: объем прилитого раствора должен составлять не менее 19,9 мл (в этом случае уксусная кислота перешла в дистиллят в количестве не менее 99,5%).

с) помещают в барботер 20 мл 1М раствора молочной кислоты. Отбирают 250 мл дистиллята. Титруют 0,1М раствором гидроксида натрия: объем прилитого раствора гидроксида натрия должен быть не более 1,0 мл (в этом случае молочная кислота переходит в дистиллят в количестве не более 0,5%).

Аппарат, отвечающий вышеуказанным требованиям, считается соответствующим международным стандартам.

4.2. Вакуумный водяной насос.

4.3. Вакуумная колба

5. Техника определения

5.1. Подготовка пробы

Удаление углекислого газа: помещают около 50 мл вина в вакуумную колбу; встряхивают 1-2 минуты с одновременным вакуумированием вакуумным водяным насосом.

5.2. Перегонка с водяным паром

Помещают в барботер 20 мл дегазированного вина, добавляют 0,5 г винной кислоты. Собирают не менее 250 мл дистиллята.

5.3. Титрование

Титруют 0,1М раствором гидроксида натрия в присутствии двух капель раствора фенолфталеина, обозначают через n мл, количество израсходованного раствора гидроксида натрия.

Добавляют четыре капли разбавленной 1/4 соляной кислоты, 2 мл раствора крахмала и несколько кристаллов йодистого калия. Титруют свободный диоксид серы 0,005 М раствором йода. Обозначают через n'  мл объем раствора йода, израсходованного на титрование.

Добавляют насыщенный раствор тетрабората натрия до вторичного появления розовой окраски. Титруют связанный диоксид серы 0,005М раствором йода. Обозначают через n''  мл объем раствора йода, израсходованного на повторное титрование.

6. Выражение результатов

6.1. Способ расчета

Содержание летучих кислот, выраженное в миллиграмм-эквивалентах на литр с точностью до одного десятичного знака, вычисляют по формуле:

 А = 5(n – 0,1 n' – 0,05 n'').

Содержание летучих кислот, выраженное в граммах уксусной кислоты на литр с точностью до двух десятичных знаков, вычисляют по формуле:

А = 0,300 (n – 0,1 n' - 0,05 n'').

6.2. Повторяемость (r)

r = 0,7 мг-экв/л,

r = 0,04 г /л, уксусной кислоты.

6.3. Воспроизводимость (R)

R = 1,3 мг-экв /л,

R = 0,08 г /л, уксусной кислоты.

6.4. Для вина, содержащего сорбиновую кислоту

Поскольку сорбиновая кислота отгоняется водяным паром до 96% при объеме дистиллята 250 мл, ее следует вычитать из полученного результата, учитывая, что 100 мг сорбиновой кислоты соответствуют по кислотности 0,89 мг-экв или 0,053 г уксусной кислоты и зная содержание сорбиновой кислоты в вине в мг/л, которое было определено другими методами.

7. Определение салициловой кислоты, перешедшей в дистиллят летучих кислот

7.1. Принцип метода

После определения содержания летучих кислот и проведения коррекции на диоксид серы, при последующем подкислении дистиллята и добавлении соли трехвалентного железа, появление фиолетовой окраски свидетельствует о наличии салициловой кислоты.

Определение салициловой кислоты, перешедшей в дистиллят с летучими кислотами, проводят на другом дистилляте, объем которого равен объему дистиллята, используемого при определении летучих кислот. Содержание салициловой кислоты в данном дистилляте определяют сравнительным колориметрическим методом. Кислотность второго дистиллята вычитают из полученного содержания летучих кислот продукта.

7.2. Реактивы:

соляная кислота (HCl) (ρ₂₀ = 1,18-1,19 г/мл);

тиосульфат натрия (Na₂S₂O₃ × 5Н₂О), раствор, 0,1М;

сульфат аммония и железа (III) (железоаммонийные квасцы) [Fe₂(SО₄)₃ × (NHJ₂SО₄ × 24 Н₂О], раствор 10% (m/v);

салицилат натрия (NaC₇H₅O₃), раствор 0,01М. Раствор содержит 1,60 г/л салицилата натрия.

7.3. Техника определения

7.3.1. Обнаружение салициловой кислоты в дистилляте, содержащем летучие кислоты

Непосредственно после определения содержания летучих кислот и коррекции на содержание свободного и связанного диоксида серы помещают в коническую колбу помещают 0,5 мл соляной кислоты, 3 мл раствора тиосульфата натрия 0,1М и 1 мл раствора железоаммонийных квасцов. Появление фиолетовой окраски указывает на присутствие салициловой кислоты.

7.3.2. Определение салициловой кислоты

Отмечают меткой в конической колбе объем дистиллята. Сливают жидкость и промывают колбу дистиллированной водой.

Перегоняют с водяным паром новую пробу вина объемом 20 мл и собирают дистиллят в коническую колбу до нанесенной отметки. Приливают 0,3 мл чистой соляной кислоты и 1 мл раствора железоаммонийных квасцов. Содержимое конической колбы окрашивается в фиолетовый цвет.

В коническую колбу, аналогичную колбе с отметкой, приливают дистиллированную воду до того же уровня, что и уровень дистиллята. Добавляют 0,3 мл чистой соляной кислоты и 1 мл раствора железоаммонийных квасцов. Вводят из бюретки 0,01М раствор салицилата натрия до получения фиолетовой окраски той же интенсивности, что и в дистилляте вина. Обозначают через n'''  мл объем прилитого раствора.

7.4. Корректировка содержания летучих кислот

Вычитают объем 0,1n''' мл из объема n мл 0,1М раствора гидроксида натрия, использованного на титрование дистиллята при определении содержания летучих кислот.

7. Диоксид серы

7.1. MA-MD-AS 323-04-DIOSU

1. Определения

Под диоксидом серы понимают диоксид серы, присутствующий в сусле или вине в следующих формах: H₂SO₃, HSO₃^-. Равновесие этих форм зависит от pH и температуры:

H₂SO₃ считают молекулярным двуоксидом серы.

Общим диоксидом серы называют сумму всех форм диоксида серы, присутствующих в вине в свободном состоянии или связанных с его компонентами.

2. Диоксид серы свободный и общий

2.1. Принцип методов

2.1.1. Арбитражный метод

Для вина и сусла.

Диоксид серы удаляют из вина или сусла потоком воздуха или азота; затем он улавливается и окисляется в разбавленном нейтральном растворе перекиси водорода. Образующаяся серная кислота определяется стандартным раствором гидрооксида натрия. Свободный диоксид серы удаляется из вина охлаждением до 10°C.

Для ректификованного концентрированного сусла.

Диоксид серы удаляется из предварительно разбавленного ректификованного концентрированного сусла нагреванием до 100°C.

2.1.2. Экспресс-метод определения (для вина и сусла)

Свободный диоксид серы определяют прямым йодометрическим титрованием. Связанный диоксид серы определяют йодометрическим титрованием после его разрушения щелочью. Складывая полученные величины, определяют общий диоксид серы.

2.2. Арбитражный метод

2.2.1. Аппаратура

Используемый аппарат должен соответствовать схеме, приведенной на рис.2 в первую очередь это касается холодильника.

Трубка для ввода газов в барботер B имеет круглый конец диаметром 1 см, в его большом горизонтальном сечении расположены 20 отверстий диаметром 0,2 мм. Альтернативно эта трубка может оканчиваться пластинкой из стекла, обеспечивающей образование большого количества мельчайших пузырьков, создающих хороший контакт газовой и жидкой фаз.

Рис.2. Схема аппарата

Внутренние диаметры четырех концентрических трубок

холодильника составляют 45, 34, 27 и 10 мм.

Расход газа, проходящего через прибор, должен составлять около 40 литров в час. Сосуд, находящийся справа на рисунке, предназначен для ограничения снижения давления, производимого водяным насосом до 20-30 см. Для регулирования вакуума при сохранении правильного расхода необходимо поместить расходомер с полукапиллярной трубкой между барботером и сосудом.

2.2.2. Реактивы:

раствор индикатора:

2.2.3. Техника определения

Определение свободного диоксида серы.

Вино перед проведением анализа должно находиться в течение двух дней при температуре 20°C в полном и укупоренном сосуде.

В колбу А аппарата на 250 мл помещают 50 мл исследуемой пробы и 15 мл фосфорной кислоты. Устанавливают колбу на место.

Помещают в барботер B  2-3 мл раствора перекиси водорода, 2 капли индикатора и нейтрализуют раствор перекиси водорода 0,01M раствором гидроксида натрия. Соединяют барботер с прибором.

Барботируют воздухом (или азотом) в течение 15 минут. Уносимый свободный диоксид серы окисляется в серную кислоту. Отсоединяют барботер от прибора и титруют образовавшуюся кислоту раствором 0,01M гидроксида натрия. Обозначают через n мл использованный объем.

Выражение результатов

Содержание свободного диоксида серы выражается в миллиграммах на литр (мг/л) целым числом.

Количество свободного диоксида серы составляет 6,4n в  миллиграммах на литр (мг/л).

Определение общего диоксида серы

Для ректификованного концентрированного сусла используют раствор, полученный в результате разбавления анализируемой пробы до 40% (m/v), согласно разделу "Общая кислотность" в пункте 5.1.2. В колбу А аппарата на 250 мл помещают 50 мл этого раствора и 5 мл фосфорной кислоты. Совмещают колбу с аппаратом.

Для вина и сусла, при предполагаемом содержании в пробе SO₂ общего менее 50 мг в литре, в колбу на 250 мл аппарата помещают 50 мл пробы и 15 мл фосфорной кислоты. Соединяют колбу с аппаратом.

При определении диоксида серы в виноградном сусле необходимо использовать 5 мл раствора 25% (m/v) фосфорной кислоты.

При предполагаемом содержании в пробе общего SO₂ более 50 мг в литре, в колбу на 100 мл аппарата помещают 20 мл пробы и 5 мл фосфорной кислоты. Соединяют колбу с аппаратом.

Помещают в барботер В  2-3 мл раствора перекиси водорода, 2 капли индикатора и нейтрализуют раствор перекиси водорода как описано ранее; доводят до кипения вино, содержащееся в колбе, используя пламя высотой 4-5 см так, чтобы оно касалось дна колбы. Колбу следует ставить не на металлическую сетку, а на рассекатель с отверстием 30 мм в диаметре. Это позволяет избегать пригорания экстрактивных веществ, осаждающихся на стенках колбы.

Поддерживают кипение при пропускании потока воздуха (или азота). Через 15 минут общий диоксид серы полностью уносится и окисляется. Определяют образовавшуюся серную кислоту титрованием 0,01М раствором гидроксида натрия. Обозначают через n мл использованный объем.

Выражение результатов

Вино и сусло: содержание общего диоксида серы выражается в миллиграммах на литр (мг/л).

Сусло ректификованное концентрированное: содержание общего диоксида серы выражается в миллиграммах на килограмм (мг/кг) общих сахаров целым числом.

Расчет

Для вина

Общий диокисид серы в миллиграммах на литр:

Для ректификованного концентрированного сусла

Диоксид серы в миллиграммах на килограмм (мг/кг) общих сахаров (подготовленная проба объемом 50 мл):

1600 × n

–––––––

P

где P – содержание общих сахаров в процентах (m/m).

3. Молекулярный диоксид серы

3.1. Принцип метода

Процентное содержание молекулярного диоксида серы, H₂SO₃ в свободном диоксиде серы определяют по величине pH , концентрации спирта и температуре.

Для известных значений температуры и объемной доли этилового спирта:

где:

I – ионная сила,

A и B  - коэффициенты, которые зависят от температуры и концентрации спирта;

K_T – термодинамическая константа диссоциации: величина pK_Т  приводится в таблице I в зависимости от концентрации спирта и температуры;

K_M – смешанная константа диссоциации

Если принять среднее значение 0,038 за величину ионной силы I, то в таблице II приведены значения pK_Т для разных температур и концентраций спирта.

Содержание молекулярного диоксида серы, найденное по формуле (1), приведено в таблице III для различных pH, температур и концентраций спирта .

3.2. Расчет

Зная pH вина и концентрацию спирта, по таблице III определяют процентное содержание молекулярного диоксида серы, для температуры Т°C. Обозначают как Х ,%

Молекулярный диоксид серы в миллиграммах на литр (мг/л) составляет Х × С,

где С – содержание свободного диоксида серы в мг/л.

8. Определение сахаров в винах методом HPLC

8.1. MA-MD-AS 311-03 SUCRES

1. Область применения

Определение фруктозы, глюкозы и сахарозы в вине и сусле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC)

2. Принцип метода

Сахара и глицерин определяются непосредственно в вине методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с рефрактометрическим детектором.

 3. Реактивы. Приготовление растворов реактивов:

3.1. Деминерализованная вода, фильтрованная через целлюлезную мембрану 0,45 µm с помощью системы для фильтрации;

3.2. Элюент: с помощью мерного цилиндра помещают 800 мл ацетонитрила во флакон на 1 литр, добавляют 200 мл воды; постоянно дегазируют гелием. В случае закрытых систем (возвращение элюента во флакон), смесь обновляется еженедельно.

4. Аппаратура:

конические колбы, 100 мл;

цилиндрические сосуды, 100 мл;

цилиндрические сосуды, 50 мл;

автоматические пипетки, 10 мл;

аллонж;

мерные колбы, 100 мл;

цилиндр на 1 л;

флакон на 1 л;

шприц, 20 мл;

система для фильтрации;

порт фильтры;

целлюлезные мембраны, 0,45 µm;

целлюлезные мембраны, 0,8 µm;

целлюлезные мембраны, 1,2 µm;

целлюлезные мембраны, 5,0 µm;

предфильтры из целлюлезы;

фильтрующий картридж со смесью кремнезема с октадецилом (например: Seppack C18);

пленка, например, Парафилм;

колбы конические, 10 мл;

хроматограф HPLC.

Алкиламиновая колонка 5 µm и 250×4 мм.

Кондиционирование колонки: колонку заполняют и проверяют по гексану. Промывают 50 мл этанола, затем 50 мл метанола, перед пропусканием смеси ацетонитрил: вода 80:20. Начальная скорость потока 0,1 мл в минуту, затем скорость постепенно увеличивают до 1 мл в минуту.

Рефрактометрический детектор  – промывают контрольную ячейку один или два раза в день элюентом, оставляют примерно на четверть часа для стабилизации фоновой линии. Устанавливают ноль на рефрактометре .

Ультразвуковые бани.

5. Подготовка пробы

Образцы подвергаются дегазации азотом или на ультразвуковой бане.

6. Порядок определения

6.1. Подготовка образца

6.1.1. Фильтрация

С помощью шприца отбирают 25 мл продукта и фильтруют:

- вино через мембрану 0,45 µm;

- сусло и необработанное вино через предварительный фильтр и ряд фильтров.

Сусло разбавляют в 5 раз. С помощью автоматической пипетки на 10 мл, оснащенной аллонжем, отбирают 20 мл вина или сусла фильтрованного (разбавленного) и количественно переносят в мерную колбу на 100 мл. Объем доводят до метки деминерализованной водой, колбу накрывают пленкой и перемешивают.

6.1.2. Удаление фенольных соединений

Пробу вина или сусла пропускают через фильтрующий картридж C18.

Подготовка картриджа C18 для фильтрации: пропускают через картридж в противоположных направлениях 10 мл метанола, затем 10 мл деминерализованной воды.

Прохождения пробы через картридж C18: промывают шприц на 10 мл с использованием примерно 2 мл пробы. Затем берут около 9 мл анализируемой пробы, соединяют картридж с узким концом шприца и продавливают образец через картридж; первые 3 мл удаляют, следующие 6 мл собирают в коническую колбу на 10 мл.

После каждой фильтрации картридж промывают  в противоположных направлениях при помощи 10 мл метанола, затем 10 мл деминерализованной воды.  В этом случае он может быть использован повторно.

6.1.3. Очистка посуды

Шприцы и иглу промывают деминерализованной водой после каждой пробы. Порт-фильтр промывают теплой водой, затем метанолом. Сушат при комнатной температуре.

6.2. Метод определения

6.2.1. Аналитические условия

Детектор регулируют в соответствии с инструкцией аппарата.

6.2.2. Внешняя калибровка

Готовят синтетическую эталонную смесь из:

Если необходимо определить и глицерин, добавляют:

Расчет ответных факторов:

RF_i= S_i/C_i ,

где:

S_i – площадь пика компонента в калибровочном растворе ;

C_i – концентрация компонента в калибровочном растворе

7. Выражение результатов

Расчет концентраций в анализируемом образце:

C_pr. = S_pr./RF_i ,

где

S_pr. – площадь пика компонента в анализируемом образце. Результаты выражают в г/л. Необходимо учитывать фактор разбавления.

8. Проверка результатов

Выполняют тест, используя эталонный метод с введением контрольных образцов среди анализируемых.

9. Эффективность метода

Продолжительность одного анализа составляет около 50 минут. Влияние разных компонентов вина: глицерин разделяют при тех же условиях что и сахара. Рекомендуют одновременное их определение. Ни один из компонентов вина не вымывается одновременно с глюкозой, фруктозой и сахарозой.

Анализ чувствителен к изменениям температуры, колонки должны быть защищены покрытием.  

9.1. Пределы обнаружения и количественного определения

9.2. Точность результатов

9.2.1. Повторяемость

Абсолютное значение разности двух результатов параллельных определений, полученных в одном и том же вине одним и тем же оператором в пределах короткого промежутка времени не должно превышать предел повторяемости не более чем в 5% случаев (Р = 0,95).

9.2.2. Воспроизводимость

Абсолютное значение разности двух результатов анализа одного и того же вина, полученных в двух лабораториях не должно превышать предел воспроизводимости не более чем в 5% случаев (Р = 0,95).

9. Глюкоза и фруктоза

9.1. MA-MD-AS 311-02-GLUFRU

1. Определение

Глюкоза и фруктоза могут быть определены по отдельности энзиматическим методом только с целью расчета соотношения глюкоза/фруктоза.

2. Принцип метода

Глюкозу и фруктозу фосфорилируют аденозинтрифосфатом (АТP) в ходе энзиматической реакции, катализируемой гексокиназой (HК), и получают глюкозо-6-фосфат (G6P) и фруктозо-6-фосфат (F6P):

Вначале глюкоза-6-фосфат окисляется в глюконат-6-фосфатат под воздействием никотинамидадениндинуклеотидфосфата (NADPH) в присутствии фермента глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (G6PDH). Количество восстановленного (NADPH) соответствует количеству глюкозо-6-фосфата и, следовательно, количеству глюкозы.

Количество восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфат определяют по абсорбции при 340 нм. По окончании реакции фруктозa-6-фосфат преобразуется под воздействием фосфоглюкозо-изомеразы (FGI) в глюкозо-6-фосфат (G6P).

Глюкозо-6-фосфат снова вступает в реакцию с никотинамидадениндинуклеотидфосфатом, в результате чего образуется глюконат-6-фосфат и восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат, который затем определяют.

3. Аппаратура

Спектрофотометр для измерений при 340 нм, максимальной длины волны абсорбции NADPH восстановленного. Поскольку имеются в виду абсолютные измерения (не по диапазону калибровки, а на базе коэффициента экстинкции NADPH восстановленного), следует контролировать шкалы длин волн и абсорбции прибора. При отсутствии спектрофотометра указанного типа можно пользоваться спектрофотометром с дискретным спектром измерения при 334 нм или 365 нм.

Kюветы стеклянные с длиной оптического пути 1 см или кюветы для одноразового пользования.

Пипетки для энзиматического тестирования 0,02; 0,05; 0,1; 0,2 мл.

4. Реактивы

4.1. Раствор 1: буферный раствор (0,3 М триэтаноламин, pH 7,6, Mg²⁺ 4 × 10^-3 M):

11,2 г хлоргидрата триэтаноламина [(C₂H₅)₃N HCl] и 0,2 g MgSO₄ × 7H₂O растворяют в 150 мл бидистиллированной воды. Добавляют примерно 4 мл 5М раствора гидроксида натрия (NaOH) для получения pH равного 7,6 и дополняют до 200 мл. Полученный буферный раствор может храниться в течение четырех недель при температуре + 4°С.

4.2. Раствор 2: раствор NADPH (примерно 11,5 × 10^-3 M): 50 мг никотин-амидадениндинуклеотидфосфата двунатриевого растворяют в 5 мл бидистиллированной воды. Этот раствор может храниться четыре недели при температуре + 4°С.

4.3. Раствор 3: раствор аденозин-5'- трифосфата (примерно 81 × 10^-3 M): 250 мг

аденозин-5'- трифосфата двунатриевого и 250 мг двууглекислого натрия (NaHCO₃)  растворяют в 5 мл бидистиллированной воды. Этот раствор может храниться четыре недели при температуре +4°С.

4.4. Раствор 4: раствор гексокиназы/глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназы: смешивают 0,5 мл гексокиназы (2 мг протеина/мл) и 0,5 мл глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (1 мг протеина/мл). Этот раствор может храниться четыре недели при температуре +4°С.

4.5. Раствор 5: раствор фосфоглюкозы-изомеразы (2 мг протеина/мл ). Суспензию используют без разбавления. Этот раствор может храниться один год при температуре +4°С.

Все реактивы, приведенные выше, продаются в специализированных магазинах.

5. Техника определения

5.1. Подготовка пробы

В зависимости от предполагаемого количества (глюкоза+фруктоза) грамм на литр пробу разбавляют следующим образом:

5.2. Определение

Установив на спектрофотометре длину волны 340 нм, производят измерения по отношению к воздуху (без кювет) или к воде. Температура от 20 до 25°C.

В две кюветы с оптическим путем 1 см вводят:

Смешивают и примерно через 3 минуты определяют абсорбцию растворов (A1). Для начала реакции добавляют:

Смешивают и выдерживают 1 минуту; измеряют абсорбцию и проверяют конец реакции через 2 минуты (A2). Добавляют немедленно:

Перемешивают, через 10 минут считывают абсорбцию и через 2 минуты проверяют конец реакции (A₃).

Определяют разность абсорбций:

A₂ – A₁ соответствует содержанию глюкозы,

A₃ – A₂ соответствует содержанию фруктозы,

для кюветы сравнения и с пробой.

Рассчитывают разность абсорбции в кювете сравнения (ΔA_т) и кювете с пробой (ΔA_D) и получают:

для глюкозы: Δ A_G =  Δ A_D – Δ A_T

для фруктозы: Δ A_F = Δ A_D – Δ A_T

Время, необходимое для действия ферментов, может меняться в зависимости от партии. Вышеуказанные данные являются информационными. Рекомендуется определять это время для каждой партии.

5.3. Выражение результатов

5.3.1 Расчеты

Общая формула для расчета концентрации С:

где V- объем реактива, мл (тест), v – объем пробы, мл, РМ – молекулярный вес определяемого вещества, d – оптический путь кюветы, см, ε – коэффициент абсорбции NADPH, при 340 нм ε = 6,3 (mmol^-1 ×  l ×  cm^-1); V= 2,92 для определения глюкозы, V= 2,94 мл для определения фруктозы, v = 0,20 мл, PM = 180,  d = 1.

Получают:

для глюкозы: С, г/л = 0,417 Δ A_G

для фруктозы: С, г/л = 0,420 Δ A_F.

Если при подготовке пробы было выполнено разбавление, результат умножают на коэффициент F.

Если измерения были проведены при длине волны 334 или 365 нм, то получают:

- при 334 нм: ε = 6,2 (mmol^-1 ×  l ×  cm^-1);

для глюкозы С, г/л = 0,425 Δ A_G

для фруктозы С, г/л = 0,428 Δ A_F

- при 365 нм: ε = 3,4 (mmol^-1 ×  l ×  cm^-1) ;

для глюкозы С, г/л = 0,773 Δ A_G

для фруктозы С, г/л = 0,778 Δ A_F

5.3.2. Повторяемость (r)

r = 0,056 x_i

5.3.3. Воспроизводимость (R)

R = 0,12 + 0,076 x_i

x_i – содержание глюкозы и фруктозы в граммах на литр

10. Органические кислоты

 10.1. MA-MD-AS 313-04 ACIORG

Органические кислоты в винах могут быть разделены одновременно и определены количественно методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

1. Принцип метода

Органические кислоты из вина могут быть выделены на неподвижных фазах двух видов: смесь кремния и октадецила и ионообменные смолы. Определение органических кислот проводят с помощью спектрофотометрического детектора UV/VIS.

Для определения винной и яблочной кислот рекомендуется разделение на колонке с наполнителем из смеси кремния с октадецилом, для лимонной и молочной кислот – разделение на колонке с ионообменной смолой. Определение проводят по отношению к внутреннему стандарту, который анализируется при тех же условиях.

Метод позволяет определить одновременно содержание шикимовой, уксусной, янтарной и фумаровой кислот.

Для анализа могут быть выбраны разные типы колонок. Условия и порядок работы, приведенные ниже, представлены в качестве примера.

2. Аппаратура

2.1. Установка для фильтрации через целлюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 µm.

2.2. Колонка с наполнителем из смеси кремния и октадецила (например: Sep Pak WATERS ASS).

2.3. Хроматограф HPLC укомплектованный:

- инжектором в виде петли с рабочим объемом 10 µl;

- термостатом;

- спектрофотометрическим детектором для измерения абсорбции при 210 нм;

- регистрирующим устройством с интегратором.

Условия хроматографирования

Разделение лимонной, молочной и уксусной кислот:

- колонка с сильной катионообменной смолой (H⁺)  (например, HPX-87 H BIO-RAD, длина 300 мм, внутренний диаметр 7,8 мм, размер частиц 9 µm);

2.3.2. Разделение винной, яблочной, молочной, шикимовой, янтарной и фумаровой кислот:

- две колонки (длина – 250 мм; внутренний диаметр – 4 мм), соединенные последовательно, заполненные смесью кремния и октадецилом в форме сферических частиц диаметром 5 µm;

3. Реактивы:

вода дистиллированная или вода качества HPLC;

метанол перегнанный;

кислота винная ;

кислота яблочная;

лактат натрия;

кислота шикимовая;

ацетат натрия;

кислота янтарная;

кислота лимонная;

кислота фумаровая ;

кислота серная (ρ₂₀=1,84 г/мл);

кислота серная, раствор 0,0125 M;

дегидрофосфат калия KH₂PO₄;

сульфат аммония (NH₄)₂SO₄;

ортофосфорная кислота, 85% (ρ₂₀=1,71 г/мл);

стандартный раствор: кислота винная (5 г/л), яблочная кислота (5 г/л), лактат натрия (6,22 г/л), кислота шикимовая (0,05 г/л), ацетат натрия (6,83 г/л), кислота янтарная (5 г/л), кислота фумаровая (0,01 г/л) и кислота лимонная (5 г/л).

4. Проведение испытания

4.1. Подготовка проб

Предварительно промывают патрон 10 мл метанола, затем 10 мл воды. Пробу вина или сока дегазируют. Фильтруют через мембрану с диаметром пор 0,45 µm.

Отбирают 8 мл фильтрата шприцем, предварительно ополоснутым анализируемой пробой; вводят это количество в патрон. Первые 3 мл удаляют, собирают следующие 5 мл (избегают высыхания патрона).

4.2. Хроматографирование

Вводят последовательно в хроматограф 10 µl стандартного раствора и 10 µl пробы, приготовленного согласно пункту 4.1. Пробы вводят 3 раза и в той же последовательности. Регистрируют хроматограмму.

5. Расчет

5.1. Качественный анализ

Определяют время выхода каждого вещества. Органические кислоты из стандартного раствора разделяются в следующей последовательности:

- лимонная, винная, яблочная, янтарная+шикимовая, молочная, фумаровая и уксусная согласно методике, описанной в пункте 2.3.1;

- винная, яблочная, шикимовая, молочная, уксусная, лимонная, янтарная и фумаровая согласно методике, описанной в пункте 2.3.2.

5.2. Количественный анализ

Определяют среднее значение трех измерений каждого из пиков для стандартного раствора и для исследуемой пробы. Рассчитывают содержание органических кислот в исследуемой пробе.

6. Выражение результатов

Концентрация органических кислот выражают следующим образом:

- в г/л до первого десятичного знака для винной, яблочной, молочной и янтарной кислот;

- в мг/л для лимонной, уксусной и фумаровой кислот.

11. Лимонная кислота

11.1 MA-MD-AS 313-09-ACIENZ

1. Сущность метода

Лимонная кислота преобразуется в оксалоацетат и ацетат в ходе реакции, катализатором которой служит цитрат-лиаза (CL):

В присутствии малат-дегидрогеназы (MDH) и лактат-дегидрогеназы (LDH) оксалацетат и его декарбоксилированное производное – пируват восстанавливаются в L-малат и L-лактат с помощью никотинамидадениндинуклеотида (NADH):

Количество NADH, окисленное до NAD⁺ в этих реакциях, пропорционально количеству присутствующего в пробе цитрата. Окисление (NADH) измеряют по уменьшению его абсорбции при длине волны 340 нм.

2. Аппаратура

2.1. Спектрофотометр для измерений при 340 нм максимальной длины волны абсорбции NADH восстановленного. Поскольку имеются в виду абсолютные измерения (не по диапазону калибровки, а на базе коэффициента экстинкции NADH восстановленного), следует контролировать шкалы длин волн и абсорбции прибора. При отсутствии спектрофотометра указанного типа можно пользоваться спектрофотометром с дискретным спектром измерения при 334 или 365 нм.

2.2. Стеклянные кюветы с оптическим путем 1 см или одноразовые кюветы.

2.3. Микропипетки для отбора объемов от 0,02 до 2 мл.

3. Реактивы

3.1. Буферный раствор с pH 7,8 (глицилглицин 0,51 М; Zn²⁺:0,6×10^-3M): растворяют 7,13 г глицилглицина в 70 мл бидистиллированной воды. Доводят pH до 7,8 примерно с 13 мл 5М раствора гидроксида натрия.

Приливают 10 мл раствора хлорида цинка ZnCl₂, содержащего 80 мг ZnCl₂ в 100 мл, и доводят до объема 100 мл бидистиллированной водой. Раствор остается стабильным в течение четырех недель при температуре +4^°C.^.

3.2. Раствор восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (NADH), примерно 6×10^-3 М: растворяют 30 мг NADH и 60 мг NaHCO₃ в 6 мл бидистиллированной воды. Раствор остается стабильным в течение четырех недель при температуре +4°C.^.

3.3. Раствор малат-дегидрогеназы/лактат-дегидрогеназы (MDH/LDH) (0,5г MDH +2,5 мг LDH/мл): готовят смешиванием 0,1 мл MDH (5 г MDH/мл), 0,4 мл раствора сульфата аммония (3,2 M) и 0,5 мл LDH (5 мг/мл). Полученная суспензия стабильна в течение одного года при температуре + 4°C.

3.4. Раствор цитрат-лиазы СL (5 мг протеина/мл). Растворяют 168 мг лиофилизата в 1 мл ледяной воды. Раствор остается стабильным в течение недели при температуре + 4°C и может хранится 4 недели в замороженном состоянии.

Рекомендуется перед определением проверить активность ферментов.

3.5. Поливинилполипиролидон (PVPP) .

Реактивы, необходимые для указанного определения, можно приобрести в специализированных магазинах.

4. Подготовка пробы

Определение содержания лимонной кислоты проводят прямо в вине, без предварительного обесцвечивания и разбавления в случае, когда общее содержание лимонной кислоты в нем меньше 400 мг/л. В противном случае вино разбавляют так, чтобы концентрация лимонной кислоты составила величину между 20 и 400 мг/л (количество лимонной кислоты в навеске составляет величину 5-80 мкг).

В случае красного вина, богатого полифенольными соединениями, рекомендуется предварительная обработка его PVPP: готовят суспензию, смешав примерно 0,2 г PVPP с водой, дают отстояться в течение 15 минут, фильтруют через бумажный фильтр.

К 10 мл вина, помещенного в коническую колбу на 50 мл, добавляют PVPP во влажном состоянии, собранный шпателем с фильтра. Размешивают в течение 2-3 минут. Фильтруют.

5. Техника определения

Устанавливают спектрофотометр на длину волны 340 нм. Абсорбцию измеряют в кюветах на 1 см, отрегулировав нулевую абсорбцию по воздуху (без кюветы на пути светового потока). В кюветы на 1 см помещают:

Тщательно перемешивают, через 5 минут снимают показания абсорбции растворов, контрольной и испытуемой пробы (А₁). Затем добавляют:

Тщательно перемешивают, через 5 минут снимают показания абсорбции растворов контрольной и испытуемой пробы (А2).

Определяют разность абсорбций А₂ – А₁ для контроля (ΔА_Т) и пробы (ΔА_D) и рассчитывают:

ΔА = ΔА_D - ΔА_Т

Поскольку время, необходимое для воздействия ферментов, может меняться от одной партии реактива к другой, оно приводится выше только в порядке информации. Рекомендуется определять оптимальное время для каждой партии.

6. Выражение результатов

Содержание лимонной кислоты указывается в миллиграммах на литр (мг/л) целым числом.

6.1. Способ вычислений

Концентрацию в миллиграммах на литр (мг/л) определяют по следующей формуле:

где: V – объем контрольной пробы (здесь 3,14 мл);

v  - объем испытуемой пробы (здесь 0,2 мл);

M – молекулярная масса определяемого вещества (здесь M_{лимонной кислоты} =192,1);

δ  – величина оптического пути кюветы (здесь 1 см);

ε – коэффициент молярной абсорбции NADH при 340 нм (здесь ε = 6,3 mmol^-1 × l × cm^-1).

Получают

С = 479 ΔА

Если при подготовке пробы ее разбавляли, результат умножают на коэффициент разбавления.

Для измерения при 334 нм: С  = 488 ΔА (ε = 6,3 mmol^-1 × l × cm^-1);

Для измерения при 365 нм: С = 887 ΔА (ε = 3,4 mmol^-1 × l × cm^-1)

6.2. Повторяемость (r):

Для содержания лимонной кислоты менее 400 мг/л: r = 14 мг/л

Для содержания лимонной кислоты более 400 мг/л: r = 28 мг/л

6.3. Воспроизводимость (R):

Для содержания лимонной кислоты менее 400 мг/л: R = 39 мг/л

Для содержания лимонной кислоты более 400 мг/л: R = 65 мг/л.

12. Винная кислота

 12.1 MA-MD-AS 313-05-ACITAR

 1. Сущность метода

1.1. Арбитражный метод

Винную кислоту, осажденную в виде рацемата кальция, определяют весовым методом. Определение может быть дополнено сравнительным определением по объему. Условия осаждения: рН, общий объем взятой пробы и концентрация осаждающих ионов должны быть такими, чтобы осаждение рацемата кальция было полным, а D(-) виннокислый калий оставался в растворе.

Если к вину была добавлена метавинная кислота, препятствующая полному осаждению рацемата кальция, ее необходимо предварительно подвергнуть гидролизу.

1.2. Метод текущих определений

Винную кислоту, отделенную пропусканием через колонку с анионитом, определяют колориметрически в элюате, в котором при добавлении ванадиевой кислоты образуется красное окрашивание. Присутствие в элюате молочной и яблочной кислот не мешает определению винной кислоты.

2. Арбитражный метод

2.1. Весовой метод

2.1.1. Реактивы

Раствор ацетата кальция, содержащий 10 г/л кальция:

Рацемат кальция кристаллогидрат, СаС₄О₆Н₄ × 4Н₂О: в цилиндрический стакан на 400 мл помещают 20 мл раствора L (+) винной кислоты (5 г/л), 20 мл раствора D (-) виннокислого аммония (6,126 г/л) и 6 мл раствора ацетата кальция (10 г/л).

Оставляют на два часа для осаждения. Собирают осадок на фильтре № 4, трижды промывают его примерно 30 мл дистиллированной воды. Высушивают при температуре 70°С до постоянного веса. Использовав указанное количество реактивов, получают около 340 мг кристаллизованного рацемата кальция.

Полученное вещество следует хранить в закрытом стеклянном сосуде.

Раствор для осаждения (рН 4,75):

Растворяют D(-) тартрат аммония в 900 мл воды; добавляют 8,8 мл раствора ацетата кальция и доводят объем до 1 литра.  Добавляют 5 мг рацемата кальция на литр, взбалтывают в течение 12 часов, затем фильтруют.

2.1.2. Техника определения

Для вина без добавления метавинной кислоты

В цилиндр на 600 мл помещают 500 мл раствора для осаждения и 10 мл вина. Перемешивают, затем инициируют осаждение воздействием стеклянной палочки на стенки сосуда. Оставляют для осаждения на 12 часов (на ночь).

Отделяют осадок фильтрацией через предварительно взвешенный фильтр № 4, тщательно ополаскивая сосуд, в котором проводилось осаждение, во избежание потерь.

После высушивания до постоянной массы (70°С) осадок взвешивают (p – масса кристаллического рацемата кальция СаС₄О₆Н₄×4Н₂О).

Для вина с добавлением метавинной кислоты

Для вина, в которое добавляли метавинную кислоту, или при подозрении на ее присутствие проводят гидролиз этой кислоты следующим образом: в коническую колбу на 50 мл помещают 10 мл вина и 0,4 мл чистой уксусной кислоты. Закрывают колбу пробкой с отводной трубкой для отвода паров и кипятят в течение 30 минут. После охлаждения количественно переносят жидкость из конической колбы в цилиндр, споласкивают два раза по 5 мл воды и продолжают анализ, как указано выше в пункте 2.1.2. "Техника определения". При вычислении результата метавинная кислота учитывается как винная.

2.1.3. Выражение результатов

Одна молекула рацемата кальция соответствует 0,5 молекулы L(+) винной кислоты, содержащейся в вине.

Количество винной кислоты в литре вина, выраженное в миллиграмм-эквивалентах, равно 384,5 р, с точностью до одного десятичного знака.

Количество винной кислоты в литре вина, выраженное в граммах винной кислот, равно 28,84 р, с точностью до одного десятичного знака.

Количество винной кислоты в литре вина, выраженное в граммах виннокислого калия, равно 36,15 р, с точностью до одного десятичного знака.

2.2. Сравнительный объемный анализ

2.2.1. Реактивы

Соляная кислота (НС1) (ρ₂₀ = 1,18–1,19 г/мл), разбавленная 1/5 (v/v)

0,05 М раствор ЭДТА:

ЭДТА (С₁₀Н₁₄N₂О₈Nа₂×2Н₂О) ______________ 18,61 г

дистиллированная вода ___________________ до 1000 мл

Раствор гидроксида натрия, 40%, (m/v):

гидроксид натрия (NаОН) __________________ 40 г

дистиллированная вода ___________________ до 100 мл

Индикатор:

калькон-угольная кислота или 2-гидрокси 4-cульфо-1-нафтил-азо-3-сульфонафтойная кислота (С₂₁Н₁₄Н₂О₇S×Н₂О) 1 г

сульфат натрия безводный (Na₂SO₄) _________100 г

2.2.2. Техника определения

После взвешивания растворяют осадок рацемата кальция в 10 мл разбавленной соляной кислоты. Промывают фильтр 50 мл дистиллированной воды. Добавляют 5 мл 40% раствора гидроксида натрия и примерно 30 мг индикатора. Титруют 0,05 М ЭДТА. Обозначают через n объем, пошедший на титрование в мл.

2.2.3. Выражение результатов

Количество винной кислоты в литре вина, выраженное в миллиграмм-эквивалентах: 5n, определяется с точностью до одного десятичного знака.

Количество винной кислоты в литре вина, выраженное в граммах винной кислоты: 0,375n, определяется с точностью до одного десятичного знака.

Количество винной кислоты в литре вина, выраженное в граммах виннокислого калия: 0,470 n, определяется с точностью до одного десятичного знака.

3. Метод текущих определений

3.1. Аппаратура

3.1.1. Стеклянная колонка длиной 300 мм и внутренним диаметром 10-11 мм, с краном.

3.1.2. Спектрофотометр для измерения абсорбции при 490 нм с кюветами на 10 мм.

3.2. Реактивы

3.2.1. Для предварительной обработки вина

Уксусная кислота (р₂₀ = 1,05 г/мл), разбавленная до 30% (v/v).

Анионит сильной основности в форме ацетата (например, анионит III по Мерку 20 – 50 меш). Готовят суспензию анионита (примерно 100 г) в 200 мл разбавленной 30% (v/v) уксусной кислоты. Оставляют в контакте не менее 24 часов до момента использования; хранят анионит для последующих анализов в разбавленной 30% (v/v) уксусной кислоте.

Уксусная кислота (ρ₂₀ = 1,05 г/мл), разбавленная до 0,5% (v/v).

Раствор сульфата натрия, содержащий 7,1 г /100 мл (0,5М): растворяют 71 г безводного сульфата натрия (Na₂SO₄) в дистиллированной воде и доводят до 1 л.

3.2.2. Для определения винной кислоты

Раствор ацетата натрия (NaCH₃COO), 27% (m/v): растворяют 270 г безводного ацетата натрия (NaCH₃COO) в дистиллированной воде и доводят до 1 л.

Ванадиевый реактив: растворяют 10 мг метаванадата аммония (NH₄V0₃) в 150 мл 1М раствора гидроксида натрия. Переливают раствор в мерную колбу на 500 мл, добавляют 200 мл 27% раствора ацетата натрия. Доводят дистиллированной водой до 500 мл.

Раствор серной кислоты, 1M.

Раствор серной кислоты, 0,5M.

Раствор серной кислоты, 0,05M.

Раствор йодной кислоты, 0,05 М: в мерную колбу на 1000 мл помещают 10,696 г метапериодата натрия, NaIO₄, 50 мл 0,5 М серной кислоты и доводят дистиллированной водой до 1 л.

Раствор глицерина, 10% (m/v): в мерную колбу на 100 мл помещают 10 г глицерина и доводят дистиллированной водой до метки.

Раствор сульфата натрия из расчета 7,1 г/100 мл (0,5M)

Раствор винной кислоты 1 г/л: в мерную колбу емкостью 500 мл помещают 0,5 г винной кислоты, 6,66 мл 1 М раствора гидроксида натрия и доводят до метки раствором сульфата натрия 7,1г/100 мл (0,5M).

Раствор гидроксида натрия, NaOH, 1М.

3.3. Техника определения

3.3.1. Подготовка колонки с анионитом

В стеклянную колонку помещают тампон из стекловаты. Пропитывают его дистиллированной водой. В колонку наливают 10 мл суспензии анионита в ацетатной форме. Декантируют. Во избежание повторного образования суспензии анионита при последующих промывках на поверхность анионита помещают тампон из стекловаты. Анионит используют однократно.

3.3.2. Выделение органических кислот

Открывают кран и дают стечь раствору уксусной кислоты так, чтобы слой жидкости был на 2-3 мм выше верхнего тампона из стекловаты.

Добавляют 10 мл 0,5% раствора уксусной кислоты. Дают жидкости стечь до указанного уровня. Повторяют операцию 4 раза.

После последней промывки кран закрывают, вносят в колонку 10 мл вина или сусла. Открывают кран и дают вину стекать по капле (1 капля в секунду) пока не останется 2-3 мл над поверхностью анионита. Добавляют в колонку 10 мл 0,5% уксусной кислоты, дают стечь с той же скоростью, что и в предыдущей операции, повторяют промывку 7 раз, используя каждый раз по 10 мл воды.

После последнего промывания закрывают кран, как только уровень жидкости будет находиться немного выше верхнего края тампона.

Элюируют кислоты, осажденные на анионите, с помощью 7,1% раствора сульфата натрия; элюат собирают в мерную колбу на100 мл до метки.

3.3.3. Определение винной кислоты

В две конические колбы a и b вводят по 20 мл элюата. Колба a служит для определения винной кислоты, а колба b, в которой винная кислота разрушается под действием йодной кислоты, используется как контроль.

В колбу a помещают: 2 мл 1М серной кислоты, 5 мл 0,05 М серной кислоты и 1 мл 10% раствора глицерина.

В колбу b помещают: 2 мл 1М серной кислоты, 5 мл 0,05М раствора йодной кислоты. Через 15 минут добавляют 1 мл 10% раствора глицерина для разрушения избытка йодной кислоты. Выдерживают 2 минуты.

После 2 минут, взбалтывая, наливают сначала в пробу b, потом сразу же в пробу a по 5 мл ванадиевого реактива. Непосредственно за этим включают хронометр и помещают растворы в кюветы спектрофотометра. Точно через 90 секунд измеряют абсорбцию пробы a  по отношению к контролю (проба b) при 490 нм.

В случае когда количество винной кислоты велико и абсорбция слишком большая, элюат разбавляют 7,1% раствором сульфата натрия, затем проводят измерение на разбавленном растворе.

Для вин с добавлением метавинной кислоты

Когда известно, что в вино была добавлена метавинная кислота или если предполагается наличие таковой, проводят гидролиз этой кислоты, как указано в арбитражном методе.

После охлаждения пробу, так же как и воду для промывания посуды (два раза по 5 мл), количественно переносят в колонку с анионитом, далее – как указано выше.

При вычислении результата метавинная кислота учитывается как винная кислота.

3.3.4. Построение калибровочной кривой

В мерные колбы на 100 мл вводят 10, 20, 30, 40 и 50 мл раствора винной кислоты концентрацией 1 г/л и доводят до метки 7,1% раствором сульфата натрия. Концентрации этих растворов соответствуют элюатам, полученным из вин, содержащих винную кислоту 1, 2, 3, 4 и 5 г/л.

В две конические колбы а и b вводят по 20 мл этих растворов и продолжают определение согласно процедуре, описанной для элюата вина.

Калибровочный график зависимости абсорбции от содержания винной кислоты имеет вид прямой, слегка изогнутой к нулевой точке. При необходимости, процедуру повторяют для проб, в которых содержание винной кислоты менее 1,0 г/л.

3.4. Выражение результатов

Для определения содержания винной кислоты используют калибровочную кривую. Содержание винной кислоты в вине выражают в граммах на литр (г/л) с точностью до одного десятичного знака.

13. Молочная кислота

13.1 MA-MD-AS 313-07-ALAENZ

1. Принцип метода

1.1. Арбитражный метод

В присутствии никотинамидадениндинуклеотид (NAD) общая молочная кислота (L-лактат и D-лактат) окисляется до пирувата в ходе реакции, катализируемой L-лактатдегидрогеназой (L-LDH) и D- лактатдегидрогеназой (D-LDH). Равновесие реакции направлено в строну лактата. Выделение пирувата из реакционной среды смещает равновесие в сторону образования пирувата.

В присутствии L-глютамата пируват преобразуется в L-аланин; реакция катализируется глютамат-пируват-трансаминазой (GPT).

Количество NADH, определенное по увеличению абсорбции при длине волны 340 нм, пропорционально количеству присутствующего лактата.

L- молочная кислота может быть определена самостоятельно с помощью реакций (1) и (3), а D-молочная кислота может быть определена аналогично с помощью реакций (2) и (3).

1.2. Метод текущих определений

Молочную кислоту отделяют пропусканием через колонку с ионообменной смолой, окисляют до ацетальдегида и определяют колориметрическим методом после реакции с нитропруссидом натрия и пиперидином.

2. Арбитражный метод

2.1. Реактивы

Вода бидистиллированная.

2.1.1. Буферный раствор pH 10 (глицилглицин 0,6 моль/л; L-глютамат 0,1 моль/л): растворяют 4,75 г глицилглицина и 0,88 г L-глутаминовой кислоты приблизительно в 50 мл бидистиллированной воды; доводят pH до 10 с помощью нескольких миллилитров 10 M раствора гидроксида натрия и доводят до объема 60 мл бидистиллированной водой. Раствор остается стабильным в течение 12 недель при температуре + 4°C.

2.1.2. Раствор никотинамидадениндинуклеотида (NAD) примерно 40×10^-3 M:  растворяют 900 мг NAD в 30 мл бидистиллированной воды. Раствор остается стабильным в течение 4 недель при температуре + 4°C.

2.1.3. Раствор глютамат-пируват-трансаминазы (GPT) 20 мг/мл. Суспензия остается стабильной в течение одного года при + 4°C.

2.1.4. Суспензия L-лактатдегидрогеназы (L-LDH) 5 мг/л. Суспензия остается стабильной в течение одного года при температуре + 4°C.

2.1.5. Суспензия  D-лактатдегидрогеназы (D-LDH), 5 мг/мл. Суспензия остается стабильной в течение одного года при температуре + 4°C.

Перед проведением определения рекомендуется проверить активность фермента.

Все реактивы имеются в продаже.

2.2. Аппаратура

2.2.1. Спектрофотометр для измерений при 340 нм, максимальной длины волны абсорбции восстановленного NADH. Поскольку имеются в виду абсолютные измерения (не по диапазону калибровки, а на базе коэффициента экстинкции восстановленного NADH), следует контролировать шкалы длин волн и абсорбции прибора. При отсутствии спектрофотометра указанного типа можно пользоваться спектрофотометром с дискретным спектром измерения при 334 нм или 365 нм.

2.2.2. Стеклянные кюветы с оптическим путем 1 см или одноразовые кюветы.

2.2.3. Микропипетки для отбора объемов от 0,02 до 2 мл.

2.3. Подготовка пробы

Не следует трогать руками ту часть лабораторной посуды, которая контактирует с реакционной средой, чтобы не внести в нее L-молочную кислоту, так как это может вызвать ошибки при получении результатов.

Определение лактата производится обычно прямо в вине без предварительного обесцвечивания и разбавления вина при условии, что содержание молочной кислоты менее 100 мг/л. Если концентрация молочной кислоты находится между 100 мг/л и 1 г/л, то его разбавляют 1/10 бидистиллированной водой; если между 1 г/л и 2,5 г/л, то вино разбавляют 1/25 бидистиллированной водой; если между 2,5 г/л и 5 г/л, то разбавляют 1/50 бидистиллированной водой.

2.4. Методика определения

2.4.1. Определение общей молочной кислоты.

До проведения определения буферный раствор приводят к температуре 20-25°С.

Спектрофотометр устанавливают на длину волны 340 нм, измеряют абсорбцию в кюветах с оптическим путем 1 см, отрегулировав нулевую абсорбцию по отношению к воздуху (контроль) (без кюветы) или к воде.

Затем в кюветы с оптическим путем 1 см помещают:

Перемешивают стеклянной мешалкой или палочкой из синтетического материала с плоским концом; через пять минут снимают показания абсорбции в кюветах с контрольной и испытуемой пробами (А₁).

Добавляют 0,02 мл раствора 2.1.4 и 0,05 мл раствора 2.1.5, смешивают, ждут, пока реакция закончится (примерно 30 минут), и измеряют показания абсорбции в кювете с контрольной и испытуемой пробами (А₂).

Определяют разность величин абсорбции (А₂-А₁) в кюветах с контрольной ΔА_Т  и испытуемой ΔА_D  пробами. Вычитают разность между ними:

ΔА = ΔА_D – ΔА_Т

2.4.2. Определение L-молочной и D-молочной кислот.

Определение L-молочной и D-молочной кислот может быть выполнено индивидуально, указанным для общей молочной кислоты способом, но после того, как было определено значение А₁,продолжая как указано ниже.

Добавляют 0,02 мл раствора 2.1.4, гомогенизируют, ждут пока реакция закончится (примерно 20 минут) и измеряют абсорбцию в кюветах с контрольной и испытуемой пробами (А₂).

Добавляют 0,05 мл раствора 2.1.5, гомогенизируют, ждут, пока реакция закончится (примерно 30 минут), и измеряют абсорбцию в кюветах с контрольной и испытуемой пробами (А₃).

Определяют разность величин абсорбции (А₂-А₁) для L-молочной кислоты и (А₃-А₂) для D-молочной кислоты для контрольной Δ A_T и испытуемой проб Δ A_D.

Окончательно рассчитывают разность:

ΔА = ΔА_D – ΔА_Т

Время, необходимое для окончательного воздействия ферментов, варьирует от одной партии к другой. Приведенное выше ориентировочное и рекомендуется определять его для каждой партии. Когда определяют только L-молочную кислоту, инкубационный период после добавления L-лактатдегидрогеназы может быть доведен до 10 минут.

2.5. Выражение результатов

Концентрацию молочной кислоты указывают в граммах на литр (г/л) с точностью до десятичного знака.

2.5.1. Способ вычислений

Концентрацию в граммах на литр определяют по общей формуле:

где: V – объем раствора теста в мл (V = 2,24 мл для L-молочной кислоты, V = 2,29 мл для D- молочной кислоты и общей молочной кислоты);

v  – объем пробы в мл (здесь 0,2 мл);

M – молекулярная масса определяемого вещества (здесь для DL- молочной кислоты  М=90,08);

δ – оптический путь кюветы в см (здесь 1 см);

ε – коэффициент абсорбции NADH (при 340 нм ε = 6,3 mmol^-1 × l × cm^-1)

Общая молочная кислота и D- молочная кислота

С = 0,164 × ΔА

Если при подготовке пробы ее разбавляли, результат умножают на коэффициент разбавления.

- измерение при 334 нм: С = 0,167 × ΔА (ε = 6,2 mmol^-1 × l × cm^-1);

- измерение при 365 нм: С = 0,303 × ΔА (ε = 3,4 mmol^-1 × l × cm^-1)

L- молочная кислота

С = 0,160 х ΔА

Если при подготовке пробы ее разбавляли, результат умножают на коэффициент разбавления.

- измерение при 334 нм: С = 0,163 × ΔА (ε = 6,2 mmol^-1 × l × cm^-1);

- измерение при 365 нм: С = 0,297 × ΔА (ε = 3,4 mmol^-1 × l × cm^-1)

2.5.2. Повторяемость (r)

r = 0,02 + 0,07 х_i ,

где х_i - концентрация молочной кислоты в пробе в г/л.

2.5.3. Воспроизводимость (R):

R = 0,05 + 0,125 х_i ,

где х_i - концентрация молочной кислоты в пробе в г/л.

14. Яблочная кислота общая

14.1. MA-MD-AS 313-10-AMALTO

1. Принцип метода

Яблочную кислоту, выделенную с помощью колонки с анионитом, определяют колориметрически. Определение количества яблочной кислоты осуществляют по интенсивности желтого цвета, полученного при обработке элюата 96% серной и хромотроповой кислот. Для исключения возможных помех аналогичных веществ образец обрабатывают смесью серной (86%) и хромотроповой кислот, и полученную абсорбцию вычитают из первоначальной абсорбции, разница определяет исключительно яблочную кислоту.

2. Аппаратура

2.1.Стеклянная колонка длиной примерно 250 мм и внутренним диаметром 35 мм, снабженная краном.

2.2. Стеклянная колонка длиной примерно 300 мм и внутренним диаметром 10-11 мм, снабженная краном.

2.3. Водяная баня, 100°С.

2.4. Спектрофотометр для измерений абсорбции при длине волны 420 нм с кюветами на 10 мм.

3. Реактивы:

анионит сильной основности (например, Merck III);

гидроксид натрия, 5% (m/v);

уксусная кислота, 30% (m/v);

уксусная кислота, 0,5% (m/v);

раствор сульфата натрия,10% (m/v);

концентрированная серная кислота 95-97% (m/m);

серная кислота  86% (m/m).

Раствор хромотроповой кислоты 5% (m/v): готовят непосредственно перед каждым определением, растворяя 500 мг хромотропата натрия  (C₁₀H₆Na₂O₈S₂×2H₂O) в 10 мл дистиллированной воды.

Раствор DL-яблочной кислоты из расчета 0,5 г/л: растворяют 250 мг яблочной кислоты  (C₄H₆O₅)  в достаточном количестве 10% раствора сульфата натрия, доводят объем до 500 мл тем же раствором (10% раствором сульфата натрия).

4. Методика определения

4.1. Подготовка анионита

Над краном стеклянной колонки 35×250 мм помещают тампон из стекловаты, пропитанный дистиллированной водой. Наполняют колонку анионитом в форме суспензии так, чтобы иметь свободное пространство примерно 50 мм над поверхностью анионита.

Промывают анионит 1000 мл дистиллированной воды. Промывают колонку 5% раствором гидроксида натрия и дают стечь до 2-3 мм над поверхностью анионита, повторяют двумя последующими промываниями 5% раствором гидроксида натрия, затем оставляют анионит в контакте с раствором на 1 час. Позже промывают анионит 1000 мл дистиллированной воды.

Позже наполняют колонку 30% раствором уксусной кислоты, дают стечь жидкости до 2-3 мм над поверхностью анионита. Повторяют операцию 2 раза, затем оставляют в контакте на 24 часа до применения колонки. Используемую колонку хранят в 30% растворе уксусной кислоты до последующих определений.

4.2. Подготовка колонки с анионитом

Над краном стеклянной колонки 11×300 мм помещают тампон из стекловаты, пропитанный дистиллированной водой. Заполняют колонку анионитом, подготовленным согласно пункту 4.1, на высоту 10 см. Дают стечь 30% раствору уксусной кислоты до 2-3 мм над поверхностью анионита, затем промывают анионит 50 мл 0,5% уксусной кислотой.

4.3. Выделение  DL-яблочной кислоты.

В колонку, подготовленную согласно пункту 4.2, приливают 10 мл вина или сусла. Дают стечь вину или суслу (средний расход – 1 капля/секунду)  до 2-3 мм над поверхностью анионита, затем промывают анионит 50 мл 0,5% уксусной кислотой и 50 мл дистиллированной воды (средний расход – 1 капля/секунду).

Элюируют кислоты, фиксированные на анионите, действием 10% раствора сульфата натрия (средний расход – 1 капля/секунду). Собирают элюат в мерную колбу на 100 мл, объем дополняют до метки.

Анионит регенерируют согласно процедуре, указанной в пункте 4.1.

4.4. Определение DL-яблочной кислоты

Берут две пробирки на 30 мл с притертой пробкой А и B. В каждую пробирку вводят по 1,0 мл элюата и 1,0 мл 5% раствора хромотроповой кислоты. Добавляют в пробирку А 10,0 мл 86% раствора серной кислоты (контроль), а в пробирку B -10,0 мл концентрированной серной кислоты (анализируемая проба). Закрывают и взбалтывают до получения однородной смеси, не смачивая шлиф.

Погружают пробирки на 10 минут в водяную баню, предварительно доведенную до кипения. Охлаждают пробирки в темном месте до 20°C. Ровно через 90 минут после начала охлаждения измеряют абсорбцию раствора B по отношению к раствору А при длине волны 420 нм в кюветах на 1 см.

4.5. Построение калибровочной кривой

В мерные колбы на 50 мл вводят 5, 10, 15 и 20 мл раствора  яблочной кислоты концентрацией 0,5 г/л, доводят объем до метки 10% раствором сульфата натрия. Приготовленные растворы соответствуют количеству 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 г/л яблочной кислоты в вине. Продолжают анализ согласно указаниям пункта 4.4.

Зависимость полученных абсорбций от содержания  яблочной кислоты имеет вид прямой, проходящей через начало координат.

Поскольку интенсивность окраски зависит от концентрации серной кислоты, необходимо проверять калибровочную кривую хотя бы для одной точки при каждой серии измерений, чтобы выявить возможные изменения, появившиеся вследствие влияния этого фактора.

 5. Выражение результатов

Количество DL-яблочной кислоты определяют по калибровочной кривой в г/л до десятичного знака.

14.2. MA-MD-AS 313-11 ALMENZ

1. Принцип метода

В присутствии никотинамидадениндинуклеотид (NAD) L-яблочная кислота (L-малат) окисляется до оксалоацетата в результате реакции, катализируемой L-малатдегидрогеназой (L-MDH).

Равновесие реакции направлено в строну малата. Выделение оксалоацетата из реакционной среды смещает равновесие в сторону образования оксалоацетата. В присутствии L-глютамата оксалоацетат преобразуется в L-аспартат, в результате реакции, катализируемой глютамат – оксалоацетат – трансаминазой (GOT):

Количество образованного NADH, определенное по увеличению абсорбции при длине волны 340 нм, пропорционально количеству присутствующего L- малата.

2. Аппаратура

2.1. Спектрофотометр для проведения измерений при 340 нм, максимуме абсорбции NADH .

При отсутствии этого прибора можно использовать фотометр с прерывистым спектром, который позволяет производить измерения при 334 нм или 365 нм.

2.2. Стеклянные кюветы с длиной оптического пути 1 см или одноразовые кюветы.

2.3. Микропипетки для отбора объемов от 0,01 до 2 мл.

3. Реактивы

Вода бидистиллированная.

3.1. Буферный раствор pH 10 (глицилглицин 0,6 моль/л, L- глютамат 0,1 моль/л): растворяют 4,75 г глицилглицина и 0,88 г L-глютамата приблизительно в 50 мл бидистиллированной воды; доводят pH до 10 с примерно 4,6 мл 10 M раствора гидроксида натрия, доводят объем до 60 мл бидистиллированной водой. Раствор остается стабильным в течение 12 недель при температуре + 4°C.

3.2. Раствор никотинамидадениндинуклеотида (NAD) примерно 0,047 M:  растворяют 420 мг NAD в 12 мл бидистиллированной воды. Раствор остается стабильным в течение 4 недель при температуре + 4°C.

3.3. Суспензия глютамат-оксалат-трансаминазы (GOT) концентрацией 2 мг/мл. Суспензия остается стабильной в течение одного года при температуре + 4°C.

3.4 Раствор L-малатдегидрогеназы (L-MDH) концентрацией 5 мг/мл. Раствор остается стабильным в течение одного года при температуре + 4°C.

Реактивы, необходимые для указанного определения, имеются в продаже.

4. Подготовка пробы

Определение L-малата проводят прямо в вине, без предварительного обесцвечивания и разбавления, в случае когда содержание L-яблочной кислоты менее 350 мг/л (измерение при 365 нм). В случае превышения этого лимита вино разбавляют бидистиллированной водой до концентрации L-яблочной кислоты между 30 и 350 мг/л (количество L-малата, присутствующего в анализируемой пробе 3- 35 мкг).

В случае, когда концентрация L-малата в вине менее 30 мг/л, объем отбираемой пробы может быть увеличен до 1 мл. Объем добавляемой воды должен быть таким, чтобы общие объемы были одинаковыми в обеих кюветах.

5. Методика определения

Спектрофотометр устанавливают на длину волны 340 нм; измеряют абсорбцию в кюветах с оптическим путем 1 см, отрегулировав нулевую абсорбцию по отношению к воздуху (без кюветы) или к бидистиллированной воде. В кюветы с оптическим путем 1 см помещают:

Смешивают, примерно через 3 минуты снимают показания абсорбции растворов контроля и пробы (А₁). Добавляют в обе пробы по 0,01 мл раствора 3.4. Смешивают, ждут окончания реакции (примерно 5-10 минут) и измеряют абсорбцию растворов контроля и пробы (А₂).

Определяют разность величин абсорбции (А₂-А₁) для пробы(ΔА_D) и для контроля (ΔА_Т)

Определяют:

ΔА = ΔА_D – ΔА_Т

Время, необходимое для реакции ферментов, может меняться от одной партии к другой. В методике данные представлены в порядке информации. Рекомендуется определять время для каждой партии.

6. Выражение результатов

Концентрацию L-яблочной кислоты указывают в граммах на литр (г/л) с точностью до одного десятичного знака.

6.1. Способ вычислений.

Концентрацию в граммах на литр определяют по общей формуле:

где:

V – объем контроля в мл (здесь 2,22 мл);

v  – объем пробы в мл (здесь 0,1 мл);

M – молекулярная масса определяемого вещества (здесь L-яблочной кислоты  = 134,09);

δ  – оптический путь кюветы в см (здесь 1 см);

ε – коэффициент абсорбции NADH при 340 нм ε = 6,3 (mmol^-1 × l × cm^-1).

Получают для L-малата:

 С = 0,473 × ΔА г/л

Если при подготовке пробы ее разбавляли, результат умножают на коэффициент разбавления.

Измерение при 334 нм: ε = 6,2 (mmol^-1 × l × cm^-1)

С = 0,482 × ΔА ;

Измерение при 365 нм: ε = 3,4 (mmol^-1 × l × cm^-1 )

С = 0,876 × ΔА

6.2. Повторяемость (r):

r = 0,03+0,034 х_i

где х_i - концентрация L-яблочной кислоты в пробе в г/л.

6.3. Воспроизводимость (R):

R = 0,05 + 0,071х_i

где х_i - концентрация L-яблочной кислоты в пробе в г/л.

14.3. MA-MD-AS 313-12 ADMENZ

1. Принцип метода

В присутствии D-малат-дегидрогеназы (D-MDH) D-яблочная кислота (D-малат) окисляется до оксалоацетата под воздействием никотинамидадениндинуклеотида (NAD). Образующийся оксалоацетат преобразуется в пируват и двуокись углерода, согласно уравнению:

Количество образованного NADH, определенное по увеличению абсорбции при длине волны 334, 340 или 365 нм, пропорционально количеству присутствующего в пробе D-малата.

2. Реактивы

Реактивы для проведения 30 определений имеются в продаже в виде наборов, включающих:

флакон 1, содержащий 30 мл буферного раствора Hepes (N-гидроксиэтил)-пиперазин-N¹-2-этан сульфоновый), pH = 9,0 и стабилизаторы;

флакон 2, содержащий примерно 210 мг лиофилизата NAD;

флакон 3 (три штуки), каждый содержит лиофилизат D-MDH, для титрования, примерно 8 единиц.

Подготовка растворов

Используют флакон 1 без разбавления. Перед использованием температуру раствора доводят до (20-25)°С;

Растворяют содержимое флакона 2 в 4 мл бидистиллированной воды.

Растворяют содержимое флакона 3 (одного из 3 флаконов) в 0,6 мл бидистиллированной воды. Перед использованием доводят температуру растворов до (20-25)°С.

Стабильность растворов

Содержимое флакона 1 хранится не более года при температуре +4°C; раствор 2 хранится около 3 недель при температуре +4°C и 2 месяца при температуре (-20)°С; раствор 3 хранится 5 дней при температуре +4°C.

3. Аппаратура

3.1. Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения при длине волны 340 нм, максимуме абсорбции NADH.

При отсутствии  этого прибора можно использовать фотометр с прерывистым спектром при 334 нм или 365 нм.

3.2. Стеклянные кюветы с оптическим путем 1 см или одноразовые кюветы.

3.3. Микропипетки для отбора объемов от 0,01 до 2 мл.

4. Подготовка пробы

Определение D-малата производят непосредственно в вине без предварительного обесцвечивания.

Количество D-малата, присутствующего в кювете, должно быть между 2 мкг и 50 мкг, поэтому вино разбавляют таким образом, чтобы концентрация D-малата составляла величину между 0,02 и 0,5 г/л или 0,02 и 0,3 г/л (в зависимости от используемой аппаратуры).

5. Методика определения

Устанавливают спектрофотометр на длину волны 340 нм, измеряют абсорбцию в кюветах с оптическим путем 1 см. Регулируют нулевую абсорбцию по отношению к воздуху (не помещая кювету) или по отношению к бидистиллированой воде.

В кюветы с оптическим путем 1 см помещают:

Тщательно перемешивают. Приблизительно через 6 минут измеряют абсорбции растворов контроля и пробы (А₁).

Добавляют:

Тщательно перемешивают. Приблизительно через 20 минут (конец реакции) измеряют абсорбцию растворов контроля и пробы (А₂).

Рассчитывают разность абсорбций (А₂-А₁) для контроля (ΔА_Т) и пробы (ΔА_D). Рассчитывают их разность:

ΔА = ΔА_D – ΔА_Т

Время, необходимое для воздействия ферментов, может меняться от одной партии к другой, рекомендуется определять его для каждой партии реактива. D-яблочня кислота быстро вступает в реакцию. Дополнительная активность фермента, может преобразовать L-винную кислоту, даже если скорость этой реакции значительно замедлена. Это может потребовать коррекцию данных экстраполированием.

 6. Выражение результатов

Концентрацию D-яблочной кислоты указывают в миллиграммах на литр (мг/л) без десятичного знака, определяют по формуле:

где:

V – объем контроля в мл (здесь 2,95 мл),

v  – объем пробы в мл (здесь 0,1 мл);

M – молекулярная масса определяемого вещества (здесь D-яблочная кислота М=134,09);

δ  – длина оптического пути кюветы в см (здесь 1 см);

ε – коэффициент абсорбции NADH:

при 340 нм ε = 6,3 (mmol^-1 ×  l × cm^-1),

при 365 нм ε = 3,4 (mmol^-1 ×  l × cm^-1),

при 334 нм ε = 6,18 (mmol^-1 ×  l × cm^-1).

Если при подготовке пробы ее разбавляли, результат умножают на коэффициент разбавления.

7. Достоверность

7.1. Повторяемость (r):

Абсолютная разница между двумя отдельными результатами, полученными на идентичном материале, этим же оператором, на одном и том же оборудовании, с коротким интервалом времени, не должна превышать значение повторяемости r в более 5% случаев, r = 11 мг/л

7.2. Воспроизводимость (R)

Абсолютная разница между двумя отдельными результатами, полученными на идентичном материале в двух различных лабораториях, не должна превышать значение воспроизводимости R в более 5% случаев.

R = 20 мг/л

8. Примечания

Принимая во внимание точность метода, рекомендуется при содержании D-яблочной кислоты менее 50 мг/л подтверждать ее концентрацию другим методом анализа.

При содержании D-яблочной кислоты менее 100 мг/л не следует интерпретировать D,L-яблочную кислоту как добавленную в вино.

Объем пробы вина, отобранный в кювету, не должен превышать 0,1 мл во избежание возможного ингибирования активности ферментов полифенолами.

15. Сорбиновая кислота

15.1. MA-MD-AS 313-14 ACISOR

1. Сущность методов

1.1. Метод абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолете

Сорбиновую кислоту (транс 2,4–гексадиеновая кислота) экстрагируют при перегонке с водяным паром и определяют в дистилляте вина абсорбционной спектрофотометрией в ультрафиолете. Вещества, влияющие на измерение абсорбции в ультрафиолете, удаляются при выпаривании досуха пробы дистиллята, слегка подщелоченной раствором гидроксида кальция.

При содержании менее 20 мг/л следует провести анализ тонкослойной хроматографией (чувствительность:1 мг/л).

1.2. Метод газовой хроматографии

Сорбиновую кислоту экстрагируют диэтиловым эфиром и определяют с помощью газовой хроматографии в присутствии внутреннего стандарта.

1.3. Метод определения с помощью тонкослойной хроматографии

Сорбиновую кислоту экстрагируют диэтиловым эфиром; разделяют с помощью тонкослойной хроматографии; концентрация оценивается полуколичественно.

2. Метод абсорбционной спектрофотометрии в ультрафиолете

2.1. Аппаратура:

аппарат для перегонки с водяным паром (Раздел "Летучие кислоты");

водяная баня, 100°C;

спектрофотометр для измерения при длине волны 256 нм с кварцевыми кюветами, толщиной 1 см.

2.2. Реактивы

кристаллическая винная кислота;

раствор гидроксида кальция, примерно 0,02 М;

эталонный раствор сорбиновой кислоты (C₆H₈O₂), 20 мг/л: растворяют 20 мг сорбиновой кислоты примерно в 2 мл раствора 0,1 М гидроксида натрия; помещают в мерную колбу на 1000 см³ и доводят до метки дистиллированной водой. Можно также растворить 26,8 мг сорбата калия в воде; перенести в колбу на 1000 см³ и довести до метки дистиллированной водой.

2.3. Методика определения

2.3.1. Перегонка

В барботер аппарата для перегонки с водяным паром помещают 10 см³ вина, добавляют 1 – 2 г винной кислоты. Собирают 250 мл дистиллята.

2.3.2. Калибровочная кривая

Готовят путем разбавления водой четыре эталонных раствора с содержанием сорбиновой кислоты соответственно: 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 мг/л; измеряют спектрофотометром абсорбцию при 256 нм по отношению к дистиллированной воде. Строят кривую зависимости абсорбции от концентрации растворов.

2.3.3. Определение

В чашку диаметром 55 мм помещают 5 мл дистиллята, добавляют 1 мл раствора гидроксида кальция. Выпаривают досуха на водяной бане. Затем остаток несколькими миллилитрами дистиллированной воды переносят количественно в колбу на 20 мл. Доводят до метки промывной водой.

Измеряют спектрофотометром абсорбцию сорбиновой кислоты при длине волны λ= 256 нм в сравнении с буферным раствором, полученным разведением до 20 мл дистиллированной водой 1 мл раствора гидроксида кальция. Значение абсорбции наносят на калибровочную прямую и определяют концентрацию сорбиновой кислоты в растворе.

На практике процедурой выпаривания досуха можно пренебречь. Измерять абсорбцию можно в дистилляте, разбавленном в отношении 1/4 по отношению к дистиллированной воде.

2.4. Выражение результатов

2.4.1 Вычисление

Концентрация сорбиновой кислоты в вине, выраженная в миллиграммах на литр, составляет:

100 × C,

где C – концентрация сорбиновой кислоты в растворе, анализируемом спектрофотометрически, выраженная в миллиграммах на литр.

3. Метод определения газовой хроматографией

3.1. Аппаратура

Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором и колонкой из нержавеющей стали [4 м × 1/8 дюйма(25,4мм/8)], обработанной диметилдихлорсиланом. Стационарная фаза состоит из смеси сукцината диэтиленгликоля (5%) и фосфорной кислоты (1%) (DEGS–H₃PO₄) или смеси адипината диэтиленгликоля (7%) и фосфорной кислоты (1%) (DEGS–H₃PO₄), закрепленной на Gashcrom Q 80-100 mesh.

Для обработки диметилдихлорсиланом (DMDCS) через колонку пропускают толуол, в котором растворены 2-3 г DMDCS. Колонку немедленно промывают метанолом, пропускают поток азота, затем гексана и снова азот, после чего заполняют.

Условия проведения измерений:

Микрошприц на 10 микролитров, градуированный по 0,1 микролитра.

3.2. Реактивы

Диэтиловый эфир (C₂H₅)₂О, перегнанный к моменту использования.

Раствор внутреннего стандарта: раствор ундекановой кислоты, C₁₁H₂₂О₂  в 95% об. этаноле, 1 г/ л.

Водный раствор серной кислоты Н₂SО₄ (ρ₂₀ = 1,84 г/мл), разбавление 1/3 (v/v).

3.3. Методика определения

3.3.1. Подготовка пробы к анализу

В цилиндр на 40 мл с притертой пробкой помещают 20 мл вина, добавляют 2 мл раствора внутреннего стандарта и 1 мл раствора серной кислоты. После перемешивания добавляют 10 мл диэтилового эфира.

Экстрагируют сорбиновую кислоту, встряхивая цилиндр в течение 5 минут. Отстаивают.

3.3.2. Подготовка эталонного раствора

Отбирают пробу вина, у которого хроматограмма эфирного экстракта не имеет пиков на уровне элюирования сорбиновой кислоты. Вносят в вино сорбиновую кислоту, в концентрации 100 мг на литр; 20 мл  пробы обрабатывают в соответствии с пунктом 3.3.1.

3.3.3. Хроматографирование

Инжектируют микрошприцем в хроматограф последовательно 2 мкл эфирного экстракта, полученного в соответствии с пунктом 3.3.2, и 2 мкл эфирного экстракта, полученного в соответствии с пунктом 3.3.1.

Регистрируют соответствующие хроматограммы; проверяют идентичность времени удерживания сорбиновой кислоты и внутреннего стандарта. Измеряют высоту (или площадь) зарегистрированных пиков.

3.4. Выражение результатов

3.4.1. Способ вычисления

Концентрацию сорбиновой кислоты С в анализируемом вине, в миллиграммах на литр (мг/л), определяют по формуле:

где:

H – высота пика сорбиновой кислоты в эталонном растворе;

h – высота пика сорбиновой кислоты в анализируемой пробе;

I  – высота пика внутреннего стандарта в эталонном растворе;

i – высота пика внутреннего стандарта в анализируемой пробе.

Концентрация сорбиновой кислоты может быть аналогично определена на основании измерений площади соответствующих пиков.

4. Обнаружение следов сорбиновой кислоты тонкослойной хроматографией

4.1. Аппаратура:

пластины для тонкослойной хроматографии, 20×20 см, покрытые полиамидным гелем (толщина 0,15 мм) с добавлением флюоресцентного индикатора;

кюветы для тонкослойной хроматографии;

микропипетки или микрошприцы объемом 5 мкл ± 0,1 мкл;

лампа ультрафиолетовая (254 нм).

4.2. Реактивы:

диэтиловый эфир (C₂H₅)₂О;

водный раствор серной кислоты Н₂SО₄ (ρ₂₀ = 1,84 г/мл), разбавление 1/3 (v/v);

эталонный раствор сорбиновой кислоты в водно-спиртовой смеси 10% об., около 20 мг на литр;

подвижная фаза: гексан–пентан-уксусная кислота (C₆H₁₄-C₅H₁₂-CH₃COOH, ρ₂₀=1,05 г/мл) 20:20:3.

4.3. Методика определения

4.3.1. Подготовка пробы к анализу

В стеклянный цилиндр емкостью примерно 25 мл с притертой пробкой помещают 10 мл вина, добавляют 1 мл раствора серной кислоты и 5 мл диэтилового эфира. Перемешивают переворачивая цилиндр. Отстаивают.

4.3.2. Подготовка эталонных растворов

Из эталонного раствора готовят пять разбавленных растворов с содержанием 2, 4, 6, 8 и 10 мг  сорбиновой кислоты на литр.

4.3.3. Хроматографирование

На расстояние 2 см от нижнего края пластинки помещают микрошприцем или микропипеткой 5 мкл эфирного экстракта, полученного в соответствии с пунктом 4.3.1 и по 5 мкл каждого из разбавленных эталонных растворов, соблюдая между ними расстояние 2 см.

В хроматографическую кювету помещают подвижную фазу, высотой примерно 0,5 см, и дают насыщаться атмосфере кюветы парами растворителя. Помещают пластинку в кювету. Дают хроматограмме мигрировать на 12-15 см (время мигрирования приблизительно 30 минут). Сушат пластинку в потоке холодного воздуха. Анализируют хроматограмму под ультрафиолетовой лампой при 254 нм.

О присутствии сорбиновой кислоты свидетельствуют темно-фиолетовые пятна на флюоресцирующем желтом фоне пластинки.

4.4. Выражение результатов

Сравнение интенсивности окраски пятен, оставленных анализируемой пробой и эталонными растворами, позволяет полуколичественно оценить концентрации сорбиновой кислоты от 2 до 10 мг на литр. Концентрация 1 мг/л может быть определена нанесением 10 мкл анализируемого раствора.

Для определения концентраций свыше 10 мг/л требуется нанести на пластинку не более 5 мкл анализируемого раствора (измеряется микрошприцем).

16. L-аскорбиновая кислота

16.1 MA-MD-AS 313-13-ALASCO

1. Сущность методов

Предлагаемые методы позволяют определить содержание L-аскорбиновой кислоты и дегидроаскорбиновой кислоты в вине и в сусле.

1.1. Арбитражный метод

L-аскорбиновую кислоту окисляют под действием активированного угля до дегидроаскорбиновой кислоты. Она образует флуоресцентное соединение в реакции с ортофенилендиамином (OPDA). Контрольная проба в присутствии борной кислоты позволяет определить фоновую флуоресценцию (по образованию комплекса борная кислота-дегидроаскорбиновая кислота) и исключить ее из результата флуорометрического определения.

1.2. Метод текущих определений

L-аскорбиновую кислоту окисляют под действием йода до дегидроаскорбиновой кислоты. Дегидроаскорбиновая кислота осаждается под действием 2,4-динитрофенилгидразина в бис-(2,4-динитрофенилгидразон). После разделения тонкослойной хроматографией и растворения в уксусной среде, это соединение красного цвета определяют спектрофотометрически при длине волны 500 нм.

2. Арбитражный метод (флуориметрический метод)

2.1. Аппаратура

Флуориметр. Используют спектрофлуориметр, оборудованный лампой с непрерывным спектром, при минимальной мощности лампы. Оптимальные длины волн для возбуждения и эмиссии определяют предварительно в соответствии с используемой аппаратурой. Для сведения: длина волны возбуждения составляет примерно 350 нм, а для эмиссии – примерно 430 нм.

Кюветы с длиной оптического пути 1 см.

Фильтр из стекла пористостью 3.

Пробирки (диаметр 10 мм).

Мешалка для пробирок.

2.2. Реактивы:

раствор дигидрохлорида орто-фенилендиамина (C₆H₈N₂), 0,02% готовят перед экспериментом;

раствор тригидрата ацетата натрия (CH₃CООNа × 3H₂О), 500 г/л;

смешанный раствор борной кислоты и ацетата натрия: растворяют 3 г борной кислоты (H₃BO₃) в 100 мл раствора ацетата натрия 500 г/л. Раствор необходимо готовить перед экспериментом;

раствор уксусной кислоты CH₃COOH (ρ₂₀ = 1,05 г/мл), разбавленный до 56% (v/v), с pH примерно  1,2;

эталонный раствор L-аскорбиновой кислоты, с концентрацией 1 г/л: растворяют на момент анализа 50 мг L-аскорбиновой кислоты, предварительно обезвоженной в эксикаторе, хранившейся в темном месте, в 50 мл раствора уксусной кислоты;

активированный уголь экстра, чистый для анализов: помещают 100 г активированного угля в коническую колбу объемом 2 л, добавляют 500 мл 10% (v/v) раствора соляной кислоты (ρ₂₀=1,19 г/мл). Доводят до кипения, затем фильтруют через фильтр из стекла, с пористостью 3.

Обработанный таким образом уголь собирают в коническую колбу на 2 л, добавляют 1 л воды, перемешивают и фильтруют через фильтр из стекла, с пористостью 3.

Операцию повторяют два раза. Затем уголь помещают в вентиляционный шкаф при 115±5°C на 12 часов (примерно на ночь).

2.3. Методика определения

2.3.1. Подготовка пробы вина или сусла

Отбирают точный объем вина или сусла и разбавляют его до 100 мл в мерной колбе раствором 56% уксусной кислоты для получения раствора с концентрацией L-аскорбиновой кислоты в интервале от 0 до 60 мг/л.

Содержимое колбы перемешивают. Добавляют 2 г активированного угля и оставляют в контакте на 15 минут, периодически перемешивая. Фильтруют через обычный бумажный фильтр, удаляя первые миллилитры фильтрата.

В две мерные колбы на 100 мл помещают по 5 мл фильтрата, затем в первую добавляют 5 мл смеси растворов борной кислоты и ацетата натрия (контрольная проба), во вторую – 5 мл раствора ацетата натрия (анализируемая проба). Оставляют в контакте на 15 минут, периодически перемешивая, затем доводят дистиллированной водой до метки.

Отбирают по 2 мл содержимого из каждой колбы, переносят в пробирки, затем добавляют по 5 мл раствора ортофенилендиамина и перемешивают с помощью мешалки; оставляют для реакции на 30 минут в темноте, затем проводят спектрофлуориметрические измерения.

2.3.2. Калибровочная кривая

В три мерные колбы на 100 мл помещают соответственно 2, 4 и 6 мл эталонного  раствора L-аскорбиновой  кислоты, доводят до метки раствором уксусной кислоты. Тщательно перемешивают.

Подготовленные эталонные растворы содержат соответственно 2, 4 и 6 мг L-аскорбиновой  кислоты в 100 мл. Добавляют по 2 г активированного угля в каждую колбу и оставляют в контакте на 15 минут, периодически перемешивая. Фильтруют через бумажный фильтр, удаляя первые миллилитры фильтрата.

Помещают соответственно по 5 мл каждого из фильтратов в три мерные колбы на 100 мл (первая серия, контроль). Повторяют операцию для второй серии. В колбах с растворами первой серии вносят 5 мл раствора смеси борной кислоты и ацетата натрия, а из второй серии – по 5 мл раствора ацетата натрия. Оставляют в контакте на 15 минут, периодически перемешивая, затем доводят дистиллированной водой до метки.

Отбирают по 2 мл из каждой колбы, помещают в пробирки, затем добавляют 5 мл раствора ортофенилендиамина и перемешивают с помощью мешалки; оставляют для реакции на 30 минут в темном месте, затем проводят спектрофлуориметрические измерения.

2.3.3. Флуориметрическое определение

Для каждого раствора при построении калибровочной кривой, для вина или сусла, устанавливают "ноль" шкалы измерений по соответствующему контрольному раствору. После этого измеряют интенсивность флуорисценции.

Калибровочная кривая должна быть линейной и проходить через начало координат. Суммарное содержание L-аскорбиновой кислоты и дегидроаскорбиновoй кислоты (C) в анализируемой пробе определяют по калибровочной кривой.

2.4. Выражение результатов

Суммарную концентрацию L–аскорбиновой кислоты и дегидроаскорбиновой кислоты в вине, выраженную в миллиграммах на литр (мг/л), рассчитывают по формуле:

C × F,

где  F – коэффициент разбавления.

3. Метод текущих определений (колориметрический )

3.1. Аппаратура

лабораторная центрифуга и пробирки на 50 мл с притертыми пробками;

водяная баня для охлаждения и термостатирования между 5 и 10°C;

водяная баня для охлаждения и термостатирования при 20°C;

пластины для тонкослойной хроматографии 20×20 см, покрытые силикагелем  G (толщиной  0,25 – 0,3 мм);

кюветы хроматографические;

микропипетка объемом 0,2 мл;

спектрофотометр, позволяющий измерять абсорбцию при 500 нм в кюветах на 1 см.

3.2. Реактивы:

раствор метафосфорной кислоты, 30% (m/v): взвешивают 30 г метафосфорной кислоты, предварительно измельченной в ступке. Быстро смывают дистиллированной водой, затем растворяют в мерной колбе на 100 мл, доводят до метки дистиллированной водой. Полученный раствор содержит приблизительно 30% (m/v) метафосфорной кислоты;

3% (m/v)  раствор метафосфорной кислоты. Готовят непосредственно перед применением разбавлением 1/10 дистиллированной  водой 30%  раствора;

1% (m/v) раствор метафосфорной кислоты. Готовят непосредственно перед применением разбавлением 1/30 дистиллированной водой 30% раствора;

суспензия полиамида: готовят суспензию из 10 г порошка полиамида для хроматографии и 60 мл дистиллированной воды, оставляют в контакте на 2 часа. Приготовленного количества достаточно для 4 определений;

тиомочевина (H₂NCSNH₂);

раствор йода, 0,05 M;

раствор 2,4-динитрофенилгидразина, 6% (m/v). Готовят суспензию из 6 г 2,4-динитрофенилгидразина в 50 мл ледяной уксусной кислоты (ρ₂₀ = 1,05 г/мл); добавляют 50 мл серной кислоты (ρ₂₀ = 1,84 г/мл). 2,4-динитрофенилгидразин растворяют при взбалтывании;

этилацетат (C₄H₈О₂), приготовленный с 2% (v/v) (ρ₂₀ = 1,05 г/мл) ледяной уксусной кислотой;

хлороформ (CHCl₃);

водный раствор крахмала, 0,5%  (m/v);

подвижная фаза: этилацетат, хлороформ, ледяная уксусная кислота (50:60:5). Смесь растворителей перед применением выдерживают 12 часов;

ледяная уксусная кислота (CH₃CООH) (ρ₂₀ = 1,05 г/мл);

раствор  L-аскорбиновой кислоты с концентрацией 1,0 г на литр 1% раствора метафосфорной кислоты.

3.3. Методика определения

3.3.1. Окисление L- аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую кислоту

Помещают 50 мл вина в мерную колбу на 100 мл, добавляют 15 мл суспензии полиамида и доводят до метки 3% раствором метафосфорной кислоты. Оставляют в контакте на один час, периодически встряхивая. Фильтруют через бумажный фильтр. Собирают 20 мл фильтрата в центрифужную пробирку, добавляют 1 мл 0,05 М раствора йода. Гомогенизируют , перемешивая пробирку закрытую пробкой. Через 1 минуту удаляют избыток йода добавлением приблизительно 25 мг тиомочевины.

3.3.2. Образование и экстрагирование бис-(2,4-динитрофенилгидразона) и дикетогулоновой кислоты

Пробирку помещают в водяную баню, охлажденную до температуры (5-10)°C, добавляют 4 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Гомогенизируют содержимое пробирки, не смачивая стеклянную пробку. Тщательно закрытую пробирку оставляют на водяной бане при 20°C приблизительно на 16 часов (например, на ночь). К содержимому пробирки добавляют 15 мл раствора этилацетата, закрывают, встряхивают 30 секунд, затем центрифугируют 5 минут при центробежной силе от 350 до 400 г.

Отбирают пипеткой 10 мл этилацетатного экстракта в коническую колбу с притертой пробкой. В содержимое центрифужной пробирки добавляют 5 мл этилацетата. Закрывают и встряхивают 30 секунд и центрифугируют 5 минут в тех же условиях. Затем отбирают 5 мл этилацетатного экстракта и добавляют этот объем к раствору, полученному при первом экстрагировании, в конической колбе. Смесь гомогенизируют встряхиванием.

3.3.3. Разделение хроматографией бис-(2,4-динитрофенилгидразона)

Проводят с интервалом не более чем 2 часа после экстрагирования. Оставляют по 2 см в нижней части и по сторонам пластины и наносят по всей длине поверхности пластины по 0,2 мл этилацетатного экстракта.

Подвижную фазу помещают в хроматографическую кювету слоем 1 см и оставляют на время для насыщения атмосферы кюветы парами растворителей. Помещают пластину в кювету, оставляют для миграции растворителя до верхнего края пластины. Сушат пластину один час в вентиляционном шкафу.

Отделяют вещество с помощью шпателя движениями, перпендикулярными зоне миграции растворителя, зона красного цвета характерного для бис-(2,4-динитрофенилгидразона). Вещество количественно переносят в коническую колбу с притертой пробкой. Добавляют 4 мл уксусной кислоты, оставляют в контакте на 30 минут, часто встряхивая. Фильтруют через бумажный фильтр непосредственно в кювету спектрофотометра. Фильтрат должен быть прозрачным.

Устанавливают "ноль" шкалы измерений по уксусной кислоте, затем измеряют абсорбцию анализируемых растворов.

3.3.4. Калибровочная кривая

В три мерные колбы на 100 мл помещают соответственно 5, 10 и 15 мл  раствора L-аскорбиновой  кислоты 1 г/л, доводят до метки 1% раствором метафосфорной кислоты. Полученные растворы содержат соответственно 50, 100 и 150 мг L-аскорбиновой кислоты на литр. Обрабатывают по 50 мл каждого из этих растворов согласно действиям, указанным в пунктах 3.3.1, 3.3.2 и 3.3.3. Строят калибровочную кривую, она должна быть линейной и проходить через начало координат.

3.3.5. Выражение результатов

Суммарная концентрация L-аскорбиновой кислоты + дегидроаскорбиновой кислоты в вине или сусле (С) определяется по калибровочной кривой и выражается в миллиграммах на литр, (мг/л).

Если суммарная концентрация L-аскорбиновой кислоты + дегидроаскорбиновой кислоты превышает 150 мг/л, объем вина сокращают до 25, 20 или 10 мл и умножают полученный результат на коэффициент разбавления F.

17. Ионная кислотность (рН)

17.1. MA-MD-AS 313-15-pH

1. Принцип метода

Измерение разности потенциалов между двумя электродами, погруженными в сусло или вино. Один из электродов имеет потенциал, зависящий от величины рН жидкости, потенциал другого электрода постоянный, известен и используется в качестве эталонного электрода.

2. Аппаратура

2.1. pH–метр со шкалой, градуированной в единицах рН, позволяющий измерять с погрешностью не более 0,05.

2.2. Электроды:

стеклянный электрод, сохраняют в в дистиллированной воде;

эталонный электрод, каломельный-насыщенный хлористый калий, сохраняют в насыщенном растворе хлористого калия;

комбинированный электрод, сохраняют в дистиллированной воде.

3. Реактивы

3.1. Буферные растворы

Насыщенный раствор кислого виннокислого калия. Раствор содержит не менее 5,7 г/л кислого виннокислого калия (HOOCC₂H₄O₂COOK) при 20°C. Этот раствор может храниться 2 месяца в присутствии 0,1 г тимола на 200 мл

0,05 M раствор кислого фталевокислого калия. Раствор содержит 10,211 г/л кислого фталевокислого калия (HOOCC₆H₄COOK) при 20°C. Максимальный срок хранения 2 месяца.

Раствор, содержащий:

Максимальный срок хранения 2 месяца

Можно также использовать готовые эталонные буферные растворы.

4. Техника определения

4.1. Подготовка пробы к анализу

4.1.1. Для сусла и вина: испытания проводят непосредственно в сусле или вине.

4.1.2. Для ректификованного концентрированного сусла:

Ректификованное концентрированное сусло разбавляют водой до получения концентрации 25±0,5% общих сахаров (25° Brix).

Если Р представляет процентную концентрацию (m/m) общих сахаров в ректификованном концентрированном сусле, то взвешивают массу, равную, и доводят водой до 100 г. Используемая вода должна иметь удельную проводимость менее 2 микросименсов на сантиметр.

4.2. Установка прибора на ноль

Эта операция выполняется перед каждым измерением, в соответствии с инструкциями для данного прибора.

4.3. Калибровка рН-метра

Калибровка рН-метра производится с использованием буферных растворов с рН 6,88 и 3,57 при 20°С. Буферный раствор с рН 4,00 при 20°С используют для контроля калибровочной шкалы.

4.4. Определение

Электрод погружают в анализируемую пробу, температура которой должна быть между 20°С и 25°С и по возможности ближе к 20^оС. Величину рН считывают непосредственно со шкалы.

Выполняют не менее двух измерений на каждой пробе. За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух определений.

5. Выражение результатов

рН сусла, вина или 25% (m/m) (25° Brix) ректификованного концентрированного сусла выражается с точностью до двух десятичных знаков.

 18. Диоксид углерода

18.1 MA-MD-AS 314-01-DIOCAR

1. Сущность метода

1.1. Арбитражный метод

1.1.1. Для тихих вин (избыточное давление CO₂ ≤ 0,5×10⁵ Pa). Объем вина, взятый от пробы, приводят к температуре, близкой к 0°C и смешивают с достаточным количеством раствора гидроксида натрия для доведения рН до 10-11. Титруют кислым раствором в присутствии карбоангидразы. Содержание диоксида углерода рассчитываются по объему кислоты, необходимой для изменения pH от 8,6 (форма бикарбоната) до 4,0 (угольная кислота). Контрольное титрование, выполняемое на пробе декарбонизированного вина в условиях, аналогичных вышеописанным, позволяет определить объем раствора гидроксида натрия, поглощенный кислотами вина.

1.1.2. Для игристых и шипучих вин

Анализируемую пробу вина приводят в состояние, близкое к точке замерзания. После отбора некоторого контрольного количества для декарбонизации, оставшийся в бутылке объем вина подщелачивают для фиксации всего СО₂ в форме Na₂CO₃. Титруют кислым раствором в присутствии угольной ангидразы. Количество диоксида углерода рассчитывают по объему кислого раствора, необходимого для изменения pH от 8,6 (форма бикарбоната) к рН 4,0 (угольная кислота). В этих же условиях проводят контрольное титрование, декарбонизированного вина с целью определения объема раствора гидроксида натрия, поглощенного кислотами вина.

1.2. Метод текущих определений:  для игристых и шипучих вин

Манометрический метод – измерение афрометром избыточного давления диоксида углерода прямо в бутылке.

2. Арбитражный метод

2.1. Для тихих вин (избыточное давление CO₂ ≤ 0,5×10⁵Pa).

2.1.1. Аппаратура:

магнитная мешалка:

pH- метр.

2.1.2. Реактивы:

раствор гидроксида натрия, NaOH, 0,1M;

раствор серной кислоты, H₂SO₄, 0,05 M;

раствор карбоангидразы, 1 г/л.

2.1.3. Методика определения

Охлаждают пробу вина примерно до 0°C вместе с пипеткой для отбора. Помещают 25 мл раствора гидроксида натрия в лабораторный стакан на 100 мл; добавляют 2 капли водного раствора карбоангидразы. Вводят 10 мл вина, используя пипетку, охлажденную до 0°C. Помещают стакан на магнитную мешалку, устанавливают электрод pH и осторожно перемешивают. После того как жидкость примет комнатную температуру, медленно титруют раствором серной кислоты до pH 8,6. Обозначают прилитый объем.

Продолжают титрование до рН 4,0. Обозначают через n мл, объем, затраченный на доведение рН от 8,6 к 4,0.

Удаляют СО₂ из пробы вина объемом около 50 мл перемешиванием под вакуумом в течение трех минут, нагревая колбу на водяной бане при 25°C. Повторяют вышеописанную процедуру с 10 мл декарбоксилированного вина и обозначают через n'мл использованный объем.

2.1.4. Выражение результатов

1 мл титрованного раствора гидроксида натрия 0,1 М соответствует 4,4 мг CO₂. Количество CO₂ в граммах на литр вина определяют по формуле:

0,44(n – n′)

Выражают с точностью до двух десятичных знаков.

При анализе вина, содержащего небольшое количество CO₂ (CO₂ < 1 г/л), добавлять угольную ангидразу в качестве катализатора гидратации CO₂ необязательно.

2.2 . Для игристых и шипучих вин

2.2.1. Аппаратура:

магнитная мешалка;

pH- метр.

2.2.2. Реактивы:

раствор гидроксида натрия, NaOH, 50% (m/m);

раствор серной кислоты, H₂SO₄, 0,05M;

раствор карбоангидразы, 1 г/л.

2.2.3. Методика определения

На анализируемой бутылке вина отмечают уровень наполнения и охлаждают ее до начальной стадии замораживания. Дают бутылке слегка нагреться, встряхивая ее до исчезновения кристаллов льда. Быстро открывают пробку и приливают 45-50 мл вина в цилиндр для контрольного определения. Точный объем навески, v мл, определяют по шкале мерного цилиндра, когда вино нагреется до комнатной температуры.

В бутылку емкостью 750 мл сразу же после отбора пробы добавляют 20 мл раствора гидроксида натрия. Ждут пока вино достигнет комнатной температуры.

В лабораторный стакан на 100 мл помещают 30 мл кипяченой дистиллированной воды и две капли раствора карбоангидразы. Добавляют 10 мл подщелаченного вина. Помещают стакан на магнитную мешалку, устанавливают электрод и магнитный стержень и слегка перемешивают.

Осторожно титруют раствором серной кислоты до рН 8,6. Обозначают прилитый объем. Продолжают титрование серной кислотой до рН 4,0. Обозначают через n, мл, объем, затраченный на приведение рН от 8,6 к 4,0.

Удаляют СО₂ из v мл вина, перемешивая под вакуумом в течение 3 минут, нагревая колбу на водяной бане примерно до 25°С. 10 мл декарбонизированного вина добавляют к 30 мл кипяченой дистиллированной воды; добавляют 2-3 капли раствора гидроксида натрия для приведения рН к 10-11. Затем применяют вышеописанный способ. Обозначают через n′, мл, добавленный объем 0,05 М серной кислоты.

2.2.4. Выражение результатов

1 мл 0,05М раствора серной кислоты соответствует 4,4 мг CO₂.

Выливают из бутылки подщелаченное вино и определяют с точностью до 1 мл исходный объем вина, наполняя бутылку водой до сделанной отметки. Обозначают его V мл.

Количество CO₂ в граммах на литр (г/л) вина определяется по следующей формуле:

Полученную величину выражают до двух десятичных знаков.

2.3. Расчет теоретического избыточного давления

Избыточное давление при 20°C (Paph₂₀), выраженное в паскалях, определяют по формуле:

где: Q – содержание CO₂ в вине в граммах на литр, (г/л);

A – алкогольная крепость вина при 20°C, % об.;

S – содержание сахаров в вине в граммах на литр, (г/л);

Patm – атмосферное давление, выраженное в паскалях.

19. Метанол

19.1. MA-MD-AS 312-03 METHAN

1. Принцип метода

Арбитражный метод

Метанол определяют газовой хроматографией в винном дистилляте с добавлением внутреннего стандарта.

Метод текущих определений

Метанол окисляют в формальдегид в присутствии перманганата калия в подкисленном фосфорной кислотой дистилляте вина, разбавленном до крепости 5% об. Формальдегид окрашивается в фиолетовый цвет в сернокислой среде с хромотроповой кислотой. Интенсивность окрашивания измеряют на спектрофотометре при длине волны 575 нм.

2. Арбитражный метод

2.1. Аппаратура:

газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором;

колонки: колонка из нержавеющей стали длиной 7,5 м и внутренним диаметром 1/8 дюйма с Carbowax 1540, пропитанным 10% Chromosorb W, 60-70 меш.;

колонка из нержавеющей стали длиной 7,5 м и внутренним диаметром 1/8 дюйма с Carbowax 400, 5% и Hallcomid М.18 OL , 1%, покрытым Chromosorb W, 60-70 меш.

В обоих случаях Chromosorb W предварительно активируют нагреванием в муфельной печи при 750-800°С в течение 4 часов.

Другие типы колонок могут также давать хорошее разделение. Описанный метод дан в качестве примера.

Условия анализа (пример): температура инжектора – 280°С; температура детектора – 270°С; газ-носитель – водород; расход водорода – 2 мл/минуту; выход – 30 мл/минуту; инжектирование "splitless"; объем инжектированной пробы – 2 мкл; инжекция при 35°С – выход закрыт в течение 40 секунд; программирование температуры – от 120°С до 170°С, 3°С /минуту.

2.2. Методика определения

Готовят раствор внутреннего стандарта (метил-4-пентанол-2), 1 г/л, в 10% об. водно-спиртовом растворе.

Готовят раствор, содержащий 5 мл водно-спиртового раствора внутреннего стандарта на 50 мл винного дистиллята, полученного, как указано в разделе 2 "Объемная доля этилового спирта при 20°C".

Готовят эталонный раствор метанола, концентрацией 100 мг/л в 10% об. водно-спиртовом растворе. Добавляют 5 мл раствора внутреннего стандарта к 50 мл эталонного раствора метанола.

Затем инжектируют в хроматограф по 2 мкл эталонного раствора и раствора с дистиллятом.

Температура термостата колонок – 90°С, расход газа-носителя – 25 мл/минуту.

2.3. Выражение результатов

Концентрацию метанола C, выраженную в миллиграммах на литр (мг/л), рассчитывают по формуле:

где:

S и S_х – площадь пика метанола в эталонном и исследуемом растворах;

I и  i  – площадь пика внутреннего стандарта в эталонном и исследуемом растворах.

3. Метод текущих определений

3.1. Реактивы

Хромотроповая кислота: 4,5-дегидроокси-2,7-нафталиндисульфокислота 2,7 (C₁₀H₈O₈S₂ × 2H₂O) с молекулярной массой 356,34 г. Белый или светло-коричневый порошок, растворимый в воде. Также используют двунатриевую соль этой кислоты в форме порошка желтого или светло-коричневого цвета, очень хорошо растворимого в воде.

Хромотроповая кислота должна давать лишь незначительное окрашивание в контрольный пробе с использованием реактива. В противном случае требуется ее очистка следующим образом: растворяют 10 г хромотроповой кислоты или ее соли в 25 мл дистиллированной воды. Если это соль уже была в употреблении, добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты (ρ₂₀=1,84 г/мл) для освобождения хромотроповой кислоты. Добавляют 50 мл метанола, нагревают до кипения, затем фильтруют. Добавляют 100 мл 2-пропанола для осаждения свободной кислоты в виде кристаллов, оставляют сушится на холоде.

Реакция – добавление хлорного железа III (1 капля) к 10 мл раствора 0,1г/1000 мл дает зеленую окраску.

Чувствительность определения – разбавляют 0,5 мл фармацевтического раствора формальдегида в мерной колбе на 1000 мл и доводят до метки дистиллированной водой. К 5 мл 0,05% раствора хромотроповой кислоты в 75% серной кислоте (v/v) добавляют 0,1 мл раствора формальдегида и нагревают 20 минут при 70^оС. Раствор должен окрашиваться в фиолетовый цвет.

0,05% раствор хромотроповой кислоты в 75% серной кислоте (v/v). Растворяют 50 мг хромотроповой кислоты или ее натриевой соли в 35 мл дистиллированной воды. Помещают полученный раствор на водяную баню со льдом и добавляют, при легком перемешивании, небольшими порциями 75 мл концентрированной серной кислоты (ρ₂₀=1,84 г/мл). Этот раствор готовят непосредственно перед использованием.

Эталонный раствор метанола 5 г/л в 5% об. спирте .

Раствор для разбавления:

Раствор фосфорной кислоты, 50 г/100 мл;

Раствор перманганата калия, 5 г/100 мл;

Раствор нейтрального сульфитa натрия, 2 г/100 мл. Раствор быстро окисляется на воздухе. Проверяют титр титрованием йодом.

3.2. Методика определения

Разбавляют винный дистиллят до спиртуозности 5% об. В колбу с притертой пробкой помещают 0,5 мл этого разбавленного дистиллята, добавляют одну каплю фосфорной кислоты, две капли раствора перманганата калия, взбалтывают и оставляют на 10 минут.

Обесцвечивают перманганат натрия 4 каплями раствора сульфита натрия (избегать избытка). Добавляют 5 мл 0,05% сернокислого раствора хромотроповой кислоты. Нагревают на водяной бане при 70°С в течение 20 минут. Оставляют для охлаждения.

Определяют абсорбцию А_s, при 570 нм, регулируя нулевую абсорбцию по контрольной пробе, приготовленной с 0,5 мл раствора для разбавления.

Построение калибровочной кривой

В мерные колбы на 50 мл помещают 2,5; 5; 10; 15; 20 и 25 мл эталонного раствора метанола. Доводят объем до метки раствором для разбавления. Эти стандартные растворы содержат соответственно 25, 50, 100, 150, 200 и 250 мг метанола в литре.

Отбирают по 0,5 мл раствора разбавления и по 0,5 мл каждой концентрации эталонных растворов и далее повторяют все операции, как указано для винного дистиллята, разбавленного до спиртуозности 5% об. Определяют абсорбцию этих растворов при 570 нм.

График зависимости абсорбции эталонных растворов от концентрации является прямой линией, проходящей через начало координат.

3.3. Расчет

По калибровочной кривой определяют содержание метанола, выраженное в миллиграммах на литр винного дистиллята, разбавленного до спиртуозности 5% об.

20. Глицерин, 2,3-бутандиол

20.1. MA-MD-AS 312-04 GLYBUT

1. Принцип метода

Арбитражный метод

После предварительного пропускания через колонку с анионитом с целью фиксирования сахаров, манита и сорбита, окисляют глицерин и 2,3-бутандиол йодной кислотой. При окислении глицерина образуется формальдегид, который под действием флороглюцина дает соединение, определяемое колориметрически при 480 нм. Соединение пиперидина и нитропруссида натрия с ацетальдегидом, образующимся при окислении 2,3-бутандиола, определяют колориметрически при 570 нм.

2. Приборы:

спектрофотометр, позволяющий производить измерения в диапазоне 300-700 нм, с кюветами с оптическим путем 1 см;

колонка стеклянная длиной примерно 300 мм и внутренним диаметром 10-11 мм, снабженная краном.

3. Реактивы:

глицерин, С₃Н₈О_3;

2,3-бутандиол;

сильноосновной анионит, например анионит III Merck или Amberlite IRA 400;

поливинилпиролидон полимеризованный (PVPP);

0,1М раствор йодной кислоты в 0,05М серной кислоте: взвешивают 10,696 г метапериодата натрия (NaIO₄); растворяют его в мерной колбе на 500 мл в 50 мл 0, 5М серной кислоты; доводят до метки дистиллированной водой;

0,05М раствор йодной кислоты в 0,025М серной кислоте: разбавляют предыдущий раствор дистиллированной водой (1:1);

раствор серной кислоты, 0,5М;

раствор гидроокиси натрия, 1М.

раствор гидроокиси натрия, 5% (m/v);

спирт, 96%;

раствор флороглюцина, 2% (m/v), готовят перед употреблением;

раствор безводного уксуснокислого натрия NaCH₃COO, 27% (m/v);

раствор нитропентацианоферрата II (нитропруссид) натрия, 2% (m/v), готовят перед употреблением;

раствор пиперидина, 25% (m/v), готовят перед употреблением.

эталонный раствор глицерина: готовят раствор глицерина 250 мг/100 мл и определяют титр глицерина в этом растворе энзиматическим методом или йодометрическим (согласно пункту 6 настоящей главы). Затем готовят эталонный раствор глицерина, взвешивая в мерной колбе на 100 мл массу m, соответствующую 250 мг чистого глицерина; доводят до метки дистиллированной водой;

эталонный раствор 2,3-бутандиола: готовят раствор 2,3-бутандиола 250 мг/100 мл и определяют титр 2,3-бутандиола в этом растворе энзиматическим методом или йодометрическим (согласно пункту 6 настоящей главы). Затем готовят эталонный раствор 2,3-бутандиола, взвешивая в мерной колбе на 100 мл массу m, соответствующую 250 мг чистого 2,3-бутандиола; доводят до метки дистиллированной водой;

раствор медно-щелочной:

Раствор двухвалентной меди А:

Раствор тартратно-щелочной B:

Медно-щелочной раствор получают смешиванием в момент использования равных количеств растворов А и B.

4. Методика определения

4.1. Подготовка анионообменной колонки

Анионит, который обычно находится в форме Cl,  должен храниться в емкости с дистиллированной декарбоксилированной водой.

Вводят 30 мл анионита в колонку. Помещают в верхнюю часть колонки тампон из стекловаты, для предотвращения попадания воздушных пузырьков в слой смолы. Пропускают 150 мл раствора гидроокиси натрия (5%) из расчета 3,5-5 мл/минуту, затем с таким же расходом – некоторое количество дистиллированной декарбоксилированной воды до нейтральной или слабощелочной реакции по фенолфталеину. После этого смола готова к работе.

Анионит, подготовленный таким образом, используют только один цикл. После этого анионит регенерируют 5% раствором соляной кислоты в течение нескольких часов, затем промывают водой до удаления хлоратов (фильтрат проверяют на присутствие хлоратов 1% раствором AgNO₃.

4.2. Подготовка пробы

Разбавляют 10 мл вина водой в 5 раз – до 50 мл. Для сильноокрашенного вина проводят предварительное обесцвечивание с помощью поливинилпирролидона (PVPP): помещают 10 мл вина в мерную колбу на 50 мл, разбавляют 20 мл воды и добавляют 300 мг PVPP, взбалтывая время от времени в течение 20 минут; доводят до метки водой и фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

Отбирают 10 мл разбавленного вина (обработанного или необработанного PVPP) и вводят в колонку с анионитом. Вино должно вытекать из колонки со скоростью не более чем 2 мл минуту. Когда уровень разбавленного вина окажется на 5-10 мм выше слоя стекловаты, добавляют дистиллированную декарбоксилированную воду в количестве, достаточном для доведения объема элюата до 100 мл, со скоростью 2-3 мл в минуту.

Необходимо проверить элюат на отсутствие сахаров. Для этого быстро доводят до кипения 5 мл элюата с 5 мл медно-щелочного раствора. Отсутствие осадка и окрашивания указывает на отсутствие сахаров в растворе.

4.3. Определение глицерина

4.3.1. Фотометрическое определение

Вводят 10 мл элюата в коническую колбу на 100 мл с притертой пробкой и добавляют последовательно 10 мл дистиллированной воды и 10 мл раствора 0,05 М йодной кислоты. Осторожно взбалтывают и выдерживают для окисления точно 5 минут, затем добавляют 10 мл раствора гидроокиси натрия 1М и 5 мл спирта-ректификата (96% об). После добавления каждого реагента взбалтывают, затем добавляют 10 мл раствора флороглюцина. Быстро перемешивают и переносят раствор в спектрофотометрическую кювету с оптическим путем 1 см.

Полученное фиолетовое окрашивание изменяется очень быстро, его интенсивность достигает максимума через 50-60 секунд и затем уменьшается. Отмечают максимальную величину абсорбции, измеренную при 480 нм по отношению к воздуху.

4.3.2. Построение калибровочной кривой

В мерные колбы на 100 мл вносят 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 и 8,0 мл эталонного раствора глицерина, доводят до метки дистиллированной водой. Эти растворы соответствуют по условиям, описанным в пункте 4.2, следующим концентрациям: 3,75; 5,00; 6,25; 7,50; 8,75 и 10,00 г/л глицерина.

Проводят измерение по пункту 4.3.1, используя каждый раз вместо элюата такой же объем эталонного раствора. Градуировочный график не проходит через начало координат.

4.4. Определение 2,3-бутиленгликоля

4.4.1. Фотометрическое определение.

Вводят 20 мл элюата в коническую колбу с притертой пробкой на 100 мл и добавляют последовательно 5 мл раствора ацетата натрия и 5 мл раствора 0,1 М йодной кислоты.

Тщательно перемешивают и выдерживают для окисления точно 2 минуты, затем добавляют 5 мл раствора нитропруссита натрия и 5 мл раствора пиперидина. Перемешивают и быстро переносят раствор в спектрофотометрическую кювету с оптическим путем 1 см.

Полученное фиолетовое окрашивание изменяется очень быстро. Интенсивность цвета достигает максимума через 30-40 секунд, затем уменьшается. Отмечают максимальную величину абсорбции, измеренное при 570 нм по отношению к воздуху.

4.4.2. Построение калибровочной кривой

В мерную колбу на 100 мл помещают 10 мл эталонного раствора 2,3-бутандиола, доводят до метки дистиллированной водой. Из этого раствора готовят эталонные растворы, помещая в мерные колбы на 100 мл соответственно 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 и 10,0 мл приготовленного раствора. Доводят дистиллированной водой до метки.

Эти растворы соответствуют по условиям, описанным в пункте 4.2, следующим концентрациям: 0,25; 0,50; 0,75; 1,00 и 1,25 г/л 2,3-бутандиола.

Проводят измерение по пункту 4.4.1, используя каждый раз вместо элюата такой же объем эталонного раствора. Градуировочный график не проходит через начало координат.

5. Расчеты и выражение результатов

Находят содержание глицерина и 2,3-бутандиола по градуировочным графикам. Результаты выражают в граммах на литр (г/л) с точностью до одного десятичного знака для глицерина и двух десятичных знаков для 2,3-бутандиола.

6. Йодометрическое титрование глицерина и 2,3-бутандиола

6.1. Реактивы

Растворы:

гидроокиси натрия, 1М;

серной кислоты, 0,5М;

йодной кислоты 0,025М ;

гидрокарбоната натрия, NaHCO₃, 8% (m/v);

aрсенита натрия 0,025М: в мерной колбе на 1000 мл растворяют 2,473 г мышьяковистого ангидрида (As₂O₃) с 30 мл гидрооксида натрия 1М, добавляют 35 мл раствора серной кислоты 0,5М и доводят до метки дистиллированной водой;

йода, 0,025М;

йодистого калия, 10% (m/v);

крахмала 2% (m/v).

6.2. Техника определения

В коническую колбу на 300 мл вносят 5 мл раствора образца глицерина и 45 мл дистиллированной воды или 25 мл образца 2,3-бутандиола и 25 мл дистиллированной воды. Затем добавляют 20 мл йодной кислоты 0,025М, оставляют на 15 минут, периодически взбалтывая; добавляют 10-20 мл раствора гидрокарбоната натрия и 20 мл раствора арсенита натрия. Оставляют на 15 минут, периодически взбалтывая. Добавляют 5 мл раствора йодистого калия и 2 мл раствора крахмала. Титруют избыток арсенита натрия раствором йода 0,025М.

Проводят параллельно слепой опыт, используя 50 мл дистиллированной воды и такие же количества реактивов.

6.3. Способ расчета

6.3.1. Глицерин

1 мл йодной кислоты 0,025М окисляет 1,151 мг глицерина. Содержание глицерина, в граммах на литр( г/л), в растворах образца глицерина:

Содержание глицерина в процентах (%):

где:

Х – объем раствора йода 0,025М, пошедшего на титрование раствора пробы глицерина, мл;

В – объем раствора йода 0,025 мл, израсходованного на слепой опыт, мл;

α – объем раствора пробы глицерина, α = 5 мл.

6.3.2. 2,3-бутандиол

1 мл йодной кислоты 0,025М окисляет 2,253 мг 2,3-бутандиола. Содержание 2,3-бутандиола в граммах на литр (г/л), в растворах образца 2,3-бутандиола:

Содержание 2,3-бутандиола в процентах (%):

где: Х' – объем раствора йода 0,025М, пошедшего на титрование раствора пробы 2,3-бутандиола , мл;

В' – объем раствора йода 0,025 мл, израсходованного на слепой опыт, мл;

b – объем раствора пробы 2,3-бутандиола , b = 25 мл.

20.2. MA-MD-AS 312-05 GLYENZ

1. Принцип метода

Метод текущих определений

Глицерокиназа (GK) катализирует реакцию фосфорилирования глицерина в глицерин-3-фосфат при помощи аденозин-5'-трифосфата (ATP) (1):

Полученный аденозин-5'-дифосфат (АDP) снова преобразуется в АTP с помощью фосфоэнолпирувата (PEP) в присутствии пируваткиназы (PК) с образованием пирувата(2):

Пируват восстанавливают в лактат с помощью восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (NADH) в присутствии лактат-дегидрогеназы (LDH) (3):

Количество NAD⁺, образующегося в результате реакции, пропорционально количеству глицерина. Окисление NADH измеряется уменьшением его экстинкции при длинах волн 334, 340 или 365 нм.

2. Приборы

2.1. Спектрофотометр, позволяющий производить измерения при длине волны 340 нм, максимуме абсорбции NADH. При отсутствии спектрофотометра можно использовать фотометр с прерывистым спектром, позволяющий осуществлять измерения при длинах волн 334 нм и 365 нм.

2.2. Стеклянные кюветы с толщиной слоя 1 см или одноразовые кюветы

2.3. Микропипетки объемом от 0,02 до 2 мл

3. Реактивы

3.1. Буферный раствор (глицилглицина 0,75М, Mg²⁺10^-3M, pH-7,4): растворяют 10,0 г глицилглицина и 0,25г сернокислого магния MgSO₄×7H₂O приблизительно в 80 мл бидистиллированной воды; добавляют примерно 2,4 мл 5М гидроокиси натрия до получения pH=7,4 и доводят объем до 100 мл. Этот раствор можно хранить до трех месяцев при температуре +4°С.

3.2. (NDAH 8,2×10^-3М, ATP 33×10^-3М, PEP 46×10^-3М): растворяют в 6 мл бидистиллированной воды 42 мг восстановленной двунатриевой соли никатинамидадениндинуклеотида, 120 мг аденозин-5'-трифосфата-Na₂H₂, 60 мг фосфоэнолпирувата натрия и 300 мг гидрокарбоната натрия (NaHCO₃). Этот раствор можно хранить 2-3 дня при температуре +4°С.

3.3. Пируват-киназа/лактат-дегидрогеназа (PK/LDH) (PK 3 мг/мл, LDH 1 мг/мл). Используют суспензию без разбавления. Смесь можно хранить до года при температуре +4°С.

3.4. Глицерокиназа (GK 1мг/мл). Суспензию можно хранить до года при температуре +4°С.

Все необходимые реактивы для определения глицерина доступны в продаже.

4. Подготовка образца

Определение глицерина обычно осуществляют непосредственно в вине, разбавленном бидистиллированной водой до концентрации глицерина от 30 до 500 мг/л (количество глицерина во взятой пробе должно быть в интервале от 3 до 50 мкг). Разбавление в 50 раз (2 мл на 100 мл) обычно является достаточным.

5. Методика определения

На спектрофотометре устанавливают длину волны 340 нм. Измеряют абсорбцию в стеклянных кюветах с толщиной слоя 1 см. Нулевая абсорбция регулируется по отношению к воздуху.

В стеклянную кювету с толщиной слоя 1 см вносят:

Перемешивают, примерно через 5 минут считывают абсорбцию (А₁). Затем добавляют:

Перемешивают, ожидают окончания реакции (приблизительно 5-10 минут) и считывают абсорбцию растворов (А₂). Если через 10 минут реакция не заканчивается, то продолжают считывать абсорбцию через каждые 2 минуты, пока уменьшение абсорбции не станет постоянным в течение 2 минут.

Определяют разность абсорбций А₂ – А₁ для контроля (ΔА_Т) и пробы (ΔА_D) и рассчитывают:

ΔА = (ΔА_D) - (ΔА_Т)

6. Выражение результатов

Концентрацию в граммах на литр (г/л), рассчитывают по формуле:

где:

V  – объем контроля в мл (здесь 3,12 мл);

v – объем образца в мл (здесь 0,1 мл);

РМ – молекулярная масса определяемого вещества (здесь глицерин = 92,1);

α – толщина слоя кюветы (здесь 1 см);

ε – коэффициент абсорбции NDAH при 340 нм: ε = 6,3 (mmol^-1 × l × cm^-1).

С = 0,456 × ∆A × F

где F- коэффициент разбавления.

Для проведения измерений при 334 нм: ε = 6,2 (mmol^-1 × l × cm^-1).

 С = 0,463 × ∆A × F

Для проведения измерений при 365 нм: ε = 3,4 (mmol^-1 × l × cm^-1).

С = 0,845 × ∆A × F

21. Железо

21.1. MA-MD-AS 322-05 FER

1. Принцип метода

Арбитражный метод

После соответствующего разбавления вина и удаления спирта содержание железа определяют непосредственно атомно-абсорбционной спектрофотометрией.

Метод текущих определений

После минерализации вина перекисью водорода железо, находящееся в форме Fe (III), восстанавливают до Fe (II) и определяют по окрашиванию в красный цвет в присутствии ортофенантролина.

2. Арбитражный метод

2.1. Аппаратура:

ротационный выпаритель с термостатированной водяной баней;

атомно-абсорбционный спектрофотометр, оборудованный воздушно-ацетиленовой горелкой;

катодная лампа для железа.

2.2. Реактивы:

стандартный раствор железа (III), 1 г/л. Используют готовый стандартный раствор (1 г/л), доступный в продаже. Этот раствор можно приготовить растворением 8,6341 г сульфата железа (III) и аммония [FeNH₄(SO₄)₂ × 12H₂O] в дистиллированной воде, слегка подкисленной 1М соляной кислотой, и доведением объема до 1 литра;

разбавленный стандартный раствор железа, 100 мг/л.

2.3. Метод определения

2.3.1. Подготовка пробы

Из вина удаляют спирт концентрированием пробы до половины исходного объема с использованием ротационного выпарителя при температуре (50-60)°С. Восстанавливают первоначальный объем дистиллированной водой. При необходимости разбавляют перед определением.

2.3.2. Калибровка

В 5 мерных колб на 100 мл помещают 1, 2, 3, 4 и 5 мл раствора железа 100 мг/л и доводят до 100 мл дистиллированной водой. Приготовленные растворы содержат соответственно 1, 2, 3, 4 и 5 миллиграммов железа на литр. Приготовленные растворы хранят в полиэтиленовых флаконах.

2.3.3. Определение

Выбирают длину волны 248,3 нм. Регулируют шкалу абсорбции на ноль по дистиллированной воде. Впрыскивают разбавленную пробу непосредственно в горелку спектрофотометра, затем последовательно пять стандартных растворов. Считывают значения абсорбции. Осуществляют измерение в двух повторностях.

2.4. Выражение результатов

2.4.1. Способ расчета.

Строят калибровочную кривую зависимости абсорбции от концентрации железа в стандартных растворах. Отмечают на этой кривой среднее значение величин абсорбций, полученных для разбавленного вина, и определяют концентрацию железа С.  

Концентрацию железа в миллиграммах на литр (мг/л) вина рассчитывают по формуле до десятичного знака:

 F × C,

где F – коэффициент разбавления.

 22. Медь

22.1. MA-MD-AS 322-06-CUIVRE

1. Принцип метода

Метод основан на использовании атомно-абсорбционного спектрофотометра.

2. Аппаратура:

платиновая капсула;

атомно-абсорбционный спектрофотометр;

катодная лампа для меди;

газ для горелки: воздух-ацетилен или окись азота-ацетилена.

3. Реактивы:

металлическая медь;

азотная кислота концентрированная, 65%, HNO₃, (ρ₂₀ = 1,38 г/мл);

разбавленная 1:2 (v/v) азотная кислота.

Раствор меди, 1 г/л.

Используют готовый стандартный раствор меди. Раствор можно приготовить путем взвешивания 1,000 г металлической меди и переноса без потерь в мерную колбу на 1000 мл. Добавляют разбавленную 1:2 азотную кислоту в количестве, достаточном для растворения металла, 10 мл концентрированной азотной кислоты и доводят до метки бидистиллированной водой.

Раствор меди, 100 мг/л.

10 мл раствора меди, 1 г/л, помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

4. Метод определения

4.1. Подготовка пробы  и определение меди

При необходимости готовят соответствующие разбавленные растворы, используя бидистиллированную воду.

4.2. Калибровка

Отбирают 0,5; 1,0 и 2,0 мл, раствора меди 100 мг/л, помещают в мерные колбы на 100 мл, дополняют объем бидистиллированной водой; полученные растворы содержат соответственно 0,5; 1,0 и 2,0 мг/л меди.

4.3. Измерение

Измеряют абсорбцию при 324,8 нм. Регулируют ноль по дистиллированной воде. Измеряют напрямую абсорбцию стандартных растворов. Проводят по два измерения для каждого раствора.

5. Выражение результатов

5.1. Способ расчета

Строят калибровочную кривую зависимости значений абсорбции от концентрации меди в стандартных растворах.

Отмечают на этой кривой среднее значение величин абсорбций, полученных для разбавленного вина, и определяют концентрацию меди С.  

Концентрация меди в миллиграммах на литр (мг/л) вина рассчитывают по формуле до двух десятичных знаков:

F × C,

где F – коэффициент разбавления

(a) Растворы, используемые при построении калибровочной кривой, и степень разбавления пробы выбирают в зависимости от чувствительности используемого прибора и от концентрации меди в пробе.

(b) Когда концентрация меди в анализируемой пробе очень мала, предусмотрена следующая процедура: 100 мл пробы помещают в платиновую чашечку и выпаривают на водяной бане при  100°С до консистенции сиропа; добавляют 2,5 мл концентрированной азотной кислоты по капле до покрытия дна чашки. Осторожно сжигают полученный остаток на электрической нагревательной пластинке или на слабом пламени; затем чашечку помещают в муфельную печь, отрегулированную на температуру 500± 25°C и оставляют примерно на час. После охлаждения золу смачивают 1 мл концентрированной азотной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой; выпаривают и снова сжигают, как было указано выше. Снова ставят чашечку в муфельную печь на 15 минут; повторяют обработку концентрированной азотной кислотой не менее трех раз. Растворяют золу, добавляя в чашечку 1 мл концентрированной азотной кислоты и 2 мл бидистиллированной воды; затем переносят в мерную колбу на 10 мл. Промывают чашечку трижды, используя каждый раз по 2 мл бидистиллированной воды; доводят до метки бидистиллированной водой.

23. Цинк

23.1. MA-MD-AS 322-08-ZINCUL

1.  Принцип метода

После удаления спирта цинк определяют непосредственно в вине атомно-абсорбционной спектрофотометрией.

2. Реактивы:

используемая для анализа вода должна быть бидистиллирована на аппарате из боросиликатного стекла или эквивалентной чистоты;

стандартный раствор цинка, 1 г/л: используют стандартный раствор цинка из торговли. Этот раствор может быть также приготовлен растворением 4,3975 г сульфата цинка (ZnSO₄ × 7H₂O) в воде и дополнением объема до одного литра;

разбавленный стандартный раствор цинка, 100 мг/л.

3. Аппаратура:

ротационный испаритель с термостатированной водяной баней;

атомно-абсорбционный спектрофотометр, оборудованный воздушно-ацетиленовой горелкой;

катодная лампа для цинка.

4. Метод определения

4.1. Подготовка пробы

Удаляют спирт из 100 мл вина уменьшением объема пробы наполовину, используя ротационный испаритель при температуре (50-60)°С. Восстанавливают первоначальный объем до 100 мл бидистиллированной водой.

4.2. Калибровка

В 4 мерные колбы на 100 мл помещают 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 мл раствора цинка 100 мг/л и дополняют до метки бидистиллированной водой. Приготовленные растворы содержат соответственно 0,5; 1,0; 1,5 и 2,0 мг цинка в литре.

4.3. Определение

Регулируют длину волны на 213,9 нм. Регулируют нулевую абсорбцию по бидистиллированной воде. Впрыскивают вино прямо в горелку спектрофотометра, затем последовательно четыре стандартных раствора. Считывают значения абсорбции. Повторяют каждое измерение.

5. Выражение результатов

5.1. Способ расчета

Строят график значений абсорбции в зависимости от концентрации цинка в стандартных растворах. Отмечают на графике среднее значение величин абсорбции, полученных для пробы разбавленного вина, и определяют концентрацию цинка  в миллиграммах на литр (мг/л) с точностью до одного десятичного знака.

24. Кадмий

24.1. MA-MD-AS 322-10-CADMIU

1. Сущность метода

Кадмий определяют непосредственно в вине методом беспламенной атомно-абсорбционной спектрофотометрии.

2. Аппаратура:

атомно-абсорбционный спектрофотометр, оборудованный графитовой печью, корректором фонового шума и мультипотенциометром;

катодная лампа для кадмия;

микропипетки на 5 мкл, снабженные специальными наконечниками для измерения методом атомной абсорбции.

Всю аппаратуру из стекла перед использованием необходимо вымыть концентрированной азотной кислотой, нагретой до температуры 70-80°С, и сполоснуть бидистиллированной водой.

2. Реактивы:

Для анализа используется вода, бидистиллированная на аппарате из боросиликатного стекла, или вода эквивалентной чистоты. Все реактивы должны быть аналитически чистыми и не должны содержать кадмий;

85% фосфорная кислота, (ρ₂₀ = 1,71 г/мл);

раствор фосфорной кислоты, полученный разбавлением 8 мл фосфорной кислоты водой до 100 мл;

0,02 М раствор двунатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA).

буферный раствор рН 9: в мерной колбе на 100 мл растворяют 5,4 г хлорида аммония в нескольких миллилитрах воды, добавляют 35 мл раствора гидроксида аммония (ρ₂₀ = 0,92 г/мл), разбавленного до 25% (v/v), и дополняют водой до метки;

эриохром черный Т: 1% (m/m) твердая смесь с хлоридом натрия;

сульфат кадмия (3CdSO₄ × 8H₂O). Титр сульфата кадмия проверяют следующим образом: точно взвешивают 102,6 мг пробы сульфата кадмия, переносят количественно в цилиндрический сосуд с небольшим количеством воды, перемешивают до растворения; добавляют 5 мл буферного раствора рН 9 и примерно 20 мг эриохрома черного Т. Титруют раствором EDTA до начала окрашивания индикатора в синий цвет;

добавленный объем EDTA должен составлять 20 мл. Если объем несколько отличается, то корректируют соответственно навеску сульфата кадмия, используемую для приготовления стандартного раствора;

стандартный раствор кадмия, 1 г/л. Используют готовый стандартный раствор из торговли. Раствор может быть также приготовлен путем растворения 2,2820 г сульфата кадмия в воде и дополнением до одного литра. Раствор хранят во флаконе из боросиликатного стекла с притертой пробкой.

4. Методика определения

4.1. Приготовление пробы

Вино разбавляют 1:2 (v/v) раствором фосфорной кислоты .

4.2 . Приготовление растворов для области калибровки

Используя эталонный раствор кадмия, готовят последовательным разбавлением растворы с концентрацией 2,5; 5,0; 10,0 и 15,0 мкг кадмия в литре.

4.3. Определение

4.3.1.  Программа для печи (в порядке информации)

В конце анализа повышают температуру до 2700°С для очистки печи.

4.3.2. Измерения методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии

Выбирают длину волны 228,8 нм. Регулируют ноль на шкале абсорбции по бидистиллированной воде. Микропипеткой впрыскивают в печь три порции по 5 мкл каждого калибровочного раствора и анализируемого раствора. Регистрируют величины абсорбции. Рассчитывают среднее значение абсорбции по результатам трех порций.

5. Выражение результатов

5.1. Способ расчета.

Строят калибровочную кривую – абсорбция в зависимости от концентрации кадмия в калибровочных растворах. Зависимость линейная. Отмечают на этой калибровочной кривой среднее значение абсорбций раствора пробы и считывают концентрацию кадмия С.

Концентрация кадмия, выраженная в микрограммах на литр вина, составляет:

2 × C

25. Свинец

25.1. MA-MD-AS 322-11-PLOMB

1.  Принцип метода

Содержание свинца определяют непосредственно в вине с использованием беспламенной атомно-абсорбционной спектрофотометрии.

 2. Аппаратура:

атомно-абсорбционный спектрофотометр, оборудованный графитовой печью, корректором неспецифической абсорбции и мультипотенциометром;

катодная лампа для свинца;

микропипетки на 5 мкл со специальными наконечниками для измерения атомной абсорбции.

Вся аппаратура из стекла перед использованием должна быть промыта концентрированной азотной кислотой, нагретой до 70-80°С, и ополоснута бидистиллированной водой.

3. Реактивы:

фосфорная кислота 85%, (ρ₂₀ = 1,71 г/мл);

раствор фосфорной кислоты, полученный разбавлением 8 мл фосфорной кислоты водой до 100 мл;

азотная кислота (ρ₂₀ = 1,38 г/мл);

эталонный раствор свинца 1 г /л. Используют готовый раствор из торговли. Этот раствор может быть также приготовлен растворением 1, 600 г нитрата свинца (II), Pb (NO₃)₂ в 1% (v/v) азотной кислоте и дополнением объема до литра. Раствор хранят во флаконе из боросиликатного стекла с притертой пробкой.

Используемая для анализа вода должна быть бидистиллирована на аппарате из боросиликатного стекла или быть эквивалентной чистоты. Все реактивы должны быть аналитически чистыми, без следов свинца.

4. Метод определения

4.1. Подготовка пробы

Вино разбавляют 1:2 или 1:3 раствором фосфорной кислоты в зависимости от предполагаемой концентрации свинца.

4.2. Подготовка калибровочных растворов

Используя эталонный раствор свинца, готовят последовательным разбавлением бидистиллированной водой растворы с концентрацией 2,5; 5,0; 10,0 и 15,0 мкг свинца в литре.

4.3. Определение

4.3.1. Программа для печи (в порядке информации):  

В конце анализа повышают температуру до 2700°С для очистки печи.

4.3.2. Измерения

Регулируют длину волны на 217 нм. Регулируют шкалу абсорбции на ноль по бидистиллированной воде. Используя микропипетку, вносят в печь три порции по 5 мкл каждого калибровочного раствора и раствора пробы. Регистрируют величины абсорбции. Рассчитывают среднее значение абсорбции по результатам трех порций.

5. Выражение результатов

5.1. Расчет

Строят кривую значений абсорбции в зависимости от концентрации свинца в интервалах калибровки. Зависимость линейная. Отмечают среднее значение абсорбций растворов пробы на калибровочной кривой, получают концентрацию свинца С.

Концентрация свинца, выраженная в микрограммах на литр вина, составляет:

C × F,

где F – коэффициент разбавления

26. Мышьяк

26.1. MA-MD-AS 323-01-ASSAA

1. Принцип метода

После выпаривания этилового спирта и восстановления мышьяка V в мышьяк III мышьяк из вина переводят в гидрид и определяют атомно-абсорбционной спектрофотометрией.

2. Оборудование

Посуда:

- мерные колбы на 50, 100 мл

- градуированные пипетки 1; 5; 10 и 25 мл

Водяная баня при температуре  100^°С

Обеззоленные фильтры.

Атомно-абсорбционный спектрофотометр с параметрами:

воздушно-ацетиленовая горелка;

лампа с полым  катодом для  мышьяка;

неспецифическая коррекция поглощения с дейтеревой лампой.

2.5. Аксессуары:

- ячейка поглощения, расположенная в воздушно-ацетиленовой горелке;

- паровой генератор (газожидкостный разделитель);

- нейтральный газ (аргон);

- генератор гидрида (рис.3).

3. Реактивы:

деминерализованная вода ультрачистая;

азотная кислота, 65%, ультрачистая;

йодат калия;

йодат калия, 10%, (m/v);

концентрированная соляная кислота;

соляная кислота, 10%;

борогидрат натрия;

гидроксид натрия;.

борогидрат натрия, 0,6% (содержание гидроксида натрия 0,5% (m/v);

хлорид кальция (используется как осушитель);

раствор чистого мышьяка 1 г/л: растворяют 1,5339 г As₂O₅ в мерной колбе на 1000 мл и доводят до метки деминерализованной водой;

стандартный раствор мышьяка, 10 мг/л: берут 1 мл раствора чистого мышьяка (1г/л)  в мерную колбу на 100 мл; добавляют 1% азотной кислоты и доводят до метки деминерализованной водой;

стандартный раствор мышьяка, 100 мкг/л: берут 1 мл раствора мышьяка (10 мг/л) в мерную колбу на 100 мл и доводят до метки деминерализованной водой;

растворы для калибровки: 0; 5; 10 и 25 мкг/л: берут последовательно 0; 5; 10 и 25 мл раствора мышьяка 100 мкг/л в четыре мерные колбы на 100 мл; добавляют в каждую колбу 10 мл 10% йодистого калия и 10 мл концентрированной соляной кислоты; оставляют на 1 час; доводят до метки деминерализованной водой.

Рис.3. Генератор гидрида.

4. Подготовка проб

25 мл вина упаривают на водяной бане при температуре 100°C и доводят до 50 мл в присутствии 5 мл 10% йодистого калия и 5 мл концентрированной соляной кислоты; оставляют на 1 час; фильтруют через обеззоленный фильтр.

Параллельно готовится раствор сравнения.

5. Измерение

Перистальтический насос всасывает раствор борогидрата, раствор 10% соляной кислоты и стандарт или образец.

Последовательно всасывает растворы для калибровки; считывают абсорбцию в течение 10 секунд.

Определяют две повторности; строят калибровочную кривую (зависимость абсорбции от концентрации мышьяка в мкг/л).

Всасывают пробы согласно пункту 4; определяют концентрацию мышьяка в пробах в мкг/л; рассчитывают концентрацию мышьяка с учетом фактора разбавления 1:2.

27. Ртуть

27.1 MA-MD-AS 323-06-MERCUR

1. Область применения

Метод используется для определения ртути в винах в концентрации от 0 до 10 мкг/л.

2. Описание метода

2.1. Принцип метода

Минерализация вина производится в кислой среде при нагревании в потоке аргона и завершается добавлением перманганата калия; восстановление избытка перманганата калия проводится гидрохлоридом гидроксиламина; восстановление ртути II до металлической ртути – хлористым оловом II; улавливание ртути потоком аргона при температуре окружающей среды.

Определение одноатомных паров ртути спектрофотометрической атомной флуоресценцией при длине волны 254 нм: атомы ртути возбуждаются от лампы с парами ртути; возбужденные таким образом атомы испускают флуоресцентное излучение, которое позволяет определить ртуть с помощью фотонного детектора, расположенного под углом 90° относительного потока возбуждения; определение методом атомной флуоресценции позволяет получить достаточную линейность и исключает эффект памяти.

2.2. Схема анализа (рис.4)

Перестатический насос впрыскивает раствор хлористого олова II, раствор сравнения (деминерализованная вода, содержащая 1% азотную кислоту) и стандарт или образец минерализованного вина.

Металлическая ртуть с помощью потока аргона проходит через газожидкостный разделитель. После прохода через ячейку осушителя ртуть определяют посредством флуоресценции.  Затем для улавливания ртути газовый поток проходит через раствор перманганата калия.

3. Реактивы:

деминерализованная вода ультрачистая;

азотная кислота, 65%, ультрачистая;

раствор сравнения: деминерализованная вода, содержащая 1% азотной кислоты;

раствор азотной кислоты 5,6 M: в мерную колбу на 1000 мл помещают 400 мл азотной кислоты ультрачистой и доводят объем деминерализованной водой;

серная кислота (ρ₂₀=1,84 г/мл);

раствор серной кислоты 9M: в мерную колбу на 1000 мл помещают 200 мл деминерализованной воды, затем 500 мл концентрированной  серной кислоты; после охлаждения доводят объем деминерализованной водой;

перманганат калия, KMnO₄;

раствор перманганата калия 5% (m/v): в мерной колбе на 1000 мл растворяют 50 г перманганата калия в деминерализованной воде. Объем доводят деминерализованной водой;

гидрохлорид гидроксиламина NH₂OH, HCl;

восстановительный раствор: растворяют 12 г гидрохлорида гидроксиламина в 100 мл деминерализованной воды;

хлорид олова II (SnCl₂ × 2H₂O);

соляная кислота концентрированная;

раствор хлорида олова II: растворяют 40 г хлорида олова II в 50 мл концентрированной соляной кислоты и доводят объем деминерализованной водой;

раствор чистой ртути 1 г/л: готовят растворением в мерной колбе на 1000 мл 1,708 г Hg(NO₃)₂×H₂O в 12% растворе азотной кислоты;

стандартный раствор ртути 10 мг/л: в мерную колбу на 100 мл помещают 1 мл раствора чистой ртути, добавляют 5 мл азотной кислоты, доводят объем деминерализованной водой;

раствор ртути 50 мкг/л: в мерную колбу на 200 мл помещают 1 мл раствора ртути 10 мг/л, добавляют 2 мл азотной кислоты; доводят объем деминерализованной водой.

Рис.4. Аналитическая схема для определения ртути

4. Оборудование

4.1. Посуда

колбы на 100, 200 и 1000 мл;

градуированные пипетки 0,5; 1; 2; 5 ; 10 и 20 мл;

перед использованием посуда должна быть промыта 10% азотной кислотой, оставлена на 24 часа в контакте, затем промыта деминерализованной водой;

аппарат для минерализации (рис.5);

колба для нагрева с контролируемой температурой;

перистатический насос;

генератор холодного пара с газожидкостным разделителем;

осушитель: гигроскопическая мембрана, продуваемая потоком воздуха от компрессора и помещенная перед детектором;

спектрофлуориметр:

лампа для паров ртути, установленная на длине волны 254 нм;

специальный детектор атомной флуоресценции;

микрокомпьютер: регулирование параметров парогенератора и детектора атомной флуоресценции, калибровка и обработка результатов;

принтер для архивирования результатов;

баллон с инертным газом (аргоном).

5. Подготовка проб и построение калибровочной кривой

5.1. Калибровочная кривая: 0; 0,25; 0,5 и 1,0 мг/л

В 4 мерные колбы на 100 мл помещают  0; 0,5; 1,0 и 2,0 мл раствора ртути 50 мкг/л, добавляют 1% азотной кислоты, доводят деминерализованной водой .

5.2. Подготовка проб (рис.5)

Вино минерализуют в аппарате из стекла Pyrex, состоящем из трех элементов, соединенных между собой притертыми сферическими соединениями: круглодонной колбы на 250 мл; камеры для улавливания паров и холодильника.

Помещают пипеткой 20 мл вина в реакционную колбу на 250 мл и подсоединяют к аппарату для минерализации. Очень медленно добавляют 5 мл серной кислоты и 10 мл азотной кислоты; оставляют на ночь.

Медленно нагревают до исчезновения паров азота; оставляют остывать. Собирают конденсирующиеся пары в реакционную колбу. Аппарат ополаскивают деминерализованной водой. Переносят содержимое реакционной колбы в мерную колбу на 100 мл. Добавляют раствор перманганата калия до стойкой окраски.

Растворяют осадок (MnO₂) восстанавливающим раствором. Доводят деминерализованной водой.

Готовят пробу сравнения на деминерализованной воде.

6. Методика работы

6.1. Аналитическое определение

Включают флуориметр: аппарат стабилизируется в течение 15 минут. С помощью перистатического насоса впрыскивают контроль, раствор хлорида олова II и стандартные растворы или пробы.

Проверяют появление пузырьков в газожидкостном разделителе. Последовательно добавляют растворы для калибровки, запускают программу генератора паров. Программное обеспечение устанавливает калибровочную кривую (процент флуоресценции в зависимости от концентрации ртути в мкг/л). Затем вводят пробы.

6.2. Автоконтроль

Все пять определений, контроль и стандарты анализируются для коррекции возможного дрейфа спектрофлуориметра.

7. Выражение результатов

Результаты выдаются компьютерными программами и выражаются в микрограммах на литр (мкг/л). Концентрацию ртути в вине выражают в мкг/л, с учетом разведения 1:5.

Рис.5.Аппарат для минерализации вина

28. Натрий

28.1 MA-MD-AS 322-03-SODIUM

1. Принцип методов

1.1. Арбитражный метод: атомно-абсорбционная спектрофотометрия.

Натрий определяют непосредственно в вине атомно-абсорбционной спектрофотометрией после добавления буферного раствора хлорида цезия для предотвращения ионизации натрия.

1.2. Метод текущих определений: пламенная фотометрия

Натрий определяют пламенной фотометрией непосредственно в вине, разбавленном не менее чем в 10 раз.

2. Арбитражный метод

2.1. Аппаратура:

атомно-абсорбционный спектрофотометр, оборудованный воздушно-ацетиленовой горелкой;

лампа с полым катодом для натрия.

2.2. Реактивы

Раствор натрия с концентрацией 1 г/л

Используют стандартный раствор натрия 1 г/л из торговли. Этот раствор можно приготовить растворением 2,542 г высушенного хлорида натрия (NaСl) в литре дистиллированной воды.

Раствор хранят в полиэтиленовом флаконе.

Модельный раствор:

5% раствор хлорида цезия (в пересчете на цезий)

Растворяют 6,330 г хлорида цезия (CsCl) в 100 мл дистиллированной воды.

2.3. Метод определения

2.3.1.  Подготовка пробы

В мерную колбу на 50 мл помещают 2,5 мл вина, 1 мл раствора хлорида цезия и доводят до метки дистиллированной водой.

2.3.2.  Калибровка

В серию мерных колб емкостью 100 мл помещают 5 мл модельного раствора и добавляют 0; 2,5; 5,0; 7,5 и 10,0 мл раствора натрия концентраций 1 г/л, предварительно разбавленного 1:100. Во все колбы добавляют по 2 мл раствора хлорида цезия и доводят объем до 100 мл дистиллированной водой.

Приготовленные стандартные растворы содержат соответственно 0; 0,25; 0,50; 0,75 и 1,00 мг натрия и 1 г цезия в литре. Эти растворы хранят в полиэтиленовых флаконах

2.3.3. Определение

Выбирают  длину волны 589 нм. На шкале абсорбции регулируют ноль по модельному раствору, содержащему 1 г/л цезия. Впрыскивают непосредственно в горелку спектрофотометра разбавленное вино, затем последовательно стандартные растворы. Отмечают абсорбцию. Определения повторяют два раза

2.4. Выражение результатов

2.4.1. Расчет

Строят калибровочную кривую зависимости изменения абсорбции от концентрации натрия в стандартных растворах.

Отмечают на этой кривой среднее значение абсорбции, полученное для пробы и определяют концентрацию натрия С в милиграммах на литр (мг/л). Концентрация натрия, выраженная целым числом в миллиграммах на литр вина, составляет:

20 × C

2.4.2. Повторяемость (r)

 r = 1 + 0,024 × X_i ,

где X_i - концентрация натрия в пробе, мг/л

2.4.3 Воспроизводимость (R)

R = 2,5 + 0,05 × X_i ,

где X_i - концентрация натрия в пробе, мг/л

3. Метод текущих определений

3.1. Аппаратура

пламенный фотометр на воздушно-бутановой смеси

3.2. Реактивы:

3.2.1. Стандартный раствор натрия, 20 мг/л:

3.2.2 Раствор для разбавления:

Для приготовления растворов 3.2.1 и 3.2.2 растворяют кислый тартрат калия примерно в 500 мл горячей дистиллированной воды, смешивают раствор с другими компонентами, предварительно растворенными в 400 мл дистиллированной воды, и доводят объем до 1 л.

В эти растворы добавляют по 2 капли аллилизотиоцианата и хранят в полиэтиленовых флаконах.

3.3. Методика определения

3.3.1. Калибровка

В 5 мерных колб на 100 мл помещают 5; 10; 15; 20 и 25 мл раствора натрия 20 мг/л, дополняют до метки раствором для разбавления. Таким образом получают растворы содержащие соответственно 1; 2; 3; 4 и 5 мг натрия на литр.

3.3.2. Определение

Измерения проводят при длине волны 589,0 нм. Устанавливают спектральную эмиссию на 100% по дистиллированной воде. Инжектируют непосредственно в горелку фотометра последовательно эталонные растворы, затем вино, разбавленное дистиллированной водой 1:10, и определяют процент спектральной эмиссии. При необходимости разбавленное вино снова разбавляют в отношении 1:10 раствором для разбавления.

3.4. Выражение результатов

3.4.1. Расчет

Строят калибровочную кривую изменения процента спектральной эмиссии в зависимости от концентрации натрия в эталонных растворах.

Отмечают на этой кривой среднее значение спектральной эмиссии, установленной для пробы, и определяют концентрацию натрия С.

Концентрация натрия, выраженная целым числом в миллиграммах на литр (мг/л) вина, составляет:

C × F,

где F  - коэффициент разбавления.

3.4.2. Повторяемость (r)

3.4.3. Воспроизводимость (R)

R = 4,7 + 0,08 × X_i ,

где X_i -  концентрация натрия в образце, мг / л

29. Калий

29.1 MA-MD-AS 322-02-POTASS

1. Принцип методов

1.1. Арбитражный метод: атомно–абсорбционная спектрофотометрия

Содержание калия  определяют непосредственно в разбавленном вине атомно-абсорбционной спектрофотометрией после добавления буферного раствора хлорида цезия во избежание ионизации калия.

1.2. Метод текущих определений: пламенная фотометрия

Содержание калия определяют пламенной фотометрией непосредственно в вине, разбавленном не менее чем 1:10.

2. Арбитражный метод

2.1. Аппаратура:

атомно-абсорбционный спектрофотометр, оборудованный воздушно-ацетиленовой горелкой;

лампа с полым катодом для калия.

2.2. Реактивы

Раствор калия концентрацией 1 г/л

Используют стандартный раствор калия 1 г/л из торговли. Этот раствор может быть приготовлен растворением 4,813 г кислого тартрата калия в литре дистиллированной воды.

Раствор хранят в полиэтиленовом флаконе.

Модельный раствор:

5% раствор хлорида цезия (в пересчете на цезий):

растворяют 6,330 г хлорида цезия (CsCl) в 100 мл дистиллированной воды.

2.3. Методика определения

2.3.1. Подготовка пробы

Помещают в мерную колбу на 50 мл 2,5 мл вина, предварительно разбавленного в пропорции 1:10, добавляют 1 мл раствора хлорида цезия и доводят до метки дистиллированной водой.

2.3.2. Калибровка

В серию мерных колб на 100 мл помещают 5 мл модельного раствора, затем добавляют 0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 мл раствора калия концентрацией 1 г/л, предварительно разбавленного 1:10, добавляют во все колбы по 2 мл раствора хлорида цезия и доводят объем до 100 мл дистиллированной водой.

Приготовленные эталонные растворы содержат соответственно 0; 2; 4; 6; 8 мг калия и 1 г цезия на литр. Эти растворы хранят в полиэтиленовых флаконах.

2.3.3. Определение

Выбирают длину волны 769,9 нм. На шкале абсорбции регулируют ноль по модельному раствору, содержащему 1 г/л цезия. Инжектируют разбавленное вино непосредственно в горелку спектрофотометра, затем последовательно эталонные растворы. Отмечают значения абсорбции. Повторяют все определения два раза.

2.4. Выражение результатов

2.4.1 Расчет

Строят калибровочную кривую зависимости величины абсорбции от концентрации калия в эталонных растворах.

Отмечают на этой кривой среднее значение абсорбции, полученное для пробы и определяют концентрацию калия С в миллиграммах на литр (мг/л).

Концентрация калия, выраженная целым числом в миллиграммах на литр вина, составляет:

F × C,

где F – коэффициент разбавления (здесь 200)

2.4.2. Повторяемость (r)

r = 35 мг/л

2.4.3. Воспроизводимость (R)

R = 66 мг/л

2.4.4. Другие способы выражения результатов

3. Метод текущих определений

3.1 Аппаратура:

пламенный фотометр на воздушно-бутановой смеси

3.2. Реактивы

3.2.1. Эталонный раствор калия 100 мг/л

3.2.2. Раствор для разбавления

Для приготовления растворов 3.2.1 и 3.2.2 растворяют кислый тартрат калия примерно в 500 мл горячей дистиллированной воды, смешивают раствор с другими компонентами, предварительно растворенными в 400 мл дистиллированной воды, и доводят объем до 1 л. В эти растворы добавляют по 2 капли этилизотиоцианата и хранят в полиэтиленовых флаконах.

3.3. Методика определения

3.3.1. Калибровка

В 4 мерные колбы на 100 мл помещают 25; 50; 75 и 100 мл эталонного раствора калия и доводят до метки раствором для разбавления. Таким образом получают растворы, содержащие соответственно 25; 50; 75; 100 мг калия на литр.

3.3.2. Определение

Измерения проводят при длине волны 766,0 нм. Устанавливают 100% спектральную эмиссию по дистиллированной воде. Впрыскивают непосредственно в горелку фотометра последовательно эталонные растворы, затем вино, разбавленное дистиллированной водой 1:10, и измеряют процент спектральной эмиссии. При необходимости разбавленное вино снова разбавляют в отношении 1:10 раствором для разбавления.

3.4. Выражение результатов

3.4.1. Расчет

Строят калибровочную кривую изменения процента спектральной эмиссии в зависимости от концентрации калия в эталонных растворах.

Отмечают на этой кривой среднее значение спектральной эмиссии, установленной для пробы разбавленного вина, и определяют концентрацию калия С.

Концентрация калия, выраженная целым числом в миллиграммах на литр (мг/л) вина, составляет:

С × F,

где F  - коэффициент разбавления.

3.4.2. Повторяемость (r) _____________ r = 17 мг/л

3.4.3. Воспроизводимость (R) _________ R = 66 мг/л ,

3.4.4. Другие способы выражения результатов:

30. Кальций

30.1 MA-MD-AS 322-04-CALCIU

1. Принцип метода

Кальций определяют непосредственно в вине, разбавленном соответствующим образом, атомно-абсорбционной спектрофотометрией после добавления специального буферного раствора.

2. Аппаратура:

атомно-абсорбционный спектрофотометр, оборудованный воздушно-ацетиленовой горелкой

лампа с полым катодом для кальция.

3. Реактивы

3.1. Эталонный раствор кальция с концентрацией 1 г/л

Используют стандартный раствор кальция 1 г/л из торговли. Этот раствор может быть приготовлен растворением 2,5 г карбоната кальция (CaCO₃) в достаточном для растворения количестве соляной кислоты, разбавленной 1/10 (v/v) , и доведением объема до 1 л дистиллированной водой.

3.2. Разбавленный эталонный раствор кальция, 50 мг/ л

Эталонные растворы кальция хранят в полиэтиленовых флаконах.

3.3. Раствор хлорида лантана, 50 г/л (в пересчете на лантан)

Растворяют 13,369 г хлорида лантана LaCl₃х7H₂O в дистиллированной воде; добавляют 1 мл HCl, разбавленной 1:10 (v/v), и доводят до 100 мл дистиллированной водой.

4. Методика определения

4.1. Подготовка пробы

В мерную колбу на 20 мл помещают 1 мл вина, 2 мл раствора хлорида лантана и доводят до метки дистиллированной водой. Вино, разбавленное 1:20, содержит 5 г лантана на литр.

Для сладких вин концентрация 5 г лантана на литр достаточна при условии, что вследствие разбавления содержание сахаров составит менее 2,5 г/л. Для вин с более высоким содержанием сахаров необходимо увеличить содержание лантана до 10 г/л.

4.2. Калибровка

В 5 мерных колб емкостью 100 мл помещают 0; 5; 10; 15 и 20 мл разбавленного эталонного раствора кальция, добавляют во все колбы по 10 мл раствора хлорида лантана и доводят до метки дистиллированной водой. Приготовленные эталонные растворы содержат соответственно 0; 2,5; 5; 7,5 и 10 мг кальция и 5 г лантана в литре. Эти растворы хранят в полиэтиленовых флаконах.

4.3. Определение

Выбирают длину волны 422,7 нм. На шкале абсорбции регулируют ноль по модельному раствору, содержащему 5 г/л лантана. Впрыскивают разбавленное вино непосредственно в горелку спектрофотометра, затем последовательно эталонные растворы, приготовленные согласно пункту 4.2. Отмечают значения абсорбции. Повторяют все определения два раза.

5 . Выражение результатов

5.1. Расчет

Строят калибровочную кривую зависимости абсорбции от концентрации кальция в эталонных растворах.

Отмечают на этой кривой среднее значение абсорбции, полученное для разбавленной пробы и определяют концентрацию кальция С в миллиграммах на литр (мг/л).

Концентрация кальция, выраженная целым числом в миллиграммах на литр вина составляет:

20 × C

5.2. Повторяемость ( r)

5.3. Воспроизводимость (R)

R, мг/л = 0,114 x_i - 0,5 ,

 где x_i - концентрация кальция в пробе, мг/л.

31. Maгний

 31.1. MA-MD-AS 322-07-MAGNES

1. Принцип метода

Магний определяют непосредственно в разбавленном вине атомно-абсорбционной спектрофотометрией.

2. Приборы

спектрофотометр атомно-абсорбционный, оборудованный воздушно-ацетиленовой горелкой;

катодная полая лампа для магния.

3. Реактивы

3.1. Эталонный раствор магния концентрацией 1 г/л.

Используют эталонный раствор магния 1 г/л из торговли. Этот раствор может быть приготовлен растворением 8,3646 г хлористого магния (MgCl₂ × 2H₂O) в дистиллированной воде и доведением объема до 1 л.

3.2. Разбавленный эталонный раствор магния с концентрацией 5 мг/л.

Эталонные растворы магния хранят в полиэтиленовых флаконах.

4. Методика определения

4.1. Подготовка образца

Разбавляют вино дистиллированной водой в пропорции 1:100 .

4.2 . Калибровка

В серию мерных колб вместимостью 100 мл помещают 5; 10; 15 и 20 мл раствора 3.2 и дополняют до метки дистиллированной водой. Приготовленные стандартные растворы соответственно содержат 0,25; 0,50; 0,75 и 1,0 мг магния на литр. Эти растворы хранят в полиэтиленовых флаконах.

4.3. Определение

Выбирают длину волны 285 нм. Регулируют нулевое показание шкалы абсорбции по дистиллированной воде. Впрыскивают разбавленное вино непосредственно в горелку спектрофотометра, затем последовательно калибровочные эталонные растворы, приготовленные согласно пункту 4.2. Записывают величины абсорбции. Определение повторяют два раза.

5. Выражение результатов

5.1. Расчет

Строят калибровочную кривую величин абсорбции в зависимости от концентрации магния в эталонных растворах.

Отмечают на этой кривой среднее значение абсорбции, полученное для разбавленной пробы вина, и определяют концентрацию магния С в миллиграммах на литр (мг/л).

Концентрация магния, выраженная в миллиграммах на литр вина, составляет:

100 × C

5.2. Повторяемость (r) ______________ r = 2,7 мг/л

5.3. Воспроизводимоть (R) __________ R = 8,0 мг/л

 32. Ацетальдегид

32.1. MA-MD-AS 315-01 ETHANA

1. Принцип метода

Ацетальдегид определяют в вине, обесцвеченном активированным углем, благодаря окрашиванию, переходящему от зеленого к фиолетовому, которое он дает с нитропентацианоферратом (II) натрия и пиперидином. Интенсивность окраски измеряют при 570 нм.

2. Аппараты

Спектрофотометр, позволяющий измерять абсорбцию при длине волны 570 нм в кювете с оптическим путем 1 см.

3. Реактивы

Раствор пиперидина, (C₅H₁₁N), 10% (v/v)

Готовят непосредственно перед каждым определением, смешиванием 2 мл пиперидина и 18 мл дистиллированной воды.

Раствор нитропентацианоферрата (II) натрия, 0,4% (m/v)

В мерной колбе на 250 мл растворяют 1 г порошка нитропентацианоферрата (II) натрия Na₂[Fe(CN)₅NO]×2H₂O. Доводят до метки дистиллированной водой.

Уголь активированный.

Соляная кислота разбавленная, 25% (v/v) (примерно 102 г/л)

Щелочной раствор: растворяют 8,75 г борной кислоты в 400 мл 1М раствора гидроокиси натрия. Объем доводят до 1 л дистиллированной водой.

4. Методика определения

4.1. Определение

В коническую колбу на 100 мл помещают 25 мл вина, добавляют 2 г активированного угля. Перемешивают в течение нескольких секунд, отстаивают 2 минуты и фильтруют через складчатый фильтр для получения прозрачного фильтрата.

В коническую колбу на 100 мл помещают 2 мл обесцвеченного фильтрата, добавляют при перемешивании 5 мл раствора нитропруссиада натрия и 5 мл раствора пиперидина, смешивают и сразу же помещают в кювету спектрофотометра с оптическим путем 1 см. Полученное окрашивание варьирует от зеленого к фиолетовому; интенсивность цвета измеряют по отношению к равному слою воздуха при длине волны 570 нм. Интенсивность окрашивания сначала быстро увеличивается, а затем резко уменьшается. За окончательное значение абсорбции берут максимальное, полученное приблизительно через 50 секунд.

Содержание ацетальдегида в анализируемой жидкости определяют по калибровочной кривой.

В исключительных случаях, если анализируемая жидкость содержит свободный несвязанный ацетальдегид, необходимо перед определением общего ацетальдегида перевести его в связанную форму с помощью диоксида серы. Для этого добавляют в часть анализируемой жидкости небольшой избыток свободного диоксида серы и оставляют на несколько часов до начала анализа.

4.2. Построение калибровочной кривой

4.2.1. Основной эталонный раствор ацетальдегида, связанного с диоксидом серы.

Готовят раствор, содержащий 5-6% диоксида серы, и определяют его точную концентрацию по 0,05 М раствору йода.

В мерную колбу на 1 л помещают объем этого раствора, соответствующий 1500 мг диоксида серы. С помощью воронки вносят в колбу приблизительно 1 мл свежеперегнанного ацетальдегида, собранного в охлаждающую смесь. Доводят объем до одного литра дистиллированной водой и оставляют на ночь.

Точное содержание в основном эталонном растворе связанного ацетальдегида определяют следующим образом: в коническую колбу на 500 мл помещают 50 мл основного эталонного раствора ацетальдегида, добавляют 20 мл разбавленной соляной кислоты и 100 мл воды. Окисляют свободный диоксид серы 0,05 М раствором йода в присутствии крахмала до появления светло-голубой окраски.

Добавляют 100 мл щелочного раствора до исчезновения голубой окраски. Титруют диоксид серы, связанный с ацетальдегидом, 0,05 M йодом до светло-голубой окраски. Обозначают n миллилитры, пошедшие на титрование.

Раствор ацетальдегида, связанного с SO₂ содержит 44,05 n мг ацетальдегида в литре.

4.2.2. Приготовление эталонных растворов ацетальдегида разных концентраций.

В мерные колбы на 100 мл вносят последовательно 5, 10, 15, 20 и 25 мл эталонного раствора ацетальдегида. Доводят до метки дистиллированной водой. В этих растворах концентрация ацетальдегида соответствует 40, 60, 120, 160 и 200 мг/л. Точная концентрация ацетальдегида в эталонных растворах рассчитывается по результатам ее определения в основном эталонном растворе.

Определяют содержание ацетальдегида в 2 мл каждого раствора, как описано выше. Графическая зависимость абсорбции этих растворов от содержания ацетальдегида представляет собой прямую, проходящую через начало координат.

33. 5-гидроксиметилфурфурол (оксиметилфурфурол)

33.1. MA-MD-AS 315-05 HYDMFF

1. Принцип методов

1.1. Колориметрический метод

 Альдегиды, производные фурана, основным из которых является 5-гидроксиметилфурфурол, вступают в реакцию с барбитуровой кислотой и p-толуидином, образуя соединения красного цвета, которые определяют колориметрически при 550 нм.

Свободная сернистая кислота при ее содержании выше 10 мг/л мешает определению, поэтому ее необходимо удалить, предварительно связав с уксусным альдегидом, избыток которого не мешает реакции.

1.2. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

Разделение проводят на колонке в противоточной фазе и определяют при 280 нм. Условия анализа описаны ниже и приводятся в качестве примера.

2. Колориметрический метод

2.1. Аппараты

спектрофотометр, позволяющий проводить измерения от 300 до 700 нм;

стеклянные кюветы с оптическим путем 1 см.

2.2. Реактивы

2.2.1. Раствор барбитуровой кислоты, 0,5% (m/v)

Растворяют 500 мг барбитуровой кислоты, C₄O₃N₂H₄, в дистиллированной воде, нагревая на водяной бане при 100°C; доводят объем до 100 мл дистиллированной водой. Раствор можно хранить в течение 1 недели.

2.2.2. Раствор p-толуидина, 10% (m/v)

10 г p-толуидина C₆H₄(CH₃)NH₂ помещают в мерную колбу на 100 мл, добавляют 50 мл изопропанола и 10 мл ледяной уксусной кислоты (ρ₂₀ = 1,05 г/мл), доводят до 100 мл изопропанолом. Раствор готовят ежедневно.

2.2.3. Водный раствор ацетальдегида, 1% (m/v). Готовят перед использованием

2.2.4. Основной раствор 5-гидроксиметилфурфурола, С₆O₃H₆, 1 г/л

В мерной колбе на 1000 мл, растворяют 1 г 5-гидроксиметилфурфурола в дистиллированной воде и доводят до метки дистиллированной водой.

Стандартные растворы, содержащие 5, 10, 20, 30 и 40 мг/л 5-гидроксиметилфурфурола, готовят из основного раствора 1 г/л последовательным его разбавлением.

Все растворы должны быть свежеприготовленными.

2.3. Техника определения

2.3.1. Подготовка проб

Если содержание свободного диоксида серы менее 10 мг/л, определение проводят непосредственно в 2 мл вина или сусла; при необходимости пробы фильтруют.

Если содержание свободного диоксида серы более 10 мг/л, то в мерную колбу на 25 мл помещают 15 мл анализируемого образца и добавляют 2 мл раствора ацетальдегида. Перемешивают. Оставляют на 15 минут. Доводят до метки дистиллированной водой; при необходимости фильтруют. Для испытания берут 2 мл раствора.

2.3.2. Колориметрическое определение

В 2 колбы с притертой пробкой на 25 мл a и b, помещают по 2 мл пробы, приготовленной, как указано в пункте 2.3.1. В каждую колбу добавляют по 5 мл раствора p-толуидина, перемешивают. В колбу b (контроль) добавляют 1 мл дистиллированной воды, а в колбу a - 1 мл раствора барбитуровой кислоты, перемешивают. Переносят содержимое колб в кюветы спектрофотометра с оптическим путем 1 см. Регулируют шкалу абсорбции на ноль по раствору из колбы b при длине волны 550 нм; изменение абсорбции - по раствору из колбы а; записывают максимальную величину абсорбции А в интервале 2 - 5 минут.

Образцы с содержанием 5-гидроксиметилфурфурола, превышающим 30 мг/л, перед анализом разбавляют.

2.3.3. Построение калибровочной кривой

В 2 колбы a и b на 25 мл помещают по 2 мл раствора 5-гидроксиметилфурфурола с концентрацией 5; 10; 20; 30 и 40 мг/л и обрабатывают согласно пункту 2.3.2.

Графическое изображение абсорбции в зависимости от содержания 5-гидроксиметилфурфурола в стандартных растворах в мг/л представляет собой прямую, проходящую через начало координат.

2.4. Расчет

Отмечают на этой кривой среднее значение абсорбции, полученной для пробы разбавленного вина, и определяют концентрацию 5-гидроксиметилфурфурола С в миллиграммах на литр (мг/л) до десятого знака. При необходимости учитывают коэффициент разбавления.

3. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

3.1. Аппаратура

высокоэффективный жидкостной хроматограф, оснащенный:

инжектором с петлей на 5 или 10 µл;

спектрофотометрическим детектором, позволяющим проводить измерения при 280 нм;

колонкой с кремнеземным сферическим наполнителем, модифицированным октадецилом;

системой регистрации с интегратором;

поток подвижной фазы - 1,5 мл/минуту;

прибор для мембранной фильтрации с мембраной 0,45 µм.

3.2. Реактивы

вода бидистиллированная;

метанол дистиллированный или для ВЭЖХ;

уксусная кислота (ρ₂₀ = 1,05 г/мл);

подвижная фаза: вода-метанол-уксусная кислота 40:9:1(v/v), заранее отфильтрованная мембраной (0,45 µм). Подвижную фазу готовят каждый день и перед использованием дегазируют;

эталонный раствор 5-гидроксиметилфурфурола, 25 мг/л: в мерную колбу на 100 мл помещают точно взвешенные 25 мг 5-гидроксиметилфурфурола и доводят объем метанолом. Разбавляют приготовленный раствор метанолом в соотношении 1:10 и фильтруют через мембрану (0,45 µм). Раствор хранят 2-3 месяца в темной склянке в холодильнике;

3.3. Техника определения

Вводят в хроматограф последовательно 5 (или 10) µл анализируемого образца и 5 (или 10) µл эталонного раствора 5-гидроксиметилфурфурола. Регистрируют хроматограмму. Время удержания 5-гидроксиметилфурфурола составляет примерно 6-7 минут.

3.4. Выражение результатов

Содержание 5-гидроксиметилфурфурола выражают в миллиграммах на литр (мг/л) до десятого знака.

34. Цианистые соединения

34.1 MA-MD-AS 315-06-DERCYA

1. Сущность метода

Общую и свободную синильные кислоты в вине высвобождают в результате кислотного гидролиза и отделяют путем перегонки. После реакции с хлорамином Т и пиридином образовавшиеся глютаконовые диальдегиды определяют колориметрическим методом по голубой окраске при реакции с 1,3-диметилбарбитуровой кислотой.

2. Аппаратура:

перегонный аппарат, описание которого приводится в разделе "Объемная доля этилового спирта при 20°С";

мерная колба на 500 мл;

водяная баня, термостатированная на 20°С;

спектрофотометр, позволяющий проводить измерения абсорбции при длине волны 590 нм;

стеклянные кюветы или одноразовые кюветы, с оптическим путем 20 мм.

3. Реактивы:

25% (m/v) фосфорная кислота (H₃PO₄)

3% (m/v) раствор хлорамина Т (C₇H₇CINNaO₂S×3H₂O).

раствор 1,3-диметилбарбитуровой кислоты: растворяют 3,658 г 1,3-диметилбарбитуровой кислоты (C₆H₈N₂O₃) в 15 мл пиридина и 3 мл соляной кислоты (ρ₂₀=1,19 г/мл), затем переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки дистиллированной водой.

Цианистый калий (KCN).

10% (m/v) раствор йодистого калия (KI).

0,1М раствор нитрата серебра (AgNO₃).

4. Методика определения

4.1. Перегонка

В мерную колбу на 500 мл помещают 25 мл вина, 50 мл дистиллированной воды, 1 мл фосфорной кислоты и несколько стеклянных шариков. Затем колбу сразу помещают в перегонный аппарат. Отводят дистиллят с помощью заостренной стеклянной трубки, конец которой опущен в мерную колбу на 50 мл, содержащую 10 мл воды. Мерную колбу погружают в ледяную воду. Собирают 30-35 мл дистиллята (или примерно 45 мл общей жидкости в мерной колбе). Промывают удлиненную трубку холодильника несколькими миллилитрами дистиллированной воды; доводят дистиллят до температуры 20°С и дополняют до метки дистиллированной водой.

4.2. Измерение

Помещают 25 мл дистиллята в коническую колбу на 50 мл с притертой пробкой, добавляют 1 мл раствора хлорамина Т и герметически закрывают. Точно через 60 секунд добавляют 3 мл раствора 1,3-диметилбарбитуровой кислоты, герметически закрывают и оставляют на 10 минут. Затем измеряют абсорбцию по отношению к контролю (25 мл дистиллированной воды вместо 25 мл дистиллята) при длине волны 590 нм в кювете с оптическим путем 20 мм.

5. Построение калибровочной кривой

5.1. Аргентометрическое титрование цианистого калия

В колбе на 300 мл растворяют приблизительно 0,2 г, точно взвешенного KCN, в 100 мл дистиллированной воды. Добавляют 0,2 мл раствора йодистого калия и титруют 0,1 М раствором нитрата серебра до появления устойчивой желтой окраски.

1 мл 0,1 М раствора нитрата серебра соответствует 13,2 мг KCN . Рассчитывают титр раствора цианистого калия.

5.2. Калибровочная кривая

5.2.1. Приготовление эталонных растворов

Зная титр основного эталонного раствора KCN, определенный согласно пункту 5.1, готовят рабочий эталонный раствор, содержащий 30 мг/л цианистой кислоты (30 мг НCN ≈ 72,3 мг KCN). Основной эталонный раствор разбавляют дистиллированной водой 1:10.

Эталоны готовят в 5 мерных колбах на 100 мл, в которые добавляют следующие объемы эталонного рабочего раствора: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 мл. Доводят до метки дистиллированной водой. Приготовленные растворы содержат 30; 60; 90; 120 и 150 мкг/л цианистой кислоты.

5.2.2. Определение

Отбирают по 25 мл растворов, полученных согласно пунктам 4.1 и 4.2. На основании величины абсорбций и известных концентраций цианистой кислоты в каждом эталоне строят калибровочную кривую, проходящую через начало координат.

6. Выражение результатов

Цианистую кислоту выражают в микрограммах на литр (мкг/л) без десятичных знаков.

6.1. Расчет

Абсорбцию пробы вина откладывают на калибровочной кривой и определяют содержание общей цианистой кислоты. В случае необходимости учитывают разбавление.

Повторяемость (r) и воспроизводимость (R):

 X_i –средняя концентрация HCN в вине.

35. Диглюкозид мальвидола

35.1 MA-F-AS 315-03-DIGMAL

1. Принцип метода

Диглюкозид мальвидола окисляется в присутствии азотистой кислоты и трансформируется в вещество, которое в аммиачной среде в ультрафиолетовом свете, дает флуоресценцию зеленого цвета. Интенсивность флуоресценции образовавшегося вещества измеряют сравнением с интенсивностью флуоресценции титрованного раствора сульфата хинина, который соответствует эталону диглюкозида мальвидола.

Поскольку свободный диоксид серы снижает интенсивность флуоресценции, его необходимо предварительно связать избытком уксусного альдегида.

2. Качественное определение

2.1. Аппаратура

Лампа ультрафиолетового излучения на 365 нм.

2.2. Реактивы

Раствор уксусного альдегида:

паральдегид кристаллический _________10 г

спирт этиловый 96% об. _____________ 100 мл

Раствор соляной кислоты, 1M

Раствор нитрита натрия, 10 г/л

Спирт 96% об., содержащий 5% концентрированного аммиака (ρ20 = 0,92 г/мл)

Вино-свидетель, содержащее 15 мг/л диглюкозида мальвидола.

2.3. Методика определения

В колбу помещают 10 мл вина и 1,5 мл раствора уксусного альдегида. Перемешивают и оставляют на 20 минут.

В центрифужную пробирку на 20 мл помещают 1 мл вина, обработанного уксусным альдегидом, одну каплю 1 М раствора соляной кислоты и 1 мл раствора нитрита натрия. Перемешивают содержимое пробирки и оставляют на 2 минуты (максимум 5 минут), затем добавляют 10 мл спирта с аммиаком.

В другой центрифужной пробирке обрабатывают 10 мл вина-свидетеля, содержащего 15 мг/л диглюкозида мальвидола. Перемешивают, оставляют на 10 минут и центрифугируют.

Декантируют прозрачную жидкость из двух пробирок в две калиброванные пробирки с притертыми пробками. Сравнивают флуоресценцию в ультрафиолетовом свете при 365 нм анализируемой пробы вина и флуоресценцию вина-свидетеля.

Для розовых вин, которые содержат меньше антоцианов, можно увеличить чувствительность метода взяв:

5 мл вина, обработанного уксусным альдегидом;

0,2 мл 1 M раствора соляной кислоты;

1 мл раствора нитрита натрия;

5,8 мл спирта с аммиаком.

Обрабатывают параллельно пробу вина-свидетеля.

2.4. Интерпретирование

Вино, не дающее флуоресценции или флуоресцирующее слабее вина-свидетеля, рассматривается как не содержащие диглюкозид мальвидола; если флуоресценция не на много слабее, равна или превосходит показатель вина-свидетеля, необходимо провести количественное определение диглюкозида мальвидола.

3. Количественное определение

3.1. Аппаратура

Прибор для измерения флуоресценции:

- длина волны возбуждения 365 нм,

- длина волны флуоресцирующего излучения 490 нм.

Кюветы кварцевые с оптическим путем 1 см.

3.2. Реактивы

Количественный свидетель.

Раствор сульфата хинина, 2 мг/л: 10 мг сульфата хинина растворяют в 100 мл 0,1 М раствора серной кислоты. Разбавляют 20 мл этого раствора в мерной колбе на 1 литр и доводят до метки 0,1 М раствором серной кислоты.

3.3. Техника определения

Пробу вина подготавливают так же, как в пункте 2 настоящей главы для всех случаев (вина красные или розовые), обрабатывают уксусным альдегидом 1 мл пробы вина.

Помещают в кварцевую кювету раствор сульфата хинина (2 мг/л) для регулирования флуоресциметра и, действуя на ширину щели или на чувствительность, устанавливают трансмиссию Т равную 100%. Затем заменяют кювету на кювету с пробой вина и считывают значение трансмиссии T1.

Если значение T1 выше 35%, пробу вина необходимо разбавить вином, не содержащим диглюкозида мальвидола, флуоресцеция которого менее 6% (определяют по предварительной пробе).

Салициловая кислота (или салицилат натрия), добавленная в пробу вина до анализа для стабилизации, дает дополнительную флуоресценцию. Это устраняется экстракцией салициловой кислоты из вина эфиром.

Дополнительная флуоресценция может иметь место в случае, когда в вино была добавлена карамель.

3.4. Расчет

Интенсивность флуоресценции равная 1 для вина без SO₂ в условиях определения, описанных выше, за исключением обработки уксусным альдегидом, соответствует 0,426 мг диглюкозида мальвидола на один литр вина.

Вина красные и розовые, не содержащие диглюкозида мальвидола, могут давать флуоресценцию, соответствующую Т= 6%.

Содержание в вине диглюкозида мальвидола С в миллиграмм на литр (мг/л):

где: T1 – считанная трансмиссия пробы вина, %,

0,426 – константа интенсивности флуоресценции, равная 1 (соответствует 0,426 мг диглюкозида мальвидола на литр),

6 – трансмиссия Т розового или красного вина, не содержащего диглюкозид

мальвидола, %.

Если проба вина была разбавлена, то результат умножают на коэффициент разбавления.

3.5. Выражение результатов

Содержание диглюкозида мальвидола выражают в миллиграммах на литр (мг/л) вина без десятичных знаков.

35.2 MA/MDF/AS 315/11 ANCZAN

Аналитический метод включает определение относительного содержания антоцианов в красных и розовых винах. Разделение проводится на колонке (высокоэффективная жидкостная хроматография – HPLC) с обращенной фазой и UV-VIS детектором. Так как состав антоцианов в винах сложный, метод предусматривает простую процедуру, которая позволяет идентифицировать и определять девять основных антоцианов вина.

1. Принцип метода

Метод основан на прямом разделении антоцианов в неэтерифицированной форме от антоцианов в виде кислых эфиров методом HPLC на колонке с обращенной фазой и градиентным элюированием вода/муравьиная кислота/ацетонитрил с спектрофотометрическим детектированием при 518 нм (рис.6).

2. Реактивы и материалы

муравьиная кислота 98%;

вода (HPLC чистоты);

ацетонитрил (HPLC чистоты);

растворители HPLC:

A – вода/муравьиная кислота/ацетoнитрил ____ 87 : 10 : 3 (v/v/v);

B – вода/муравьиная кислота/ацетонитрил ____ 40 : 10 : 50 (v/v/v);

мембранные фильтры для дегазации растворителей HPLC и для подготовки анализируемых проб;

эталонные образцы для идентификации пиков:

цианидин-3-глюкозид; M=484,84 г/мол;

пионидин-3-глюкозид; M=498,84 г/мол;

мальвидин-3-глюкозид; M=528,84 г/мол;

мальвидин-3,5-диглюкозид; M=691,04 г/мол.

3. Оборудование

Для проведения испытаний необходимо следующее оборудование:

Система HPLC, оснащенная:

градиентным бинарным насосом;

системой инжектирования образцов объемом от 10 до 200 мкл;

детектором UV- VIS;

интегратором или компьютером со специальной программой;

термостатом колонок (до 40°C);

системой дегазации растворителей;

разделительной колонкой: например, LiChrospher 100 RP 18 (5µm) или LiChroCart 250-4;

предколонкой: например, RP18 (30-40 мм) с диаметром патрона 2 мм и длиной 20 мм.

5. Методика определения

5.1. Подготовка пробы

Осветленные вина могут быть тестированы напрямую, а мутные образцы нуждаются в предварительной фильтрации с помощью мембранного фильтра 0,45µm. Первая часть фильтрата выбрасывается.

Поскольку диапазон линейности абсорбции в зависимости от концентрации антоцианов очень широкий, объем инжектируемой пробы может варьировать от 10 до 200 мкл, в зависимости от интенсивности цвета вина. Не зарегистрировано существенной разницы для разных объемов инжектируемой пробы.

5.2. Определение

Разделение антоцианов осуществляют при следующих условиях HPLC:

градиенты элюирования:

Для обеспечения эффективности колонки число теоретических тарелок (N), рассчитанное в соотношении с мальвидол-3-глюкозидом, не должно быть менее 20000, а разрешение (Rs) между пеонидин-3-кумарил-глюкозидом и мальвидин-3-кумарил- глюкозидом не должно быть менее 1,5. Если эти значения ниже, используют другую колонку.

На рис.6 приведена типичная хроматограмма с разделенными антоцианами:

6. Выражение результатов

Значения выражаются в относительных единицах по отношению к общему содержанию антоцианов, определенных этим методом.

Рис.6. Разделение 9 антоцианов в красном вине.

36. Диэтиленгликоль

36.1 MA-MD-AS 315-09 DIEGLY

1. Принцип метода

Разделяют диэтиленгликоль газовой хроматографией на капиллярной колонке после экстракции эфиром. Метод позволяет определить диэтиленгликоль в винах в концентрации, равной или более чем 10 мг/л.

2. Аппаратура

газовый хроматограф укомплектованный:

пламенно-ионизационным детектором,

разделительной капиллярной колонкой с полиэтиленгликолем (Carbowax 20M), длиной 50 м и диаметром 0,32 мм.

3. Реактивы:

раствор 1,3-пропандиола, 1 г/л в 20% об. спирта (внутренний стандарт);

водный раствор диэтиленгликоля , НОСН₂СН₂ОСН₂СН₂ОН, 20 мг/л.

4. Методика определения

В мерную колбу на 50 мл помещают: 10 мл вина, 1 мл раствора 1,3-пропандиола и 25 мл эфира. Взбалтывают и добавляют нейтральный углекислый калий в количестве, необходимом до насыщения смеси. Взбалтывают. Разделяют на две фазы центрифугированием.

Осуществляют вторую экстракцию. Удаляют эфир испарением и растворяют остаток в 5 мл этанола.

Полнота экстракции должна быть не менее 90%.

Хроматографирование проводят в условиях, описанных выше.

5. Выражение результатов

Идентификацию диэтиленгликоля производят по времени его удерживания в сравнении с эталонным раствором, анализируемым в тех же условиях, что и вино.

Определение производят при сравнении с эталонным раствором по методу внутреннего стандарта.

При содержании диэтиленгликоля, равном или менее 20 мг/л, рекомендуется подтверждать его присутствие с помощью масс-спектрометрии.

37. Показатель Фолин-Чокальтеу

37.1 MA-MD-AS 2-10 INDFOL

1. Определение

Показатель Фолин-Чокальтеу - это результат, полученный по методу, описанному ниже.

2. Принцип метода

Все фенольные соединения, содержащиеся в вине, окисляются реактивом Фолин-Чокальтеу. Этот реактив образован смешением фосфорно-вольфрамовой (Н₃PW₁₂O₄₀) и фосфорно-молибденовой (Н₃PМо₁₂O₄₀) кислот, которые после окисления фенолов восстанавливаются в смесь окислов вольфрама (W₈O₂₃) и молибдена (Мо₈O₂₃), окрашенных в синий цвет.

Синяя окраска имеет максимальную абсорбцию при 750 нм и пропорциональна общему содержанию присутствующих первоначально фенольных соединений.

3. Реактивы

Реактивы должны быть чистыми для анализа. Используют дистиллированную воду или воду эквивалентной чистоты.

Реактив Фолин-Чокальтеу

Используют готовый реактив, имеющийся в продаже. Этот реактив может быть также приготовлен следующим образом: 100 г вольфрамата натрия (Na₂WO₄×H₂O) и 25 г молибдата натрия (Na₂Мо₁₂O₄×H₂O), растворяют в 700 мл дистиллированной воды. Добавляют 50 мл 85% фосфорной кислоты (ρ₂₀ = 1,71 г/мл) и 100 мл соляной концентрированной кислоты (ρ₂₀ = 1,19 г/мл). Доводят до температуры кипения и кипятят 10 часов с обратным холодильником, затем добавляют 150 г сульфата лития (Li₂SO₄×H₂O) и несколько капель брома и снова кипятят 15 минут. Охлаждают и дополняют объем до литра дистиллированной водой.

Раствор безводного карбоната натрия Na₂СO₃, 20% (m/v).

4. Аппаратура:

мерные колбы на 100 мл;

спектрофотометр, позволяющий проводить измерения при 750 нм.

5. Методика определения

5.1. Красные вина

В мерную колбу на 100 мл помещают последовательно 1 мл вина, разбавленного 1:5, 50 мл дистиллированной воды, 5 мл реактива Фолин-Чокальтеу и 20 мл раствора карбоната натрия. Дополняют до 100 мл дистиллированной водой. Перемешивают. Оставляют на 30 минут для прохождения реакции. Определяют абсорбцию при 750 нм в кювете с оптическим путем 1 см по отношению к контролю, приготовленному с дистиллированной водой вместо вина.

Если абсорбция значительно отличается от 0,3, необходимо сделать соответствующее разбавление.

5.2. Белые вина

Все операции проводят в тех же условиях, но в качестве пробы берут 1 мл неразбавленного белого вина.

5.3. Ректификованное концентрированное сусло

5.3.1. Подготовка пробы

Используют раствор, с концентрацией сахаров 25% (m/m) (250° Brix), подготовленный, как указано в разделе "17. Ионная кислотность (pH)" пункт 4.1.2.

5.3.2. Измерения

Все измерения проводят в тех же условиях, что и для красного вина (пункт 5.1), но берут пробу объемом 5 мл, подготовленную в соответствии с пунктом 5.3.1. Измеряют абсорбцию по сравнению с контролем, приготовленным с 5 мл 25% (m/m) раствора инвертного сахара.

6. Выражение результатов

6.1. Способ расчета

Результат выражают в виде показателя, полученного умножением абсорбции на 100 для красных вин, разбавленных 1:5 (или на коэффициент соответствующего другого разбавления) и на 20 для белых вин. Для ректификованного концентрированного  сусла абсорбцию умножают на 16.

6.2. Повторяемость

Расхождение между результатами двух определений, проведенных одновременно или одно за другим тем же лаборантом, не должно превышать 1.

Хорошая повторяемость результатов обеспечивается соответствующей чистотой лабораторной посуды (мерные колбы и кюветы спектрофотометра).

38. Охратоксин-A

38.1. MA-MD-AS 315-10 OСHRAT

1. Область применения

Метод применяется для определения охратоксина-А (ОТА) в красных, розовых и белых винах (в том числе и в специальных винах), в концентрациях до 10 мкг/л, при использовании колонки "immunoaffinite" и высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC).

Метод может быть применен к игристым и газированным винам при условии, что образцы будут предварительно дегазированы.

2. Принцип метода

Образец вина разбавляют раствором, содержащим полиэтиленгликоль и бикарбонат натрия, фильтруют и пропускают через колонку "immunoaffinite". OTA элюируют метанолом и разделяют методом HPLC с использованием флуориметрического детектора.

3. Реактивы:

хлорид натрия (NaCl);

гидрокарбонат натрия (NaHCO₃);

полиэтиленгликоль (PEG 8000);

иетанол (CH₃OH);

ацетонитрил (CH₃CN);

очищенная лабораторная вода качества EN ISO 3696;

уксусная кислота, 85% (CH₃COOH);

раствор разбавленный (1% PEG + 5% NaHCO₃): растворяют 10 г PEG и 50 г NaHCO₃ в 950 мл воды и доводят до 1 литра дистиллированной водой;

раствор для промывания (2,5% NaCl +0,5% NaHCO₃): растворяют 25 г NaCl и 5 г NaHCO₃ в 950 мл воды и доводят до 1 литра дистиллированной водой;

подвижная фаза HPLC (вода: ацетонитрил: ледяная уксусная кислота - 99:99:2, v/v/v): смешивают 990 мл воды с 990 мл ацетонитрила и 20 мл ледяной уксусной кислоты. Фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и дегазируют (например гелием);

толуол;.

смесь растворителей (толуол: ледяная уксусная кислота - 99:1, v/v ): смешивают 99 частей по объему толуола с одной частью по объему ледяной уксусной кислоты.

эталонный раствор OTA: растворяют 1 мг OTA или содержание одной ампулы (в случае если OTA получен в виде пленки после выпаривания) в смеси растворителей для получения раствора с содержанием 20 или 30 мкг/л OTA.

Для определения точной концентрации регистрируют спектр поглощения раствора между 300 и 370 нм в кварцевой кювете с оптического путем 1 см, используя смесь растворителя в качестве контроля. Определяют максимальное поглощение и рассчитывают концентрацию ОТА (С) в мкг/мл уравнением:

C = A_max × M × 100/ε × δ

где: A_max – поглощение при максимальной длине волны (примерно 333 нм)

M – молекулярный вес OTA = 403,8 г/моль

ε – коэффициент молярный экстинкции OTA в смеси растворителей, ε = 544/моль

δ – оптический путь (см)

Этот раствор устойчив при температуре -18°C в течение 4 лет.

Стандартный раствор OTA (2 мкг/мл в смеси толуол: уксусная кислота - 99:1, v/v): разбавляют эталонный раствор смесью растворителей для получения стандартного раствора OTA концентрацией 2 мкг/мл.

Раствор хранят при температуре +4°C в холодильнике. Стабильность должна быть проверена регулярно.

4. Оборудование:

стеклянные флаконы (4 мл);

вакуумный насос для подготовки колонок "immunoaffinite";

сосуд и трубка для слива, соединенные с колонкой "immunoaffinite";

фильтр из стекловолокна (например, Whatman GE/A);

колонка "immunoaffinite" специальная для OTA. Колонка должна иметь возможность связывать не менее 100 нг ОТА и позволять, чтобы производительность очистки была не менее 85% в случае прохождения раствора с содержанием 100 нг ОТА;

роторный испаритель;

жидкостной хроматограф, оснащенный насосом, который может обеспечить постоянный поток 1 мл/минуту;

система инжектирования на 100 мкл;

колонка аналитическая HPLC из нержавеющей стали 150x4,6 мм, заполненная стационарной фазой C18 (5 µm), укомплектованная предколонкой или предварительным фильтром (0,5 µm), содержащим соответствующую фазу. Колонки других размеров могут быть использованы, если они обеспечивают хорошую основу и фоновый шум, позволяющий обнаружить пик OTA среди других пиков;

флуоресцентный детектор с длиной волны возбуждения, установленной на уровне 333 нм, длиной волны излучения - 460 нм;

системы Acquisition;

спектрометр ÚV.

5. Методика определения

5.1. Подготовка проб

Наливают 10 мл  вина в коническую колбу на 100 мл. Добавляют 10 мл разбавленного раствора. Хорошо перемешивают. Фильтруют через стекловолоконный фильтр (фильтрация необходима для мутных вин или при наличии осадка).

5.2. Очистка на колонке "immunoaffinite"

Устанавливают колонку "immunoaffinitе", подсоединяют вакуумный насос и фиксируют сосуд для слива. Добавляют 10 мл (эквивалент 5 мл вина) разбавленного раствора в колбу и пропускают через колонку "immunoaffinitе" со скоростью потока примерно 1 капля в секунду. Промывают колонку "immunoaffinitе" 5 мл моющего раствора, затем 5 мл воды со скоростью потока от 1 до 2 капель в секунду.

Высушивают колонку сухим воздухом. Вымывают OTA в стеклянную колбу с 2 мл метанола при скорости потока 1 капля в секунду. Элюат упаривают досуха при температуре 50°C азотом. Сразу растворяют в 250 мкл подвижной фазы HPLC и хранят при 4°C до анализа методом HPLC.

5. 3. Метод HPLC

Инжектируют 100 мкл экстракта (что эквивалентно 2 мл вина) в инжекторную петлю хроматографа.

Условия работы:

расход: ________________________________________ 1 мл / минуту.

подвижная фаза: ацетонитрил: вода: ледяная уксусная кислота (99:99:2, v/v/v)

флуоресценция обнаружения:

длина волны возбуждения – ________________________ 333 нм

длина волны излучения – __________________________ 460 нм

объем инжектирования: ___________________________ 100 мкл

6. Количественное определение охратоксина-А (OTA)

Расчет количества OTA проводят по площади или высоте пика, соответствующим времени удержания OTA по предварительно построенной калибровочной кривой.

6.1. Калибровочная кривая

Калибровочная кривая строится каждый день перед анализом и всякий раз, когда изменяются условия хроматографирования. Берут 0,5 мл стандартного раствора OTA концентрацией 2 мкг/мл, помещают в стеклянный сосуд и выпаривают растворитель азотом. Растворяют в 10 мл подвижной фазы HPLC, предварительно фильтрованной через фильтр диаметром пор 0,45µm. Это обеспечивает концентрацию раствора OTA в 100 мкг/мл.

Готовят 5 калибровочных растворов для HPLC в 5 флаконах по 5 мл согласно таблице. Дополняют каждый стандарт до 5 мл подвижной фазы HPLC. Инжектируют по 100 мкл каждого раствора в хроматограф.

Если количество OTA в образцах находится за пределами диапазона калибровки, делают соответствующее разбавление или инжектируют меньшие объемы. В этом случае окончательный расчет (7) должен быть рассмотрен в каждом конкретном случае.

Рекомендуется, чтобы калибровочная кривая проходила через ноль для точной количественной оценки концентрации OTA менее 0,1 мкг/л.

7. Расчет

Расчет количества OTA производится по предварительно построенным на стандартных растворах калибровочным кривым.

Рассчитывается концентрация OTA (C_ota), в нг/мл (что эквивалентно мкг/л), по формуле:

C_ota =M_a x 2/V₁ x V₃/V₂ ,

где: M_a – масса охратоксина-A (нг) согласно матрице инжектирования, внесенная в колонку и определенная по калибровочной кривой;

2 – коэффициент разбавления;

V₁ – объем образца (10 мл);

V₂ – объем исследуемого раствора, вводимого в колонку (100 мкл);

V₃ – объем раствора, используемого для разбавления сухого элюата (250 мл).

39. Наличие синтетических красителей

39.1 MA-MD-AS 315-08-COLSYN

1. Принцип метода

Вино концентрируют до 1/3 объема, подщелачивают раствором гидроокиси натрия и экстрагируют эфиром. Эфирную фазу, промытую водой, экстрагируют раствором уксусной кислоты. Этот уксуснокислый раствор подщелачивают аммиаком, доводят до кипения в присутствии нитей шерсти, обработанной сульфатом алюминия и кислым виннокислым калием. Предполагаемый присутствующий краситель фиксируется на нитях шерсти. Краситель переходит в раствор при обработке нитей шерсти раствором уксусной кислоты. После выпаривания раствора уксусной кислоты остаток растворяют в водно-спиртовом растворе и анализируют хроматографией в тонком слое для идентификации красителей.

Оставшаяся после экстракции эфиром водная фаза возможно содержит в себе красители кислотного характера. Экстракция красителей основывается на их сродстве с шерстью животных, которую они сильно окрашивают: обрабатывают минеральными кислотами и фиксируют их на нитях шерсти.

Для концентрирования красителей осуществляют двойную или многократную фиксацию красителей последовательно на все уменьшающихся нитях шерсти. Если нити шерсти окрашиваются, значит, в вино был добавлен синтетический краситель, который впоследствии можно определить хроматографией в тонком слое.

2. Аппаратура:

стеклянные пластинки 20x20 см, покрытые порошком целлюлозы;

хроматографическая кювета.

3. Реактивы:

эфир серный;

раствор гидроокиси натрия, 5%;

уксусная кислота (ледяная), (ρ₂₀ = 1,05 г/ мл);

ледяная уксусная кислота, разбавленная дистиллированной водой в пропорции 1:18;

соляная кислота, (ρ₂₀ = 1,19 г/мл), разбавленная дистиллированной водой в пропорции 1:10;

аммиак (ρ₂₀ = 0,92 г/ мл);

волокна белые шерстяные, предварительно промытые, обезжиренные эфиром и высушенные;

волокна белые шерстяные, предварительно промытые, обезжиренные эфиром, высушенные и протравленные следующим образом: растворяют 1 г сульфата алюминия кристаллического A₁₂(SO₄)3×18H₂O и 1,2 г кислого тартрата калия в 500 мл воды. Помещают 10 г волокон белой шерсти, предварительно промытой, обезжиренной в эфире и высушенной, взбалтывают в течение 1 часа, затем оставляют на 2-3 часа, после чего сушат при температуре окружающей среды;

4. Техника определения

4.1. Определение синтетических красителей щелочного характера

4.1.1. Экстракция красителей

В коническую колбу на 500 мл помещают 200 мл вина, кипятят до уменьшения объема до 1/3 от первоначального. После охлаждения концентрированное вино нейтрализуют 5% раствором гидроокиси натрия до изменения натуральной окраски вина.

Экстрагируют эфиром в два приема по 30 мл эфира. Эфирные фракции, содержащие красители щелочного характера, объединяют; остаток вина после экстракции должен быть  сохранен для определения красителей кислотного характера.

Эфирный экстракт промывают два раза по 5 мл воды для извлечения из него гидроокиси натрия, затем осторожно взбалтывают с 5 мл разбавленного раствора уксусной кислоты.

Если полученная кислая водная фаза окрашена, это указывает на присутствие в вине синтетического красителя щелочного характера.

Присутствие синтетического красителя щелочного характера может быть подтверждено его фиксацией на нитях протравленной шерсти. Для этого кислую водную фазу, полученную согласно вышеуказанной процедуре, подщелачивают 5% раствором аммиака, затем добавляют 0,5 г нитей протравленной шерсти и кипятят 5 минут. Ополаскивают шерсть под проточной водой. Если шерсть окрашивается, то вино содержит синтетический краситель щелочного характера.

4.1.2. Анализ хроматографией в тонком слое

Водную кислую фазу, содержащую синтетический краситель щелочного характера, концентрируют до 0,5 мл. Если краситель был зафиксирован на нитях шерсти, их обрабатывают кипячением в 10 мл дистиллированной воды и 10 каплями уксусной кислоты (ρ₂₀ = 1,05 г/мл). После удаления нитей раствор концентрируют до объема 0,5 мл.

На поверхность стеклянной пластины, покрытой целлюлозой, наносят 20 мкл этого концентрированного раствора, отступив 3 см от бокового края и 2 см от нижнего края пластины. Помещают пластину в кювету с растворителем № 1 таким образом, чтобы ее нижний конец был погружен в растворитель на 1 см. Когда фронт растворителя поднимется на 15-20 см, ее вынимают и оставляют сохнуть на воздухе.

Идентифицируют краситель по растворам синтетических красителей щелочного характера, нанесенных последовательно на хроматографическую пластину.

4.2. Определение синтетических красителей кислотного характера

4.2.1. Экстракция красителей

Для тестирования используют остаток вина после определения красителей щелочного характера. В случае когда тестирование красителя щелочного характера не проводили, в коническую колбу на 500 мл помещают 200 мл вина, кипятят и концентрируют до 1/3 первоначального объема.

В обоих случаях после охлаждения остатка или концентрированного вина добавляют 3 мл разбавленного раствора соляной кислоты и 0,5 г белой шерсти, кипятят в течение 5 минут. Жидкость декантируют, а шерсть промывают под проточной водой.

Промытые волокна шерсти помещают в коническую колбу, добавляют 100 мл воды и 2 мл разбавленной соляной кислоты, затем кипятят в течение 5 минут. Декантируют кислую жидкость, затем повторяют процедуру до получения бесцветной жидкости .

Волокна после хорошей промывки, для полного извлечения кислой жидкости, помещают в коническую колбу с 50 мл дистиллированной воды и 10 каплями аммиака (ρ₂₀ = 0,92 г/мл), умеренно кипятят 10 минут для растворения синтетических красителей кислотного характера, которые, возможно, были зафиксированы на волокнах. Затем вынимают волокна, доводят объем до 100 мл и кипятят жидкость для выпаривания аммиака. После охлаждения подкисляют 2 мл разбавленной соляной кислоты (контролируют по индикатору – 1 каплю жидкости наносят на индикаторную бумагу).

В кислую жидкость помещают 60 мг (примерно 20 см) волокон белой шерсти, кипятят в течение 5 минут, вынимают нить и аккуратно ополаскивают в проточной воде. В случае когда волокна окрасились в красный (красное вино) или желтый (белое вино) цвет, считается доказанным присутствие синтетического красителя кислотного характера.

Если окрашивание волокон нечеткое, производят обработку аммиаком и повторные процедуры на 30 мг других волокон (около 10 см волокон). Появление слабого, но четкого цвета доказывает присутствие синтетического красителя кислотного характера.

При необходимости, для более полной фиксации, повторяют процедуру фиксации-элюирования 4-5 раз до тех пор, пока розовое окрашивание не станет отчетливым.

Волокна окрашенной шерсти обрабатывают кипячением с 10 мл дистиллированной воды и 10 каплями аммиака (ρ₂₀ = 0,92 г/мл). Вынимают волокна, а аммиачный раствор концентрируют до объема 0,5 мл.

4.2.2. Анализ хроматографией в тонком слое

На стеклянную пластину, покрытую целлюлозой, наносят 20 мкл этого концентрированного раствора, отступив 3 см от бокового края и 2 см от нижнего края пластины. Помещают пластину в кювету с растворителем № 2 таким образом, чтобы нижний край пластины был погружен в растворитель на 1 см. Когда фронт растворителя мигрирует на высоту 15-20 см, вынимают пластину и оставляют сохнуть на воздухе.

Идентифицируют краситель по растворам синтетических красителей кислотного характера, нанесенных последовательно на хроматографическую пластину.

40. Наличие синтетических подслащивающих веществ

40.1 MA-MD-AS 315-07 EDUSYN

1. Принципы методов

1.1. Арбитражный метод

Определение сахарина (сульфамида бензойного), дульцина (p-этоксифенилмочевины), цикламата (циклогексилсульфамaта) и Р-4000 (2-N–пропокси-2-амино-4-нитробензен).

После концентрирования вина сахарин, дульцин и Р-4000 экстрагируют в кислой среде бензолом; затем экстрагируют цикламат из вина этилацетатом (необходимо строго соблюдать порядок экстракции). Остатки после выпаривания растворителей анализируют хроматографией в тонком слое.

Сахарин и цикламат идентифицируют хроматографированием на пластинах из целлюлозы (растворитель: ацетон-этилацетат-аммиак), первый в бензольном экстракте, второй - в этилацетатном экстракте после очистки его эфиром.

Эти подсластители проявляются на пластинах после опрыскивания раствором бензидин-анилин-ацетат меди и разделения при следующих величинах Rf: 0,29 для цикламата, 0,46 для сахарина.

P-4000 и дульцин идентифицируют хроматографией в слое полиамида в бензольном экстракте (растворитель: толуол-метанол-кислота уксусная ледяная). Эти подсластители, проявляющиеся после опрыскивания раствором p-диметиламинобензальдегида, разделяются при следующих величинах Rf: 0,60 для дульцина, 0,80 для Р-4000.

1.2. Метод текущих определений

Определение сахарина, дульцина и цикламата.

Эти подсластители экстрагируют из вина ионообменной жидкостью, затем снова экстрагируют разбавленным аммиаком, идентифицируют хроматографией в тонком слое из смеси порошка целлюлозы и порошка полиамида (растворитель: ксилен-пропанол-ледяная н-уксусная кислота-муравьиная кислота). Они проявляются благодаря их голубой флуоресценции на желтом фоне, наблюдаемой в ультрафиолете после опрыскивания раствором 2,7–дихлорофлуоресцина.

Последующее опрыскивание раствором 1,4-диметилами-нобензальдегида позволяет дифференцировать дульцин, который дает оранжевое пятно в отличие от ванилина и эфиров р-гидроксибензойной кислоты, которая мигрирует с тем же Rf.

2. Арбитражный метод

Определение сахарина, дульцина и Р-4000.

2.1. Аппаратура:

хроматографическая кювета;

шприцы микрометрические или микропипетки;

делительная воронка диаметром 15 мм и высотой 180 мм, снабженная краном;

водяная баня на 100^°C;

сушильный шкаф с регулированием температуры до 125^°C.

2.2. Реактивы:

растворители для экстракции:

- бензол;

- этилацетат;

растворители для хроматографии:

смесь № 1: ацетон: этилацетат: концентрированный аммиак (ρ₂₀=0,92 г/мл), 60: 30: 10;

смесь № 2: толуол: метанол: уксусная кислота ледяная (ρ₂₀=1,05 г/мл), 90: 10: 10;

пластины для хроматографирования 20х20 см:

- со слоем порошка целлюлозы (например Whatman CC41 или Macherey-Nagel MN300);

- со слоем порошка полиамида (например, Merck);

реактив для проявления сахарина и цикламата: готовят спиртовый раствор бензидина: 250 мг в 100 мл этанола, насыщенный раствор ацетата меди и свежеперегнанный анилин. Смешивают 15 мл раствора бензидина, 1 мл анилина и 0,75 мл насыщенного раствора ацетата меди. Этот раствор должен быть приготовлен непосредственно перед анализом. Он соответствует объему, необходимому для проявления одной пластины 20x20 см;

кислота соляная разбавленная 1:2 (v/v);

раствор азотной кислоты, 25%;

реактив для проявления Р-4000 и дульцина: растворяют 1 г 1,4-р-диметиламинобензальдегида в 50 мл метанола; добавляют 10 мл азотной кислоты; доводят объем до 100 мл метанолом. На одну пластину 20х20 см используют 15 мл реактива;

0,1% водно-спиртовый раствор цикламата: растворяют 100 мг натриевой или кальциевой соли циклогексилсульфаминовой кислоты в 100 мл смеси равных частей этанола и воды;

0,05% водный раствор сахарина;

раствор 0,05 г дульцина в 100 мл метанола;

раствор 0,05 г Р-4000 в 100 мл метанола.

2.3. Техника определения

2.3.1. Экстрагирование

100 мл вина помещают в цилиндрический сосуд, быстро выпаривают при кипячении до объема 30 мл, постоянно направляя струю холодного воздуха на поверхность сосуда. Охлаждают.

Подкисляют 3 мл соляной кислоты, разбавленной 1:2. Переливают в коническую колбу на 500 мл с притертой пробкой, добавляют 40 мл бензола и перемешивают механической мешалкой 30 минут. Переливают в делительную воронку для отделения органической фазы, которая центрифугируется в случае образовании эмульсии.

Помещают органическую фазу в коническую колбу с притертой пробкой. Вино, экстрагированное бензолом, находящееся в нижнем слое воронки, помещают в коническую колбу на 500 мл с притертой пробкой, в которую предварительно наливают 40 мл этилацетата. Взбалтывают 30 минут и отделяют органическую фазу, как описано выше. Следят за тем, чтобы была собрана только органическая фаза без вина.

На водяной бане при 100^°C выпаривают каждый растворитель для экстракции небольшими порциями в чашечках диаметром 50-60 мм, обдувая холодным воздухом поверхность чашечек. Выпаривание продолжают до получения сиропообразного остатка.

Растворяют остаток из чашки, в которой был выпарен бензольный экстракт, 0,5 мл водно-спиртового раствора (1:1) (0,25 мл раствора достаточно для растворения остатка, а остальные 0,25 мл для промывки чашки). Полученный водно-спиртовой экстракт переносят в маленькую пробирку с притертой пробкой (экстракт B).

Остаток из чашки после выпаривания этилацетатного экстракта (который содержит цикламат) растворяют 0,5 мл воды и переносят в делительную воронку. Промывают чашку  10 мл этилового эфира, затем добавляют эфир к содержимому делительной воронки. Энергично взбалтывают в течение 2 минут и отделяют нижний слой в пробирку, в которую предварительно было помещено 0,5 мл этанола. Получают в целом 1 мл водно-спиртового раствора, который предположительно содержит цикламат (экстракт А).

2.3.2. Хроматографирование

Сахарин и цикламат

Для определения сахарина и цикламата используют пластину из целлюлозы: одну половину для определения цикламата, другую половину - для сахарина.

Для этого на половину пластины наносят 5-10 мкл экстракта А и 5 мкл эталона цикламата, на вторую половину пластины наносят 5-10 мкл экстракта В и 5 мкл эталонного раствора сахарина. Помещают подготовленную таким образом пластину в хроматографическую кювету, содержащую растворитель № 1 (ацетон-этилацетат-аммиак), оставляют для миграции на высоту 10-12 см.

Вынимают пластину из кюветы и сушат горячим воздухом; осторожно и равномерно опрыскивают реактивом с бензидином (17-18 мл для каждой пластины). Сушат пластину холодным воздухом. Затем помещают пластину в сушильный шкаф при 120-125^°C на 3 минуты. Появляются пятна темно-серого цвета на светло-коричневом фоне; цвет пятен со временем усиливается.

P-4000 и дульцин

Наносят 5 мкл экстракта В и по 5 мкл эталонных растворов дульцина и Р-4000 на пластину из полиамида. Подготовленную таким образом пластину помещают в хроматографическую кювету, которая содержит растворитель № 2 (толуол-метанол-уксусная кислота). Оставляют для миграции на высоту 10-12 см.

Вынимают пластину из кюветы, сушат холодным воздухом; опрыскивают 15 мл реактива с р-диметиламино-бензальдегидом, после этого сушат холодным воздухом до появления пятен желто-оранжевого цвета, которые соответствуют дульцину и P-4000.

Чувствительность

Реактив с бензидином позволяет проявить пятна, соответствующие 2 мкг сахарина и 5 мкг цикламата. Реактив с р-диметиламинобензальдегидом позволяет проявить пятна, соответствующие 0,3 мкг дульцина и 0,5 мкг Р-4000.

Этот метод позволяет выявить с учетом возможностей различных экстракций:

3. Метод текущих определений

3.1. Аппаратура:

устройство для нанесения тонкого слоя;

пластины стеклянные 20х20 см: тщательно смешивают 9 г порошка целлюлозы и 6 г порошка полиамида. Добавляют при взбалтывании 60 мл метанола. Наносят на пластины слой толщиной 0,25 мм. Сушат 10 минут при 70^°C. Этого количества достаточно для подготовки 5 пластин;

водяная баня с регулированием температуры или роторный испаритель;

лампа UV для исследования хроматографических пластин.

3.2. Реактивы:

эфир петролейный (40-60^°);

ионообменная смола в жидкой форме, например, Амберлит LA-2;

уксусная кислота разбавленная 1: 5 (v/v);

раствор ионообменника: 5 мл ионообменника тщательно перемешивают с 95 мл петролейного эфира и 20 мл уксусной кислоты, разбавленной 1:5 (v/v). Используют верхний слой;

раствор азотной кислоты, 1 М;

раствор серной кислоты, 10% (v/v);

аммиак разбавленный 1:4 (v/v);

порошок полиамидный, например: Macherey-Nagel или Merck;

порошок целлюлозы, например: Macherey-Nagel MN 300AC;

растворитель для хроматографии: ксилен: n-прoпанол: уксусная кислота (ρ₂₀=1,05 г/мл): муравьиная кислота (98-100%) в пропорции 45:6:7:2;

раствор для проявления:

0,2% раствор 2,7-дихлорфлуорисцина в этаноле;

раствор р-диметиламинобензальдегида: растворяют 1 г р-диметиламинбензальдегида, помещенного в мерную колбу на 100 мл с приблизительно 50 мл этанола. Добавляют 10 мл 25% азотной кислоты и доводят до метки этанолом;

эталонные растворы:

0,1% раствор дульцина в метаноле;

0,1% раствор сахарина в смеси метанола и воды в соотношении 1:1;

раствор цикламата: раствор содержит 1 г натриевой или кальциевой соли циклогексилсульфамидной кислоты в 100 мл смеси метанола и воды в соотношении 1:1;

1% раствор ванилина в смеси метанола и воды в соотношении 1:1;

1% раствор эфира р-гидроксибензойной кислоты в метаноле.

3.3. Техника определения

50 мл вина помещают в делительную воронку, подкисляют 10 мл разбавленным раствором серной кислоты и экстрагируют в 2 приема по 25 мл раствором жидкого ионообменника. 50 мл полученного раствора промывают в 3 этапа по 50 мл дистиллированной водой, которой дают стечь, затем в 3 этапа по 15 мл разбавленным аммиаком. Растворы аммиака объединяют, затем выпаривают досуха при 50^°C на водяной бане или в роторном испарителе. Остаток растворяют в 5 мл ацетона и двух каплях азотной кислоты, фильтруют и снова выпаривают досуха при температуре 70^°C на водяной бане. Необходимо избегать долгого нагревания и температуры выше 70^°C. Остаток растворяют 1 мл метанола; 5-10 мкл этого раствора и 2 мкл эталонных растворов наносят на пластину. Оставляют для миграции растворителя (ксилен-n-прoпанол-уксусная кислота-муравьиная кислота) на высоту около 15 см (примерно в течение 1часа).

После высушивания на воздухе пластину опрыскивают раствором дихлорфлуоресцина. Сахарин и цикламат проявляются тотчас в виде светлых пятен на розовом фоне. При исследовании в UV (254 или 360 нм) все три подсластителя проявляются синим цветом на желтом фоне.

Подсластители разделяются снизу вверх в следующем порядке: цикламат , сахарин, дульцин.

Ванилин и эфиры р-дегидроксибензойной кислоты имеют такую же величину Rf , что и дульцин. Для идентификации дульцина в присутствии этих соединений пластина должна быть спрыснута раствором р-диметиламинобензальдегида. Дульцин проявляется в виде оранжевого пятна, тогда как другие соединения не вступают в реакцию.

Чувствительность - предельное количество, определяемое на хроматографической пластине 5 мкг для всех трех веществ.

Этот метод позволяет определить: 10 мг/л сахарина, 50 мг/л цикламата и 10 мг/л дульцина.

41. Микробиологический анализ сусла и вина

41.1 MA-MD-AS 4-01 ANMICR

Цель

Целью микробиологического анализа являются контроль за спиртовым и/или молочным брожением, выявление опасности микробиальных загрязнений, что позволяет обнаружить все отклонения от нормы не только в готовом продукте, но и на различных этапах производства.

Все операции проводят с соблюдением обычных асептических условий для работ в микробиологии, используя материалы, стерилизованные вблизи горелки Бунзена или в камере с ламинарным потоком, и прокаливая отверстия пипеток, цилиндров, колб и др.

Перед началом микробиологического анализа необходимо правильно отобрать образцы для анализа.

Область применения

Микробиологический анализ можно применять для вин, сусел, мистелей и в случаях, когда эти продукты испорчены микробиальной деятельностью.

Методы микробиологического анализа

В зависимости от информации, которую необходимо получить, микробиологический анализ проводят, прибегая к следующим методам:

1. Испытания на выдержку:

испытание выдержкой на воздухе;

испытание выдержкой в термостате.

2. Идентификация микроорганизмов и прямой подсчет дрожжей:

микроскопическая экспертиза жидкости и осадка;

окрашивание метиленовой синью;

окрашивание по Граму;

исследование каталаз;

прямой подсчет дрожжей под микроскопом .

3. Подсчет микроорганизмов

3.1. Культуры в/или на твердой среде или твердой подложке:

культуры на пластине;

культуры на фильтровальной мембране.

3.2. Культуры в жидкой среде - "Наиболее вероятное число" (NPP)

Материалы:

камера с ламинарным потоком;

микроскоп;

термостат для инкубации при температуре 20-35°C, снабженный термометром;

термостат для сухой стерилизации при температуре 180°C, снабженный термометром;

инкубатор с CO₂ или герметические сосуды, закрытые герметично, снабженные генератором CO₂ или другими приборами, обеспечивающие атмосферу, обогащенную CO₂;

pH-метр, калиброванный в единицах pH, позволяющий измерять до ± 0,1 единиц;

автоклав, позволяющий осуществлять необходимую стерилизацию паром материала и культурных сред;

центрифуга;

водяная баня;

газовая горелка;

весы с чувствительностью до десятых миллиграмма;

гематиметр – счетчик с ячейкой Нойбауэра или его эквивалент;

прибор для стерильной фильтрации с фильтрующими мембранами диаметром 13 или 25 мм, порами 0,22 µm, из эфиров целлюлозы или поливинилиденфторида или эквивалентные с гидрофобными краями;

горелка Бунзена;

мерные колбы на 100 и 1000 мл;

колбы Эрленмейера на 100, 150, 300 и 1000 мл, закупоренные стерилизованным ватным тампоном;

пробирки на 50, 100, 300, 500 и 1000 мл;

пипетки на 1, 10, 15, 20 и 25 мл, стерилизованные;

центрифужные пробирки, стерилизованные;

стеклянные пробирки для автоклава, без выступающих краев, размерами 160x16 мм и 180x18 мм, закупоренные ватным тампоном, предварительно стерилизованные, или эквивалентное приспособление;

тонкие пластинки;

покровные стекла;

пипетки Пастера, стерилизованные;

стерилизованная петля;

фильтровальная бумага;

иммерсионное масло;

спирт 70 и 95% об.

Может использоваться другое оборудование при условии, что оно имеет эквивалентные характеристики.

Техника отбора проб

Необходимо, чтобы пробы были типичными. Используют пипетки для бочек и длинные стеклянные трубки для чанов. Следует осуществлять отбор в местах предварительно стерилизованных для избежания внешних заражений, которые могут дать ложно положительные результаты. Для осуществления отбора "краником для дегустации" из бочек необходимо оставить протечь несколько литров пробы. Должны дезинфицировать поверхность контакта, например, спиртом 70% об. или газовой горелкой.

Анализ проб должны проводить как можно быстрее после отбора. Во время транспортирования и хранения пробы должны помещаться в холод (4-5)°C для стабилизации микробиальной флоры.

1. Испытания выдержкой

Цель

Эти испытания проводят с целью предупреждения риска микробиальных изменений.

Принцип

Этот способ основан на установлении визуальных изменений (помутнение, опалесценция, осадок, нежелательный цвет) в вине, происходящих под действием кислорода воздуха или температуры. Характер изменений должен проверяться и подтверждаться микроскопированием.

Ход работы

1.1. Проба с выдержкой на воздухе

Образец вина в 50 мл после грубой фильтрации через бумажный стерильный фильтр помещают в стерильную колбу Эрленмейера на 150 мл, закупоренную ватным тампоном, и оставляют при комнатной температуре в течение 3 дней. Прозрачность, цвет, присутствие мутности, осадка, опалесценции рассматриваются в зависимости от времени. В случае появления помутнения, осадка, опалесценции или изменения цвета проводят микроскопирование.

1.2. Проба с выдержкой в термостате

Образец вина в 100 мл после грубой фильтрации через бумажный стерильный фильтр помещают в стерильную колбу Эрленмейера, закупоренную ватным тампоном, помещают в термостат при 30°C и исследуют не менее чем через 72 часа. Органолептические изменения могут служить показателями микробиального развития. В этом случае необходимо провести микроскопирование.

2. Идентификация микроорганизмов и прямой подсчет дрожжей

2.1. Микроскопирование жидкости и осадка

Цель

Микроскопирование необходимо проводить с целью выявления и дифференциации возможно присутствующих дрожжей и бактерий.

Однако микроскопирование не позволяет отличить живые микроорганизмы от мертвых. С помощью окрашивания жизнеспособных микроорганизмов можно примерно подсчитать количество живых дрожжей.

Принцип

Этот метод основан на увеличительной способности микроскопа, позволяющей обнаружить микроорганизмы, размеры которых порядка микрона.

Ход работы

Микроскопирование можно проводить непосредственно в жидкости или в осадке.

Прямое обследование жидкости представляет интерес, только когда численность микроорганизмов достаточно высока (более 5×10⁵ клеток/мл).

В случае низкого содержания микроорганизмов в вине необходимо провести концентрирование. С этой целью центрифугируют приблизительно 10 мл вина при 3000-5000 оборотов в минуту в течение 5-15 минут. Затем декантируют надосадочную жидкость, и осадок смешивают с жидкостью, которая осталась в центрифужной пробирке.

Для проведения микроскопических исследований помещают на стеклянную пластинку стерильной пипеткой Пастера каплю жидкости или осадка, смешанного с жидкостью, накрывают покровным стеклом и помещают под окуляр микроскопа. Исследуют чистое поле или контрастные фазы, позволяющие лучше увидеть элементы структуры микроорганизмов. Как правило, используют увеличение в 400-1000 раз.

2.2. Окрашивание микроорганизмов метиленовой синью

Цель

Окрашивание микроорганизмов метиленовой синью позволяет отличить живые дрожжи от мертвых.

Принцип

Это окрашивание основано на присутствии в живых клетках фермента, восстанавливающего краситель. Например, метиленовая синь восстанавливается ферментом живых клеток, которые остаются бесцветными. Мертвые клетки поглощают краситель и окрашиваются в синий цвет.

Реактивы:

раствор метиленовой сини, 0,1%: в колбе Эрленмейера растворяют 0,1 г метиленовой сини в 100 мл дистиллированной воды. Фильтруют через бумажный фильтр. Раствор должен быть свежеприготовленным.

Ход работы

Наносят на пластинку каплю образца и каплю красителя. Перемешивают при помощи петли и через 5 минут изучают в микроскопе в светлом поле.

Результаты

Живые клетки остаются бесцветными, а мертвые окрашиваются в синий цвет.

Эти методы окрашивания не являются достаточно точным и используются только для приблизительного подсчета, они не рекомендуются для бактерий. Для различия микроорганизмов - дрожжей и бактерий – живых и мертвых – используют более совершенную технику, например, эпифлуоресцентную микроскопию.

2.3. Окрашивание по Граму

Цель

Окрашивание по Граму проводят с целью различить молочные бактерии (грамположительные) от уксусных бактерий (грамотрицательных) и изучения их морфологии.

Необходимо иметь в виду, что окрашивание по Граму не дает окончательный результат, поскольку в осадках с молочными и уксусными бактериями могут присутствовать и другие бактерии.

Принцип

Это окрашивание основано на отличиях между грамположительными и грамотрицательными бактериями, обусловленными разнообразием структуры и химического состава клеточных стенок. Стенки грамотрицательных бактерий богаты липидами и имеют незначительное количество пептидоглюканов, что позволяет спирту проникнуть и растворить образовавшийся фиолетовый комплекс генциан-йода, обесцвечивая клетки, которые затем перекрашиваются сафранином в красный цвет. Тогда как стенки клеток грамположительных бактерий содержат большое количество пептидоглюканов и незначительную концентрацию липидов. Толщина стенок пептидоглюканов и дигидратация обусловленная спиртом, не позволяют спирту проникнуть в клетку, поэтому фиолетовая или темно-синяя окраска фиолетового комплекса генциан-йода сохраняется.

Существует множество изменений в методе окрашивания по Граму. Метод окрашивания по Граму неэффективен, если осуществлен на очень старой культуре. Штамм должен находиться в фазе показательного роста в течение 24 – 48 часов.

Растворы:

Используют только дистиллированную воду.

1. Раствор генциана фиолетового: 2 г генциана фиолетового, помещают в колбу Эрленмейера на 100 мл и растворяют в 20 мл 95% об. спирта; растворяют 0,8 г оксалата аммония в 80 мл дистиллированной воды. Смешивают эти два раствора и используют через 24 часа. Перед использованием фильтруют через бумажный фильтр. Хранят в темноте в закрытом флаконе.

2. Раствор люголя: растворяют 2 г йодистого калия в небольшом количестве воды (4-5 мл) и в этом насыщенном растворе растворяют 1 г йода. Дополняют объем до 300 мл дистиллированной водой. Хранят в темноте в закрытом флаконе.

3. Раствор сафранина: 0,5 г сафранина, помещают в колбу Эрленмейера на 100 мл, растворяют в 10 мл 95% об. спирта и добавляют 90 мл воды. Перемешивают. Хранят в темноте в закрытом флаконе

Ход работы

Приготовление препаратов для микроскопирования

Проводят посев бактерий в жидкую или твердую среду. Собирают петлей или проволочкой молодую культуру бактерий из осадка (после центрифугирования жидкой культуры) или прямо из твердой среды и перемешивают с одной каплей стерилизованной воды.

Готовят мазок на пластине, распределяя каплю микробиальной суспензии тонким и равномерным слоем. Оставляют мазок подсушиться. Затем для фиксации мазка проводят пластинку быстрым движением три раза сквозь горелку Бунзена или по другой аналогичной технике. После охлаждения выполняют окрашивание.

Окрашивание

На фиксированный мазок наносят несколько капель раствора генциана фиолетового. Оставляют на 2 минуты для реакции и промывают водой.

Наносят одну или две капли раствора люголя. Оставляют на 30 секунд для реакции. Промывают водой и сушат на фильтровальной бумаге.

Наносят 95% об. спирт, оставляют на 15 секунд для реакции. Промывают водой и сушат на фильтровальной бумаге

Наносят несколько капель раствора сафранина, оставляют на 10 секунд для реакции. Промывают водой и сушат на фильтровальной бумаге.

На окрашенный мазок наносят каплю иммерсионного масла. Микроскопируют, используя иммерсионный объектив, в светлом поле.

Результаты

Молочные бактерии остаются окрашенными в фиолетовый или темно-синий цвет (грамположительные).

Уксусные бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные).

2.4. Исследование каталазы

Цель

Цель исследования – отличить молочные бактерии от уксусных. Дрожжи и уксусные бактерии имеют положительную реакцию на каталазу, молочные бактерии – отрицательную.

Необходимо иметь в виду, что исследование каталазы не окончательно, поскольку, кроме молочных и уксусных бактерий, могут присутствовать и другие.

Принцип

Реакция на каталазу основана на свойстве аэробных микроорганизмов разлагать перекись водорода с освобождением кислорода:

Реактивы

Раствор перекиси водорода, 3%: помещают в колбу на 100 мл, 10 мл 30% раствора перекиси водорода и дополняют объем свежекипяченой дистиллированной водой. Перемешивают и хранят в холодильнике в темном флаконе. Раствор должен быть свежеприготовленным.

Ход работы

На пластину наносят каплю 3% раствора перекиси водорода, затем на эту каплю добавляют немного молодой колонии. Если происходит газовыделение, то культура содержит каталазу. Иногда сложно заметить газовыделение, особенно колониями бактерий, поэтому в этом случае рекомендуется проводить микроскопирование препарата (объектив x10).

2.5. Прямой подсчет дрожжей под микроскопом:

Цель

Цель прямого подсчета – определить общую дрожжевую заселенность (живые и мертвые). Метод рекомендуется только для подсчета дрожжей.

Подсчет бактерий сложен и приблизителен в связи с их незначительным размером, и особенно по причине присутствия коллоидных частиц. Метод можно использовать для грубого подсчета живых клеток, используя окрашивание живых клеток метиленовой синью.

Принцип

Метод основан на подсчете микроорганизмов при помощи микроскопа в известном объеме образца. Устройствами измерения этого объема являются специальные пластинки типа гематиметра или счетчика клеток. Пластинки с расчерченной поверхностью, покрытые более толстой плоской пластиной, удерживают известный объем образца.

Существуют разные счетчики клеток. Например, счетчики клеток Neubauer, включающее центральное углубление в 0,1 мм и площадь 1 мм². Дно углубления разделено на 400 маленьких квадратиков. Таким образом, объем образца, соответствующий одному маленькому квадратику равен 1/400 мм³.

Ход работы

Помещают каплю гомогенизированного образца в центр пластинки, избегая переливания через край. Покрывают толстой пластинкой, избегая образования газообразных пузырьков. Оставляют на несколько минут для закрепления.

Концентрация должна быть не очень высокой и не очень разбавленной. Если речь идет о слишком густом заселении, то образец должен быть разбавлен. Напротив, если количество клеток незначительное, необходимо повысить концентрацию центрифугированием.

Подсчет микроорганизмов под микроскопом проводят при их содержании между 200 и 500 клеток. Избегают двойного подсчета одних и тех же клеток. Для получения более точной цифры необходимо подсчитывать в разных полях. Например, можно подсчитать 5 больших квадратов (каждый состоящий из 16 маленьких квадратов), 1 в центре и 4 по краям разграфленного плана или 5 больших квадратов по диагонали. Рекомендуется провести подсчет 2 раза. Для выражения клеток в миллилитрах определяют среднее арифметическое двух подсчетов, результат делят на 400 маленьких квадратов и умножают на 10⁴. Если предварительно были проведены разбавления или концентрирование учитывается коэффициент разбавления или концентрирования.

3. Подсчет микроорганизмов в культурной среде

Цель

Цель подсчета культур микроорганизмов – оценить уровень загрязнения образца, то есть определить его микробиальную чистоту, так как жизнеспособные микроорганизмы способны испортить продукт.

В зависимости от типа используемой питательной среды и условий культивирования можно выделить три типа микроорганизмов: дрожжи, молочные и уксусные бактерии.

3.1. Культура на твердых средах

Принцип

Этот метод основан на предположении, что жизнеспособный микроорганизм, развитый в/на специфической питательной среде и в подходящих условиях, размножается, образуя колонию, видимую невооруженным глазом.

3.1.1. Культура на пластинах

Цель

Этот метод используют для подсчета микроорганизмов, когда микробиальная концентрация высокая, и проводят разбавления.

Материалы

Кроме вышеперечисленного материала используют:

чашки Петри (пластины) 57 см² (пластмассовые) или 65 см² (стекло Pyrex);

растворители и твердые среды культур (приложение 4 и 5).

Ход работы

Подсчет колоний в чашках Петри может осуществляться прямым введением в массу или на поверхность культурной среды образца после соответствующей инкубации.

Разбавление

Поскольку заранее микробиальная концентрация неизвестна, делают последовательные разбавления, десятичные и возрастающие таким образом, чтобы получить наиболее подходящее количество колоний (между 30 и 300) для их подсчета .

Можно сделать примерный расчет степени разбавления образца при помощи микроскопа. Для этого из гомогенизированного образца готовят серию десятичных разбавлений (1:10) в растворителе.

В первую пробирку отбирают 1 мл образца и добавляют 9 мл растворителя. Перемешивают. Во вторую пробирку отбирают 1 мл из предыдущего разбавления и добавляют 9 мл растворителя. Продолжают разбавлять до последнего подходящего разбавления, согласно рассматриваемой микробиальной заселенности, используя стерильные пипетки для каждого разбавления. (см. схему в приложении № 1).

Приготовление инокуляции введением в агарную среду

Готовят чашки Петри таким образом, чтобы получить разбавление, которое даст 30 и 300 колоний.

Инокулируют 1 мл образца и 1 мл из каждого приготовленного разбавления в две чашки Петри, выбирают разбавления согласно предполагаемой микробиальной заселенности и немедленно перемешивают; используют разные стерилизованные пипетки или автоматические пипетки с гидрофобными насадками. Затем вливают 15 мл агарной культурной среды при температуре 42-45°C, заранее расплавленной на кипящей водяной бане или в микроволновой печи, избегая длительного нагревания. Быстро и аккуратно перемешивают смесь круговыми движениями в оба направления, избегая образования пузырьков воздуха и переливания через край. Охлаждают на плоской поверхности до затвердевания.

Приготовление инокуляции на поверхности агарной культурной среды

Помещают 0,1-0,2 мл образца из выбранных разбавлений таким образом, чтобы на поверхности агарной среды не получилось чрезмерное количество жидкости, которое может влиять на качество распределения. Рекомендуется использовать разбавление в 10 раз концентрированнее, чем в методе введения в агарную среду. На поверхность питательной среды равномерно распределяют выбранный образец с помощью стеклянной палочки, обработанной спиртом и пламенем.

Чашки Петри инкубируют в термостате в перевернутом положении:

дрожжи - при температуре 20-25°C в течение 3-10 дней в аэробиозе. (Для счета дрожжей инкубационный период в течение 3 дней вполне достаточен. Если предполагается присутствие Dekkera Brettanomyces, инкубационный период должен занять 7-10 дней);

молочные бактерии - при температуре 25°C в течение 4-10 дней в анаэробиозе или в микроаэрофилии;

уксусные бактерии - при температуре 25-30°C в течение 2-4 дней в аэробиозе.

Подсчитывают количество образовавшихся колоний невооруженным глазом, при помощи лупы или счетчиком колоний. В случае сомнений подтверждают специфику колоний (дрожжи или бактерии) под микроскопом.

Тестируют стерильность среды, разбавителя и материала, сделав холостой опыт с образцом стерильной воды для каждой серии проб.

Результаты

Результаты выражают в единицах, образующих колонии/мл – UFC/мл (вместо микроорганизм/мл, потому что каждая колония может происходить как из одного микроорганизма, так и от нескольких микроорганизмов), в научном обозначении с десятичным знаком (например 1100 выражают как "1,1×10³ UFC/мл").

Если количество колоний оценивают на глаз, то результаты выражают в UFCE/мл (E - приблизительно).

Подсчитывают пластины, содержащие 30–300 колоний. Подсчитывают UFC/мл, умножая среднее арифметическое количество колоний на коэффицент разбавления. Указывают продолжительность инкубационного периода.

Правила для вычисления UFC с подсчетом и оценкой

1. Подсчитывают точно колонии каждого разбавления, содержащие от 30 до 300 колоний, и определяют их среднюю арифметическую величину.

2. Если ни одна из двух чашек одного разбавления не содержит от 30 до 300 колоний, рассчитывают среднюю арифметическую величину количества колоний для обеих чашек, соответствующих этому разбавлению.

3. Если два последовательных разбавления содержат от 30 до 300 колоний, подсчитывают среднюю арифметическую величину для расчета, при условии, что наибольшее количество не превосходит наименьшее в два раза. Если больше чем в два раза, используют наименьшее значение. Например: 150 (разбавление 10^-1) и 350 (разбавление 10^-2); соотношение 350/150 больше 2. Следовательно, используют наименьшее количество, то есть 150, и рассчитывают UFC/мл, умножая на фактор разбавления.

4. Если все чашки содержат менее 30 колоний, рассматривают только чашки с наименьшим разбавлением. Определяют среднюю арифметическую величину и представляют результаты приблизительно.

5. Если чашки ни одного из разбавлений не содержат колоний и если не присутствуют ингибиторы, число считается как "<1,0", по фактору наименьшего разбавления (умножают на коэффициент разбавления и представляют приблизительные результаты). Например: если в разбавлении 10^-2 (наименьшее) нет колоний, результат будет выражен как "< 1,0 × 10² UFCE /мл").

6. Если все чашки содержат более 300 колоний, рассматривают расчет, близкий к 300 колониям. Таким образом, учитывают только чашки с наибольшим разбавлением и представляют результаты приблизительно.

7. Если количество колоний в чашке значительно превышает 300, результаты не выражают как "TNTC" (too numerous to count). Если меньше 10 колоний/см², считают в 13 квадратах (счетчиком колоний). Определяют среднюю арифметическую величину квадрата и умножают на соответствующий фактор для подсчета колоний в чашке. Аналогично, когда имеют более 10 колоний/см², рассчитывают их число в 4 характерных квадратах, определяют среднюю арифметическую величину для каждого квадрата и производят расчет как указано выше. Для чашки площадью 57 cм² фактор равен 57 и для чашки с площадью 65 см² - 65.

8. В случае перезаселения в чашках более 100 колоний/см², выражают результат в виде оценки. Для расчета умножают 5700 или 6500 на наиболее высокий фактор разбавления. Например, для разбавления 10^-3 UFCE будет выражен как "> 5,7 × 10⁶ UFCE/мл" или "> 6,5 × 10⁶ UFCE/мл".

3.1.2. Методы фильтрации при помощи мембраны

Цель

Цель метода - осуществить расчет микроорганизмов при слабой микробиальной заселенности. Производят концентрирование микроорганизмов, которые удерживаются на фильтрующей мембране соответствующей пористости после фильтрации определенного объема образца.

Материалы

Кроме вышеперечисленного материала используют:

вакуумный насос или аналогичный прибор;

фильтровальную систему (фильтр и воронка) для мембраны диаметром 47 мм. Может быть из нержавеющей стали или стекла Pyrex, из аутоклавируемой или стерильной неавтоклавируемый  пластмассы;

платформу для фильтрации или вакуумную колбу;

ловушку между колбой и вакуумным насосом;

пинцет для фиксации;

пинцет с закругленными краями для мембран;

щипцы для схватывания фильтровальной системы во время стерилизации (прокаливанием или погружением в кипящую воду);

сосуд из нержавеющей стали для стерилизации фильтровальной системы в кипящей воде;

фильтрующие мембраны из эфиров целлюлозы с диаметром 47 мм, с гидрофобными краями, предпочтительно белые, разбитые на квадраты с пористостью 0,2 µm, 0,45 µm или 0,8 µm. Предпочтительно используют стерильные мембраны в индивидуальных упаковках, поставляемые в торговлю. В противном случае стерилизуют в автоклаве при 121°C в течение 10 минут; чашки Петри из стекла Pyrex или пластмассы – 60 минут;

стерильные абсорбирующие тампоны.

Питательные среды (см. приложение № 5).

Ход работ

1. Подготовка пластин

Подготавливают необходимое количество чашек Петри с соответствующей питательной средой. Фильтрующие мембраны могут быть размещены на соответствующей агарной среде или на твердой поверхности – абсорбирующем тампоне, пропитанном подходящей жидкой питательной средой.

a) Чашки Петри с соответствующей твердой агарной средой (см. приложение № 5):

помещают в чашки Петри диаметром 60 мм примерно 6 мл, предварительно растопленной на водяной бане и охлажденной до 45°C. Оставляют затвердеть на плоской поверхности. Чашки переворачивают для их использования через 2-3 часа. Можно использовать готовые чашки при условии, что они не заражены и не высушены.

b) Чашки Петри с соответствующей жидкой средой (смотри приложение № 5) :

если используют жидкую питательную среду, мембраны устанавливаются в чашки Петри на абсорбирующий тампон, пропитанный жидкой средой.

Для приготовления чашек с жидкой питательной средой открывают чашку Петри и помещают внутрь абсорбирующий стерильный тампон (необходимо иметь стерильные чашки с абсорбирующие стерильные тампоны). Используют в основном ампулы на 2 мл с соответствующей жидкой стерильной питательной средой, поставляемые торговлей, или их эквивалент. Из ампулы на 2 мл наливают примерно 1,8 мл на абсорбирующий тампон, равномерно распределяя на всей поверхности.

2. Фильтрование образца

Перед началом фильтрации фильтровальные устройства стерилизуют в автоклаве. Между фильтрациями нержавеющие или из стекла Pyrex установки сбрызгивают спиртом и проносят через пламя горелки Бунзена или погружают в кипящую воду на 5 минут. Для пластмассового оборудования можно использовать альтернативные средства стерилизации, такие как ультрафиолетовое излучение с выдержкой в течение 2 минут, а также другие соответствующие химические или физические реагенты.

Помещают ловушку между колбой для отсасывания и вакуумным насосом. Присоединяют фильтровальную систему к отсасывающей колбе. Закрепляют воронку на фильтровальной подставке при помощи фиксирующего зажима. Вводят несколько миллилитров стерилизованной воды для хорошего сцепления мембраны с фильтрующей подставкой и оставляют полностью стечь.

С помощью прокаленного и заранее охлажденного пинцета извлекают из стерильной упаковки фильтрующую мембрану с соответствующей пористостью. Помещают мембрану на фильтрующую основу в центр сеткой вверх.

Вводят подходящий объем гомогенизированного образца с предполагаемой заселенностью. Число колоний, удобное для подсчета, должно находится между 20 и 200. Идеальное значение, чтобы иметь возможность хорошо их различить, – это 60–80 колоний.

После фильтрации осторожно отсоединяют вакуум для исключения обратного оттока. (Фильтрующий объем обычно варьирует от 25 до 500 мл. Необходимо всегда наливать известный объем образца. В случае, если объем образца меньше 20 мл, добавляют при помощи стерильной воронки некоторый объем стерилизованной воды таким образом, чтобы покрыть мембрану, а затем стерилизованной пипеткой вводят образец для фильтрования.)

Отсоединят воронку, захватывают прокаленным и охлажденным пинцетом мембрану и помещают ее на питательную среду жидкой культуры в чашке Петри сеткой вверх. Избегают образования пузырьков воздуха между мембраной и средой, которые могут помешать однородному контакту и, следовательно, правильному микробиальному развитию.

Переворачивают чашку и помещают в термостат на время и в условиях, необходимых для развития микроорганизмов, которых хотим обнаружить.

Для дрожжей:

используют фильтрующие мембраны с пористостью 0,45 или 0,8µм, агарную среду YEPD (см. приложение № 5) и инкубируют в аэробиозе при температуре 20-25°C в течение 3-10 дней. (Для подсчета дрожжей достаточна инкубация в течение 3 дней. Если предполагается присутствие Dekkera Brettanomyces, инкубационный период должен занять7-10 дней.)

Для молочных бактерий:

используют фильтрующие мембраны с пористостью 0,2 или 0,45 µм, соответствующую агарную культурную среду (смотри приложение 5), инкубируют в анаэробиозе или микроаэрофилии при 25°C. Продолжительность инкубации может занять 10 дней.

Для уксусных бактерий:

используют фильтрующие мембраны с пористостью 0,2 или 0,45 µм, соответствующую агарную культурную среду (см. приложение № 5), инкубируют в аэробиозе при 25-30°C в течение 2-4 дней.

Подсчитывают развившиеся колонии невооруженным глазом, при помощи лупы или счетчика колоний. В случае сомнений идентичность колоний (дрожжи или бактерии) подтверждают под микроскопом.

Тестируют стерильность среды, фильтрующих мембран и материала, сделав холостой опыт с образцом стерильной воды для каждой серии.

Результаты

Выражают результаты в единицах, образующих колонии/мл - UFC/мл (вместо микроорганизм/мл, потому что каждая колония может происходить как от одного микроорганизма, так и от нескольких микроорганизмов). При фильтрации большого объема вина и малом числе развившихся колоний микроорганизмов, можно представить результаты относительно использованного объема.

Если не имело место развитие колоний и нет ингибиторов, расчет можно считать как "<1,0 UFC" по большему фильтрованному объему вина.

Подсчитывают все колонии на мембране, когда на квадрате находятся 1-2 колонии. В случае чрезмерного числа колоний на мембране следует повторить анализ, с использованием меньшего количества образца. Если число колоний слишком высоко – более 200, можно подсчитать, когда колонии не соприкасаются друг с другом и их распределение можно считать характерным. Если это невозможно, выражают результаты как "TNTC" (too numerous tocount).

Учитывают пористость использованной мембраны и продолжительность инкубации.

3.2. Культура в жидкой среде - "наиболее вероятное число" (NPP)

Цель

Цель метода – оценить число жизнеспособных микроорганизмов в вине, имеющем высокое содержание твердых частиц, суспензии и/или высокие показатели засорения.

Принцип

Техника основана на определении количества жизнеспособных микроорганизмов в жидкой среде, исходя из принципа их нормального распределения в образце.

Разбавители и жидкая среда культур (см. приложения № 4 и 5).

Ход работы

Готовят несколько количественных последовательных разбавлений. После инкубации этой серии разбавлений некоторая часть проб не дает рост микроорганизмов (отрицательные пробы), другая часть находится в стадии развития микроорганизмов (положительные пробы).

Если образец и разбавления являются гомогенными и количество разбавлений достаточно большое, то возможна статистическая обработка результатов, используя соответствующие таблицы (таблицы, основанные на вычислении вероятностей McCrady) и обобщают результат относительно исходной пробы.

Приготовление разбавлений

Из образца гомогенизированного вина готовят серию десятичных разбавлений (1:10) в разбавителе. В первую пробирку помещают 1 мл вина и добавляют 9 мл разбавителя. Перемешивают. Во вторую пробирку помещают 1 мл из первой пробирки и добавляют 9 мл растворителя. Разбавляют до последнего подходящего разбавления, используя стерильные пипетки для каждого разбавления. Выполняют разбавления до отсутствия развития микроорганизмов в последнем разбавлении (см. схему приложения № 2).

Приготовление инокуляции

Вносят по 1 мл вина и по 1 мл из каждого приготовленного на данный момент разбавления, в три пробирки с соответствующей питательной культурной средой (см. приложение № 5). Перемешивают. Инокулируют пробирки в термостате при температуре 25°C, для дрожжей (от 3 до 10 дней), в аэробиозе, для молочных бактерий – в анаэробиозе или микроаэрофилии (от 8 до 10 дней), периодически наблюдая до последнего инкубационного дня.

Результаты

Считают положительными все пробирки, в которых образовался беловатый осадок и/или помутнение, свидетельствующие о микробиальном развитии. Подтверждают результаты при помощи микроскопа. Необходимо указать продолжительность инкубации.

Записывают количество положительных и отрицательных пробирок для каждой из комбинаций из трех пробирок (каждого разбавления). Например, "3-1-0" означает: три положительные пробирки при разбавлении 10⁰ (вино), одна при разбавлении 10^-1 и ноль при разбавлении 10^-2.

Для количества разбавлений более трех будут иметь значение только три результата. Чтобы выбрать результаты и использовать их в определении "NPP", необходимо определить "характерное число" согласно примерам в таблице, приведенной ниже.

Расчет наиболее вероятного количества (NPP)

Принимая в расчет полученное характерное число, определяем NPP по таблице А (приложение № 3), основываясь на теории вероятности McCrady, учитывая выполненное разбавление. Если концентрация равна 10⁰, 10^-1, 10^-2, показания прямые. Если концентрация 10¹, 10⁰, 10^-1, показания умножают на 0,1, если концентрация 10⁰, 10^-2, 10^-3, показания умножают на 10.

При необходимости, в случае повышения уровня обнаружения, можно использовать концентрацию вина 10¹. Для получения этой концентрации микроорганизмов в 1 мл центрифугируют 10 мл вина и отбирают 1 мл осадка (после того как отобрали 9 мл отстоявшейся жидкости), затем инокулируют согласно ранее описанному методу.

Выражение результатов

Содержание микроорганизмов в вине должно быть представлено количеством зародышей в миллилитре с десятичным знаком. Если содержание ниже 1,0 зародыша в 1 мл, то результат выражают как "< 1,0 зародыш/мл".

Приложение № 4 - (OENO 8/95)

Разбавители

Разбавители указаны в качестве примера.

Используемая вода должна быть дистиллированной, бидистиллированной или деионизированной, без следов металлов, ингибиторов или других антимикробных веществ.

1. Физиологическая вода: в мерную колбу на 1000 мл помещают 8,5 г хлористого натрия. После растворения в воде доводят объем до уровня. Перемешивают. Фильтруют. Распределяют по 9 мл по пробиркам. Закупоривают ватным тампоном и автоклавируют 20 минут при 121°C.

2. Ополаскивающий раствор 1/4: в мерную колбу на 1000 мл помещают 2 250 г хлористого натрия, 0,105 г хлористого калия, 0,120 г хлористого кальция (CaC₂×6H₂O), 0,050 г бикарбоната натрия. После растворения в воде доводят до уровня. Перемешивают. Распределяют по 9 мл по пробиркам. Закупоривают ватным тампоном и автоклавируют 15 минут при 121°C.

Приложение № 5 - (OENO 8/95)

Культурные среды

Культурные и антимикробиальные среды приведены в качестве примера.

Используемая вода должна быть дистиллированной, бидистиллированной или деионизированной, без следов металлов, ингибиторов или других антимикробных веществ.

1. Культурные среды твердые

1.1. Для дрожжей:

Среда YEPD (Дрожжевой экстракт, пептон, декстроза), агар + хлорамфеникол

Подготовка: в 1000 мл колбу Эрленмейера взвешивают 10 г дрожжевого экстракта (Difco или эквивалент), 20 г пептона, 20 г глюкозы и 100 мг хлорамфеникол. Растворяют в 450 мл воды.

Отдельно растворяют 20 г агара на 500 мл воды в колбу на 1000 мл, помещают в горячую баню, часто помешивая и избегая длительного нагрева. После полного растворения добавляют предыдущий раствор, объем дополняют до 1000 мл водой и перемешивают. Распределяют в пробирках Буше по 15 мл (для подсчета на пластинах) и по 6 мл (для подсчета при мембранной фильтрации). Закупоривают ватным тампоном и автоклавируют в течение 15 минут при 121°C.

Вместо хлорамфениколана поверхность при распределении среды может быть добавлен пенициллин 20 U/мл и стрептомицин 40 U/мл.

1.2. Для молочнокислых бактерий:

Среда Lafon-Lafurcade и др., агар + актидион

Подготовка: в 1000 мл колбу Эрленмейера взвешивают 5 г дрожжевого экстракта, 10 г мясного экстракта, 15 г триптического пептона, 5 г ацетата натрия, 2 г цитрата аммония, 0,05 г сульфата марганца, 0,2 г сульфата магния, 20 г глюкозы, 50 мг актидиона. Растворяют в 400 мл воды, доводят рН до 5,4 раствором гидроксида натрия 1 N или 1 N раствором соляной кислоты. Добавляют 1 мл Tween 80.

Отдельно, в колбе на 1000 мл, растворяют 20 г агара в 500 мл воды, помещают в горячую баню, часто помешивая, избегая длительного нагрева. После полного растворения добавляют предыдущий раствор и объем дополняют до 1000 мл водой. Перемешивают и распределяют в пробирках Буше по 15 мл (для подсчета на пластинах) и по 6 мл (для подсчета при мембранной фильтрации). Закупоривают ватным тампоном и автоклавируют в течение 20 минут при 121°C.

Среда Dubois (среда 104), агар + актидион

Подготовка: в колбу Эрленмейера на 1000 мл взвешивают 5 г дрожжевого экстракта (Difco), 5 г пептона, 3 г L-яблочной кислоты, 0,05 г сульфата магния, 0,05 г сульфата марганца, 50 мг актидиона. Растворяют в 200 мл воды. Добавляют 250 мл томатного сока, доводят рН до 4,8 раствором гидроксида натрия 1 N или 1 N соляной кислоты. Добавляют каплю Tween 80.

Отдельно, в колбе на 1000 мл, растворяют 20 г агара в 500 мл воды, помещают в горячую баню, часто помешивая, избегая длительного нагрева. После полного растворения добавляют предыдущий раствор и дополняют до 1000 мл водой. Перемешивают и распределяют в пробирках Буше по 15 мл (для подсчета на пластинах) и по 6 мл (для подсчета при мембранной фильтрации). Закупоривают ватным тампоном и автоклавируют в течение 20 минут при 121°C.

Среда TJB (Tomato Luice Broth),) агар + актидион

Подготовка: в колбу Эрленмейера на 1000 мл взвешивают 5 г глюкозы, 2 г триптона (Difco), 5 г пептона (Difco), 5 г дрожжевого экстракта (Difco), 1 г экстракта печени и 50 мг актидиона. Растворяют в 400 мл томатного сока. Доводят рН до 5,5 раствором гидроксида натрия 1 N или 1 N соляной кислоты. Добавляют каплю Tween 80.

Отдельно, в колбе на 1000 мл, растворяют 20 г агара в 500 мл томатного сока, помещают в горячую баню, часто помешивая избегая перегрева. После полного растворения добавляют предыдущий раствор и дополняют до 1000 мл томатным соком.

Перемешивают и распределяют в пробирках Буше по 15 мл (для подсчета на пластинах) и по 6 мл (для подсчета при мембранной фильтрации). Закупоривают ватным тампоном и автоклавируют в течение 20 минут при 121°C.

Томатный сок разбавляют в 4,2 раза и фильтруют через Watman № 1 (1000 мл).

1.3. Для уксуснокислых бактерий

Среда G2 агар + актидион

Подготовка: в колбу Эрленмейера на 1000 мл взвешивают 1,2 г дрожжевого экстракта, 2 г фосфата аммония, 50 мг актидион. Добавляют 500 мл яблочного сока и доводят рН до 5 раствором гидроксида натрия 1 N или раствором 1 N соляной кислоты.

Отдельно, в колбе на 1000 мл, растворяют 20 г агара в 450 мл воды, помещают в горячую баню, часто помешивая избегая длительного нагрева. После полного растворения добавляют предыдущий раствор и дополняют до 1000 мл водой. Перемешивают и распределяют в пробирках Буше по 15 мл (для подсчета на пластинах) и по 6 мл (для подсчета при мембранной фильтрации). Закупоривают ватным тампоном и автоклавируют в течение 20 минут при 121°C.

Среда Carr, агар + актидион

Подготовка: в колбу Эрленмейера на 1000 мл взвешивают 30 г дрожжевого экстракта (Difco), 50 мг актидиона. Растворяют в 500 мл воды, добавляют 1 мл 2,2% бромкрезолового зеленого.

Отдельно растворяют 20 г агара в 450 мл воды в колбе на 1000 мл, помещают в горячую баню, часто помешивая, избегая длительного нагрева. После полного растворения добавляют предыдущий раствор и дополняют до 1000 мл водой. Перемешивают и распределяют в пробирках Буше по 15 мл (для подсчета на пластинах) и по 6 мл (для подсчета при мембранной фильтрации) Закупоривают ватным тампоном и автоклавируют в течение 20 минут при температуре 121°C.

После разжижения и охлаждения до 45°С добавляют в среду 20 мл спирта на литр, стерилизуют путем фильтрации (мембраны поливинилиденфторид) и перемешивают.

 2. Жидкие культурные среды

2.1. Для дрожжей

Среда YEPD (Дрожжевой экстракт, пептон, декстроза) + хлорамфеникол

Подготовка: в колбу Эрленмейера на 1000 мл взвешивают 10 г дрожжевого экстракта (Difco или эквивалент), 20 г пептона, 20 г глюкозы и 100 мг хлорамфеникола. Растворяют, доводят до 1000 мл водой и перемешивают.

Распределяют в пробирках по 5 мл и автоклавируют в течение 15 минут при 121°C.

2.2. Для молочнокислых бактерий

Среда MTJ (50% среды MRS "Lactobacilli Man Rogosa and Sharpe Broth" + 50% среды TJB "Tomato Luice Broth") + актидион

Подготовка: в колбу Эрленмейера на 1000 мл взвешивают 27,5 г MRS "Lactobacilli Man Rogosa and Sharpe Broth", добавляют 500 мл воды, нагревают до кипения для полного растворения, добавляют 20,5 г среды TJB "Tomato Luice Broth" и 50 мг актидиона. Дополняют до 1000 мл водой и после доведения рН до 5,5 раствором 1 N соляной кислоты перемешивают. Распределяют в пробирках по 10 мл и автоклавируют в течение 15 минут при 121°C.

Используют 10 мл вместо 5 мл (в случае дрожжей) из-за повышенной чувствительности молочнокислых бактерий к кислороду.

42. Аллилизотиоцианат

42.1 Аллилизотиоцианат

1. Сущность метода

Аллилизотиоцианат, возможно присутствующий в вине, выделяют путем перегонки и идентифицируют методом газовой хроматографии.

2. Реактивы:

абсолютный этиловый спирт;

стандартный раствор: раствор аллилизотиоцианата в абсолютном спирте, содержащий 15 мг аллилизотиоцианата на литр;

охлаждающая смесь, состоящая из этанола и углекислого льда, температура (- 60)°C.

3. Aппаратура:

аппарат для перегонки, рис.7. Через аппарат проходит непрерывный поток азота.

Терморегулируемая нагревательная поверхность;

расходомер;

газовый хроматограф со спектрофотометрическим детектором, снабженным фильтром-разделителем для серосодержащих соединений (длина волны λ = 394 нм) или любым подходящим детектором;

хроматографическая колонка из нержавеющей стали, с внутренним диаметром 3 мм и длиной 3 м, заполненная 10% Carbowax 20 M на Cromosorb WHP, 80-100 меш;

микрошприц на 10 мкл.

4. Meтодика определения

Помещают 2 л вина в перегонную колбу, вводят несколько миллилитров спирта в две коллекторные трубки так, чтобы пористые части колец, предназначенных для дисперсии газа, были полностью погружены. Охлаждают снаружи обе трубки охлаждающей смесью. Соединяют колбу с коллекторными трубками и направляют в аппарат поток азота при дебите три литра в час. Нагревают вино до 80°C, регулируя температуру нагревательной поверхности, дистиллируют и собирают 45-50 мл дистиллята.

Рекомендуется использовать следующие условия:

температура инжектора – 200°C,

температура колонки – 130°C,

поток газа-носителя гелия – 20 мл/минуту.

Вводят с помощью микрошприца такой объем стандартного раствора, чтобы пик, соответствующий аллилизотиоцианату, мог быть легко идентифицирован на хроматограмме.

Таким же образом вводят в хроматограф пробу дистиллята. Проверяют если время удерживания полученного пика соответствует пику стандартного раствора аллилизотиоцианата.

В условиях, описанных выше, ни один из натуральных компонентов вина не дает пиков, имеющих время удерживания, аналогичное времени удерживания аллилизотиоцианата.

Рис.7. Аппарат для перегонки в токе азота

43. Специальные методы анализа сусла концентрированного ректификованного

Общее содержание катионов

1. Сущность метода

Пробу обрабатывают катионообменной смолой высокой кислотности. Катионы обмениваются на H⁺. Общие катионы выражаются разностью между общей кислотностью вытекающей жидкости и общей кислотностью пробы.

2. Аппаратура:

стеклянная колонка внутренним диаметром 10-11 мм и длиной приблизительно 300 мм, снабженная краном;

pH-метр, со шкалой, градуированный в единицах не менее чем до 0,1 рН.

Электроды:

стеклянный электрод, который хранят в дистиллированной воде;

эталонный электрод каломель/хлористый калий, который хранят в насыщенном растворе хлористого калия;

комбинированный электрод, который хранят в дистиллированной воде;

3. Реактивы:

катионообменная смола высокой кислотности, в форме Н⁺, замачиваемая в воде на ночь для набухания;

0,1 М раствор гидроксида натрия;

индикаторная бумага, рН.

4. Методика определения

4.1. Подготовка пробы

Используют раствор, полученный разбавлением ректификованного концентрированного сусла до 40% (m/v), как указано в разделе "Общая кислотность", пункт 5.1.2.

4.2. Подготовка ионообменной колонки

В колонку помещают примерно 10 мл ионообменной смолы в форме H⁺. Колонку прополаскивают дистиллированной водой до удаления остатков кислоты, используя для этого бумажный индикатор.

4.3. Обмен ионов

Через колонку пропускают 100 мл раствора ректификованного концентрированного сусла, подготовленного, согласно пункту 4.1, по 1 капле в секунду. Собирают вытекающую жидкость в лабораторный стакан. Промывают колонку 50 мл дистиллированной воды. Титруют кислотность вытекающей жидкости (включая воду для промывки) 0,1 М раствором гидроксида натрия до рН, равном 7 при 20 °С. Щелочной раствор следует приливать осторожно при постоянном перемешивании. Обозначают через n мл объем использованного 0,1 М раствора гидроксида натрия.

5. Выражение результатов

Содержание общих катионов выражают в миллиграмм-эквивалентах на килограмм общих сахаров с точностью до десятичного знака.

5.1. Расчеты

Кислотность вытекающей жидкости выражается в миллиграмм-эквивалентах на килограмм ректификованного концентрированного сусла:

E = 2,5 n

Общая кислотность ректификованного концентрированного сусла, в миллиграмм-эквивалентах на килограмм (смотри раздел "Общая кислотность" пункт 6.1.2):

Общие катионы, в миллиграмм-эквивалентах на килограмм общих сахаров:

(2,5n-a) / P × 100,

где P - содержание общих сахаров в процентах (m/m).

Проводимость

1. Принцип метода

Измерение электрической проводимости столба жидкости между двумя параллельными платиновыми электродами, составляющими одно из плечей моста Уитстона. Проводимость изменяется в зависимости от температуры. Ниже проводимость выражают при 20°C.

2. Аппаратура:

кондуктометр для измерений проводимости в области от 1-1000 микро-сименс на сантиметр (µS/cm^-1);

водяная баня для термостатирования анализируемых проб примерно при 20°C (20 ± 2°C).

3. Реактивы:

деминерализованная вода с удельной проводимостью менее 2 µS/cm^-1 при 20°C;

эталонный раствор хлорида калия: растворяют 0,581 г хлорида калия (KC1), предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 105°C, в деминерализованной воде. Дополняют объем до одного литра деминерализованной водой. Этот раствор имеет проводимость 1000 µS/cm^-1 при 20°C. Раствор не должен храниться более 3 месяцев.

4. Методика определения

4.1.Подготовка пробы к анализу

Используют раствор с содержанием общих сахаров 25% (m/m) (25° Brix), как указано в разделе "Ионная кислотность (pH)", пункт 4.1.2.

 4.2. Определение проводимости

Доводят температуру анализируемой пробы до 20°C погружением в водяную баню. Держат температуру в интервале ± 0,1°C. Споласкивают два раза ячейку кондуктометра анализируемым раствором. Измеряют проводимость и выражают результат в µS/cm^-1.

5. Выражение результатов

Результаты для 25% (m/m) (250 Brix) раствора ректификованного концентрированного сусла выражают в микро-сименс на сантиметр (µS/cm^-1) при 20°C целым числом.

5.1. Расчеты

Если прибор не имеет устройства для контроля температуры, проводимость корректируют используя приведенную ниже таблицу. Если температура ниже 20°C – поправку добавляют, если температура выше 20°C – поправку отнимают.

Температурные поправки проводимости для температур, отличных от 20°C, (µS/cm^-1)

Оксиметилфурфурол (ОМФ)

1. Сущность методов

1.1. Колориметрический метод

Альдегидные производные фурана, основным из которых является оксиметрилфурфурол, вступают в реакцию с барбитуровой кислотой и паратолуидином, образуя соединение красного цвета, которое определяют колориметрией при 550 нм.

1.2. Метод высокоэффективной  жидкостной хроматографии (HPLC)

Разделяют на хроматографической колонке с обратной фазой и определяют при 280 нм.

2. Колориметрический метод

2.1. Аппаратура:

спектрофотометр для проведения измерений между 300-700 нм;

стеклянные кюветы с оптическим путем 1 см.

2.2. Реактивы:

раствор барбитуровой кислоты, 0,5 %, (m/v): растворяют 500 мг барбитуровой кислоты (С₄О₃N₂H₄) в дистиллированной воде и слегка нагревают на водяной бане при 100°C. Дополняют объем до 100 мл дистиллированной водой. Раствор хранят примерно неделю;

раствор паратолуидина, 10%, (m/v): помещают 10 г паратолуидина C₆H₄(CH₃)NH₂ в мерную колбу на 100 мл; добавляют 50 мл изопропанола CH₃CH(OH)CH₃ и 10 мл ледяной уксусной кислоты CH₃COOH (ρ20 = 1,05 г/мл). Дополняют объем до 100 мл изопропанолом. Раствор должен обновляться ежедневно;

водный раствор ацетальдегида, CH₃CHO, 1%, (m/v), готовят непосредственно перед использованием;

эталонный водный раствор оксиметрилфурфурола C₆O₃H₆, 1 г/л.

Последовательно готовят эталонные растворы, содержащие 5, 10, 20, 30 и 40 мг/л оксиметилфурфурола разбавлением раствора концентрацией 1 г/л. Все растворы должны быть свежеприготовленными.

2.3. Метод определения

2.3.1. Подготовка пробы

Используют раствор, полученный разбавлением до 40% (m/v) ректификованного концентрированного сусла, как указано в разделе "Общая кислотность". Для определения используют 2 мл этого раствора.

2.3.2. Колориметрическое определение

В две мерные колбы с притертой пробкой на 25 мл (а и b), помещают 2 мл пробы, подготовленной, согласно пункту 2.3.1. В каждую колбу вносят по 5 мл раствора паратолуидина; перемешивают. Добавляют в колбу b (контроль) 1 мл дистиллированной воды, а в колбу а (анализируемая проба) 1мл раствора барбитуровой кислоты . Перемешивают для гомогенизации. Переносят содержимое колб в кюветы спектрофотометра с оптическим путем 1 см. Устанавливают на ноль шкалу абсорбции по содержимому колбы b при длине волны 550 нм. Следят за изменением абсорбции содержимого колбы а; отмечают максимальную величину А, которая достигается в период между 2-5 минутами.

Пробы, содержащие оксиметрилфурфурола выше 30 мг/л, следует перед анализом разбавить.

2.3.3. Калибровочная кривая

Помещают по 2 мл каждого из растворов оксиметрилфурфурола, содержащих 5, 10, 20, 30 и 40 мг/л в две серии колб на 25 мл а и b, и обрабатывают согласно пункту 2.3.2. Калибровочная кривая изменения абсорбции в зависимости от концентрации оксиметрилфурфурола в миллиграммах на литр ( мг/л), представлена прямой, проходящей через начало координат.

2.4. Выражение результатов

Содержание оксиметрилфурфурола в ректификованном концентрированном сусле выражается в миллиграммах на килограмм (мг/кг) общих сахаров.

2.4.1. Способ расчета

Концентрация оксиметрилфурфурола C в миллиграммах на литр (мг/л) в анализируемой пробе определяют, отложив на калибровочной кривой величину абсорбции А, измеренную на этой пробе.

Концентрация оксиметрилфурфурола в миллиграммах на килограмм (мг/кг) общих сахаров:

250 × C/P,

где P - содержание в процентах (m/m) общих сахаров в ректификованном концентрированном сусле.

3. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC)

3.1. Аппаратура:

жидкостной хроматограф, укомплектованный:

инжектором с петлей 5 или 10 мкл;

спектрофотометрическим детектором для измерений при 280 нм;

колонкой с силикагелем и октадецилом (например, Bondapak C18 - Corasil, Waters Ass).

Расход мобильной фазы:1,5 мл/минуту.

Аппарат с мембраной для фильтрации с диаметром пор 0,45 µm.

3.2. Реактивы:

бидистиллированная вода;

метанол дистиллированный, CH₃ОH или качества HPLC;

Уксусная кислота, CH₃COOH, (ρ₂₀ = 1,05 г/мл);

мобильная фаза:вода:метанол:уксусная кислота, (40:9:1 v/v), предварительно фильтрованная через мембрану (0,45 µm). Мобильную фазу подготавливают ежедневно и перед применением дегазируют.

Эталонный раствор оксиметрилфурфурола, 25 мг/л: в мерную колбу на 100 мл помещают точно взвешенные 25 мг оксиметрилфурфурола (C₆H₃О₆) и доводят до метки метанолом. Разбавляют этот раствор 1:10 метанолом и фильтруют через мембрану (0,45 µm). Раствор хранят в холодильнике в темной склянке 2-3 месяца.

3.3. Методика определения

3.3.1. Подготовка пробы

Используют раствор ректификованного концентрированного сусла, разбавленный до 40% (m/v), как указано в разделе "Общая кислотность", и фильтруют через мембрану 0,45 µm.

3.3.2. Хроматографическое определение

Инжектируют в хроматограф 5 (или 10) µl пробы, подготовленной согласно пункту 3.3.1 и 5 (или 10) µl эталонного раствора оксиметрилфурфурола. Регистрируют хроматограмму. Время удерживания оксиметрилфурфурола составляет около 6-7 минут.

3.4. Выражение результатов

Содержание оксиметрилфурфурола в ректификованном концентрированном сусле выражают в миллиграммах на килограмм (мг/кг) общих сахаров.

3.4.1. Способ расчета

Концентрация оксиметрилфурфурола C в 40%-ом (m/v) растворе ректификованного концентрированного сусла в миллиграммах на килограмм (мг/кг) общих сахаров составляет:

250 × C/P,

где P - содержание в процентах (m/m) общих сахаров в ректификованном концентрированном сусле.

Тяжелые металлы

1. Сущность методов

1.1. Ускоренный метод оценки тяжелых металлов

Присутствие тяжелых металлов в ректификованном концентрированном сусле, разбавленном соответствующим образом, устанавливают по окраске, которая появляется при образовании сернистых соединений. Содержание тяжелых металлов оценивают сравнением с эталонным раствором свинца, соответствующим максимально допустимому содержанию.

1.2. Определение содержания свинца методом атомной абсорбционной спектрофотометрии

Хелатное соединение, которое образует свинец с пирролидиндитиокарбаматом аммония, экстрагируют с помощью метилизобутилкетона и абсорбцию измеряют при 283,3 нм. Содержание свинца определяют по стандартным растворам.

2. Ускоренный метод оценки содержания тяжелых металлов

2.1. Реактивы:

разбавленная соляная кислота, 70% (m/v): отбирают 70 г соляной кислоты HC1 (ρ₂₀ = 1,16-1,19 г/мл) и дополняют водой до 100 мл;

разбавленная соляная кислота, 20% (m/v)): отбирают 20 г соляной кислоты HC1 (ρ₂₀ = 1,16-1,19 г/мл) и дополняют водой до 100 мл;

разбавленный аммиак: отбирают 14 г аммиака NH₃ (ρ₂₀ = 0,931-0,934 г/мл) и дополняют водой до 100 мл;

буферный раствор pH 3,5: растворяют 25 г ацетата аммония, CH₃COONH₄, в 25 мл воды и добавляют 38 мл разбавленной соляной кислоты (70%). Необходимую величину pH устанавливают с помощью разбавленной соляной кислоты (20%) или разбавленного аммиака и дополняют водой до 100 мл;

раствор тиоацетамида C₂H₅SN, 4% (m/v);

раствор глицерина C₃H₈О₃, 85% (m/v), (nD ^20°С = 1,449 - 1,455);

реактив тиоацетамид: к 0,2 мл раствора тиоацетамида добавляют 1 мл смеси из 5 мл воды, 15 мл 1M раствора гидроксида натрия и 20 мл глицерина. Нагревают на водяной бане при 100°C в течение 20 секунд. Готовят непосредственно перед применением;

раствор свинца концентрацией 0,002 г/л: готовят раствор свинца 1г/л, растворяя в воде 0,400 г нитрата свинца Pb(NО₃)₂ и дополняя объем водой до 250 мл. Разбавляют полученный раствор водой непосредственно перед анализом: 2 мл на 1000 мл с целью получения раствора 0,002 г/л.

2.2. Методика определения

В 10 мл воды растворяют 10 г ректификованного концентрированного сусла. Добавляют 2 мл буферного раствора рН 3,5; смешивают. Добавляют 1,2 мл реактива тиоацетамид. Снова перемешивают. Готовят контроль в тех же условиях, используя 10 мл раствора свинца 0,002 г/л. Через 2 минуты раствор ректификованного концентрированного сусла окрашивается в коричневый цвет. Интенсивность окраски не должна быть больше, чем у контроля.

2.3. Расчет

В аналогичных вышеописанных условиях контрольный образец соответствует максимально допустимой концентрации тяжелых металлов, в пересчете на свинец 2 мг/кг ректификованного концентрированного сусла.

3. Определение содержания свинца методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии

3.1. Аппаратура:

атомный абсорбционный спектрофотометр, оборудованный воздушно-ацетиленовой горелкой;

катодная лампа для свинца.

3.2. Реактивы:

разбавленная уксусная кислота: отбирают 12 г ледяной уксусной кислоты (ρ₂₀ = 1,05 г/мл) и дополняют водой до 100 мл;

раствор пиролидиндитиокарбамата аммония C₅H₁₂N₂S₂, 1%, (m/v);

метилизобутилкетон (CH₃)₂CHCH₂COCH₃;

раствор свинца, 0,010 г/л: раствор свинца 1 г/л разбавляют в соотношении 1:100 (v/v).

3.3. Методика определения

3.3.1. Подготовка раствора к анализу

Растворяют 10 г ректификованного концентрированного сусла в смеси равных объемов разбавленной уксусной кислоты и воды и дополняют этой же смесью до 100 мл. Добавляют 2 мл раствора пиролидиндитиокарбамата аммония и 10 мл метилизобутилкетона. Перемешивают 30 секунд, защищая от яркого света. Оставляют до разделения на два слоя. Используют слой метилизобутилкетона.

3.3.2. Приготовление эталонных растворов

Готовят три эталонных раствора, содержащих помимо 10 г ректификованного концентрированного сусла 1, 2 и 3 мл раствора свинца 0,010 г/л. Обрабатывают так же, как анализируемый раствор.

3.3.3. Контроль

Контроль подготавливают в условиях, аналогичных указанным в пункте 3.3.1 для анализируемого раствора, но без добавления ректификованного концентрированного сусла.

3.3.4. Определение

Регулируют длину волны на 283,3 нм. Атомизируют в пламени метилизобутилкетон, взятый из контроля, и устанавливают нулевое показание на шкале абсорбции.

Определяют абсорбцию анализируемого раствора и эталонных растворов, применяя соответствующие экстрагирующие растворы.

3.4. Выражение результатов

Содержание свинца выражают в миллиграммах на килограмм (мг/кг) ректификованного концентрированного сусла с точностью до одного десятичного знака.

3.4.1. Расчет

Строят кривую зависимости абсорбции от концентрации свинца, добавленного в эталонные растворы; при этом нулевая концентрация соответствует анализируемому раствору.

Химический анализ этилового спирта

Данный метод используют для определения этилового спирта в слабоалкогольных жидкостях, таких как сусло, концентрированное сусло, ректификованное концентрированное сусло.

1. Сущность метода

Обычная перегонка жидкости. Окисление этанола в дистилляте бихроматом калия. Титрование избытка бихромата калия раствором железа (II).

2. Аппаратура

Используют аппараты для дистилляции, описанные в разделе 2 "Объемная доля этилового спирта при 20°С".

3. Реактивы:

раствор бихромата калия: растворяют 33,600 г бихромата калия K₂Cr₂O₇ в таком количестве воды, которое достаточно для получения одного литра раствора при 20°C. Один миллилитр раствора окисляет 7,8924 мг спирта;

раствор сульфата железа (II) и аммония: растворяют 135 г сульфата железа (II) и аммония FeSО₄ × (NH₄)₂SО₄ × 6H₂O в таком количестве воды, которое достаточно для получения одного литра раствора, и добавляют 20 мл концентрированной серной кислоты H₂SO₄ (ρ₂₀ = 1,84 g/ml). В дальнейшем раствор медленно окисляется;

раствор перманганата калия: растворяют 1,088 г перманганата калия KMnO₄ в таком количестве воды, которое достаточно для получения одного литра раствора;

серная кислота разбавленная: к 500 мл воды постепенно добавляют, постоянно помешивая, 500 мл серной кислоты H₂SO₄ (ρ₂₀ = 1,84 г/мл);

реактив ортофенантролина с двухвалентным железом: растворяют 0,695 г сульфата железа FeSО₄ × 7H₂O в 100 мл воды, добавляют 1,485 г моногидрата ортофенантролина C₁₂H₈N₂ × H₂O. Нагревают для ускорения растворения. Полученный раствор ярко-красного цвета очень хорошо хранится.

4. Методика определения

4.1. Дистилляция

В перегонную колбу помещают 100 г ректификованного концентрированного сусла и 100 мл воды. Дистиллят собирают в мерную колбу на 100 мл и дополняют водой до метки.

4.2. Окисление

В сосуд с притертой пробкой на 300 мл, с широким горлышком, что позволяет его промывать без потерь, помещают 20 мл титрованного раствора бихромата калия и 20 мл разбавленной серной кислоты и перемешивают. Добавляют 20 мл дистиллята. Закрывают сосуд и ожидают не менее чем 30 минут, периодически взбалтывая (сосуд "для испытания"). Титруют раствор сульфата железа (II) и аммония по отношению к раствору бихромата калия, поместив в идентичный сосуд те же количества реактивов, но заменив при этом 20 мл дистиллята на 20 мл дистиллированной воды (сосуд "контроль").

4.3. Титрование

К содержимому сосуда "для испытания" добавляют 4 капли реактива ортофенантролина. Титруют избыток бихромата калия раствором сульфата железа (II) и аммония. Титрование прекращают, когда окраска среды переходит от серо-голубого к коричневому цвету. Для получения более точной информации относительно окончания реакции с помощью перманганата калия меняют окрашивание от коричневого к серо-голубому. Вычитают десятую часть использованного объема этого раствора из добавленного объема раствора сульфата железа (II). Обозначают разность через n мл. Аналогичным образом действуют в отношении сосуда "контроль". Обозначают разность через n′ мл.

5. Выражение результатов

Этанол выражают в граммах на килограмм (г/кг) общих сахаров до десятичного знака.

5.1. Способ расчета

n′ мл железосодержащего раствора восстанавливают 20 мл раствора бихромата калия, которые окисляют 157,85 мг чистого этанола. Один миллилитр раствора железа (II) имеет ту же восстановительную способность, что и 157, 85/n′ мг этанола; (n - n′) мл раствора железа (II) имеют ту же восстановительную способность, что и 157,85(n- n′)/n′ мг этанола.

Концентрация этанола в граммах на килограмм (г/кг) ректификованного концентрированного сусла:

7,892 × (n′- n)/ n

Концентрация этанола в г/кг общих сахаров:

789,2 × (n′- n)/ n′ P,

где P- концентрация общих сахаров в процентах, (m/m).

Мезо-инозитол, сцилло-инозитол и сахара

1.Сущность метода

Газовая хроматография силановых производных.

2. Реактивы:

внутренний стандарт: ксилит (водный раствор примерно 10 г/л, к которому добавляют на кончике шпателя азид натрия);

бис(Триметилсилил)Трифлуероацетамид-BSTFA-(C₈H₁₈F₃NOSi₂);

триметилхлорсилан (C₃H₉CISi);

пиридин аналитически чистый (C₅H₅N);

мезоинозитол (C₆H₁₂O₆).

3. Аппаратура:

газовый хроматограф;

капиллярная колонка (например, из расплавленного кремния, покрытый OV 1, с толщиной пленки 0,15 pm, длиной 25 м и внутренним диаметром 0,3 мм).

Рабочие условия:

газ-носитель: водород или гелий;

расход газа-носителя: примерно 2 мл/минуту;

температура инжектора и детектора: 300°C;

программирование температуры: 1 минута 160°C, 4°C в минуту до 260°C, постоянная температура 260°C в течение 15 минут;

разделение потока 1:20;

интегратор;

микрошприц на10 мкл;

микропипетки на 50, 100 и 200 мкл; .

колбы с тефлоновой пробкой на 2 мл;

сушильный шкаф.

4. Методика определения

В мерную колбу на 50 мл помещают 5 г точно взвешенного ректификованного концентрированного сусла. Добавляют 1 мкл эталонного раствора ксилита и дополняют водой до метки. После гомогенизации пробы отбирают 100 мкл раствора, помещают в колбу с тефлоновой пробкой и высушивают под слабой струей воздуха. Для ускорения выпаривания можно добавить, при необходимости, 100 мкл чистого этилового спирта. Остаток тщательно растворяют в 100 мкл пиридина, добавляют 100 мкл бис (триметилсилил)трифлуероацетамид и 10 мкл триметилхлорсилана; закрывают колбу тефлоновой пробкой и греют в сушильном шкафу в течение одного часа при 60°C. Отбирают 0,5 мкл светлой жидкости и инжектируют горячей иглой в соответствии с вышеуказанным разделением потока.

5. Расчет результатов

Готовят раствор, содержащий: 60 г/л глюкозы, 60 г/л фруктозы, 1 г/л мезо-инозитола и 1 г/л сахарозы. Взвешивают 5 г этого раствора и действуют в соответствии с пунктом 4. На основании полученной хроматограммы определяют коэффициенты отклика мезо-инозитола и сахарозы по сравнению с ксилитом. Для сцилло-инозитола, не имеющегося в готовом виде, время удерживания находится между последним пиком аномерных форм глюкозы и пиком мезо-инозитола, применяют тот же коэффициент отклика, что и для мезо-инозитола.

6. Выражение результатов

Содержание мезо-инозитола и сцилло-инозитола выражают в миллиграммах на килограмм общих сахаров. Содержание сахарозы выражается в граммах на килограмм сусла.