Hotărâre nr. 414 din 02.07.2025

GUVERNUL REPUBLICII MOLDOVA

H O T Ă R Â R E

cu privire la aprobarea Regulamentului privind stabilirea

metodelor de referinţă pentru analiza băuturilor spirtoase

nr. 414  din  02.07.2025

 (în vigoare 10.09.2028) 

Monitorul Oficial al R. Moldova nr. 474-477 art. 582 din 10.09.2025

* * *

 UE

În temeiul art.17⁷ alin.(2) din Legea nr.1100/2000 cu privire la fabricarea şi circulaţia alcoolului etilic şi a producţiei alcoolice (republicată în Monitorul Oficial al Republicii Moldova, 2023, nr.126, art.197), cu modificările ulterioare, Guvernul

HOTĂRĂŞTE:

1. Se aprobă Regulamentul privind stabilirea metodelor de referinţă pentru analiza băuturilor spirtoase (se anexează).

2. Controlul asupra executării prezentei hotărâri se pune în sarcina Agenţiei Naţionale pentru Siguranţa Alimentelor.

3. Prezenta hotărâre intră în vigoare la expirarea a 36 de luni de la data publicării în Monitorul Oficial al Republicii Moldova.

Aprobat

prin Hotărârea Guvernului nr.414/2025

REGULAMENT

privind stabilirea metodelor de referinţă

pentru analiza băuturilor spirtoase

Prezentul Regulament transpune Regulamentul (CE) nr.2870/2000 al Comisiei din 19 decembrie 2000 de stabilire a metodelor comunitare de referinţă pentru analiza băuturilor spirtoase, CELEX: 32000R2870, publicat în Jurnalul Oficial al Uniunii Europene L 333 din 29 decembrie 2000, aşa cum a fost modificat ultima oară prin Regulamentul de punere în aplicare (UE) 2023/383 al Comisiei din 16 februarie 2023.

Capitolul I

DOMENIUL DE APLICARE

1. Metodele de referinţă pentru analiza băuturilor spirtoase şi a alcoolului etilic de origine agricolă, menţionate în anexă, asigură conformitatea cu Regulamentul privind definirea, descrierea, prezentarea şi etichetarea băuturilor ce conţin alcool, aprobat prin Hotărârea Guvernului nr.589/2023:

1.1. în cazul unui control oficial;

1.2. în eventualitatea unui diferend.

2. În sensul Regulamentului privind stabilirea metodelor de referinţă pentru analiza băuturilor spirtoase (în continuare – Regulament) următoarele noţiuni semnifică:

2.1. limită de repetabilitate – valoare mai mică sau egală pentru care se estimează o diferenţă absolută între două rezultate ale testării obţinute în condiţii de repetabilitate (acelaşi operator, aceeaşi aparatură, acelaşi laborator şi un interval scurt de timp), cu o probabilitate de 95% (SM ISO 3534-1);

2.2. limită de reproductibilitate – valoare mai mică sau egală pentru care se estimează o diferenţă absolută între două rezultate ale testării obţinute în condiţii de reproductibilitate (operatori diferiţi, aparatură diferită, laborator diferit), cu o probabilitate de 95% (SM ISO 3534-1);

2.3. precizie – grad de conformitate dintre rezultatul unui test şi valoarea de referinţă acceptată (SM ISO 3534-1).

Capitolul II

DISPOZIŢII GENERALE

3. Prezentul Regulament se aplică alcoolului etilic de origine agricolă şi băuturilor spirtoase, astfel cum sunt definite la art.1 din Legea nr.1100/2000 cu privire la fabricarea şi circulaţia alcoolului etilic şi a producţiei alcoolice şi în anexa nr.2 la Regulamentul privind definirea, descrierea, prezentarea şi etichetarea băuturilor ce conţin alcool, aprobat prin Hotărârea Guvernului nr.589/2023.

4. În sensul prezentului Regulament, alcoolul etilic de origine agricolă este considerat un distilat a cărui concentraţie alcoolică în volume trebuie să se măsoare direct, în conformitate cu secţiunea a 2-a a capitolului I din anexă. Totuşi, dacă proba de alcool nu este limpede sau dacă sunt vizibile particule suspendate, aceasta se distilează.

5. În cazul determinării substanţelor volatile în alcoolul etilic de origine agricolă, este necesară calibrarea cu soluţia standard C preparată în etanol absolut, pentru a se obţine o matrice de corespondenţă potrivită între probe şi soluţiile standard detaliate în secţiunea a 2-a a capitolului III din anexă.

6. În scopul determinării furfuralului în alcoolul etilic de origine agricolă, potrivit detaliilor menţionate în capitolul IX din anexă, alcoolul etilic de origine agricolă se diluează în două prin adăugarea de apă, astfel încât să fie dublat volumul său iniţial şi să se ajungă la o concentraţie alcoolică în volume compatibilă cu soluţiile de calibrare. Rezultatele analizei furfuralului se convertesc în grame per hectolitru cu 100% alcool în volume, în conformitate cu ecuaţia:

“Concentraţia de furfural în grame per hectolitru de alcool 100% vol. =
Concentraţia de furfural în mg/l × 10/tăria alcoolică în volume (% vol.)” ,

unde

tăria alcoolică în volume (% vol.) este tăria alcoolică a probei măsurate, astfel cum este determinată în capitolul I din anexă.

7. În ceea ce priveşte determinarea conţinutului de radiocarbon din etanol şi din alcoolul etilic de origine agricolă, se utilizează metoda prevăzută în capitolul X din anexă.

8. Fără a aduce atingere subpct.1.1, sunt admise alte metode analitice sub responsabilitatea şefului de laborator, cu condiţia ca exactitatea şi precizia (repetabilitatea şi reproductibilitatea) metodelor să fie cel puţin echivalente cu cele ale metodelor analitice de referinţă prevăzute în anexă.

9. În cazul în care nu sunt stabilite metode de referinţă analitice pentru detectarea şi cuantificarea substanţelor conţinute într-o anumită băutură spirtoasă, se utilizează următoarele metode:

9.1. metode analitice validate pentru proceduri recunoscute la nivel internaţional sau al Uniunii Europene şi care îndeplinesc, în mod special, criteriile stabilite în anexa nr.2 la Legea nr.82/2024 privind controalele oficiale în domeniul agroalimentar;

9.2. metode analitice conforme cu standardele recomandate ale Organizaţiei Internaţionale pentru Standardizare (în continuare – ISO) sau adoptate în calitate de standarde naţionale;

9.3. metode analitice recunoscute de Adunarea Generală a Oficiului Internaţional al Viei şi Vinului (în continuare – OIV) şi publicate de către OIV;

9.4. în absenţa unei metode menţionate la subpct.9.1, 9.2 şi 9.3, din motive de exactitate, repetabilitate şi reproductibilitate:

9.4.1 o metodă analitică aprobată de către un stat membru al Uniunii Europene;

9.4.2. acolo unde este cazul, orice altă metodă analitică adecvată.

Anexă

la Regulamentul de stabilire a metodelor

de referinţă pentru analiza băuturilor spirtoase

METODE DE REFERINŢĂ

pentru analiza băuturilor spirtoase

şi a alcoolului etilic de origine agricolă

Capitolul I

DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI ALCOOLICE ÎN VOLUME

Metoda de referinţă include două secţiuni:

Secţiunea 1. Pregătirea distilatului

Secţiunea a 2-a. Măsurarea densităţii distilatului

1. Domeniu de aplicare

Metoda se utilizează pentru determinarea concentraţiei alcoolice reale în volume la băuturile spirtoase.

2. Referinţe normative

SM SR EN ISO 3696:2006 – Apă utilizată pentru laboratoare analitice. Specificaţii şi metode de analiză.

3. Termeni şi definiţii

3.1. temperatură de referinţă – temperatură standard de 20 °C la care are loc determinarea concentraţiei alcoolice în volume, a densităţii şi a densităţii specifice la băuturile spirtoase. Termenul “la t °C” este rezervat pentru toate determinările (a densităţii sau a concentraţiei alcoolice în volume) exprimate la o temperatură diferită de temperatura de referinţă de 20 °C;

3.2. densitate – masă per unitate de volum in vacuo la băuturile spirtoase la 20 °C. Se exprimă în kilogram pe metru cub, iar simbolul său este ρ_{20 °C} sau ρ₂₀.

3.3. densitate specifică – raport, exprimat ca număr zecimal, dintre densitatea unei băuturi spirtoase la 20 °C şi densitatea apei la aceeaşi temperatură. Acesta are simbolul d_{20 °C/20 °C} sau d_20/20, sau numai d, în cazul în care nu există posibilitatea de a se crea confuzie. Caracteristica măsurată trebuie specificată pe certificatul de testare, fiind utilizate numai simbolurile definite mai sus.

Densitatea specifică poate fi obţinută pe baza densităţii ρ₂₀ la 20 °C.

sau

unde:

998,203 reprezintă densitatea apei la 20 °C.

3.4. tărie alcoolică reală în volume – tărie alcoolică reală în volume la băuturile spirtoase este egală cu numărul de litri de alcool etilic conţinuţi în 100 litri de amestec apă-alcool cu aceeaşi densitate ca şi alcoolul sau băutura spirtoasă după distilare. Valorile de referinţă pentru tăria alcoolică în volume (%vol.) la 20 °C în raport cu densitatea la 20 °C, pentru diferite amestecuri apă-alcool care sunt utilizare, sunt cele din tabelul internaţional adoptat de către Organizaţia Internaţională de Metrologie Legală în Recomandarea nr.22.

Ecuaţia generală care stabileşte legătura dintre tăria alcoolică în volume şi densitatea unui amestec apă-alcool la o anumită temperatură este prezentată în manualul metodelor de analiză a OIV.

3.4.1. Pentru lichiorurile şi lichiorurile-cremă pentru care este foarte dificil să se măsoare cu exactitate volumul, proba trebuie cântărită, iar tăria alcoolică se calculează mai întâi în funcţie de masă.

Formula de conversie:

unde:

TAM = concentraţia alcoolică în masă,

ρ₂₀ (alcool) = 789,24 kg/m³.

4. Principiu

În urma distilării, tăria alcoolică în volume a distilatului se determină prin picnometrie, densimetrie electronică sau densimetrie, cu utilizarea unei balanţe hidrostatice.

Secţiunea 1

Pregătirea distilatului

1. Domeniu

Metoda este adecvată pentru pregătirea distilatelor utilizate la determinarea concentraţiei alcoolice în volume la băuturile spirtoase.

2. Principiu

Băuturile spirtoase sunt distilate pentru a separa alcoolul etilic de alte componente volatile de materie extractivă (substanţe care nu se distilează).

3. Reactivi şi materiale:

3.1. granule împotriva împroşcării;

3.2. emulsie antispumantă concentrată (pentru lichiorurile-cremă).

4. Aparatură şi echipamente

Aparatura de laborator obişnuită şi, în mod special, următoarele:

4.1. baie de apă care poate fi menţinută între 10 °C şi 15 °C. Baie de apă care poate fi menţinută la 20 °C (± 0,2 °C);

4.2. baloane volumetrice clasa A, de 100 ml şi de 200 ml, care au fost certificate la 0,1 % şi respectiv 0,15 %;

4.3. aparat de distilare, care:

4.3.1. trebuie să îndeplinească următoarele cerinţe:

4.3.1.1. numărul de îmbinări nu trebuie să depăşească minimul necesar strict pentru a asigura un sistem etanş;

4.3.1.2. să includă un dispozitiv care să prevină amorsa (antrenarea lichidului în fierbere de vapor) şi să normalizeze ritmul de distilare a vaporilor bogaţi în alcool;

4.3.1.3. condensare rapidă şi completă a vaporilor de alcool;

4.3.1.4. colectarea primelor fracţii de distilare într-un mediu apos.

Sursa de căldură trebuie utilizată cu un difuzor de căldură adecvat, pentru a preveni orice reacţie pirogenă care să implice materia extractivă;

4.3.2. figura 1 ilustrează un aparat de distilare adecvat, care include următoarele părţi:

4.3.2.1. balon cu fund rotund, de 1 litru, cu o îmbinare din sticlă mată;

4.3.2.2. coloană de rectificare cu înălţimea minimă de 20 cm (de exemplu, o coloană tip “Vigreux”);

4.3.2.3. conector cu cot cu un condensator cu margine dreaptă cu lungimea de 10 cm (condensator tip West) fixat vertical;

4.3.2.4. spirală de răcire, cu lungimea de 40 cm;

4.3.2.5. tub de extragere, care transportă distilatul pe fundul unui balon gradat de colectare care conţine o cantitate mică de apă.

Aparatul descris mai sus este adecvat în cazul unei probe de minimum 200 ml. Cu toate acestea, se poate distila o probă mai mică (100 ml) cu ajutorul unui balon de distilare mai mic, cu condiţia să fie dotat cu un cap-barbotor sau cu un alt instrument pentru a preveni antrenarea.

Figura 1. Aparat de distilare pentru măsurarea concentraţiei alcoolice

reale în volume a băuturilor spirtoase

1. balon de sticlă, de 1 litru, cu fundul rotund, cu îmbinare sferică standardizată de sticlă rodată;

2. coloană de rectificare tip “Vigreux” cu înălţimea minimă de 20 cm;

3. condensator West cu margine dreaptă, cu lungimea de 10 cm;

4. spirală de răcire cu lungimea de 40 cm.

5. Depozitarea probelor de testare

Înainte de analiză, probele sunt depozitate la temperatura camerei.

6. Mod de lucru

Observaţii preliminare:

Distilarea poate fi făcută pe baza procedurii publicate de către Uniunea Internaţională de Chimie Pură şi Aplicată (International Union of Pure and Applied Chemistry) IUPAC (1968).

6.1.Verificarea aparatului de distilare

Aparatura utilizată trebuie să poată permite următoarele:

distilarea a 200 ml de soluţie apă-alcool, cu o concentraţie cunoscută aproape de 50 % vol., şi nu trebuie să cauzeze o pierdere de alcool mai mare de 0,1 % vol.

6.2. Băuturile spirtoase cu o concentraţie alcoolică sub 50 % vol.

Se măsoară 200 ml de băutură spirtoasă într-un balon volumetric. Se notează temperatura acestui lichid sau se menţine o temperatură standard (20 °C). Se toarnă proba în balonul cu fund rotund din aparatura de distilare şi se limpezeşte balonul volumetric cu trei porţiuni, fiecare de aproximativ 20 ml de apă distilată. Se adaugă fiecare porţiune de apă de limpezire la conţinutul balonului de distilare.

Această diluţie de 60 ml este suficientă pentru băuturile spirtoase care conţin mai puţin de 250 g de extract sec la litru. În rest, pentru a preveni piroliza, volumul de apă de limpezire trebuie să fie de cel puţin 70 ml în cazul în care concentraţia extrasului sec este de 300 g/l, 85 ml – pentru 400 g/l de extract sec şi 100 ml – pentru 500 g/l de extract sec (anumite lichioruri sau creme de fructe). Se ajustează aceste volume proporţional cu diferitele volume ale probelor.

Se adaugă câteva granule antiîmproşcare (3.1) (şi emulsie antispumantă în cazul lichiorurilor-cremă).

Se toarnă 20 ml de apă distilată în balonul volumetric original de 200 ml, care va fi utilizat pentru a păstra distilatul. Acest balon trebuie apoi plasat într-o baie de apă rece (4.1) (între 10 şi 15 °C – pentru băuturile spirtoase cu aromă de anason).

Se distilează, evitând antrenarea şi carbonizarea, agitând uneori conţinutul balonului, până când nivelul distilatului este cu câţiva milimetri sub marcajul de calibrare a balonului volumetric.

În cazul în care temperatura distilatului a fost coborâtă la ± 0,5 °C faţă de temperatura iniţială a lichidului, se completează cu apă distilată până la marcaj şi se amestecă bine.

Distilatul este folosit pentru a determina tăria alcoolică în volume (secţiunea a 2-a).

6.3. Băuturi spirtoase cu concentraţie alcoolică peste 50 % vol.

Se măsoară 100 ml de băutură spirtoasă într-un balon volumetric de 100 ml şi se toarnă în balonul cu fund rotund din aparatura de distilare.

Se limpezeşte balonul volumetric de câteva ori cu apă distilată şi se adaugă apa respectivă la conţinutul balonului de distilare cu fund rotund. Se utilizează suficientă apă pentru a aduce conţinutul balonului până la aproximativ 230 ml.

Se toarnă 20 de ml apă distilată într-un balon volumetric de 200 ml, care va fi utilizat pentru a păstra distilatul. Acest balon trebuie plasat într-o baie de apă rece (4.1) (între 10 şi 15 °C – pentru băuturile spirtoase cu aromă de anason).

Se distilează, agitându-se uneori conţinutul balonului, până când nivelul distilatului este cu câţiva milimetri sub marcajul de calibrare a balonului volumetric de 200 ml.

În cazul în care temperatura distilatului a fost coborâtă la ± 0,5 °C faţă de temperatura iniţială a lichidului, se completează cu apă distilată până la marcaj şi se amestecă bine.

Distilatul este folosit pentru a determina tăria alcoolică în volume (secţiunea a 2-a).

Tăria alcoolică în volume a băuturii spirtoase este dublul concentraţiei alcoolice a distilatului.

Secţiunea a 2-a

Măsurarea densităţii distilatului

Metoda A. Determinarea concentraţiei alcoolice reale în volume la băuturi spirtoase – măsurarea prin picnometrie

1. Principiu

Tăria alcoolică în volume este obţinută din densitatea distilatului măsurată prin picnometrie.

2. Reactivi şi materiale

Pe durata analizei, dacă nu se specifică altfel, se utilizează numai reactivi cu grad analitic recunoscut şi apă de cel puţin gradul 3, conform definiţiei SM SR EN ISO 3696:2006.

2.1. Soluţie de clorură de sodiu (2 % m/v)

Pentru a pregăti 1 litru, se cântăresc 20 g de clorură de sodiu şi se dizolvă la un litru de apă.

3. Aparatură şi echipamente

Aparatura de laborator obişnuită şi, în mod special, următoarele:

3.1. balanţă analitică care permite cântărirea a 0.1 mg;

3.2. termometru cu îmbinare cu sticlă rodată, calibrat în zecimi de grad de la 10 la 30 °C. Acesta trebuie certificat sau testat pe baza unui termometru certificat;

3.3. picnometru din sticlă pyrex, cu o capacitate de aproximativ 100 ml, dotat cu un termometru detaşabil din sticlă mată (3.2). Picnometrul are un tub lateral cu o lungime de 25 mm şi un diametru intern de (maximum) 1 mm care se încheie cu o îmbinare şlefuită conică. Pot fi utilizate şi alte picnometre, conform descrierii SM ISO 3507, de exemplu 50 ml, acolo unde este cazul;

3.4. o sticlă utilizată ca tară, cu acelaşi volum extern (maximum 1 ml) ca şi picnometrul şi cu masa egală cu masa picnometrului umplut cu un lichid cu densitatea de 1.01 (soluţie de clorură de sodiu menţionată la subpct. 2.1);

3.5. manta izolată termic, care se mulează exact pe corpul picnometrului.

Metoda de determinare a densităţii băuturilor alcoolice în vacuum necesită utilizarea unei balanţe cu două platane, a unui picnometru şi a unei sticle utilizate drept tară, cu acelaşi volum exterior, pentru a elimina efectul de flotabilitate a aerului în orice moment. Această tehnică simplă poate fi aplicată utilizând o balanţă cu un singur platan, cu condiţia ca sticla utilizată drept tară să fie cântărită din nou, pentru a monitoriza modificările efectul de flotabilitate al aerului în timp.

4. Mod de lucru

Observaţii preliminare: procedura următoare este descrisă pentru utilizarea unui picnometru de 100 ml la determinarea concentraţiei alcoolice; acesta dă cele mai exacte rezultate. Totuşi, este posibil să se utilizeze şi un picnometru mai mic (de exemplu, de 50 ml).

4.1. Calibrarea picnometrului

Picnometrul se calibrează prin determinarea următorilor parametri:

- tara picnometrului gol;

- volumul picnometrului la 20 °C;

- masa picnometrului umplut cu apă la 20 °C.

4.1.1. Calibrarea cu ajutorul unei balanţe cu un singur platan:

se determină:

- masa picnometrului curat şi uscat (P);

- masa picnometrului umplut cu apă la t °C (P1);

- masa sticlei utilizate drept tară (T0).

4.1.1.1. se cântăreşte picnometrul curat şi uscat (P).

4.1.1.2. se umple atent picnometrul cu apă distilată la temperatura ambiantă şi se ataşează termometrul;

4.1.1.3. se şterge cu grijă picnometrul până este uscat şi se instalează în mantaua izolată termic;

4.1.1.4. se agită răsturnând containerul până când termometrul indică o temperatură constantă;

4.1.1.5. se așează picnometrul astfel încât să se îmbine cu marginea superioară a tubului lateral;

4.1.1.6. se citeşte temperatura t °C şi, dacă este necesar, se corectează posibilele inadvertenţe ale gradaţiei temperaturii;

4.1.1.7. se cântăreşte picnometrul umplut cu apă (P1);

4.1.1.8. se cântăreşte sticla utilizată drept tară (T0);

4.1.1.9. calcule:

4.1.1.9.1. tara picnometrului gol = P – m,

unde:

m reprezintă masa aerului din picnometru.

m = 0,0012 × (P1 – P),

unde:

2: 0,0012 reprezintă densitatea aerului uscat la 20 °C la o presiune de 760 mm Hg;

4.1.1.9.2. volumul picnometrului la 20 °C:

unde:

F_t reprezintă factorul pentru temperatura la t °C din anexa la Metodele de referinţă pentru analiza băuturilor spirtoase şi a alcoolului etilic de origine agricolă;

V₂₀ °C trebuie să fie cât mai apropiat de 0,001 ml;

4.1.1.9.3. masa apei în picnometru la 20 °C:

unde:

0,998203 reprezintă densitatea apei la 20 °C.

Dacă este necesar, poate fi utilizată valoarea 0,99715 a densităţii aerului, iar tăria alcoolică se calculează pe baza densităţii echivalente din tabelele Accize şi Vame HM pentru aer;

4.1.2. metoda de calibrare utilizând o balanţă cu două platane:

4.1.2.1. se plasează sticla utilizată ca tară pe platanul din stânga, iar picnometru curat şi uscat cu opritorul colector – pe platanul din dreapta. Se echilibrează cele două platane, plasând greutăţi pe cel care conţine picnometrul: p grame;

4.1.2.2. se umple atent picnometrul cu apă distilată la temperatura ambiantă şi se ataşează termometrul;

4.1.2.3. se şterge cu grijă picnometrul până este uscat şi se instalează în mantaua izolată termic;

4.1.2.4. se agită, răsturnând containerul, până termometrul indică o temperatură constantă;

4.1.2.5. se reglează nivelul cu exactitate până la marginea superioară a tubului lateral. Se curăţă tubul lateral, se ataşează opritorul colector;

4.1.2.6. se citeşte temperatura t °C şi, dacă este necesar, se corectează posibilele inadvertenţe ale gradaţiei temperaturii;

4.1.2.7. se cântăreşte picnometrul umplut cu apă, compensând pentru echilibrare cu p′ greutatea, în grame;

4.1.2.8. calcule

4.1.2.8.1. tara picnometrului gol = p + m,

unde:

m reprezintă masa aerului din picnometru.

m = 0,0012 × (p – p′) ;

4.1.2.8.2. volumul picnometrului la 20 °C:

unde:

F_t reprezintă factorul pentru temperatura la t °C din anexa la Metodele de referinţă pentru analiza băuturilor spirtoase şi a alcoolului etilic de origine agricolă.

V_{20 °C} trebuie să fie cât mai apropiat de 0,001 ml.

4.1.2.8.3. masa apei în picnometru la 20 °C:

unde:

0,998203 reprezintă densitatea apei la 20 °C.

4.2. Determinarea concentraţiei alcoolice a probei de testare

4.2.1. Utilizând o balanţă cu un singur platan:

4.2.1.1. se cântăreşte sticla utilizată drept tară, greutate T1;

4.2.1.2. se cântăreşte picnometrul cu distilatul preparat, P2 reprezintă greutatea la t °C;

4.2.1.3. calcule

4.2.1.3.1. dT = T1 - T0;

4.2.1.3.2. masa picnometrului gol în momentul măsurării = P – m + dT;

4.2.1.3.3. masa lichidului din picnometru la t °C = P2 – (P – m + dT);

4.2.1.3.4. densitatea la t °C în g/ml;

4.2.1.3.5.

4.2.1.3.6. se exprimă densitatea la t °C în kilograme pe m³, prin înmulţirea ρ_{t °C} cu 1 000 , valoarea fiind cunoscută ca ρ_t;

4.2.1.3.7. se corectează ρ_t la 20 folosind tabelul densităţilor ρ_T pentru amestecuri de apă-alcool din Compendiul metodelor internaţionale pentru analiza vinului şi a mustului al OIV.

Se caută în tabel linia care corespunde temperaturii T în grade, fără zecimale, aflată imediat sub t °C, cea mai mică densitate peste ρ_t. Se foloseşte diferenţa din tabel găsită sub această densitate, pentru a calcula densitatea ρ_t a alcoolului la temperatura T în cauză, în grade fără zecimale;

4.2.1.3.8. folosind linia pentru temperatură, fără zecimale, se calculează diferenţa dintre densitatea ρ′ din tabel imediat deasupra ρ_t şi densitatea calculată ρ_t. Se împarte această diferenţă la diferenţa din tabel, care se află la dreapta densităţii ρ′. Coeficientul indică porţia zecimală a concentraţiei alcoolice, iar întregul concentraţiei alcoolice se află în partea superioară a coloanei în care se află densitatea ρ′ (Dt, tăria alcoolică).

Alternativ, se păstrează picnometrul într-o baie de apă menţinută la 20 °C (± 0,2 °C), în cazul în care se completează până la marcaj;

4.2.1.4. rezultat

Folosind densitatea ρ₂₀, se calculează tăria alcoolică reală pe baza tabelelor pentru tăria alcoolică identificate, prezentate mai jos:

tabelul care indică valoarea concentraţiei alcoolice în volume (% vol) la 20 °C ca funcţie a densităţii la 20 °C a amestecurilor de apă-alcool este tabelul internaţional adoptat de Organizaţia Internaţională de Metrologie Legală în Recomandarea nr.2;

4.2.2. metoda care foloseşte balanţa cu un singur platan:

4.2.2.1. se cântăreşte picnometrul cu distilatul preparat (vezi partea I), unde ρ″ este masa la t °C;

4.2.2.2. calcule:

4.2.2.2.1. masa lichidului din picnometru la t °C = ρ + m – ρ″;

4.2.2.2.2. densitatea la t °C în g/ml

4.2.2.2.3. se exprimă densitatea la t °C în kilograme pe m³ şi se efectuează corectarea temperaturii pentru a calcula tăria alcoolică la 20 °C, aşa cum este indicat anterior pentru folosirea balanţei cu un singur platan.

5. Caracteristici de performanţă ale metodei (precizia)

5.1. Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost preluate dintr-un studiu internaţional de performanţă a metodei, efectuat cu proceduri acceptate la nivel internaţional [1], [2].

Metoda B. Determinarea concentraţiei alcoolice reale în volume pentru băuturile spirtoase – măsurarea prin densitometrie electronică (bazată pe oscilaţia frecvenţei rezonante a unei probe într-o celulă de oscilare)

1. Principiu

Densitatea lichidului este determinată prin măsurători electronice ale oscilaţiilor unui tub vibrator sub formă de litera U. Pentru a efectua aceste măsurători, proba este adăugată unui sistem de oscilaţii, al cărui frecvenţă de oscilare este astfel modificată de masa adăugată.

2. Reactivi şi materiale

În timpul analizei, dacă nu se specifică altfel, se utilizează numai reactivi cu grad analitic recunoscut şi cu apă de cel puţin de gradul 3, conform definiţiei din SM SR EN ISO 3696:2006:

2.1. acetonă (CAS 666-52-4) sau alcool absolut;

2.2. aer uscat.

3. Aparatură şi echipamente

Aparate de laborator obişnuite şi, în mod special, următoarele aparate:

3.1. Densitometru cu afişaj digital

Densitometrul electronic pentru efectuarea acestor măsurători trebuie să poată exprima densitatea în g/ml, cu 5 zecimale.

Densitometrul trebuie să fie aşezat pe o suprafaţă perfect stabilă, izolată de vibraţii.

3.2. Reglarea temperaturii

Performanţa densitometrului este valabilă numai dacă celula de măsurare este conectată la un regulator de temperatură încorporat, care poate atinge aceeaşi stabilitate a temperaturii la ± 0,02 °C sau mai puţin.

Stabilirea şi monitorizarea precisă a temperaturii în celula de măsurare sunt foarte importante, deoarece o eroare de 0,1 °C poate determina variaţia densităţii cu 0,1 kg/m³.

3.3. Seringi de injectare a probei sau dispozitiv de autoprelevare a probelor.

4. Mod de lucru

4.1. Calibrarea densitometrului

Aparatul se calibrează conform instrucţiunilor producătorului, la prima punere în funcţiune. Aparatul trebuie să se recalibreze în mod regulat şi să se verifice pe baza unui standard de referinţă certificat sau a unei soluţii de referinţă interne de laborator, bazate pe un standard de referinţă certificat.

4.2. Determinarea densităţii probei:

4.2.1. dacă este necesar, înainte de măsurare se curăţă şi se usucă celula cu acetonă sau cu alcool absolut şi în aer uscat. Se clăteşte celula cu proba de testare;

4.2.2. se injectează proba în celulă (utilizând o seringă sau un dispozitiv de autoprelevare de probe), până la umplerea completă a celulei. În timpul umplerii se verifică dacă sunt eliminate toate bulele de aer. Proba trebuie să fie omogenă şi să nu conţină particule solide. Particulele de materiale în suspensie se elimină prin filtrare înainte de efectuarea analizei;

4.2.3. după stabilizarea indicatorului, se notează densitatea ρ₂₀ sau tăria alcoolică afişată de densitometru.

4.3. Rezultat

Dacă se foloseşte densitatea ρ₂₀, tăria alcoolică reală se calculează cu ajutorul tabelelor de concentraţie alcoolică identificate în continuare.

Tabelul care cuprinde valoarea concentraţiei alcoolice în volume (% vol.) la 20 °C ca funcţie a densităţii la 20 °C a amestecurilor de apă-alcool este tabelul adoptat în Recomandarea nr.22 de către Organizaţia Internaţională de Metrologie Legală.

5. Caracteristici de performanţă ale metodei (precizia)

5.1. Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost preluate dintr-un studiu internaţional de performanţă a metodei, efectuat cu proceduri acceptate la nivel internaţional [1], [2].

Metoda C. Determinarea concentraţiei alcoolice reale în volume a băuturilor spirtoase – măsurarea prin densitometrie, cu ajutorul balanţei hidrostatice

1. Principiu

Tăria alcoolică a băuturilor spirtoase poate fi măsurată prin densitometrie cu ajutorul unei balanţe hidrostatice bazate pe principiul lui Arhimede, conform căruia un corp scufundat într-un lichid este împins la suprafaţă de o cantitate de lichid egală cu greutatea lichidului dislocat.

2. Reactivi şi materiale

În timpul analizei, dacă nu se specifică altfel, se folosesc numai reactivi cu grad analitic recunoscut şi apă de cel puţin gradul 3, conform definiţiei din SM SR EN ISO 3696:2006.

2.1. Soluţie de curăţare a flotorului (hidroxid de sodiu, 30% m/v)

Pentru a prepara 100 ml de soluţie, se cântăresc 30 g de hidroxid de sodiu şi se completează cu etanol de 96 % vol.

3. Aparatură şi echipamente

Aparate de laborator obişnuite şi, în mod special, următoarele:

3.1. balanţă hidrostatică cu un singur platan cu sensibilitate de 1 mg;

3.2. flotor cu un volum de cel puţin 20 ml, adaptat special pentru balanţă, suspendat de un fir cu diametru de maximum 0,1 mm;

3.3. cilindru gradat cu marcaj pentru nivel. Flotorul trebuie să poată fi conţinut complet în volumul cilindrului situat sub marcaj; suprafaţa lichidului poate fi penetrată numai de firul de susţinere. Cilindrul gradat trebuie să aibă un diametru intern de minimum 6 mm mai mare decât diametrul flotorului;

3.4. termometru (sau probă de măsurare a temperaturii) gradat cu grade şi zecimi de grade, de la 10 la 40 °C, calibrat la 0,05 °C;

3.5. greutăţi, calibrate de un organism de certificare recunoscut.

4. Mod de lucru

Flotorul şi cilindrul gradat trebuie curăţate, după fiecare măsurare, cu apă distilată, să se usuce cu hârtie moale de laborator care nu lasă fire şi clătite cu soluţie a cărei densitate urmează să fie determinată. Măsurările se efectuează în momentul în care aparatul este stabil, pentru a limita pierderile de alcool cauzate de evaporare.

4.1. Calibrarea balanţei

Deşi, în mod obişnuit, balanţele au un sistem intern de calibrare, balanţa hidrostatică trebuie să poată efectua calibrarea cu greutăţile verificate de către un organism de certificare oficial.

4.2. Calibrarea flotorului

4.2.1. se umple cilindrul gradat până la marcaj cu apă dublu distilată (sau apă cu puritate echivalentă, adică apă microfiltrată cu conductibilitate de 18,2 ΜΩ/cm) la o temperatură între 15 °C şi 25 °C, de preferinţă 20 °C;

4.2.2. se scufundă flotorul şi termometrul, se amestecă, se citeşte densitatea lichidului din aparat şi, dacă este necesar, se corectează indicaţia, astfel încât aceasta să fie egală cu cea a apei la temperatura de măsurare.

4.3. Verificarea folosind o soluţie de apă-alcool:

4.3.1. se umple cilindrul gradat până la marcaj cu un amestec de apă-alcool cu concentraţie cunoscută, la o temperatură între 15 şi 25 °C, de preferinţă 20 °C;

4.3.2. se scufundă flotorul şi termometrul, se amestecă, se citeşte densitatea lichidului (sau tăria alcoolică, dacă este posibil) din aparat. Tăria alcoolică astfel stabilită trebuie să fie egală cu tăria alcoolică determinată anterior.

Soluţia cu concentraţie alcoolică cunoscută poate fi folosită şi la calibrarea flotorului, în locul apei dublu distilate.

4.4. Măsurarea densităţii distilatului (sau a concentraţiei alcoolice, dacă aparatul permite aceasta):

4.4.1. se toarnă proba de testare într-un cilindru gradat până la marcaj;

4.4.2. se scufundă flotorul şi termometrul, se amestecă, se citeşte densitatea lichidului (sau tăria alcoolică, dacă este posibil) din aparat. Se notează temperatura dacă densitatea se măsoară la t °C (ρ_t);

4.4.3. se corectează ρ_t la 20, folosind tabelul de densităţi ρΤ pentru amestecurile apă-alcool din Compendiul metodelor internaţionale pentru analiza vinului şi a mustului a OIV.

4.5. Curăţarea flotorului şi a cilindrului gradat

4.5.1. se cufundă flotorul în soluţia de curăţare a flotorului în cilindrul gradat;

4.5.2. se lasă să se înmoaie timp de o oră, rotind periodic flotorul;

4.5.3. se clăteşte cu multă apă de la robinet, apoi cu apă distilată;

4.5.4. se usucă cu hârtie moale de laborator care nu lasă scame.

Această procedură se efectuează după prima utilizare a flotorului, apoi ori de câte ori este cazul.

4.6. Rezultat:

Cu ajutorul densităţii ρ₂₀ se calculează tăria alcoolică reală, folosind tabelele ce indică concentraţia alcoolică menţionate mai jos.

Tabelul care cuprinde valoarea concentraţiei alcoolice în volume (% vol.) la 20°C, ca funcţie a densităţii la 20°C a amestecurilor de apă-alcool, este tabelul adoptat în Recomandarea nr.22 de către Organizaţia Internaţională de Metrologie Legală.

5. Caracteristici de performanţă ale metodei (precizia)

5.1. Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost preluate dintr-un studiu internaţional de performanţă a metodei, efectuat cu proceduri acceptate la nivel internaţional [1], [2].

Capitolul II

DETERMINAREA EXTRACTULUI SEC TOTAL AL

BĂUTURILOR SPIRTOASE PRIN GRAVIMETRIE

1. Domeniu

Această metodă este utilizată pentru a măsura conţinutul de substanţe solide dizolvate într-o băutură spirtoasă, după îndepărtarea alcoolului şi a apei prin evaporare.

2. Referinţe normative

SM SR EN ISO 3696:2006 – Apă utilizată pentru laboratoare analitice. Specificaţii şi metode de analiză.

3. Definiţie

Extractul sec total sau materia uscată totală include toată materia nevolatilă în condiţii fizice specificate.

4. Principiu

Cântărirea reziduului rămas după evaporarea alcoolului pe o baie de apă la fierbere şi uscarea într-un cuptor de uscare.

5. Aparatură şi echipamente:

5.1. capsulă cilindrică de evaporare cu fundul plat cu diametru de 35 mm;

5.2. baie cu apă la fierbere;

5.3. pipetă de 25 ml, clasa A;

5.4. cuptor de uscare;

5.5. desicator;

5.6. balanţă analitică cu precizie de 0,1 mg.

6. Prelevare şi probe

Probele se păstrează la temperatura camerei înainte de analiză.

7. Mod de lucru:

7.1. se transferă cu pipeta 25 ml de alcool care conţine sub 15 g/l materie uscată într-o placă cilindrică de evaporare cu fundul plat cu diametru de 55 mm. În timpul primei ore de evaporare, placa de evaporare se plasează pe capacul unei băi de apă la fierbere în aşa fel încât lichidul să nu fiarbă, deoarece ar duce la pierderi prin stropire. Se lasă încă o oră în contact direct cu vaporii băii de apă la fierbere;

7.2. se finalizează uscarea, aşezând placa de evaporare într-un cuptor de uscare la 105 °C ± 3 °C timp de două ore. Se lasă placa de evaporare să se răcească într-un desicator şi se cântăreşte placa de evaporare şi conţinutul acesteia.

8. Calcule

Masa reziduului înmulţită cu 40 este egală cu conţinutul uscat din alcool şi trebuie să fie exprimată în g/l, până la o zecimală.

9. Caracteristici de performanţă ale metodei (precizia)

9.1. Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost preluate dintr-un studiu internaţional de performanţă a metodei efectuat cu proceduri acceptate la nivel internaţional [1], [2].

Capitolul III

DETERMINAREA SUBSTANŢELOR VOLATILE

ŞI A METANOLULUI DIN BĂUTURILE SPIRTOASE

Secţiunea 1

Observaţii generale

1. Definiţii

Regulamentul privind definirea, descrierea, prezentarea şi etichetarea băuturilor ce conţin alcool, aprobat prin Hotărârea Guvernului nr.589/2023, stabileşte nivelurile minime de compuşi volatili, alţii decât etanolul şi metanolul, pentru mai multe băuturi spirtoase, băuturi alcoolice cu conţinut redus de alcool şi băuturi slab alcoolice. Numai pentru aceste produse, aceste niveluri sunt considerate, în mod convenţional, echivalente cu suma concentraţiilor de:

1.1. acizi volatili exprimaţi ca acid acetic;

1.2. aldehide exprimate ca etanal prin suma etanalului (acetaldehidă) şi a fracţiei de etanal conţinută în 1,1 dietoxietan (acetal);

1.3. următoarele alcooluri superioare: propan-1-ol, butan-1-ol, butan-2-ol, 2-metilpropan-1-ol, evaluate ca alcool individual, şi 2-metilbutan-1-ol şi 3 - metilbutan-1-ol evaluat ca alcool individual sau ca suma celor două;

1.4. acetat de etil.

Următoarele metode convenţionale se folosesc pentru măsurarea compuşilor volatili:

1.4.1. acizii volatili prin aciditate volatilă;

1.4.2. aldehidele (etanal şi acetal), acetatul de etil şi alcoolurile prin cromatografie cu gaz (GPC).

2. Analiza prin cromatografia gazoasă a compuşilor volatili

Evaluările prin cromatografia gazoasă a compuşilor volatili, alţii decât cei menţionaţi anterior, se pot dovedi a fi extrem de interesante, ca mijloace de determinare a originii materiei prime folosite în distilare şi a condiţiilor de distilare efective.

Unele alcooluri conţin alte componente volatile, cum ar fi compuşi aromatici, care sunt caracteristici materiilor prime folosite la obţinerea alcoolului, aromei băuturii spirtoase şi caracteristicilor speciale ale preparării alcoolului. Aceşti compuşi sunt importanţi pentru evaluarea cerinţelor stabilite în Regulamentul privind definirea, descrierea, prezentarea şi etichetarea băuturilor ce conţin alcool, aprobat prin Hotărârea Guvernului nr.589/2023.

Secţiunea a 2-a

Determinarea prin cromatografia gazoasă a congenerilor volatili:

aldehide, alcooluri superioare, acetat de etil şi metanol

1. Domeniu

Această metodă este potrivită pentru a se determinarea 1,1-dietoxietanul (acetalul), 2-metilbutan-1-olul (alcoolul amil activ), 3-metilbutan-1-olul (alcoolul izoamil), metanolul (alcoolul metilic), etil etanoatul (etilul acetat), butan-1-olul (n-butanol), butan-2-olul (sec-butanol), 2-metilpropan-1-olul (alcool izobutil), propan-1-olul (n-propanolul) şi etanalul (acetaldehidă) din băuturile spirtoase, folosind cromatografia gazoasă. Metoda foloseşte un standard intern, de exemplu pentan-3-olul. Concentraţiile analiţilor sunt exprimate în grame pe 100 de litri de alcool absolut. Tăria alcoolică a produsului trebuie să se determine înainte de analiză. Băuturile spirtoase care pot fi analizate folosind această metodă includ whisky, brandy, rom, rachiu de vin, rachiu de fructe şi rachiu de tescovină.

2. Trimiteri normative

SM SR EN ISO 3696:2006 – Apă utilizată pentru laboratoare analitice. Specificaţii şi metode de analiză.

3. Definiţie

Congenerii sunt substanţe volatile formate în acelaşi timp cu etanolul în procesul fermentaţiei, al distilării şi al maturării băuturilor spirtoase.

4. Principiu

Congenerii din băuturile spirtoase sunt determinaţi prin injectarea directă a băuturii spirtoase sau a băuturii spirtoase diluate corespunzător într-un sistem de cromatografie cu gaz (GC). Un standard intern corespunzător se adaugă băuturii spirtoase înainte de injectare. Congenerii sunt separaţi prin programarea temperaturii pe o coloană adecvată şi sunt detectaţi folosind un detector de ionizare cu flacără (FID). Concentraţia fiecărui congener este determinată ţinând cont de standardul intern al factorilor de răspuns, care sunt obţinuţi în timpul calibrării în aceleaşi condiţii cromatografice ca şi cele pentru analiza băuturilor spirtoase.

5. Reactivi şi materiale

Dacă nu există alte specificaţii, se vor folosi numai reactivi cu puritatea de peste 97 %, achiziţionaţi de la un furnizor acreditat ISO cu certificat de puritate, care nu prezintă congeneri la diluţia test (acest lucru poate fi confirmat prin injectarea de standarde de congener individuale la diluţia test, folosind condiţiile de operare ale cromatografului cu Gaz de la subpct. 6.4) şi numai apă de cel puţin 3 grade, conform definiţiei din SM SR EN ISO 3696:2006. Acetalul şi acetaldehida se păstrează la întuneric, la < 5 °C, iar toţi ceilalţi reactivi pot fi păstraţi la temperatura camerei.

5.1. etanol absolut (CAS 64-17-5);

5.2. metanol (CAS 67-56-1);

5.3. propan-1-ol (CAS 71-23-8);

5.4. 2-metilpropan-1-ol (CAS 78-83-1);

5.5. standarde interne acceptabile: pentan-3-ol (CAS 584-02-1), pentan-1-ol (CAS 71-41-0), 4-metilpentan-1-ol (CAS 626-89-1) sau metil nonanoat (CAS 1731-84-6);

5.6. 2-metilbutan-1-ol (CAS 137-32-6);

5.7. 3-metilbutan-1-ol (CAS 123-51-3);

5.8. acetat de etil (CAS 141-78-6);

5.9. butan-1-ol (CAS 71-36-3);

5.10. butan-2-ol (CAS 78-92-2);

5.11. acetaldehidă (CAS 75-07-0);

5.12. acetal (CAS 105-57-7);

5.13. soluţie de etanol 40 % v/v.

Pentru a prepara 400 ml/l de soluţie de etanol se toarnă 400 ml de etanol (5.1) într-un balon volumetric de 1 litru, se completează cu apă distilată şi se amestecă.

Doar în cazul alcoolului etilic de origine agricolă, se toarnă etanol absolut (CAS 64-17-5);

5.14. prepararea şi păstrarea soluţiilor standard (procedura folosită pentru metoda validată).

Toate soluţiile standard pot fi păstrate la < 5 °C şi pot fi proaspăt preparate, lunar. Masele componentelor şi ale soluţiilor trebuie să fie înregistrate cu o precizie de 0,1 mg;

5.14.1. soluţia standard – A

Se transferă cu pipeta într-un balon volumetric de 100 ml, care conţine aproximativ 60 ml de soluţie de etanol (5.13), pentru a minimaliza evaporarea componentei, se completează cu soluţie de etanol (5.13) şi se amestecă bine. Se notează greutatea balonului, fiecare componentă adăugată şi greutatea finală totală a conţinutului.

Se recomandă adăugarea acetalului şi a acetaldehidei la sfârşit, pentru a minimiza pierderile prin evaporare.

Doar în cazul alcoolului etilic de origine agricolă, soluţia standard – A se prepară prin aspirarea cu pipeta de reactivi cu volume reduse de alcooli superiori, cu scopul de a avea soluţii standard cu concentraţii apropiate de limitele legale pentru alcoolul etilic de origine agricolă;

5.14.2. soluţia standard – B

Se transferă cu pipeta 3 ml de pentan-3-ol sau alt standard intern corespunzător (5.5) într-un balon volumetric de 100 ml, care conţine aproximativ 80 ml de soluţie de etanol (5.13), se completează cu soluţie de etanol (5.13) şi se amestecă bine.

Se notează greutatea balonului, greutatea pentan-3-olului sau a altui standard intern adăugat şi greutatea finală totală a conţinutului.

Doar în cazul alcoolului etilic de origine agricolă, soluţia standard – B se prepară prin aspirarea cu pipeta a unui standard intern adecvat cu volume reduse, cu scopul de a avea soluţii standard cu concentraţii apropiate de limitele legale pentru alcoolul etilic de origine agricolă;

5.14.3. soluţia standard – C

Se transferă cu pipeta 1 ml de soluţie A (5.14.1) şi 1 ml de soluţie B (5.14.2) într-un balon volumetric de 100 ml, care conţine aproximativ 80 ml de soluţie de etanol (5.13), se completează cu soluţie de etanol (5.13) şi se amestecă bine.

Se notează greutatea balonului, a fiecărei componente adăugate şi greutatea finală totală a conţinutului;

5.14.4. soluţia standard – D

Pentru a menţine continuitatea analitică, se prepară un standard de control de calitate folosind standardul – A preparat anterior (5.14.1). Se transferă cu pipeta 1 ml de soluţie A (5.14.1) într-un balon volumetric de 100 ml care conţine aproximativ 80 ml de soluţie de etanol (5.13), se completează cu soluţie de etanol (5.13) şi se amestecă bine.

Se notează greutatea balonului, a fiecărei componente adăugate şi greutatea finală totală a conţinutului;

5.14.5. soluţia standard – E

Se transferă cu pipeta 1 ml de soluţie B (5.14.2) într-un balon volumetric de 100 ml, care conţine aproximativ 80 ml de soluţie de etanol (5.13), se completează cu soluţie de etanol (5.13) şi se amestecă bine.

Se notează greutatea balonului, a fiecărei componente adăugate şi greutatea finală totală a conţinutului;

5.14.6. soluţii standard folosite la verificarea liniarităţii răspunsului FID

În diferite baloane volumetrice de 100 ml, care conţin aproximativ 80 ml de soluţie de etanol (5.13), se transferă cu pipeta 0 ml, 0,1 ml, 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml de soluţie A (5.14.1) şi 1 ml de soluţie B (5.14.2), se completează cu soluţie de etanol (5.13) şi se amestecă bine.

Se notează greutatea balonului, a fiecărei componente adăugate şi greutatea finală totală a conţinutului;

5.14.7. soluţie standard de control al calităţii

Se transferă cu pipeta 9 ml de soluţie standard D (5.14.4) şi 1 ml de soluţie E (5.14.5) într-un vas de cântărire şi se amestecă bine.

Se notează greutatea balonului, a fiecărei componente adăugate şi greutatea finală totală a conţinutului.

6. Aparatură şi echipamente:

6.1. aparatura de măsurare a densităţii şi a concentraţiei alcoolice;

6.2. balanţa analitică de măsurare cu patru zecimale;

6.3. un cromatograf cu gaz, cu temperatura programată, echipat cu un detector şi cu un integrator de ionizare cu flacără sau alte sisteme de tratare a datelor care pot măsura platourile şi vârfurile de maxim;

6.4. coloană (coloane) de gaz cromatografie ce pot separa analiţii, astfel încât rezoluţia minimă dintre componentele individuale (altele decât 2- metilbutan-1-ol şi 3-metilbutan-1-ol) să fie de minimum 1,3.

Următoarele coloane şi condiţii GC reprezintă exemple potrivite:

1. o cavitate de retenţie 1 m × 0,32 mm i.d. conectată la o coloană CP-WAX 57 CB de 50 m × 0.32 mm i.d., grosimea filmului de 0,2 μm (polietilenă glicol stabilizat), urmată de o coloană Carbowax 400 de 50 m × 0,32 mm i.d., grosimea filmului de 0,2 μm. (Coloanele sunt conectate cu ajutorul conectorilor apăsare-fixare):

2. o cavitate de retenţie 1 m × 0,32 mm i.d. conectată la o coloană CP-WAX 57 CB de 50 m × 0.32 mm i.d., grosimea filmului de 0,2 μm (polietilenă glicol stabilizat). (Cavitatea de retenţie este conectată cu ajutorul unui conector apăsare-fixare):

3. o coloană împachetată (5 % CW 20M, Carbopak B), 2 m × 2 mm diametru interior:

7. Prelevare şi probe

Probă de laborator. La primire se măsoară tăria alcoolică a fiecărei probe (6.1).

8. Mod de lucru (folosit pentru metoda validată)

8.1. Porţiune de testare

8.1.1. se cântăreşte un vas de cântărire corespunzător sigilat şi se notează greutatea.

8.1.2. se transferă cu pipeta în vas 9 ml de probă de laborator şi se notează greutatea (M_PROBĂ);

8.1.3. se adaugă 1 ml de soluţie standard E (5.14.5) şi se notează greutatea (M_IS);

8.1.4. se agită puternic materialul de testare (cel puţin 20 de inversări). Probele trebuie să se păstreze la sub 5 °C înainte de analiză, pentru a minimiza pierderile prin volatilizare.

8.2. Test martor

8.2.1. folosind balanţa cu patru zecimale (6.2), se cântăreşte vasul de cântărire corespunzător sigilat şi se notează greutatea;

8.2.2. se transferă cu pipeta 9 ml de soluţie de etanol 400 ml/l (5.13) şi se notează greutatea;

8.2.3. se adaugă 1 ml de soluţie standard E (5.14.5) şi se notează greutatea;

8.2.4. se agită puternic materialul de testare (cel puţin 20 de inversări); Probele trebuie să se păstreze la temperatura sub 5 °C înainte de analiză, pentru a minimiza pierderile prin volatilizare.

8.3. Test preliminar

Se injectează soluţia standard C (5.14.3) pentru a se asigura că toţi analiţii sunt separaţi cu o rezoluţie minimă de 1,3 (cu excepţia 2-metilbutan-1-olului şi a 3-metilbutan-1-olului).

8.4. Calibrare

Calibrarea trebuie să se verifice folosind următoarea procedură. Se asigură un răspuns liniar prin analiza succesivă a trei exemplare din fiecare soluţie standard de liniaritate (5.14.6.), care conţine un standard intern (IS). Din platourile sau vârfurile de maxim ale integratorului pentru fiecare injectare se calculează raportul R pentru fiecare congener şi se realizează un grafic pentru R versus rata de concentraţie a congenerului faţă de standardul intern (IS). Trebuie să se obţină o diagramă liniară cu un coeficient de corelare de cel puţin 0,99.

8.5. Determinarea

Se injectează o soluţie standard C (5.14.3) şi 2 soluţii standard QC (5.14.7). Se continuă cu probe necunoscute (preparate conform subpct. 8.1 şi 8.2), inserând un standard QC la fiecare zece probe, pentru a asigura stabilitatea analitică. Se injectează o soluţie standard C (5.14.3) după fiecare cinci probe.

9. Calcule

Se poate folosi un sistem automat de tratare a datelor, cu condiţia ca datele să poată fi verificate cu ajutorul principiilor descrise în metoda menţionată în continuare.

Se măsoară fiecare platou sau vârf de maxim pentru congener şi vârfurile standardului intern.

9.1. Calcularea factorului de răspuns

Din cromatograma injectării de soluţie standard C (5.14.3), se calculează factorii de răspuns pentru fiecare congener folosind ecuaţia (1).

unde:

IS = standard intern;

Conc. congener = concentraţia de congener în soluţia C (5.14.3);

Conc. IS = concentraţia standardului intern în soluţia C (5.14.3);

9.1.2. analiza probei

Folosind ecuaţia (2) menţionată în continuare, se calculează concentraţia fiecărui congener din probe.

unde:

M_PROBĂ = greutatea probei (8.1.2);

M_IS = greutatea standardului intern (8.1.3);

Conc. IS = concentraţia de standard intern în soluţia E (5.14.5);

RF = factor de răspuns calculat folosind ecuaţia 1;

9.1.3. analiza soluţiei standard de control al calităţii

Folosind ecuaţia (3) menţionată în continuare, se calculează recuperarea procentuală a valorii ţintă pentru fiecare congener în standardele de control al calităţii (5.14.7):

Concentraţia analitului în standardul QC se calculează folosind ecuaţiile (1) şi (2) menţionate anterior.

9.2. Prezentarea finală a rezultatelor

Rezultatele sunt convertite din μ/g în g la 100 litri alcool absolut pentru probe, folosind ecuaţia (4):

unde:

ƍ = densitatea în kg/m³.

Rezultatele se menţionează cu 3 cifre semnificative şi maximum o zecimală (de exemplu, 11,4 g la 100 l alcool absolut).

10. Asigurarea calităţii şi controlul calităţii (pentru metoda validată)

Cu ajutorul ecuaţiei (2) menţionate anterior se calculează concentraţia fiecărui congener din soluţiile standard de control al calităţii, preparate conform procedurii de la subpct. 8.1.1-8.1.4. Cu ajutorul ecuaţiei (3) se calculează procentul de recuperare a valorii-ţintă. Dacă rezultatele analizate se încadrează în limitele a ± 10 % din valorile teoretice, pentru fiecare congener, se poate începe analiza. În caz contrar, se recomandă o investigaţie, pentru a găsi cauza inexactităţii şi pentru a întreprinde măsuri de remediere corespunzătoare.

11. Caracteristici de performanţă ale metodei (precizia)

Rezultatele statistice ale testului interlaboratoare

Tabelele următoare prezintă valorile pentru următorii compuşi: etanal, acetat de etil, acetal, etanal total, metanol, butan-2-ol, propan-1-ol, butan-1-ol, 2- metil-propan-1-ol, 2 metil-butan-1-ol, 3 metil-butan-1-ol.

Următoarele date au fost preluate dintr-un studiu internaţional de performanţă a metodei, efectuat cu proceduri acceptate la nivel internaţional.

Secţiunea a 3-a

Determinarea acidităţii volatile a băuturilor spirtoase

1. Domeniu de aplicare

Metoda a fost validată printr-un test interlaboratoare pe rom, brandy, rachiu de tescovină şi rachiu de fructe, la niveluri variind între 30 mg/l şi 641 mg/l.

2. Referinţe normative

SM SR EN ISO 3696:2006 – Apă utilizată pentru laboratoare analitice. Specificaţii şi metode de analiză.

3. Definiţii:

3.1. aciditatea volatilă se calculează prin scăderea acidităţii fixe din aciditatea totală;

3.2. aciditatea totală reprezintă suma acidităţilor titrabile;

3.3. aciditatea fixă reprezintă aciditatea reziduului rămas după evaporarea până la uscare a băuturii spirtoase.

4. Principiu

Aciditatea totală şi aciditatea fixă sunt determinate prin titrare sau prin potenţiometrie.

5. Reactivi şi materiale

Pe durata analizei, dacă nu se specifică altfel, se utilizează doar reactivi cu grad analitic recunoscut şi apă de cel puţin gradul 3, conform definiţiei din SM SR EN ISO 3696:2006:

5.1. soluţie de hidroxid de sodiu (NaOH) 0,01 M;

5.2. soluţie-indicator mixt:

se cântăreşte 0,1 g de carmin indigo şi 0,1 g de roşu de fenol;

se dizolvă în 40 ml apă şi se completează până la 100 ml cu etanol.

6. Aparatură şi echipamente

Aparatură indirectă de laborator, sticlărie gradată A şi următoarele:

6.1. pompă de apă;

6.2. evaporator de tip rotativ sau o baie cu ultrasunete;

6.3. echipament pentru titrate potenţiometrică (opţional).

7. Prelevare şi probe

Probele se depozitează la temperatura camerei înainte de analiză.

8. Mod de lucru

8.1. Aciditate totală

8.1.1. Pregătirea probei

Băutura spirtoasă se iradiază cu ultrasunete (ultrasonicare) sau se agită timp de două minute în vid pentru a se elimina dioxidul de carbon, dacă este necesar.

8.1.2. Titrare

Se transferă cu pipeta 25 ml din băutura spirtoasă într-un balon Erlenmeyer de 500 ml.

Se adaugă aproximativ 200 ml de apă distilată fiartă şi răcită (proaspăt pregătită zilnic) şi 2-6 picături de soluţie indicator mixt (5.2).

Se titrează cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,01 M (5.1) până culoarea galben-verzuie devine violetă, în cazul băuturii spirtoase incolore şi, respectiv, până culoarea galben-maronie devine roşu-maronie, în cazul băuturii spirtoase maronii.

Titrarea se poate realiza, de asemenea, prin potenţiometrie, până la pH 7,5.

Se notează cu “n1 ml” volumul soluţiei de hidroxid de sodiu 0,01 M adăugate.

8.1.3. Calculare

Aciditatea totală (AT), exprimată în miliechivalenţi pe litru de băutură spirtoasă, este egală cu 0,4 × n₁.

Aciditatea totală (AT′), exprimată în miligrame de acid acetic pe litru de băutură spirtoasă, este egală cu 24 × n₁.

8.2. Aciditate fixă

8.2.1. Pregătirea probei

Se lasă să se evapore 25 ml din băutura spirtoasă, până la uscare:

Se transferă cu pipeta 25 ml din băutura spirtoasă într-o placă cilindrică de evaporare cu fundul plat cu diametru de 55 mm. În timpul primei ore de evaporare, placa de evaporare se plasează pe capacul unei băi de apă la fierbere, în aşa fel încât lichidul să nu fiarbă, întrucât fierberea ar conduce la pierderi prin stropire.

Se finalizează uscarea aşezând placa de evaporare într-un cuptor de uscare la 105 °C timp de două ore. Se lasă placa de evaporare să se răcească într-un desicator.

8.2.2. Titrare

Se dizolvă reziduul rămas după evaporarea cu apă distilată fiartă şi răcită (proaspăt pregătită zilnic), se completează până la un volum de circa 100 ml şi se adaugă 2-6 picături de soluţie indicator mixt (5.2).

Se titrează cu soluţie de hidroxid de sodiu 0,01 M (5.1).

Titrarea se poate realiza, de asemenea, prin potenţiometrie până la pH 7,5.

Se notează cu n₂ ml volumul soluţiei de hidroxid de sodiu 0,01 M adăugate.

8.2.3. Calculare

Aciditatea fixă (AF), exprimată în miliechivalenţi pe litru de băutură spirtoasă, este egală cu 0,4 × n₂.

Aciditatea fixă (AF), exprimată în miligrame de acid acetic pe litru de băutură spirtoasă, este egală cu 24 × n₂.

9. Calcularea acidităţii volatile

9.1. Se exprimă în miliechivalenţi pe litru:

fie:

AT = aciditatea totală în miliechivalenţi pe litru;

AF = aciditatea fixă în miliechivalenţi pe litru;

Aciditatea volatilă, AV, în miliechivalenţi pe litru, este egală cu: AT – AF;

9.2. se exprimă în miligrame de acid acetic pe litru:

unde:

AT′ = aciditatea totală în miligrame de acid acetic pe litru;

AF′ = aciditatea fixă în miligrame de acid acetic pe litru;

Aciditatea volatilă, AV, în miligrame de acid acetic pe litru, este egală cu:

AT′ – AF′;

9.3. se exprimă în grame de acid acetic pe hl de alcool pur 100 % vol şi este egală cu:

unde:

A este tăria alcoolică în volume a băuturii spirtoase.

10. Caracteristici de performanţă ale metodei (precizia)

10.1. Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost preluate dintr-un studiu internaţional de performanţă a metodei efectuat cu proceduri acceptate la nivel internaţional [1], [2].

Tipuri de probe:

A – rachiu de prune; nivel de ramificare*;

b – rom i; duplicate oarbe;

c – rom ii; nivel de ramificare*;

d – şliboviţă; duplicate oarbe;

e – brandy; duplicate oarbe;

f – rachiu de tescovină; duplicate oarbe.

______________________________

^[1] “Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method-Performance Studies”, Horwitz, W. (1995) Pure and Applied Chemistry 67, 332-343.

^[2] Horwitz, W. (1982) Analytical Chemistry 54, 67A-76A.

Capitolul IV

ANETOLUL. DETERMINAREA TRANS-ANETOLULUI

ÎN BĂUTURILE SPIRTOASE PRIN CROMATOGRAFIE

ÎN FAZĂ GAZOASĂ

1. Domeniu de aplicare

Prezenta milizare analitică de laborator – Caracteristici şi metode de testare.

3. Principiu

Concentraţia în trans-anetol a băuturii spirtoase se determină prin cromatografie în fază gazoasă (GC). După adăugarea aceleiaşi cantităţi de etalon intern, de exemplu 4-alilanisol (estragol), când estragolul nu este prezent în mod natural în eşantion, eşantionul de testare, pe de o parte, şi soluţia de referinţă conţinând trans-anetol de concentraţie cunoscută, pe de altă parte, ambele se diluează apoi cu ajutorul unei soluţii de etanol de 45 % şi se injectează direct în cromatograf. Este necesară o extracţie înainte de prepararea şi analiza eşantionului pentru băuturile spirtoase cu o concentraţie mare în glucide.

4. Reactivi şi materiale

În procesul analizei se utilizează exclusiv reactivi de o puritate de minimum 98 % şi apă din minimum clasa 3, în conformitate cu definiţia standardului SM SR EN ISO 3696:2006.

Substanţele de referinţă trebuie păstrate la rece (aproximativ 4 °C), într-un loc ferit de lumină, în recipiente de aluminiu sau în flacoane speciale din sticlă colorată (brună) pentru reactivi. Dopurile trebuie prevăzute, de preferinţă, cu un dispozitiv de etanşare din aluminiu. Trans-anetolul trebuie “decongelat” din starea sa cristalină înainte de utilizare, dar în niciun caz temperatura sa nu trebuie să depăşească 35 °C.

4.1. Etanol de 96 % vol. (CAS 64-17-5);

4.2. 1-metoxi-4-(1-propenil) benzen; (trans-anetol) (CAS 4180-23-8);

4.3. etalon intern propus: 4-alilanisol, (estragol) (CAS 140-67-0);

4.4. etanol de 45 % vol.;

Se adaugă 560 g de apă distilată la 378 g de etanol de 96 % vol.;

4.5. Prepararea soluţiilor-etalon

Toate soluţiile-etalon trebuie păstrate la temperatura camerei (15-35 °C), într-un loc ferit de lumină, în recipiente de aluminiu sau în flacoane din sticlă colorată (brună) pentru reactivi. Dopurile trebuie prevăzute, de preferinţă, cu un dispozitiv de etanşare din aluminiu.

Trans-anetolul şi 4-alilanisolul sunt, practic, insolubile în apă, de aceea este necesar să fie dizolvate în puţin etanol de 96 % (subpct. 4.1) înainte de adăugarea etanolului de 45 % (subpct. 4.4).

Soluţiile-mamă trebuie reînnoite săptămânal.

4.5.1. Soluţia-etalon A

Soluţie-mamă de trans-anetol (concentraţie: 2 g/l)

Se cântăresc 40 mg de trans-anetol (subpct. 4.2) într-un balon gradat de 20 ml (sau 400 mg în 200 ml etc.). Se adaugă puţin etanol de 96 % (subpct. 4.1) şi se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (subpct. 4.4). Se amestecă bine.

4.5.2. Soluţia-etalon intern B

Soluţie-mamă de etalon intern, de exemplu, de estragol (concentraţie: 2 g/l)

Se cântăresc 40 mg de estragol ( subpct. 4.3) într-un balon gradat de 20 ml (sau 400 mg în 200 ml etc.). Se adaugă puţin etanol de 96 % (subpct. 4.1) şi se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (subpct. 4.4). Se amestecă bine.

4.5.3. Soluţii utilizate pentru verificarea linearităţii răspunsului detectorului cu ionizare în flacără

Răspunsul privind linearitatea la detectorul cu ionizare în flacără trebuie controlat în vederea analizei pentru o serie de concentraţii ale trans-anetolului din băuturile spirtoase de la 0 g/l până la 2,5 g/l. În timpul procedurii de analiză, eşantioanele necunoscute de băuturi spirtoase ce trebuie analizate se diluează de 10 ori (subpct. 8.3). Pentru condiţiile analizei descrise în prezenta metodă, soluţiile-mamă ce corespund unor concentraţii de 0 g/l, 0,05 g/l, 0,1 g/l, 0,15 g/l, 0,2 g/l şi 0,25 g/l de trans-anetol în eşantionul de analizat se prepară după cum urmează: se prelevează cu ajutorul pipetelor 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml şi 2,5 ml de soluţie-mamă A (subpct. 4.5.1) şi se introduc prelevările în baloane gradate separate de 20 ml. În fiecare balon, se introduc cu o pipetă 2 ml de soluţie-etalon intern B (subpct. 4.5.2) şi se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. Se amestecă bine.

Se utilizează soluţia-martor (subpct. 8.4) ca soluţie de 0 g/l.

4.5.4. Soluţia-etalon C

Se introduc cu pipeta 2 ml de soluţie etalon A (subpct. 4.5.1) într-un balon gradat de 20 ml, se adaugă 2 ml de soluţie etalon intern B (subpct. 4.5.2) şi se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (subpct. 4.4). Se amestecă bine.

5. Aparatură şi echipamente necesare:

5.1. cromatograf în fază gazoasă, dotat cu un detector cu ionizare în flacără şi cu un integrator sau orice alt sistem de colectare şi de gestionare a datelor, capabil să măsoare ariile sau înălţimile vârfului şi echipat cu un dispozitiv automat de eşantionare sau cu aparatele necesare pentru injectarea manuală a eşantionului;

5.2. injector divizat/nedivizat;

5.3. coloană cromatografică capilară cu următoarele caracteristici, de exemplu:

lungimea: 50 m;

diametrul intern: 0,32 mm;

grosimea filmului: 0,2 μm;

faza staţionară: FFAP – polimer poros reticulat din polietilen glicol modificat cu TPA;

5.4. materialele de laborator de utilizare curentă: sticlărie gradată de precizie A, balanţă de analiză (precizie: ± 0,1 mg).

6. Condiţii de desfăşurare a cromatografiei în fază gazoasă

Tipul şi dimensiunile coloanei, precum şi condiţiile de operare ale cromatografiei în fază gazoasă trebuie să permită separarea anetolului de etalonul intern şi de orice altă substanţă ce ar putea interveni. Condiţiile tipice de lucru pentru coloana prezentată ca exemplu la subpct. 5.3 sunt următoarele:

6.1. gaz transportor: heliu analitic;

6.2. debit: 2 ml/min;

6.3. temperatura injectorului: 250 °C;

6.4. temperatura detectorului: 250 °C;

6.5. condiţii de temperatură ale cuptorului: palier izoterm la 180 °C timp de 10 minute;

6.6. volum de injectare: 1 μl, raport 1:40.

7. Eşantioane

Eşantioanele trebuie păstrate la temperatura camerei, ferite de lumină şi de frig.

8. Mod de lucru

8.1. Căutarea prezenţei eventuale a estragolului în eşantion

Pentru a se asigura că eşantionul nu conţine în mod natural estragol, este necesar să se efectueze o analiză-martor, fără adăugarea vreunui etalon intern. Dacă eşantionul conţine în mod natural estragol, atunci se alege alt etalon intern (de exemplu, mentolul).

Se introduc cu o pipetă 2 ml de eşantion într-un balon gradat de 20 ml şi se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (subpct. 4.4). Se amestecă bine.

8.2. Prepararea eşantioanelor necunoscute

Se introduc cu o pipetă 2 ml de eşantion într-un balon gradat de 20 ml, apoi se adaugă 2 ml de soluţie-etalon intern B (subpct. 4.5.2) şi se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (subpct. 4.4). Se amestecă bine.

8.3. Analiză martor

Se introduc cu o pipetă 2 ml de soluţie-etalon intern B (subpct. 4.5.2) într- un balon gradat de 20 ml şi se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (subpct. 4.4). Se amestecă bine.

8.4. Test de linearitate

Înainte de începerea analizei, trebuie verificată linearitatea răspunsului detectorului cu ionizare în flacără, analizând de trei ori succesiv fiecare dintre soluţiile-etalon pentru verificarea linearităţii (subpct. 4.5.3).

De la ariile sau de la înălţimile vârfului integratorului, pentru fiecare injectare, se reprezintă grafic concentraţia, în g/l, a soluţiei-mamă corespunzătoare în funcţie de raportul R.

R = aria sau înălţimea vârfului trans-anetolului împărţită la înălţimea sau la aria vârfului estragolului.

Se obţine o reprezentare lineară.

8.5. Determinare

Se injectează soluţia-martor (subpct. 8.3), apoi soluţia-etalon C (subpct. 4.5.4), urmată de unul dintre etaloanele de linearitate (subpct. 4.5.3) care va servi drept eşantion de control al calităţii (acesta se poate alege cu referire la concentraţia probabilă a trans-anetolului în eşantionul necunoscut), apoi cinci eşantioane necunoscute (subpct. 8.2). Pentru a asigura stabilitatea analitică, se introduce un eşantion de control al linearităţii (de control al calităţii) după fiecare serie de cinci eşantioane necunoscute.

9. Calcularea factorului de răspuns

Se măsoară ariile vârfului (utilizând un integrator sau alt sistem de colectare şi de gestionare a datelor) sau înălţimile vârfului (integrare manuală) pentru trans- anetol şi pentru etalonul intern.

9.1. Calcularea factorului de răspuns (RF_i)

Factorul de răspuns se calculează în următorul mod:

RF_i = (C_i/aria sau înălţimea_i) * (aria sau înălţimea_is/C_is),

unde:

C_i – concentraţia trans-anetolului în soluţia etalon A (subpct. 4.5.1);

C_{is –} concentraţia etalonului intern în soluţia etalon B (subpct. 4.5.2);

aria_i – aria (sau înălţimea) vârfului trans-anetolului ;

aria_is – aria (sau înălţimea) vârfului etalonului intern.

Factorul RF_i se calculează din cele cinci eşantioane de soluţie C (subpct. 4.5.4).

9.2. Analiza soluţiilor de testare a linearităţii răspunsului detectorului cu ionizare în flacără

Se injectează soluţiile de testare a linearităţii (subpct. 4.5.3).

9.3. Analiza eşantionului

Se injectează soluţia de eşantion necunoscut (subpct. 8.2).

10. Calcularea rezultatelor

Formula pentru calcularea concentraţiei trans-anetolului este următoarea:

c_i = C_is * (aria sau înălţimea_i/aria sau înălţimea_is)*RF_i,

unde:

c_{i –} concentraţia necunoscută a trans-anetolului;

C_is – concentraţia etalonului intern în eşantionul necunoscut (subpct. 4.5.2);

aria sau înălţimea_i – aria sau înălţimea vârfului trans-anetolului;

aria sau înălţimea_is – aria sau înălţimea vârfului etalonului intern;

RF_i – coeficientul răspunsului (calculat conform subpct. 9.1).

Concentraţia trans-anetolului se exprimă în grame pe litru, cu o zecimală.

11. Asigurarea şi controlul calităţii

Cromatogramele trebuie să prezinte o bună separare a anetolului de etalonul intern, precum şi de orice alte substanţe ce ar putea interveni. Valoarea RF_i se calculează din rezultatele celor cinci injecţii de soluţie C (subpct. 4.5.4). În cazul în care coeficientul de variaţie [CV % = (decalaj standard/medie)*100] se încadrează în jurul valorii de 1 %, valoarea medie a factorului RF_i este acceptabilă.

Calculul anterior trebuie utilizat pentru a calcula concentraţia trans-anetolului din eşantionul ales pentru controlul calităţii dintre soluţiile pentru controlarea linearităţii (subpct. 4.5.3).

Dacă rezultatele medii calculate, pornind de la analiza soluţiei pentru controlarea linearităţii alese ca eşantion intern de control al calităţii (ICC), se încadrează în jurul valorii de 2,5 % din valoarea lor teoretică, atunci rezultatele obţinute pentru eşantioanele necunoscute sunt considerate acceptabile.

12. Tratarea eşantioanelor de băuturi spirtoase cu un conţinut mare de zahăr şi a eşantioanelor de lichior înainte de analiza prin cromatografie în fază gazoasă

Extragerea alcoolului din băuturile spirtoase cu un conţinut mare de zahăr se realizează pentru a determina concentraţia în trans-anetol prin cromatografia capilară în fază gazoasă.

12.1. Principiu

Se prelevează o parte alicotă din eşantionul de lichior, la care se adaugă etalonul intern, la o concentraţie similară celei a analitului (trans-anetolul) prezent în lichior. Se adaugă apoi fosfat de sodiu dodecahidrat şi sulfat de amoniu anhidru. Amestecul se agită bine şi se refrigerează. Se separă două faze, iar faza alcoolică superioară se recuperează. Se prelevează o parte alicotă din această fază alcoolică şi se diluează cu o soluţie de etanol de 45 % vol. (subpct. 4.4). În acest stadiu nu se adaugă niciun etalon intern, deoarece acesta a fost deja adăugat. Soluţia obţinută se analizează prin cromatografie în fază gazoasă.

12.2. Reactivi şi materiale

În procesul extracţiei, se utilizează exclusiv reactivi de o puritate de minimum 99 %:

12.2.1. sulfat de amoniu anhidru (CAS 7783-20-2);

12.2.2. fosfat de sodiu dibazic, dodecahidrat (CAS 10039-32-4).

12.3. Aparatură şi echipamente

Baloane conice, baloane de separare, frigider.

12.4. Mod de lucru

12.4.1. Căutarea estragolului în eşantion

Pentru a se asigura că eşantionul nu conţine în mod natural estragol, este necesar să se efectueze o prelevare-martor (subpct. 12.6.2) şi să se realizeze analiza acesteia fără a vreun etalon intern. Dacă se demonstrează că eşantionul conţine în mod natural estragol, este necesar să se aleagă alt etalon intern.

12.4.2. Extragerea

Se introduc cu pipeta 5 ml de etanol de 96 % vol. (subpct. 4.1) într-un balon conic, apoi se adaugă succesiv 50 mg de etalon intern (subpct. 4.3) şi 50 ml de eşantion. Se adaugă 12 g de sulfat de amoniu anhidru (subpct. 12.2.1) şi 8,6 g de fosfat de sodiu dibazic, dodecahidrat (subpct. 12.2.2). Se închide balonul conic.

Se agită balonul timp de cel puţin treizeci de minute. Se poate utiliza un dispozitiv de agitare mecanică, dar nu o bară magnetică pentru agitare acoperită cu teflon, deoarece teflonul absoarbe o parte din analit. Trebuie reţinut că sărurile adăugate nu se vor dizolva complet.

Balonul închis se pune în frigider (T < 5 °C) timp de cel puţin două ore.

După aceea, ar trebui să poată fi observate două straturi distincte în fază lichidă şi un reziduu solid. Stratul de alcool trebuie să fie limpede. Dacă nu este aşa, balonul se pune din nou în frigider până se observă o separare netă.

Când stratul de alcool este limpede, se prelevează cu grijă o parte alicotă (10 ml, de exemplu), fără a tulbura stratul apos, apoi se pune într-un flacon de sticlă brună şi se închide cu grijă.

12.4.3. Prepararea extractului de eşantion ce trebuie analizat

Se aşteaptă până când extractul (subpct. 12.4.2) ajunge la temperatura camerei.

Se prelevă 2 ml din stratul de alcool al extractului de eşantion la temperatura camerei, se introduc cu pipeta într-un balon gradat de 20 ml, se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (subpct. 4.4) şi se amestecă bine.

12.5. Determinare

Se urmează modul de lucru prezentat la subpct. 8.5.

12.6. Calcularea rezultatelor

Pentru calcularea rezultatelor se utilizează următoarea formulă:

unde:

m_is – masa etalonului intern (subpct. 4.3) prelevat (subpct. 12.4.2) (în miligrame);

V – volumul eşantionului necunoscut (50 ml);

RF_i – factorul de răspuns (subpct. 9.1);

aria_i – aria vârfului trans-anetolului;

aria_is – aria vârfului etalonului intern.

Rezultatele se exprimă în grame pe litru, cu o zecimală.

12.7. Controlul şi asigurarea calităţii

Se urmează modul de lucru prezentat la subpct. 11.

13. Caracteristicile de performanţă ale metodei (precizia)

Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Tabelele de mai jos prezintă valorile anetolului.

Datele menţionate provin dintr-un studiu internaţional privind performanţele metodei, realizat conform procedurilor autorizate la nivel internaţional.

Tipuri de eşantioane:

A – “pastis”, duplicate oarbe;

B – “pastis”, duplicate oarbe;

C – “pastis”, duplicate oarbe;

D – “pastis”, duplicate oarbe;

E – “pastis”, duplicate unice;

F – “pastis”, duplicate unice.

Tipuri de eşantioane:

G – ouzo, niveluri de ramificare (*);

H – anason, duplicate oarbe;

I – lichior cu aromă de anason, duplicate;

J – lichior cu aromă de anason, duplicate.

Capitolul V

ACIDUL GLICIRIZIC. DETERMINAREA ACIDULUI GLICIRIZIC PRIN

CROMATOGRAFIE LICHIDĂ DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ

1. Domeniu de aplicare

Prezenta metodă este recomandată pentru determinarea acidului glicirizic în băuturile spirtoase cu aromă de anason, prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC). Regulamentul privind definirea, descrierea, prezentarea şi etichetarea băuturilor ce conţin alcool, aprobat prin Hotărârea Guvernului nr.589/2023, prevede că orice băutură spirtoasă cu aromă de anason, numită “pastis”, trebuie să prezinte un conţinut în acid glicirizic cuprins între 0,05 g şi 0,5 g per litru.

2. Referinţe normative

SM SR EN ISO 3696:2006 – Apă pentru utilizare analitică de laborator – Caracteristici şi metode de testare.

3. Principiu

Concentraţia în acid glicirizic se determină utilizând cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC) cu detectare UV. Se filtrează o soluţie-etalon şi eşantionul de testare şi se injectează separat şi direct în sistemul HPLC.

4. Reactivi şi materiale

În procesul analizei, se folosesc exclusiv reactivi adaptaţi la cromatografia lichidă, etanol absolut şi apă de clasa 3, în conformitate cu definiţia din standardul SM SR EN ISO 3696:2006:

4.1. etanol de 96 % vol. (CAS 64-17-5);

4.2. glicirizinat de amoniu C₄₂H₆₂O₁₆.NH₃ (Sare de acid glicirizic monoamoniacal);

(Masă molară: 839,98), (CAS 53956-04-0): puritate de minimum 90 %;

(Masă molară a acidului glicirizic: 822,94);

4.3. acid acetic cristalizabil, CH₃COOH, (CAS 64-19-7);

4.4. metanol, CH₃OH (CAS 67-56-1);

4.5. etanol de 50 % vol.

Pentru 1 000 ml la 20 °C:

4.5.1. etanol de 96 % vol. (subpct. 4.1): 521 ml,

4.5.2. apă (pct. 2.): 511 ml;

4.6. prepararea soluţiilor de eluare pentru cromatografie lichidă de înaltă performanţă.

4.6.1. Solvent de eluare A (exemplu):

80 de părţi (volume) de apă (pct. 2);

20 de părţi (volume) de acid acetic (subpct. 4.3).

Se degazează solventul de eluare timp de cinci minute.

Dacă apa care se utilizează nu a fost microfiltrată, se recomandă filtrarea solventului de eluare preparat cu ajutorul unui filtru pentru solvenţi organici cu un diametru al porilor mai mic sau egal cu 0,45 μm.

4.6.2. Solvent de eluare B

Metanol (subpct. 4.4)

4.7. Prepararea soluţiilor etalon

Toate soluţiile etalon trebuie reînnoite la fiecare două luni.

4.7.1. Soluţia de referinţă C

Se cântăresc, cu o eroare de maximum 0,1 mg, 25 mg de glicirizinat de amoniu (subpct. 4.2) într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă etanol de 50 % vol. (subpct. 4.5) şi se dizolvă glicirizinatul de amoniu. După dizolvare, se completează până la semn cu o nouă cantitate de etanol de 50 % vol. (subpct. 4.5).

Se filtrează cu ajutorul unui filtru pentru solvenţi organici.

4.7.2. Soluţii-etalon (folosite pentru a controla linearitatea răspunsului instrumentelor)

Se prepară o soluţie-mamă de 1,0 g/l, introducând, cu o eroare de maximum 0,1 mg, 100 mg de glicirizinat de amoniu într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă puţin etanol de 50 % vol. (subpct. 4.5) şi se dizolvă glicirizinatul de amoniu. După dizolvare, se completează până la semn cu o nouă cantitate de etanol de 50 % vol. (subpct. 4.5).

Se prepară cel puţin alte patru soluţii ce corespund la 0,05 g/l, 0,1 g/l, 0,25 g/l şi 0,5 g/l de glicirizinat de amoniu, prelevând cu ajutorul unei pipete, respectiv, 5 ml, 10 ml, 25 ml şi 50 ml din soluţia-mamă de 1,0 g/l în baloane de 100 ml, gradate, separate. Se completează apoi până la semn cu o nouă cantitate de etanol de 50 % vol. (subpct. 4.5) şi se amestecă bine.

Se filtrează toate soluţiile cu ajutorul unui filtru pentru solvenţi organici.

5. Aparatură şi echipamente

5.1. Sistem de separare

5.1.1. Cromatografie lichidă de înaltă performanţă;

5.1.2. sistem de pompare ce permite obţinerea şi menţinerea unui debit constant sau programat de înaltă precizie;

5.1.3. sistem de detectare prin spectrofotometrie în domeniul UV: se reglează la 254 nm;

5.1.4. sistem de degazare a solvenţilor;

5.2. integrator computerizat sau înregistrator ce funcţionează în deplină compatibilitate cu restul sistemului;

5.3. coloană (exemplu):

material: oţel inoxidabil sau sticlă;

diametru interior: 4-5 mm;

lungime: 100-250 mm;

fază staţionară: silicagel reticulat cu grup funcţional octadecil (C18), de preferinţă sferic, cu o granulometrie maximă de 5 μm;

5.4. echipament de laborator:

5.4.1. balanţă de analiză (precizie: 0,1 mg);

5.4.2. sticlărie gradată de precizie (clasa A);

5.4.3. dispozitiv de filtrare pentru volume mici pe micromembrană.

6. Condiţii ale cromatografiei

6.1. Caracteristicile eluării (exemplu):

6.1.1. debit: 1 ml/minut;

6.1.2. solvent A = 30 %;

6.1.3. solvent B = 70 %.

6.2. detectare:

6.2.1. UV = 254 nm.

7. Mod de lucru

7.1. Prepararea eşantionului de băutură spirtoasă

Se filtrează, dacă este necesar, printr-un filtru pentru solvenţi organici (diametrul porilor: 0,45 μm).

7.2. Determinare

După stabilizarea condiţiilor cromatografice:

7.2.1. se injectează 20 μl de soluţie de referinţă C (subpct. 4.7.1);

7.2.2. se injectează 20 μl de soluţie de eşantion;

7.2.3. se compară cele două cromatograme. Se identifică vârfurile acidului glicirizic după timpul lor de retenţie. Se măsoară ariile (sau înălţimile) lor şi se calculează concentraţia în g/l, până la două zecimale, folosind următoarea ecuaţie:

unde:

c – concentraţia în g/l a acidului glicirizic în băutura spirtoasă analizată;

C – concentraţia în g/l a glicirizinatului de amoniu în soluţia de referinţă;

h – aria (sau înălţimea) vârfului acidului glicirizic din băutura spirtoasă; analizată

H – aria (sau înălţimea) vârfului acidului glicirizic din soluţia de referinţă;

P – puritatea glicirizinatului de amoniu utilizat ca substanţă de referinţă

(în %);

823 – masa molară a acidului glicirizic;

840 – masa molară a glicirizinatului de amoniu.

8. Caracteristicile de performanţă ale metodei (precizia)

Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Tabelul de mai jos prezintă valorile acidului glicirizic.

Datele menţionate provin dintr-un studiu internaţional privind performanţele metodei, realizat conform procedurilor autorizate la nivel internaţional.

Tipuri de eşantioane:

A – “pastis”, duplicate oarbe;

B – “pastis”, duplicate, la două niveluri de concentrare (*);

C – “pastis”, duplicate oarbe;

D – “pastis”, duplicate oarbe;

E – “pastis”, duplicate oarbe.

Capitolul VI

CALCONE. METODĂ DE CROMATOGRAFIE LICHIDĂ

DE ÎNALTĂ PERFORMANŢĂ PENTRU A VERIFICA

PREZENŢA CALCONELOR ÎN PASTIS

1. Domeniu de aplicare

Prezenta metodă este adecvată pentru determinarea prezenţei calconelor în băuturile cu aromă de anason. Calconele sunt coloranţi naturali din familia flavonoidelor, prezenţi în lemnul dulce (Glycyrrhiza glabra).

Pentru ca o băutură spirtoasă cu aromă de anason să se numească “pastis”, conform Regulamentului privind definirea, descrierea, prezentarea şi etichetarea băuturilor ce conţin alcool, aprobat prin Hotărârea Guvernului nr.589/2023, aceasta trebuie să conţină calcone.

2. Referinţe normative

SM SR EN ISO 3696:2006 – Apă utilizată pentru laboratoare analitice. Specificaţii şi metode de analiză.

3. Principiu

Se prepară o soluţie de extract de lemn dulce de referinţă. Prezenţa sau absenţa calconelor se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă cu detectare UV.

4. Reactivi şi materiale

În procesul analizei se folosesc doar reactivi adaptaţi la cromatografia lichidă de înaltă performanţă. Etanolul trebuie să fie de 96 % vol. Trebuie să se folosească doar apă de clasa 3 (în conformitate cu definiţia din norma SM SR EN ISO 3696:2006):

4.1. etanol de 96 % vol. (CAS 64-17-5);

4.2. acetonitril CH₃CN, (CAS 75-05-8);

4.3. substanţă de referinţă: Glycyrrhiza glabra (lemn dulce)

Lemn dulce (Glycyrrhiza glabra) măcinat mare. Dimensiuni medii ale particulelor de tip “batonaşe”: lungimea 10-15 mm, grosimea 1-3 mm;

4.4. acetat de sodiu CH₃COONa, (CAS 127-09-3);

4.5. acid acetic cristalizabil CH₃COOH, (CAS 64-19-7);

4.6. prepararea soluţiilor.

4.6.1. Etanol de 50 % vol.

Pentru 1 000 ml la 20 °C:

4.6.1.1. etanol de 96 % vol. (subpct. 4.1): 521 ml

4.6.1.2. apă (pct. 2): 511 ml.

4.6.2. Solventul A: acetonitril

Acetonitril (subpct. 4.2) de puritate analitică pentru HPLC se degazează.

4.6.3. Solventul B: 0,1 M dintr-o soluţie tampon de acetat de sodiu cu pH de 4,66

Se cântăresc 8,203 g de acetat de sodiu (subpct. 4.4), se adaugă 6,005 g de acid acetic cristalizabil (subpct. 4.5) şi se completează până la 1 000 ml cu apă (pct. 2) într-un balon gradat.

5. Prepararea extractului de referinţă din Glycyrrhiza glabra (subpct. 4.3):

5.1. se cântăresc 10 g de lemn dulce măcinat (Glycyrrhiza glabra) (subpct. 4.3) şi se pun într-un balon de distilare cu fund rotund;

5.1.1. se adaugă 100 ml de etanol de 50 % vol. (subpct. 4.6.1);

5.1.2. se distilează sub reflux timp de o oră;

5.1.3. se filtrează;

5.1.4. se rezervă filtratul pentru o utilizare ulterioară;

5.2. se recuperează extractul de lemn dulce prezent în filtru;

5.2.1. se pune într-un balon de distilare cu fund rotund;

5.2.2. se adaugă 100 ml de etanol de 50 % vol. (subpct. 4.6.1);

5.2.3. se fierbe sub reflux timp de o oră;

5.2.4. se filtrează. Se păstrează filtratul pentru o utilizare ulterioară;

5.3. extragerea de lemn dulce trebuie să se efectueze de trei ori succesiv;

5.4. se combină cele trei filtrate;

5.5. se evaporă faza solvent (subpct. 5.4) cu ajutorul unui evaporator de tip rotativ;

5.6. se recuperează extractul rezidual (subpct. 5.5) cu 100 ml de etanol de 50 % vol. (subpct. 4.6.1).

6. Aparatură şi echipamente:

6.1. sistem de separare:

6.1.1. cromatografie lichidă de înaltă performanţă;

6.1.2. sistem de pompare ce permite obţinerea şi menţinerea unui debit constant sau programat la înaltă presiune;

6.1.3. sistem de detectare prin spectrofotometrie în domeniul UV/vizibil care se poate regla la 254 nm şi 370 nm;

6.1.4. sistem de degazare a solvenţilor;

6.1.5. cuptor în coloană cu temperatura reglată la 40 °C ± 0,1 °C;

6.2. integrator computerizat sau înregistrator ce funcţionează în compatibilitate cu restul sistemului de separare;

6.3. coloana:

6.3.1. material: oţel inoxidabil sau sticlă;

6.3.2. diametru interior: 4-5 mm;

6.3.3. fază staţionară: silicagel reticulat cu grupare funcţională de tip derivat octadecil (C18), cu o granulometrie maximă de 5 μm (faza reticulată);

6.4. echipament obişnuit de laborator, mai ales:

6.4.1. balanţă de analiză (precizie: ± 0,1 mg);

6.4.2. aparat de distilare echipat cu un condensator cu reflux ce cuprinde, de exemplu:

6.4.2.1. un balon de 250 ml cu fund rotund, cu îmbinare şlefuită standardizată;

6.4.2.2. un condensator cu reflux de o lungime de 30 cm;

6.4.2.3. o sursă de căldură (orice pirogenare a materiilor extractive trebuie evitată cu ajutorul unui dispozitiv corespunzător);

6.4.3. aparat de evaporare de tip rotativ;

6.4.4. dispozitiv de filtrare (de exemplu, pâlnie Buchner);

6.5. condiţii ale cromatografiei (exemplu):

6.5.1. caracteristici de eluare a solvenţilor A (subpct. 4.6.2) şi B (subpct. 4.6.3):

6.5.1.1. se trece de la gradientul 20/80 (v/v) la 50/50 (v/v) în 15 minute;

6.5.1.2. se trece de la gradientul 50/50 (v/v) la 75/25 (v/v) în 5 minute;

6.5.1.3. concentraţia egală la 75/25 (v/v) timp de 5 minute;

6.5.1.4. stabilizare a coloanei între două injectări;

6.5.1.5. concentraţia egală la 20/80 (v/v) timp de 5 minute;

6.5.2. debit: 1 ml/minut;

6.5.3. reglări ale detectorului cu UV.

Detectorul trebuie reglat la 370 nm, pentru a detecta prezenţa calconelor, şi apoi la 254 nm, pentru a detecta acidul glicirizic.

Schimbarea lungimilor de undă (de la 370 nm la 254 nm) trebuie efectuată cu 30 de minute înainte de începerea vârfului de eluare a acidului glicirizic.

7. Mod de lucru

7.1. Prepararea eşantionului de băutură spirtoasă

Se filtrează printr-un filtru pentru solvenţi organici (diametrul porilor: 0,45 μm).

7.2. Prepararea extractului rezidual de lemn dulce (subpct. 5.6)

Înaintea analizei, se procedează la o diluare de 1:10 în etanol de 50 % vol. (subpct. 4.6.1).

7.3. Determinare

7.3.1. Se injectează 20 μl din extractul de lemn dulce preparat (subpct. 7.2).Se efectuează analiza în condiţiile cromatografice descrise anterior (subpct. 6.5);

7.3.2. se injectează 20 μl din eşantion (băutură spirtoasă cu aromă de anason, subpct. 7.1). Se efectuează analiza în condiţiile cromatografice descrise anterior (subpct. 6.5);

7.3.3. se compară cele două cromatograme obţinute. Trebuie să existe o mare asemănare între cele două cromatograme în zona de ieşire a calconelor (în timpul detectării la 370 nm în condiţiile de analiză descrise anterior). Vezi figura 1.

8. Cromatograma caracteristică pentru pastis

Figura 1. Cromatograma obţinută prin metoda descrisă anterior,

indicând prezenţa calconelor într-un “pastis”

Vârfurile de la 1 la 8 corespund calconelor, iar vârful 9 – acidului glicirizic.

9. Caracteristicile de performanţă ale metodei (precizia)

Rezultatele testului interlaboratoare

Tabelul de mai jos prezintă caracteristicile de performanţă pentru identificarea prezenţei sau absenţei calconelor în “pastis” şi în băuturile spirtoase cu aromă de anason.

Datele menţionate provin dintr-un studiu internaţional privind performanţele metodei, realizat conform procedurilor autorizate la nivel internaţional.

Tipuri de eşantioane:

A – “pastis”, duplicate oarbe;

B – “pastis”, eşantion unic;

C – “pastis”, eşantion unic;

D – “pastis” (fără calcone), duplicate oarbe;

E – “pastis” (fără calcone), duplicate oarbe;

F – lichior cu aromă de anason (fără calcone), duplicate oarbe;

G – lichior cu aromă de anason (fără calcone), duplicate oarbe;

H – ouzo, (fără calcone), eşantion unic;

I – ouzo, (fără calcone), eşantion unic;

J – anason (fără calcone), duplicate oarbe;

K – “pastis” (fără calcone), duplicate oarbe.

Capitolul VII

ZAHARURI TOTALE

1. Domeniu de aplicare

Metoda HPLC-RI se aplică pentru a determina zaharurile totale (exprimate ca zahăr invertit) din băuturile spirtoase, cu excepţia lichiorurilor care conţin ouă şi produse lactate.

Metoda a fost validată printr-un test interlaboratoare pentru “pastis”, anason distilat, lichior de cireşe, “crème de” (urmată de numele fructului sau al materiei prime utilizate) şi “crème de cassis”, la niveluri variind între 10,86g/l şi 509,7 g/l. Cu toate acestea, linearitatea răspunsului instrumentului a fost dovedită pentru o concentraţie variind între 2,5 g/l şi 20,0 g/l.

Această metodă nu este destinată pentru determinarea conţinuturilor scăzute de zaharuri.

2. Referinţe normative

SM SR EN ISO 3696:2006 – Apă utilizată pentru laboratoare analitice. Specificaţii şi metode de analiză.

3. Principiu

Cromatografia lichidă de înaltă performanţă testează soluţiile de zahăr, pentru a le stabili concentraţiile de glucoză, fructoză, zaharoză, maltoză şi lactoză.

Această metodă utilizează o fază staţionară de alchilamină şi detectarea refractometriei diferenţiale şi este prezentată ca exemplu. Este posibilă şi utilizarea răşinilor schimbătoare de anioni ca fază staţionară.

4. Reactivi şi materiale:

4.1. glucoză (CAS 50-99-7), cu o puritate de minimum 99 %;

4.2. fructoză (CAS 57-48-7), cu o puritate de minimum 99 %;

4.3. zaharoză (CAS 57-50-1), cu o puritate de minimum 99 %;

4.4. lactoză (CAS 5965-66-2), cu o puritate de minimum 99 %;

4.5. maltoză monohidrată (CAS 6363-53-7), cu o puritate de minimum 99%;

4.6. acetonitril pur (CAS 75-05-8) pentru analiza HPLC;

4.7. apă distilată sau demineralizată, de preferat microfiltrată;

4.8. solvenţi (exemplu):

solventul de eluare este compus din:

75 de părţi (volume) de acetonitril (4.6);

25 de părţi (volume) de apă distilată (4.7).

Se trece heliu prin solventul de eluare, într-un ritm lent, timp de 5-10 minute, înainte de a fi folosit pentru degazare.

Dacă apa utilizată nu a fost microfiltrată, solventul ar trebui să fie filtrat cu ajutorul unui filtru pentru solvenţi organici cu diametrul porilor mai mic decât sau egal cu 0,45 μm;

4.9. etanol absolut (CAS 64-17-5);

4.10. soluţie de etanol (5 %, v/v);

4.11. pregătirea soluţiei-mamă standard (20g/l).

Se cântăresc 2 g din fiecare dintre zaharurile care urmează să fie analizate (subpct. 4.1.-4.5.), se transferă cantitativ într-un balon volumetric de 100 ml.

(N.B.: 2,11 g de maltoză monohidrată echivalează cu 2 g de maltoză)

Se ajustează la 100 ml cu o soluţie de alcool de 5 % vol. (4.10), se agită şi se păstrează la aproximativ + 4 °C. Se prepară o nouă soluţie-mamă o dată pe săptămână;

4.12. pregătirea soluţiilor standard de lucru (2,5 g/l, 5,0 g/l, 7,5 g/l, 10,0 g/l şi 20,0 g/l)

Se diluează soluţia-mamă, 20 g/l, (subpct. 4.11) corespunzător cu o soluţie de alcool de 5 % vol. (subpct. 4.10) pentru a obţine cinci soluţii standard de lucru de 2,5 g/l; 5,0 g/l; 7,5 g/l; 10,0 g/l şi 20,0 g/l. Se filtrează cu un filtru având diametrul porilor mai mic decât sau egal cu 0,45 μm (subpct. 5.3).

5. Aparatură şi echipamente

5.1. Sistemul HPLC care poate asigura rezoluţia liniei de bază pentru toate zaharurile

5.1.1. Cromatograf lichid de înaltă performanţă prevăzut cu valvă de injecţie cu şase orificii şi cu o buclă de 10 μL sau cu orice alt dispozitiv, automat sau manual, pentru injectarea fiabilă a microvolumelor;

5.1.2. sistem de pompare care permite obţinerea şi menţinerea unui debit constant sau programat de înaltă precizie;

5.1.3. refractometru diferenţial;

5.1.4. integrator computerizat sau înregistrator ce funcţionează în compatibilitate cu restul sistemului;

5.1.5. precoloană:

se recomandă ataşarea unei precoloane adecvate la coloana analitică;

5.1.6. coloană (exemplu):

5.1.7. condiţii pentru cromatografie (exemplu):

solvent de eluare (4.8.), debit: 1 ml/minut;

detectare: refractometrie diferenţială.

Pentru a se asigura că detectorul este perfect stabil, acesta ar trebui să fie pornit cu câteva ore înainte de utilizare. Celula de referinţă trebuie să fie umplută cu solvent de eluare;

5.2. balanţa analitică cu o precizie de 0,1 mg;

5.3. dispozitiv de filtrare pentru volume mici cu ajutorul unei micromembrane de 0,45 μm.

6. Depozitarea probelor

La primire, înainte de analiză probele trebuie depozitate la temperatura camerei.

7. Mod de lucru

7.1. Partea A: Pregătirea probei

7.1.1. se agită proba;

7.1.2. se filtrează cu un filtru având diametrul porilor mai mic sau egal cu 0,45 μm (5.3.).

7.2. Partea B: HPLC

7.2.1. determinare

Se injectează 10 μl din soluţiile standard (subpct. 4.12.) şi probe (subpct. 7.1.2.). Se efectuează analiza în condiţii cromatografice adecvate, cum ar fi cele descrise mai sus;

7.2.2. în cazul în care oricare vârf al unei probe are suprafaţa (sau înălţimea) mai mare decât vârful corespunzător în soluţia standard cea mai concentrată, proba trebuie diluată cu apă distilată şi reanalizată.

8. Calculare

Se compară cele două cromatograme obţinute pentru soluţia standard şi pentru băutura spirtoasă. Se identifică vârfurile după timpul lor de retenţie. Se măsoară suprafeţele lor (sau înălţimile), pentru a se calcula concentraţiile prin metoda standard externă. Se iau în considerare toate diluţiile efectuate în timpul pregătirii probei.

Rezultatul final reprezintă suma zaharozei, maltozei, lactozei, glucozei şi fructozei, exprimat ca zahăr invertit în g/l.

Zahărul invertit se calculează ca suma tuturor monozaharidelor şi, reducând dizaharidele prezente, plus cantitatea stoechiometrică de glucoză şi fructoză calculată din zaharoza prezentă.

Zahăr invertit (g/l) = glucoză (g/l) + fructoză (g/l) + maltoză (g/l) + lactoză (g/l) + (zaharoză (g/l) × 1,05),

unde:

1,05 = (masa moleculară a fructozei + masa moleculară a glucozei)/masa moleculară a zaharozei.

9. Caracteristici de performanţă ale metodei (precizia)

9.1. Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost obţinute dintr-un studiu internaţional de performanţă a metodei, efectuat cu proceduri acceptate la nivel internaţional [1], [2].

______________________________

^[1] “Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method- Performance Studies”, Horwitz, W. (1995) Pure and Applied Chemistry 67, 332-343.

^[2] Horwitz, W. (1982) Analytical Chemistry 54, 67A-76A.

Fructoza, glucoza, maltoza

Zaharoza

Zaharuri totale

Capitolul VIII

GĂLBENUŞUL DE OU. DETERMINAREA CONCENTRAŢIEI

DE GĂLBENUŞ DE OU DIN BĂUTURILE SPIRTOASE

PRIN METODA FOTOMETRICĂ

1. Domeniu de aplicare

Prezenta metodă este adecvată pentru determinarea concentraţiei de gălbenuş de ou de la 40 la 250 g/l în lichiorul de ou şi în lichiorul pe bază de ou.

2. Referinţe normative

SM SR EN ISO 3696:2006 – Apă utilizată pentru laboratoare analitice. Specificaţii şi metode de analiză.

3. Principiu

Compuşii fosforoşi solubili în etanol prezenţi în gălbenuşul de ou se extrag şi se determină prin fotometrie sub formă de complex fosfomolibdenic.

4. Reactivi:

4.1. apă dublu-distilată;

4.2. diatomit;

4.3. etanol de 96 % vol. (CAS 64-17-5);

4.4. soluţie de acetat de magneziu de 15 % (CAS 16674-78-5);

4.5. acid sulfuric de 10 % (CAS 7664-93-9);

4.6. acid sulfuric 1N;

4.7. soluţie de fosfat monobazic de potasiu (CAS 778-77-0), KH₂PO₄, de 0,16 g/l;

4.8. reactiv pentru determinarea fosfatului: se dizolvă 20 g de molibdat de amoniu (CAS 12054-85-2), (NH₄)₆Mo₇O₂₄.₄H₂O în 400 ml de apă la 50 °C.

Se dizolvă, în alt recipient, 1 g de vanadat de amoniu (CAS 7803-55-6), NH₄VO₃, în 300 ml de apă caldă, se lasă să se răcească, apoi se adaugă 140 ml de acid nitric concentrat (CAS 7697-37-2). Se combină soluţiile răcite într-un balon gradat de 1 000 ml şi se completează până la gradaţia de 1 000 ml.

5. Aparatură şi echipamente:

5.1. balon conic de 100 ml;

5.2. baie ultrasonică (sau agitator magnetic);

5.3. balon conic de 100 ml;

5.4. baie de apă la 20 °C;

5.5. filtru (Whatman nr.4 sau echivalent);

5.6. creuzet de porţelan (sau de platină);

5.7. baie de apă clocotită;

5.8. placă fierbinte;

5.9. cuptor închis;

5.10. balon gradat de 50 ml;

5.11. balon gradat de 20 ml;

5.12. spectrofotometru reglat la 420 nm;

5.13. cuvă de 1 cm.

6. Eşantioane

Înainte de analiză, eşantioanele se păstrează la temperatura camerei.

7. Mod de lucru

7.1. Pregătirea eşantioanelor

7.1.1. se introduc 10 g de eşantion într-un balon conic de 100 ml (subpct. 5.1);

7.1.2. se adaugă 70 ml de etanol treptat şi în cantităţi mici, amestecând la fiecare adăugare. Amestecul se introduce într-o baie ultrasonică (subpct. 5.2) timp de 15 minute [sau se amestecă cu ajutorul unui agitator magnetic (subpct. 5.2) timp de 10 minute la temperatura camerei];

7.1.3. se transferă conţinutul balonului într-un balon gradat de 100 ml (subpct. 5.3) şi se adaugă volume de etanol de spălare (subpct. 4.3). Se completează cu etanol (subpct. 4.3) până la gradaţia de etalonare, apoi baloanele se pun într-o baie de apă la 20 °C (subpct. 5.4). Se completează până la semnul de etalonare, la temperatura de 20 °C;

7.1.4. se adaugă o cantitate mică de diatomit (subpct. 4.2) şi se filtrează (subpct. 5.5), eliminând primii 20 ml;

7.1.5. se transferă 25 ml de filtrat într-un creuzet de porţelan (sau de platină) (subpct. 5.6). Filtratul trebuie apoi să se concentreze prin evaporare uşoară într-o baie de apă clocotită (subpct. 5.7), după adăugarea a 5 ml de soluţie de acetat de magneziu de 15 % (subpct. 4.4);

7.1.6. se aşează creuzetele pe o placă fierbinte (subpct. 5.8) şi se încălzesc până sunt aproape uscate;

7.1.7. se calcinează reziduul uscat încălzindu-l până la incandescenţă, la 600 °C, într-un cuptor închis (subpct. 5.9) până se obţine o cenuşă albă. Operaţiunea durează cel puţin o oră şi jumătate, dar se poate prelungi toată noaptea;

7.1.8. se recuperează cenuşa cu ajutorul a 10 ml de acid sulfuric de 10 % (subpct. 4.5) şi se transferă cu ajutorul spălărilor de apă distilată (subpct. 4.1) într-un balon gradat de 50 ml (subpct. 5.10). Conţinutul se completează cu apă distilată până la semn, la temperatura camerei. Se rezervă o parte alicotă de 5 ml din această soluţie de cenuşă pentru prepararea soluţiei de eşantion ce se utilizează pentru testarea fotometrică a fosfaţilor.

7.2. Testare fotometrică a fosfaţilor

7.2.1. Soluţie comparativă:

7.2.1.1. se introduc 10 ml de acid sulfuric de 10 % (subpct. 4.5) într-un balon gradat de 50 ml (subpct. 5.10) şi se completează până la semn cu apă distilată (subpct. 4.1);

7.2.1.2. într-un balon gradat de 20 ml (subpct. 5.11), se introduce o parte alicotă de 5 ml din această soluţie (subpct. 7.2.1.1), apoi se adaugă 1 ml de acid sulfuric de 1N (subpct. 4.6) şi 2 ml de reactiv la fosfat (subpct. 4.8). Se completează până la un volum de 20 ml cu apă distilată (subpct. 4.1);

7.2.1.3. se închide, fără a fixa ermetic dopul, se agită şi se încălzeşte într-o baie de apă clocotită (subpct. 5.7) timp de 10 minute, apoi se lasă să se răcească într-o baie de apă (subpct. 5.4) la 20 °C timp de 20 de minute;

7.2.1.4. se varsă această soluţie comparativă într-o cuvă de 1 cm (subpct. 5.13).

7.2.2. Soluţie de eşantion:

7.2.2.1. Într-un balon gradat de 20 ml (subpct. 5.11), se introduce o parte alicotă de 5 ml din soluţia de cenuşă (subpct. 7.1.8), apoi se adaugă 1 ml de acid sulfuric de 1N (subpct. 4.6) şi 2 ml de reactiv la fosfat (subpct. 4.8). Se completează până la un volum de 20 ml cu apă distilată (subpct. 4.1);

7.2.2.2. se închide, fără a fixa ermetic dopul, se agită şi se încălzeşte într-o baie de apă clocotită (subpct. 5.7) timp de 10 minute, apoi se lasă să se răcească într-o baie de apă (subpct. 5.4) la 20 °C timp de 20 de minute;

7.2.2.3. soluţia galbenă care se formează se analizează imediat spectrofotometric (subpct. 5.12) într-o cuvă de 1 cm (subpct. 5.13) la 420 nm în raport cu soluţia comparativă (subpct. 7.2.1.4).

7.2.3. Curba de etalonare:

7.2.3.1. Pentru a stabili curba de etalonare, se adaugă părţi alicote de 2 ml de reactiv la fosfat (subpct. 4.8) în baloane gradate de 20 ml (subpct. 5.11) care conţin fiecare 1 ml de acid sulfuric 1N (subpct. 4.6) şi, respectiv, 0 ml, 2 ml, 4 ml, 6 ml, 8 ml şi 10 ml de soluţie de fosfat monobazic de potasiu (subpct. 4.7) şi se completează până la gradaţia de 20 ml cu apă distilată (subpct. 4.1);

7.2.3.2. se închide, fără a fixa ermetic dopul, se agită şi se încălzeşte într-o baie de apă clocotită (subpct. 5.7) timp de 10 minute, apoi se lasă să se răcească într-o baie de apă (subpct. 5.4) la 20 °C timp de 20 de minute şi se analizează spectrofotometric la 420 nm (subpct. 5.12), într-o cuvă de 1 cm (subpct. 5.13), în raport cu soluţia comparativă (subpct. 7.2.1.4);

7.2.3.3. stabilirea curbei de etalonare

8. Exprimarea rezultatelor

Conţinutul în gălbenuş de ou, exprimat în g/l, se calculează după următoarea formulă:

unde:

110 – factorul de conversie pentru cantitatea totală de P2O5 în g din 100 g de gălbenuş de ou;

mg P₂O₅ – valoarea determinată de curba de etalonare;

densitate – masa per unitate de volum (g/ml) de lichior de ou la temperatura de 20 °C;

E – masa lichiorului de ou în g

40 – factorul de diluare pentru o porţiune de 5 ml de soluţie de cenuşă.

9. Caracteristicile de performanţă ale metodei (precizia)

Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Tabelul de mai jos oferă valorile pentru gălbenuşul de ou.

Datele menţionate provin dintr-un studiu internaţional privind performanţele metodei, realizat conform procedurilor autorizate la nivel internaţional.

Tipuri de eşantioane:

A – Advocaat, duplicate oarbe;

B – Advocaat, duplicate oarbe;

C – Advocaat, duplicate oarbe;

D – Advocaat (diluat), niveluri de ramificare (*);

E – Advocaat, duplicate oarbe.

Capitolul IX

DETERMINAREA URMĂTORILOR COMPUŞI DIN LEMN ÎN BĂUTURILE

SPIRTOASE PRIN METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALTĂ

PERFORMANŢĂ (HPLC): FURFURAL, 5-HIDROXIMETILFURFURAL,

5-METILFURFURAL, VANILINĂ, ALDEHIDĂ SIRINGICĂ, ALDEHIDĂ

CONIFERILICĂ, SINAPALDEHIDĂ, ACID GALIC, ACID ELAGIC,

ACID VANILIC, ACID SIRINGIC ŞI SCOPOLETINĂ

1. Domeniu de aplicare

Metoda se referă la determinarea următorilor compuşi: furfural, 5- hidroximetilfurfural, 5-metilfurfural, vanilină, aldehidă siringică, aldehidă coniferilică, sinapaldehidă, acid galic, acid elagic, acid vanilic, acid siringic şi scopoletină, prin cromatografia lichidă de înaltă performanţă.

2. Referinţă normativă

Metodă analitică recunoscută şi publicată de către OIV cu numărul de referinţă OIV-MA-BS-16: R2009.

3. Principiu

Determinarea prin cromatografia lichidă de înaltă performanţă (HPLC), cu detectare prin spectofotometrie în ultraviolet la mai multe lungimi de undă şi prin spectrofluorimetrie.

4. Reactivi

Reactivii trebuie să fie de calitate analitică. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puţin echivalentă. Este de preferat să se utilizeze apă microfiltrată cu o rezistivitate de 18,2 M Ω^.cm.

4.1. Alcool de 96 % vol.;

4.2. metanol de calitate HPLC (Solvent B);

4.3. acid acetic diluat la 0,5 % vol. (Solvent A);

4.4. faze mobile: (dat numai ca exemplu).

Solvent A (0,5 % acid acetic) şi solvent B (metanol pur). Se filtrează printr-o membrană (cu porozitate 0,45 μm). Dacă este necesar, se degazează într-o baie cu ultrasunete;

4.5. soluţie standard de referinţă cu puritate minimă 99 %: furfural, 5- hidroximetilfurfural, 5-metilfurfural, vanilină, aldehidă siringică, aldehidă coniferilică, sinapaldehidă, acid galic, acid elagic, acid vanilic, acid siringic şi scopoletină;

4.6. soluţie de referinţă: substanţele standard se dizolvă într-o soluţie apă-alcool de 50 % vol.

Concentraţiile finale în soluţia de referinţă trebuie să fie de ordinul a: furfural: 5 mg/l; 5-hidroximetilfurfural: 10 mg/l; 5-metilfurfural 2 mg/l; vanilină: 5 mg/l; aldehidă siringică: 10 mg/l; aldehidă coniferilică: 5 mg/l; sinapaldehidă: 5 mg/l; acid galic: 10 mg/l; acid elagic: 10 mg/l; acid vanilic: 5 mg/l; acid siringic: 5 mg/l; scopoletină: 0,5 mg/l.

5. Aparatură

Aparatură standard de laborator:

5.1. un cromatograf lichid de înaltă performanţă capabil să funcţioneze în mod gradient binar şi echipat cu:

5.1.1. un detector spectrofotometric capabil să măsoare la lungimi de undă de la 260 nm până la 340 nm. Cu toate acestea, este de preferat să se lucreze cu un detector cu multiple lungimi de undă cu reţea de diode, pentru a confirma puritatea vârfurilor;

5.1.2. un detector spectrofluorimetric – lungime de undă de excitare: 354 nm, lungime de undă de emisie: 446 nm (pentru determinarea urmelor de scopoletină; care este detectabilă, de asemenea, la 313 nm, cu ajutorul spectrofotometriei);

5.1.3. un dispozitiv de injectare care poate introduce 10 μl sau 20 μl (de exemplu) din proba de testare;

5.1.4. o coloană pentru cromatografie lichidă de înaltă performanţă, de tip RP C18, cu dimensiunea maximă a particulei de 5 μm;

5.2. seringi pentru HPLC;

5.3. dispozitiv pentru filtrare prin membrană a volumelor mici;

5.4. integrator computerizat sau înregistrator care funcţionează în compatibilitate cu întreaga aparatură şi, în special, care trebuie să aibă mai multe canale de achiziţie.

6. Mod de lucru

6.1. Pregătirea soluţiei care urmează a fi injectată

Soluţia de referinţă şi băutura spirtoasă se filtrează, dacă este necesar, printr-o membrană cu diametrul maxim al porilor de 0,45 μm.

6.2. Condiţii de operare cromatografică:

analiza se efectuează la temperatura ambiantă cu ajutorul echipamentului descris la subpct. 5.1, folosind fazele mobile de la subpct. 4.4, cu un debit de aproximativ 0,6 ml pe minut şi urmărind gradientul de mai jos (dat numai ca exemplu):

timp: 0 min, 50 min, 70 min, 90 min;

solvent A (apă-acid): 100 %, 60 %, 100 %, 100 %;

solvent B (metanol): 0 %, 40 %, 0 %, 0 %.

Trebuie remarcat că, în anumite cazuri, acest gradient ar trebui modificat pentru a se evita coeluările.

6.3. Determinare

6.3.1. se injectează soluţiile standard de referinţă separat, apoi amestecate.

Se adaptează condiţiile de operare astfel încât factorii de rezoluţie ai vârfurilor tuturor compuşilor să fie egali cu cel puţin 1;

6.3.2. se injectează proba preparată conform subpct. 6.1;

6.3.3. se măsoară suprafaţa vârfurilor în soluţia de referinţă şi băutura spirtoasă, precum şi se calculează concentraţiile.

7. Exprimarea rezultatelor

Concentraţia fiecărui constituent se exprimă în mg/l.

8. Caracteristici de performanţă ale metodei (precizia)

Următoarele date au fost obţinute în 2009 dintr-un studiu internaţional de performanţă a metodei, efectuat cu proceduri acceptate la nivel internaţional [1], [2].

8.1. Furfural

8.2. 5-Hidroximetilfurfural

8.3. 5-Metilfurfural

8.4. Vanilină

8.5. Aldehidă siringică

8.6. Aldehidă coniferilică

8.7. Sinapaldehidă

8.8. Acid galic

8.9. Acid elagic

8.10. Acid vanilic

8.11. Acid siringic

8.12. Scopoletină

^{__________________________________}

^[1] “Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method- Performance Studies”, Horwitz, W. (1995) Pure and Applied Chemistry 67, 332-343.

^[2] Horwitz, W. (1982) Analytical Chemistry 54, 67A-76A.

Capitolul X

DETERMINAREA CONŢINUTULUI

DE RADIOCARBON ÎN ETANOL

1. Introducere

Determinarea conţinutului de radiocarbon în etanol permite să se facă distincţia dintre alcoolul pe bază de combustibili fosili (alcool de sinteză) şi alcoolul pe bază de materii prime produse recent (alcool de fermentaţie).

2. Definiţie

Conţinutul de radiocarbon al etanolului trebuie considerat ca fiind conţinutul de radiocarbon determinat prin metoda descrisă aici sau prin metoda descrisă în standardul SM EN 16640, metoda C.

Conţinutul natural de radiocarbon din atmosferă (valoarea de referinţă), care este absorbit de vegetaţia vie prin asimilare, nu este o valoare constantă. Valoarea de referinţă se determină, aşadar, pe etanolul din materii prime provenite din cea mai recentă perioadă de vegetaţie. Valoarea de referinţă anuală este determinată în conformitate cu standardul SM EN 16640. Totuşi, poate fi acceptată o altă valoare de referinţă, dacă valoarea respectivă este certificată de către un organism acreditat.

3. Principiu

Conţinutul de radiocarbon al probelor care conţin alcool cu cel puţin 85 % masă de etanol se determină direct prin numărare prin scintilaţie lichidă.

4. Reactivi

4.1. Scintilator cu toluen:

5,0 g de 2,5-difeniloxazol (PPO);

0,5 g de p-bis-[4-metil-5-feniloxazol (2)]-benzen (dimetil-POPOP) într-un litru de toluen pur pentru analiză.

Se pot utiliza şi scintilatoare cu toluen cu această compoziţie disponibile în comerţ, gata preparate.

4.2. Standard radiocarbon

Radiocarbon n-hexadecan cu o activitate de aproximativ 1 × 106 dpm/g (circa 1,67 × 106 cBq/g) şi cu o precizie garantată a activităţii determinate de ± 2 % rel.

4.3. Etanol fără radiocarbon

Alcool de sinteză din materii prime de origine fosilă, cu cel puţin 85 % masă de etanol, pentru determinarea zgomotului de fond.

4.4. Alcool pe bază de materii prime produse recent, în cea mai recentă perioadă de vegetaţie, cu cel puţin 85 % masă de etanol ca soluţie de referinţă.

5. Aparatură:

5.1. spectrometru cu scintilaţie lichidă cu mai multe canale, cu procesor şi standardizare externă automată şi afişaj al raportului canal/standard extern (construcţie standard: trei canale de măsurat şi două canale pentru standardul extern);

5.2. flacoane contor, sărace în potasiu, adaptate pentru spectrometru, cu dopuri filetate în culori închise, prevăzute cu o protecţie interioară din polietilenă;

5.3. pipete volumetrice de 10 ml;

5.4. dispozitiv de dozare automată de 10 ml;

5.5. balon cu fund rotund de 250 ml, prevăzut cu dop din sticlă rodată;

5.6. aparat de distilare a alcoolului prevăzut cu manta de încălzire, de exemplu de tip Micko;

5.7. injector microlitru de 50 μl;

5.8. pâlnie de picnometru, picnometre de 25 ml şi 50 ml. Ca alternativă, trebuie admis un echipament echivalent, de exemplu de densimetrie electronică;

5.9. termostat cu temperatură constantă de ± 0,01 °C.

6.Procedură

6.1. Reglarea echipamentelor

Echipamentele trebuie reglate în conformitate cu instrucţiunile producătorului. Condiţiile de măsurare sunt optime în cazul în care valoarea E2/B, indicele de calitate, este la maximum.

E = efficiency (eficienţă);

B = background (zgomot de fond).

Numai două canale de măsurat se optimizează. Cel de-al treilea canal se lasă complet deschis pentru a permite controlul.

6.2. Selecţia flacoanelor contor

Se umplu mai multe flacoane contor, decât vor fi necesare ulterior, cu câte 10 ml de etanol de sinteză fără conţinut de radiocarbon şi 10 ml de scintilator cu toluen. Se măsoară fiecare pe parcursul a cel puţin 4 cicluri × 100 de minute. Se elimină flacoanele al căror zgomot de fond se abate cu mai mult de ± 1 % rel. de la medie. Se utilizează numai flacoane noi, provenite din acelaşi lot de fabricaţie.

6.3. Determinarea raportului canal/standard extern (RCSE)

În timpul procesului de reglare a canalelor (subpct. 6.1), RCSE se determină cu ajutorul programului de calcul corespunzător, în cazul în care se determină coeficientul de eficienţă. Standardul extern utilizat este Cesiu 137, deja integrat din fabricaţie.

6.4. Pregătirea probei

Se pot măsura probele cu un conţinut de etanol de cel puţin 85 % masă, fără impurităţi, cu o absorbanţă sub 450 nm. Un reziduu slab de esteri şi aldehide nu are un efect perturbator. Conţinutul de alcool al probei este determinat, în prealabil, cu o aproximare de 0,1%.

7. Măsurarea probelor prin utilizarea unui standard extern

7.1. Probele cu absorbanţă redusă descrise la subpct. 6.4, cu o valoare RCSE de aproximativ 1,8, pot fi măsurate prin RCSE, ceea ce constituie o măsură a coeficientului de eficienţă.

7.2. Măsurare

Se introduc cu pipeta câte 10 ml din fiecare probă preparată în conformitate cu subpct. 6.4 într-un flacon contor controlat pentru zgomot de fond şi se adaugă 10 ml de scintilator cu toluen, cu ajutorul unui dispozitiv de dozare automată. Probele din flacoane se omogenizează prin mişcări circulare corespunzătoare. Lichidul nu trebuie să umezească protecţia interioară din polietilenă din dopul filetat. Se prepară în acelaşi mod un flacon cu etanol fosil fără conţinut de radiocarbon pentru a determina zgomotul de fond. Pentru a verifica valoarea anuală relevantă a radiocarbonului, se prepară o probă duplicat din etanol produs recent, provenit din ultima perioadă de vegetaţie, amestecându-se un flacon cu standardul intern, a se vedea pct.8.

Proba-martor şi proba pentru zgomot de fond se aşază la începutul seriei de măsurători, care trebuie să conţină cel mult 10 probe de analiză. Timpul total de măsurare per probă este de cel puţin 2 × 100 de minute, probele individuale fiind măsurate în etape parţiale de 100 de minute fiecare, pentru a permite detectarea eventualelor derive sau defecţiuni ale echipamentelor. Aşadar, un ciclu corespunde unui interval de măsurare de 100 de minute per probă.

Probele-martor şi probele pentru zgomot de fond trebuie preparate din nou din patru în patru săptămâni.

În cazul probelor cu absorbanţă uşor redusă (cu RCSE de aproximativ 1,8), eficienţa este afectată doar neglijabil de modificarea acestei valori. În cazul în care modificarea se încadrează în intervalul ± 5 % rel., este probabil să se obţină aceeaşi eficienţă. În cazul probelor cu absorbanţă mai ridicată, cum ar fi alcoolii denaturaţi, eficienţa se poate determina cu ajutorul graficului de corecţie a absorbanţei. În cazul în care nu există un program de calcul disponibil, trebuie să se utilizeze standardul intern, ceea ce conduce la un rezultat fără echivoc.

8. Măsurarea probelor prin utilizarea unui standard intern hexadecan ¹⁴C

8.1. Procedură

Probele-martor şi probele pentru zgomot de fond (etanol produs recent şi etanol fosil), precum şi materialul necunoscut se măsoară fiecare în duplicat. O probă-duplicat se prepară într-un flacon neselecţionat, adăugându-se o cantitate dozată cu precizie (30 μl) de hexadecan radiocarbon ca standard intern (activitate suplimentară de aproximativ 26 269 dpm/gC, circa 43 782 cBq/gC). Pentru prepararea celorlalte probe şi timpii de măsurare, a se vedea subpct. 7.2, însă timpul de măsurare pentru probele cu standard intern poate fi redus la aproximativ cinci minute printr-un prereglaj la 10⁵ impulsuri. Pe o serie de măsurători, se utilizează câte un duplicat al probei-martor şi al probei pentru zgomot de fond; acestea se aşază la începutul seriei de măsurători.

8.2. Utilizarea standardului intern şi a flacoanelor contor

Pentru a se preveni contaminarea în cazul măsurărilor cu un standard intern, standardul trebuie depozitat şi manipulat departe de spaţiul în care se prepară şi se măsoară probele pentru analiză. După măsurare, flacoanele controlate pentru zgomot de fond pot fi reutilizate. Dopurile filetate şi tuburile care conţin standardul intern se elimină.

9. Exprimarea rezultatelor

9.1 Unitatea activităţii unei substanţe radioactive este becquerelul

1 Bq = 1 dezintegrare/sec

Indicarea radioactivităţii specifice se exprimă în becquereli în raport cu un gram de carbon = Bq/gC.

Pentru a obţine mai multe rezultate practice, acestea trebuie să fie exprimate în centibecquereli (cBq/gC).

Pot fi utilizate, de asemenea, descrierile şi formulele utilizate în literatura de specialitate, bazate pe dpm. Pentru a obţine valorile corespunzătoare în cBq, valoarea dpm se înmulţeşte cu 100/60.

9.2. Exprimarea rezultatelor cu un standard extern

9.3. Exprimarea rezultatelor cu un standard intern

9.4. Abrevieri

cpm_pr – media ratei de numărare a probelor, calculată pentru toată durata măsurării;

cpmNE – media ratei impulsurilor pentru zgomot de fond, calculată în acelaşi mod;

cpmIS – rata de numărare a probelor, cu un standard intern;

dpmIS – cantitatea de standard intern adăugată (radioactivitate etalonată dpm);

V – volumul probelor utilizate, în ml;

F – conţinutul, în grame, de alcool pur per ml, în funcţie de concentraţie;

Z – coeficientul de eficienţă corespunzător valorii RCSE;

1,918 – numărul de grame de alcool per gram de carbon.

10. Fiabilitatea metodei

10.1. Repetabilitate (r)

r = 0,632 cBq/g C;

S_(r) = ± 0,223 cBq/g C.

10.2. Reproductibilitate (R)

R = 0,821 cBq/g C;

S_(R) = ± 0,290 cBq/g C.

Anexă

la metodele de referinţă pentru analiza băuturilor

spirtoase şi a alcoolului etilic de origine agricolă

Tabel

Factorii F de multiplicare a masei de apă conţinută în picnometrul

Pyrex la t °C, pentru calcularea volumului picnometrului la 20 °C